CN117327808B - 扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用 - Google Patents
扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117327808B CN117327808B CN202311628074.5A CN202311628074A CN117327808B CN 117327808 B CN117327808 B CN 117327808B CN 202311628074 A CN202311628074 A CN 202311628074A CN 117327808 B CN117327808 B CN 117327808B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- base
- sequence
- weevil
- rice
- type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000966204 Lissorhoptrus oryzophilus Species 0.000 title claims abstract description 33
- 101150087323 COI gene Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 title abstract description 7
- 230000008186 parthenogenesis Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000254152 Sitophilus oryzae Species 0.000 claims description 45
- 102100030878 Cytochrome c oxidase subunit 1 Human genes 0.000 claims description 25
- 101000919849 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 1 Proteins 0.000 claims description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 240000005859 Orthosiphon aristatus Species 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 6
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 6
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 241000185686 Apocynum venetum Species 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 1
- 102000015884 Cytochrome c oxidase subunit I Human genes 0.000 description 1
- 108050004212 Cytochrome c oxidase subunit I Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000000452 mid-foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域。本发明提供了扩增稻水象甲线粒体COI基因序列的特异性引物组，包括正向引物DSXJF5和反向引物DSXJR5；还提供了该特异性引物组在区分稻水象甲生殖型中的应用、试剂盒以及方法。本发明操作简单，结合测序结果，凭借3个特异性碱基快速高效地区分稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型，为稻水象甲的检疫和预防提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种扩增稻水象甲线粒体COI基因序列的特异性引物组及其应用。
背景技术
稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)，是一种重要的外来入侵和检疫性害虫，属鞘翅目、象甲科、沼泽象亚科、稻水象属，成虫以取食叶片为害，幼虫蛀食稻根，使水稻根系发黑发烂从而影响吸收营养物质的能力，导致植株生长能力下降并大大减产。它繁殖能力强，传播方式多，寄主范围广，适应性强，对水稻的产量有非常重要的影响。
稻水象甲成虫体长2.5-3.8mm，体壁为褐色，覆盖灰色的鳞片，触角红褐色，中足胫节两侧各有一排长的游泳毛；蛹长约3mm，白色；老熟幼虫体长约10mm，白色无足，头部褐色；卵长约0.8mm，白色圆柱形，两端圆略弯。稻水象甲在美国存在两性生殖和孤雌生殖2种生殖型，在国内经调查后皆为孤雌生殖型。快速区分稻水象甲2种生殖型的技术，可为稻水象甲2种生殖型生物学研究奠定基础，对稻水象甲入侵和传播的研究具有重要理论意义，能为稻水象甲的检疫和预防提供科学依据。稻水象甲体小难以辨认，2种生殖型成虫形态高度相似，寄主范围一致，难以用肉眼快速检测鉴定。目前，对稻水象甲2种生殖型的特异性检测的方法尚未建立。
由于是同一个物种的2种生殖型，线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome coxidase subunit I，COI)基因序列基本上一致，难以通过多序列比对设计特异性明显的引物对，直接通过凝胶电泳图上面的条带有无直接得出结果。因此，亟需得到一对特异性COI引物并用来快速区分稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于稻水象甲线粒体COI基因序列扩增的特异性引物，它能快速区分稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型，是对稻水象甲2种生殖型生物学鉴定识别方法的补充和改进，对稻水象甲入侵和传播的研究具有重要理论意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种扩增稻水象甲线粒体COI基因序列的特异性引物组，包括正向引物DSXJF5和反向引物DSXJR5。
作为优选，所述正向引物DSXJF5的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述反向引物DSXJR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明提供了所述特异性引物组在区分稻水象甲生殖型中的应用。
本发明提供了一种区分稻水象甲生殖型的试剂盒，所述试剂盒包括所述特异性引物组、扩增试剂和检测试剂。
本发明还提供了一种利用所述特异性引物组区分稻水象甲生殖型的方法，包括如下步骤：
（1）以待测样本的总DNA为模板，利用所述特异性引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
（2）对扩增产物进行凝胶电泳，并测序，然后依据测序结果序列判断稻水象甲生殖型；
当目标序列对比模板25N3的序列时，第236位碱基为T、第311位碱基为A、第323位碱基为A时，为稻水象甲两性生殖型；当序列第236位碱基为C、第311位碱基为G、第323位碱基为G时，为稻水象甲孤雌生殖型。
作为优选，所述PCR扩增的总体系以25μL计，包括Vazyme 2xRapid Taq MasterMix 12.5μL、正向引物DSXJF5 1μL、反向引物DSXJR5 1μL、DNA模板2.5μL、ddH2O 8μL。
作为优选，所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 15s，46℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；循环完成后再72℃处理5min。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明技术方案基于稻水象甲线粒体COI基因序列扩增得到特异性引物组正向引物DSXJF5和反向引物DSXJR5；通过PCR扩增，结合测序结果，依据测序结果序列特定位点的3个特异性碱基的差异，快速高效地区分稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型。其中，当目标序列对比模板25N3的序列中第236位碱基为T、第311位碱基为A、第323位碱基为A时，为稻水象甲两性生殖型；当序列第236位碱基为C、第311位碱基为G、第323位碱基为G时，为稻水象甲孤雌生殖型。相对于常规的形态学鉴定，本发明技术方案操作简单快速，客观准确，特异性强，为稻水象甲的检疫和预防提供科学依据，是对稻水象甲2种生殖型生物学鉴定识别方法的补充和改进，对稻水象甲入侵和传播的研究具有重要理论意义。
附图说明
图1为COI通用引物对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的扩增结果图(其中M表示Vazyme DL 2000 Plus DNA Marker；1表示稻水象甲孤雌生殖型；2表示稻水象甲两性生殖型)；
图2为COI通用引物对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的多序列比对图(第1-5行为5个稻水象甲两性生殖型序列，第6-8行为3个稻水象甲孤雌生殖型序列)；
图3为特异性引物对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的扩增结果图(其中M表示Vazyme DL 2000 Plus DNA Marker，1表示稻水象甲孤雌生殖型，2表示稻水象甲两性生殖型；第一组1和2表示通用引物)；
图4为特异性引物1组对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的第一次验证多序列比对图(每个比对的第1行为稻水象甲两性生殖型模板序列，第2行为稻水象甲孤雌生殖型模板序列，第3行为稻水象甲两性生殖型利用特异性引物获得的序列，第4行为稻水象甲孤雌生殖型利用特异性引物获得的序列)；
图5为特异性引物2组对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的第一次验证多序列比对图(每个比对的第1行为稻水象甲两性生殖型模板序列，第2行为稻水象甲孤雌生殖型模板序列，第3行为稻水象甲两性生殖型利用特异性引物获得的序列，第4行为稻水象甲孤雌生殖型利用特异性引物获得的序列)；
图6为特异性引物3组对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的第一次验证多序列比对图(每个比对的第1行为稻水象甲两性生殖型模板序列，第2行为稻水象甲孤雌生殖型模板序列，第3行为稻水象甲两性生殖型利用特异性引物获得的序列，第4行为稻水象甲孤雌生殖型利用特异性引物获得的序列)；
图7为特异性引物5组对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的第一次验证多序列比对图(每个比对的第1行为稻水象甲两性生殖型模板序列，第2行为稻水象甲孤雌生殖型模板序列，第3行为稻水象甲两性生殖型利用特异性引物获得的序列，第4行为稻水象甲孤雌生殖型利用特异性引物获得的序列)；
图8为特异性引物5组对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的第二次验证扩增效果图(其M表示Vazyme DL 2000 Plus DNA Marker；25N1、25N2、25N3、25N6、25N7、25M6、25P3、SS4表示稻水象甲两性生殖型；A14、262、263、26M2表示稻水象甲孤雌生殖型)；
图9为特异性引物5组对稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的第二次验证多序列比对图(第1行为稻水象甲两性生殖型模板序列，第2行为稻水象甲孤雌生殖型模板序列，第3-10行为稻水象甲两性生殖型利用引物5组获得的序列，第11-14行为稻水象甲孤雌生殖型利用引物5组获得的序列)。
具体实施方式
本发明提供了一种扩增稻水象甲线粒体COI基因序列的特异性引物组，包括正向引物DSXJF5和反向引物DSXJR5。
在本发明中，所述正向引物DSXJF5的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，序列为5’-GGATTATTAGGGTTTGTTGT-3’；所述反向引物DSXJR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，序列为5’-AGTTAGTCCTCCGATTGTGA-3’。
本发明提供了所述特异性引物组在区分稻水象甲生殖型中的应用。
本发明提供了一种区分稻水象甲生殖型的试剂盒。
在本发明中，所述试剂盒包括上述特异性引物组、扩增试剂和检测试剂。本发明中所述扩增试剂包括Vazyme 2xRapid Taq Master Mix、ddH2O。
本发明还提供了利用所述特异性引物组区分稻水象甲生殖型的方法，包括如下步骤：
（1）以待测样本的总DNA为模板，利用所述特异性引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
（2）对扩增产物进行凝胶电泳，并测序，然后依据测序结果序列判断稻水象甲生殖型。
在本发明中，当目标序列对比模板25N3的序列时，第236位碱基为T、第311位碱基为A、第323位碱基为A时，为稻水象甲两性生殖型；当序列第236位碱基为C、第311位碱基为G、第323位碱基为G时，为稻水象甲孤雌生殖型。
在本发明中，所述样本的总DNA通过Easy Tissue&Blood DNA Extraction Kit试剂盒提取获得(易思得，中国)。
在本发明中，取5μL扩增产物进行电泳，剩下的20μL(未纯化)PCR产物直接送公司测序。本发明中所述测序委托浙江尚亚生物技术有限公司、生工生物工程(上海)股份有限公司操作。
在本发明中，所述PCR扩增的总体系以25μL计，包括Vazyme 2xRapid Taq MasterMix 12.5μL、正向引物DSXJF5 1μL、反向引物DSXJR5 1μL、DNA模板2.5μL、ddH2O 8μL。
在本发明中，所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 15s，46℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；循环完成后再72℃处理5min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1设计特异性COI引物
（一）提取稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的总DNA
本实施例中的待检昆虫为稻水象甲的孤雌生殖型和两性生殖型，其中稻水象甲孤雌生殖型来自于中国江西，稻水象甲两性生殖型来自于美国路易斯安那。将获取的稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型单头虫分别放入1.5 mL的离心管中，倒入磁珠至淹没虫体，SCIENTZ-48S高通量组织研磨器(宁波新芝，中国)液氮研磨充分后，再根据Easy Tissue&Blood DNA Extraction Kit试剂盒(易思得，中国)分别提取各单头虫总DNA，洗脱液40μL，保存于-20℃。
采用不同时间、不同提取方法对同一批次孤雌生殖型和两性生殖型稻水象甲处理，提取得到总DNA，其中，稻水象甲两性生殖型的总DNA编号包括25N1、25N2、25N3、25N6、25N7、25M6、25P3，稻水象甲孤雌生殖型的总DNA编号包括A14、262、263、26M2。
（二）用COI通用引物进行PCR扩增检测总DNA提取效率
为确保提取到稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的总DNA的正确性，从而更准确无误地进行后续实验操作，因此用COI通用引物进行PCR扩增反应检测总DNA提取效率。
以稻水象甲两性生殖型25N3和孤雌生殖型A14的总DNA为模板，其中，COI通用引物包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列为5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’；反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列为5’-TCCAATGCACATATCTGCCATATTA-3’。
PCR扩增的总体系以25μL计，具体包括：Vazyme 2xRapid Taq Master Mix 12.5μL、正向引物F 1μL、反向引物R 1μL、DNA模板2.5μL、ddH2O 8μL。PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 15s，46℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；循环完成后再72℃处理5min获得扩增产物。分别取两种生殖型PCR扩增产物各5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，用1wt%琼脂糖凝胶电泳分离。
结果如图1所示，两种生殖型即每条泳道均出现一条大小为1000bp左右的DNA扩增条带，提取效率较好，后续送公司测序符合。所述稻水象甲两性生殖型模板25N3的COI序列如SEQ ID NO.3所示，序列为TGATTTTTGGACACCCAGAAGTATATATTTTAATTCTCCCAGGATTTGGAATAATCTCCCATATTATTGGTCAAGAAAGAGGAAAAAAAGAAGCCTTCGGCGTACTTGGAATAATCTATGCAATAATAGCAATTGGATTATTAGGGTTTGTTGTTTGAGCACACCACATATTTACAGTAGGATTAGATGTCGATACACGAGCCTATTTTACTTCTGCTACAATAATTATTGCAGTTCCTACTGGAATTAAAATTTTTAGATGATTAGCAACTTATCATGGGACACAAATTTCTTTTAATCCATCTTCTTTATGGTCATTAGGATTCATTTTCCTTTTCACAATCGGAGGACTAACTGGAGTTATTTTAGCAAATTCATCTATTGATATTATTCTTCATGATACCTACTATGTAGTAGCCCATTTCCACTATGTTTTATCTATAGGTGCAGTATTTGCTATTTTAGGAGGAATCATTCAATGATTCCCCCTTTTTACTGGATTGACATTAAATTCTAAATTTTTAAAAACTCAATTTTTAATTATATTTATCGGAGTAAATATAACTTTCTTTCCCCAACATTTTCTTGGTCTAAGAGGTATACCACGACGATATTCTGATTATCCAGATGCTTATTTTTTATGAAACATAGTATCTTCAATTGGAAGATTAATTTCATTAATAGGGGTATTTTATTTCATTTTTATCTTATGAGAAGCTTTTTCATCTAAACGAATAAATCTTTCAAGATCAAGAATAAATACATCACTAGAATGAATACAATTTTTTCCTCCAGCAGAACATAGCTATGCAGAATTACCTGTAATTACAAATTTCTAATATGG；
所述稻水象甲孤雌生殖型模板A14的COI序列如SEQ ID NO.4所示，序列为CAACATTTTATTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTCTCCCAGGATTTGGAATAATCTCCCATATTATTGGTCAAGAAAGAGGAAAAAAAGAAGCCTTCGGTGTACTTGGAATAATCTATGCAATAATAGCAATTGGATTATTAGGGTTTGTTGTTTGAGCCCACCACATATTTACAGTAGGATTAGATGTCGATACACGAGCCTATTTTACTTCTGCTACAATAATTATTGCAGTCCCTACTGGAATTAAAATTTTTAGATGATTAGCAACTTATCATGGGACACAAATTTCTTTTAATCCATCTTCTTTGTGGTCATTAGGGTTCATTTTCCTTTTCACAATCGGAGGACTAACTGGAGTTATTTTAGCAAATTCATCTATTGATATTATTCTTCATGATACCTACTATGTAGTAGCCCATTTCCACTATGTTTTATCTATAGGTGCAGTATTTGCTATTTTAGGAGGAATCATTCAATGATTCCCCCTTTTTACTGGATTGACATTAAATTCTAAATTTTTAAAAACTCAATTTTTAATTATATTTATCGGAGTAAATATAACTTTCTTTCCCCAACATTTTCTTGGTCTAAGAGGTATACCACGACGATATTCTGATTATCCAGATGCTTATTTTTTATGAAACATAGTATCTTCAATTGGAAGATTAATTTCATTAATAGGGGTATTTTATTTCATTTTTATCTTATGAGAAGCTTTTTCATCTAAACGAATAAATCTTTCAAGATCAAGAATAAATACATCACTAGAATGAATACAATTTTTTCCTCCAGCAGAACATAGCTATGCAGAATTACCTGTAATTACAAATTTCTAATATGG。
但用COI通用引物难以直观通过条带来区分稻水象甲两种生殖型，送公司进一步测序因相同物种序列基本一致而无法辨认，故从中找寻特异性碱基来明确区分开两种生殖型。
（三）设计特异性COI引物
送公司测序获取稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型的COI序列，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，然后用Primer Premier 5和DNAMAN设计比对引物。
由于是同一个物种的两种生殖型，基因序列基本上一致，难以用以前方法，通过多序列比对设计特异性明显的引物对，直接通过凝胶电泳图上面的条带有无直接得出结果。因此，采取设计特异性引物扩增得到两种生殖型个别碱基特异的序列的方法，来明确区分两种生殖型。
具体操作：通过选取扩增出的多个两种生殖型的COI序列，进行多序列比对，找到特异性碱基，从而区分。通过序列比对发现有5个碱基都是差异明显的(如图2)，即依照COI序列中这5处明显差异碱基来区分两种生殖型。依据序列比对结果设计得到针对两种生殖型的特异性COI引物，具体见表1。
表1 针对稻水象甲两种生殖型的6对特异性COI引物
实施例2
利用特异性COI引物快速区分稻水象甲两种生殖型。
（一）
以总DNA为模板利用表1中的特异性COI引物进行PCR扩增获得扩增产物。
以稻水象甲两性生殖型25N3和孤雌生殖型A14的总DNA为模板，用表1中记载的6对特异性COI引物进行PCR扩增反应。PCR体系为25μL，具体包括：Vazyme 2xRapid Taq MasterMix 12.5μL、正向引物F 1μL、反向引物R 1μL、DNA模板2.5μL、ddH2O 8μL。PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 15s，46℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；循环完成后再72℃处理5min获得扩增产物。
（二）
取上述得到的每种PCR扩增产物各5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，用1wt%琼脂糖凝胶电泳分离。
结果如图3所示，引物1组、引物2组、引物3组和引物5组对稻水象甲两种生殖型的扩增结果中泳道都出现一条大小为200bp左右的DNA扩增条带，且大小深浅基本一致，送公司测序观察是否特异性。进行多序列比对，发现四对引物都能准确呈现3个碱基的差异(如图4-7)，即用同一个引物在一段高度一致的序列中，在目标序列对比模板25N3的序列中第236位碱基为T、第311位碱基为A、第323位碱基为A的是稻水象甲两性生殖型，相同位置碱基为C、G和G的是稻水象甲孤雌生殖型，以此快速区分稻水象甲两种生殖型。
（三）
基于上述提取得到的其他稻水象甲两性生殖型序列(25N1、25N2、25N6、25N7、25M6、25P3)和孤雌生殖型序列(262、263、26M2)，选择较好效果的引物5继续进行测定，结果如图9所示，可以看出，每个泳道都能出现一条大小为200bp左右的清晰明亮的DNA扩增条带，送公司测序获得序列，进行多序列比对，符合预期，都能准确呈现3个碱基的差异(如图8)。
综上可得到，本发明基于稻水象甲线粒体COI基因序列扩增的特异性引物能快速区分稻水象甲孤雌生殖型和两性生殖型，其中引物5组正向引物DSXJF5和反向引物DSXJR5扩增效果最好，特异性强，能为稻水象甲的检疫和预防提供科学依据，具有很好的实用性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.检测鉴别稻水象甲生殖型的位点的特异性引物组在区分稻水象甲生殖型中的应用，其特征在于，所述特异性引物组为扩增稻水象甲线粒体COI基因序列的引物组，包括正向引物DSXJF5和反向引物DSXJR5；
所述正向引物DSXJF5的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述反向引物DSXJR5的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
所述鉴别稻水象甲生殖型的位点为如SEQ ID NO.3所示的COI基因序列的第236位碱基、第311位碱基和第323位碱基；
当第236位碱基为T、第311位碱基为A、第323位碱基为A时，为稻水象甲两性生殖型；当序列第236位碱基为C、第311位碱基为G、第323位碱基为G时，为稻水象甲孤雌生殖型。
2.一种利用权利要求1所述特异性引物组区分稻水象甲生殖型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以待测样本的总DNA为模板，利用权利要求1所述特异性引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行凝胶电泳，并测序，然后依据测序结果序列判断稻水象甲生殖型；
当目标序列对比模板25N3的COI序列时，第236位碱基为T、第311位碱基为A、第323位碱基为A时，为稻水象甲两性生殖型；当序列第236位碱基为C、第311位碱基为G、第323位碱基为G时，为稻水象甲孤雌生殖型；
所述模板25N3的COI序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的总体系以25μL计，包括Vazyme 2xRapid Taq Master Mix 12.5μL、正向引物DSXJF5 1μL、反向引物DSXJR5 1μL、DNA模板2.5μL、ddH2O 8μL。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：94℃3min；94℃15s，46℃15s，72℃30s，共35个循环；循环完成后再72℃处理5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311628074.5A CN117327808B (zh) | 2023-12-01 | 2023-12-01 | 扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311628074.5A CN117327808B (zh) | 2023-12-01 | 2023-12-01 | 扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117327808A CN117327808A (zh) | 2024-01-02 |
| CN117327808B true CN117327808B (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=89279640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311628074.5A Active CN117327808B (zh) | 2023-12-01 | 2023-12-01 | 扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117327808B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113073141A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-07-06 | 山西省植物保护植物检疫总站 | 一种鉴定稻水象甲特异引物对及其应用 |
| CN114717327A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-08 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种基于scar-pcr技术在天敌肠道检测入侵害虫稻水象甲的方法 |
| CN114717328A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-08 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法 |
| CN116463433A (zh) * | 2023-06-15 | 2023-07-21 | 浙江大学海南研究院 | 一对特异性coi引物及其在快速鉴定四纹豆象中的应用 |
-
2023
- 2023-12-01 CN CN202311628074.5A patent/CN117327808B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113073141A (zh) * | 2021-05-20 | 2021-07-06 | 山西省植物保护植物检疫总站 | 一种鉴定稻水象甲特异引物对及其应用 |
| CN114717327A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-08 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种基于scar-pcr技术在天敌肠道检测入侵害虫稻水象甲的方法 |
| CN114717328A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-07-08 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种基于scar-pcr技术在稻水象甲肠道检测其食性的方法 |
| CN116463433A (zh) * | 2023-06-15 | 2023-07-21 | 浙江大学海南研究院 | 一对特异性coi引物及其在快速鉴定四纹豆象中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| The distribution of the invasive pest, rice water weevil Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (Coleoptera: Curculionidae), is expanding in Europe: First record in the Balkans, confirmed by CO1 DNA barcoding;Ioannis A. Giantsis 等;Phytoparasitica;第1-3页 * |
| 湖南省稻水象甲遗传多样性的研究;胡岩;中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑(第10期);第2.4.2节部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117327808A (zh) | 2024-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Collins et al. | Polymorphisms in grapevine DNA detected by the RAPD PCR technique | |
| RU2010144789A (ru) | Процесс и способ мониторинга желудочно-кишечной микрофлоры | |
| CN111471756B (zh) | 用于鲟鱼性别鉴定的特异性dna片段ssm1及应用 | |
| CN105821054B (zh) | 一种四川华鳊dna条形码标准检测序列及其应用 | |
| CN107354219B (zh) | 一种鉴定企鹅性别的方法及试剂盒 | |
| Elyasigorji et al. | Mitochondrial genes as strong molecular markers for species identification | |
| Othman et al. | A review on next-generation wildlife monitoring using environmental DNA (eDNA) detection and next-generation sequencing in Malaysia | |
| CN104450697B (zh) | 一种与牡蛎抗病毒特性相关的snp标记及其应用 | |
| KR101151757B1 (ko) | 대한한국 연안 해파리류의 종 판별 방법과 이에 따른 해파리류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 | |
| CN103789441B (zh) | 一种用于鉴别两个海马种群的ssr分子标记方法 | |
| CN117327808B (zh) | 扩增稻水象甲线粒体coi基因序列的特异性引物组及其应用 | |
| CN106636411A (zh) | 一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN107299145B (zh) | 用于检测鉴别华支睾吸虫和/或扇棘单睾吸虫的引物组及试剂盒 | |
| KR101166781B1 (ko) | 미토콘드리아 ｄｎａ 다형성 분석에 의한 느타리버섯류의 품종 판별 특이 프라이머 및 이의 용도 | |
| JP6413122B2 (ja) | キノコの同定方法、及び、同定キット | |
| WO2023087791A1 (zh) | 一种识别黄绿卷毛菇原产地的dna条形码、引物组及应用 | |
| CN113502334B (zh) | 一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记c27449及其应用 | |
| Singh et al. | Molecular markers in diagnosis and management of fungal pathogens: A review | |
| CN111621574B (zh) | 用于鉴定鹤鸵目动物性别的引物、性别鉴定方法及试剂盒 | |
| KR20150081774A (ko) | 뽕나무 동정방법 | |
| CN104673890B (zh) | 基于特异性ss‑coi引物的棉黑蚜pcr快速检测方法 | |
| CN116769927B (zh) | 一种鉴别长丰鲢的渗入基因、引物、方法及应用 | |
| CN110894544A (zh) | 鲑鱼甲病毒（sav）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN116555433B (zh) | 一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物、试剂盒及应用 | |
| Kuehn et al. | Differentiation of meat samples from domestic horses (Equus caballus) and asiatic wild asses (Equus hemionus) using a species-specific restriction site in the mitochondrial cytochrome b region |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |