KR20230097514A - 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법 - Google Patents

흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 흰반점 증후군 바이러스의 외피막 단백질 발현 유전자인 VP664 및/또는 VP28을 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 이를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물, 검출용 키트 및 이를 이용한 흰반점 증후군 바이러스 검출방법에 관한 것이다.

Description

흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법 {Composition For Detecting White Spot Syndrom Virus and Method of Detecting White Spot Syndrom Virus Using the Same}
본 발명은 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 흰반점 증후군 바이러스의 외피막 단백질 발현 유전자인 VP664 및/또는 VP28을 증폭하기 위한 프라이머 쌍, 이를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물, 검출용 키트 및 이를 이용한 흰반점 증후군 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
흰반점병(white spot disease; WSD)은 새우의 외골격(두흉갑)에 흰색 반점이 나타나는 질환으로, 수입 냉동 새우 검역, 양식 새우 등의 대량폐사의 원인으로 심각한 경제적 손실을 입히고 있다. 아시아에서 최초로 보고 된 이래로, 현재 대부분의 아시아 국가 및 북아메리카 등의 지역에서 양식 새우의 WSD가 꾸준히 발병하고 있으며, WSD는 세계적으로 새우 양식산업에 심각한 경제적 손실을 입히고 있다. 국제수역사무국 OIE (World Organization for animal health) 및 국내 해양수산부에서도 10 대 전염성 병원체로 지정하여 관리되고 있다.
우리나라의 경우, 1993년 서해안 일대의 대하 및 보리새우 양식장에서 최초로 WSD가 보고되었으며, 그 후 현재까지 전세계적으로 매년 새우 양식산업의 경제적 손실이 늘고 있다. 특히, 대하 및 보리새우의 경우, WSD가 강한 전염성을 보여 발병된 후 3-10일 이내에 개체의 90% 이상이 감염 및 폐사되고 있다.
흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV)는 WSD의 원인 바이러스로, 계통발생학적으로는 니마비리데과(Nimaviridae) 휘스포바이러스속(Whispovirus)에 속한다. 또한, WSSV는 이중나선형 DNA 바이러스로 형태학적 길이는 약 250-380 nm, 넓이는 80-120 nm이고, 유전체의 길이는 290-305 kb로 바이러스 중에서도 큰 사이즈에 이르는 것으로 알려져 있다. 국제수역사무국(OIE)에서는 해수, 기수 및 담수 서식 새우류, 게, 가재 등을 포함하는 넓은 범위의 수생 갑각류를 WSSV 감염 숙주로 정의하고 있으며, 이와 더불어 야생 갑각류 및 조개류 등을 질병 매개체로 지정하고 있다.
WSSV는 감염 새우, 양식장 인근 갑각류 및 패류에서 검출되는 WSSV 특이적 유전자 및 항원을 검출함으로써 최종 진단될 수 있다. WSSV 진단법은 대부분 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 유전자 탐침을 이용한 현장혼성화(in situ hybridization) 및 면역학적 항원 진단키트를 이용하는 것으로 알려져 있다. 특히, WSSV는 배양 가능한 표준 세포주의 부재로 인해 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 진단법을 사용하는 것이 가장 일반화되어 있다.
현재 국제수역사무국(OIE)에서 권장하고 있는 유전자 진단법으로 Nested PCR법을 이용한 방법과 Real time PCR법 및 대만 GeneReach Biotechnology Corporation에서 판매하고 있는 IQ2000, IQplus 제품이 전세계적으로 WSSV의 진단을 위해 사용되고 있다. 그러나, 이러한 기존의 유전자 진단법은 한가지 특이 유전자만을 검출할 수 있도록 고안되어 있어 진단의 민감도 및 특이도가 현저히 떨어진다는 문제점이 있어 매개체 생물에서의 정확한 진단이 어려울 뿐만 아니라, 일부 음성시료에 대해서 거짓 양성반응을 유발하거나, 양성시료에 대해서 거짓 음성반응을 유발할 수 있어 진단의 신뢰성이 떨어진다는 문제점이 있다.
WSD는 전염성이 매우 높아 거짓 양성반응(위양성)보다는 거짓 음성반응(위음성)으로 인해 수입 및 수출, 양식에 지대한 영향을 줄 수 있다.
거짓 음성반응(위음성)이 유발할 수 있는 문제로는 낮은 민감도를 가진 검사법도 영향을 줄 수 있지만, 분자진단을 위한 핵산 추출 과정에서 300kb에 달하는 거대한 핵산으로 구성되어 있는 WSD의 경우 핵산 추출과정에서 나타나는 핵산 파편 현상으로 인해 바이러스가 존재를 하지만, 검출하려고 하는 부위 유전자의 파편현상이 발생하게 되면 거짓 음성(위음성)결과를 초래할 수 있다.
이러한 기술적 배경에서, 본 출원의 발명자들은 민감도 향상 및 특이도 측면에서 우수한 유전자 진단법에 관해 연구하던 중, WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP664 및/또는 VP28과 각 유전자에 결합하는 프라이머 쌍을 통해 단일 튜브에서 두 개 타겟을 동시에 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 감염정도가 낮은 검체에서도 검출이 가능하고, 핵산 추출과정에서 나타나는 핵산 파편 현상으로 인한 거짓음성(위음성)률을 현저히 낮출 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 흰반점 증후군 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 흰반점 증후군 바이러스 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 검체에서 추출된 핵산을 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV) 검출방법에 관한 것이다.
본 발명을 통해 흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV)를 검출함에 있어 야기될 수 있는 위음성, 위양성에 대해 방지할 수 있는, 조성물, 키트 및 검출방법을 제공할 수 있다. 특히, WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP28과 VP664을 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 이용하고, 단일 튜브에서 두 유전자를 같은 형광물질이 탑재된 각 프로브와 같이 사용하여 실시간중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜주고 핵산 추출과정에서 하나의 유전자 파편이 발생이 되더라도 다른 유전자를 동시 검출하기에 위음성이 나타날 확률을 현저히 감소시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 WSSV 진단법의 단일 튜브 듀얼타겟 실시간연쇄중합반응에서 각 유전자에 대한 프라이머 위치와 유전자 파편 발생 유무에 따른 음양성 검출 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 WSSV 진단법의 VP28 및 VP664 유전자에 대한 검출 민감도와 VP28 및 VP664 유전자를 동시 검출했을 때의 민감도 차이를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 듀얼타겟검출법과 종래의 유전자 진단법인 국제수역사무국(OIE)에 명시되어 있는 Real time PCR 법과 대만 GeneReach Biotechnology Corporation 사에서 개발한 IQ2000 WSSV detection kit(국제수역사무국 매뉴얼에 검사법으로 등재) 진단법과 하와이(미국), 국내양식업에서 무작위 샘플링을 통해 확보한 새우 샘플을 이용하여 WSSV 검출률을 비교 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 검체에서 추출된 핵산을 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 검체에서 추출된 핵산을 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
흰반점 증후군 바이러스 내에 유전자 두 곳을 동시에 검출함으로써 핵산 추출과정에서 나타나는 핵산 파편(Fragment)에 의해 한 개의 타겟 유전자가 상실되어도 검출이 가능하여, 위음성 발생율을 현저히 낮춰주고, 한 튜브에서 두 개의 유전자를 같은 형광 염료를 이용하여 검출함으로써 낮은 카피수까지 검출이 가능하여, WSSV 감염된 개체뿐만아니라, 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수산생물 방역, 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 분자진단에 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 '프라이머'는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
절한 완충용액 중의 적절한 조건 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 명세서에서 '상보적 결합'은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션되는 것을 의미하고, 이합체(duplex) 구조를 형성할 수 있다. 상보적 결합은 쌍을 이루는 뉴클레오티드 서열 간의 상보성이 왓슨-크릭 결합(Watson-Crick pair)을 이루거나, 일부 비 왓슨-크릭 결합(Non-Watson-Crick base pair)이 존재하여도 형성될 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하고, 유전자 증폭 반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 5'-말단 및 3'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
예를 들어, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 쌍 중 서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 흰반점 증후군 바이러스 외피막 단백질을 구성하는 VP28 유전자에 결합할 수 있다.
상기 프라이머 쌍 중 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 프라이머 쌍은 흰반점 증후군 바이러스 외피막 단백질을 구성하는 VP664 유전자에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로브는 프라이머 쌍에 의해 특이적으로 증폭된 유전자에 상보적으로 혼성화 할 수 있다.
혼성화 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
상기 프로브는 예를 들어, 서열번호 3 또는 6의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1 및 2의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 4 및 5의 서열을 포함하는 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따르면 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3 프로브 세트 1, 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6 세트 2와 함께 단일 튜브에서 핵산을 증폭하는 경우 민감도가 매우 향상될 수 있다.
본 발명에 따른 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP28과 VP664와 결합하는 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 단일 튜브에서 두 유전자를 같은 형광물질이 탑재된 각 프로브와 같이 사용하여 실시간중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜주고 핵산 추출과정에서 하나의 유전자 파편이 발생이 되더라도 다른 유전자를 동시 검출하기에 위음성이 나타날 확률을 현저히 감소시킬 수 있다.
경우에 따라서, 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 증폭 산물의 양은 형광신호에 의해 검출할 수 있다. 프로브가 결합된 증폭산물의 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(intercalator)을 사용하는 인터컬레이팅(Intercalating)법, 5' 말단은 형광물질, 3' 말단은 소광자(quencher)로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 등이 있다.
구체적으로, 상기 프로브 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자 (quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein) 또는 BHQ (Black Hole Quencher), 상기 소광자는 포스페이트 (Phosphate)에서 선택되어 사용할 수 있다.
구체적으로, 각 프로브는 동일 형광물질이 탑재된 것이 바람직하다.
본원발명에 따른 증폭은 실-시간 정량 증폭 예를 들어 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-Time PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)등의 방법을 통해 수행될 수 있다.
"실시간연쇄중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction: PCR)" 은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머와 형광물질이 탑재된 프로브 세트로부터 표적 핵산을 실시간으로 증폭하여 검출하는 방법으로, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 실시간 중합효소연쇄반응에 있어 PCR 증폭 산물의 양은 형광 신호에 의해 검출할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응이 진행되면서 증가하는 폴리뉴클레오티드 양에 따라 형광 신호의 세기가 증가하게 되고, 증폭 사이클 횟수에 따른 형광 신호 세기를 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선을 얻게 된다.
본 발명의 Real-time PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 인터컬레이션(intercalation)됨으로써 형광량이 비로소 기기에 감지되기 시작한다. 이렇게 형광량이 최저 감지가능 수준(background level)을 넘어 두드러지게 증가하는 시점의 증폭주기인 한계 주기(threshold cycle, Ct)가 나타난다. 주형 초기량의 로그(log)값과 주형을 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭할 때 해당하는 한계 주기 사이에는 직선적으로 비례하는 관계를 가지고 있다. 따라서, 핵산의 초기량을 이미 알고 있는 시료를 이용하여 초기량의 로그값과 한계 주기를 측정하여 표준검량곡선을 얻음으로써 핵산 증폭산물의 실시간 측정방법을 제공한다.
실시간중합연쇄반응에서 항원-항체 핫스타트 핵산 증폭 방법 또는 피로포스페이트와 피로포트파타아제를 이용하는 핫스타트 핵산 증폭 방법, DNA 압타머 (aptamer)를 이용한 핫스타트 핵산 증폭 방법 등이 포함된 실시간연쇄중합반응 시약을 사용하는 것이 바람직하다.
시료의 DNA를 실시간연쇄증폭반응 시약과 WSSV 진단용 프라이머 세트, 즉 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3 프로브 세트 1, 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6 세트 2와 함께 튜브에 첨가하여, (a) 91 내지 97℃의 온도에서 1분 내지 5분간 변성시키는 사전 DNA 변성단계; (b) 1차 PCR 반응을 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3 세트 1, 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6 세트 2을 이용하여, 50 내지 65℃의 온도에서 5 내지 25초간; 형광스캔; 처리하는 과정을 30 내지 45회 사이클로 수행하였으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱이, 상기 중합효소연쇄반응에서 온도 및 시간의 조건은 본 발명의 중합효소연쇄반응 산물을 생성하기 위해 설정된 수치로, 실험방법 및 기기의 변경 등에 따라 통상의 당업자의 적절한 선택에 의해 타당한 수치로 변경될 수 있다.
또한, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 프로브 표지 물질은 형광 물질이나, 형광 물질 종류에 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다.
본 발명은 또한, 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 경우에 따라, 중합효소, 버퍼와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 프라이머 쌍 및/또는 프로브 각각을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행함에 있어 사용되는 키트와 관련된 구성에 대한 설명은 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 검체는 새우류, 게류 및 패류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 대상 시료는 흰반점 증후군 바이러스 감염개체, 매개체 및 보유 생물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검체로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 핵산의 추출은 예를 들어 상업화 되어 공급되고 있는 다양한 키트 또는 추출 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명을 통해 흰반점 증후군 바이러스를 낮은 감염 검체로도 진단가능하여 민감도가 매우 우수하고, 특이도 및 핵산 추출과정에서 발생될 수 있는 유전자 파편에 의한 위음성률을 기존 검출 방법에 비해 현저하게 낮출 수 있는 효과를 가지고 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] WSSV VP28 및 VP664 유전자를 표적으로 하는 프라이머 세트 제작
흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrome virus; WSSV)의 외피막 단백질를 구성하는 유전자, 즉 VP1664 또는 VP28에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 제작하기 위해서, 국제유전자은행(NCBI, GenBank)에 등록된 WSSV 관련 유전정보 전체 유전자 염기서열을 참조하였으며, 대표적으로 국제유전자은행(NCBI, GenBank)에 등록되어있는 GenBank Accession No. AF332093.3을 참조하였다. 중국 균주(등록번호 제 AF332093호), 태국 균주(등록번호 제AF369029) 및 대만 균주(등록번호 제 AF440570)의 전체 유전자 염기서열을 참조하였다.
이로부터 WSSV 외피막 단백질을 표적으로하는 프라이머 세트, 즉 VP28 유전자 표적으로 하는 특이 프라이머 및 프로브 및 VP664를 표적으로 하는 특이 프라이머 및 프로브는 국제수역사무국(OIE) WSSV 검사 프로토콜에 기입되어 있는 프라이머 및 프로브를 사용하였다. 이를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1] 프라이머 및 프로브 염기서열
Figure pat00001
[실시예 2] WSSV 진단법의 VP28 및 VP664 유전자에 대한 각 검출 민감도와 VP28 및 VP664 유전자를 동시 검출했을 때의 민감도 평가
본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 WSSV 검출에 대한 민감도를 확인하기 위하여, WSSV에 감염된 새우 유영각에서 핵산추출 프로토콜에 따라 핵산 추출하여, 10^-1 희석배수부터 10^-7 희석배수까지 추출된 DNA을 희석한 후 [실시예1] 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트와 서열번호 4 내지 6 프라이머 세트를 각 사용한 것과 서열번호 1내지 6 프라이머 세트가 혼합된 프라이머 세트와 함께 AccuPower Plus Dualstar qPCR Mastermix(Bioneer)의 튜브에 첨가한 후, 95℃의 온도에서 5분간 DNA를 변성시켰다. 이후, 95℃의 온도에서 20초간, 55℃의 온도에서 30초간, 스캔 단계(형광 측정)처리하는 과정을 실시간 PCR 증폭기기(Exicycler96 thermal block, BIONEER)를 이용하여 실행하였다.
본 발명의 WSSV 듀얼 타겟 유전자 진단법은 종래의 유전자 진단법인 국제수역사무국 매뉴얼에 따른 VP664 유전자 검출 진단법 및 본 발명을 통해 디자인된 VP 28 유전자 검출 진단법과 VP664와 VP28 유전자 검출 프라이머가 혼합된 진단법에 대한 민감도를 확인한 바 종래의 유전자 진단법인 국제수역사무국 매뉴얼에 따른 VP664 유전자 검출 진단법 및 본 발명을 통해 디자인된 VP 28 유전자 검출 진단법에 비해 VP28, VP664 검출 프라이머가 혼합된 검출 진단법에서 10배 높은 희석배수까지 검출되어, 매우 우수한 민감도를 확인하였다. 이의 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pat00002
[실시예 3] 본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 검출률과 종래의 유전자 진단법의 검출률 비교
본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 검출률과 종래의 유전자 진단법의 검출률을 비교하기 위하여, 본 발명의 WSSV 유전자 진단법과 종래의 유전자 진단법의 검출률을 하와이(미국), 국내 양식업장에서 무작위로 샘플링하여 검출률 비교 평가를 수행하였다.
구체적으로는, 무작위 샘플에 대해 바이러스성 DNA/RNA 추출 키트를 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하여, 핵산을 추출하였다. 상기 실시예 2와 동일하게, 종래의 유전자 진단법(국제수역사무국 매뉴얼에 따른 VP664 유전자 검출)과 대만 GeneReach Biotechnology Corporation 사에서 개발한 IQ2000 WSSV detection kit(국제수역사무국 매뉴얼에 검사법으로 등재)를 사용하여 본 발명의 WSSV 듀얼타겟 유전자 진단법과 비교하였다.
종래의 유전자 진단법과 본 발명의 듀얼타겟 유전자 진단법은 상기 실시예 2와 같이 실시하였으며, IQ2000 WSSV detection kit는 제품 매뉴얼에 따라 수행하였다.
각각의 유전자 진단법에 따라 측정된 WSSV 검출률을 비교하였으며, 이의 결과를 하기 표 3, 표 4와 도 2에 나타내었다.
[표 3]
Figure pat00003
[표 4]
Figure pat00004
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIONEER CORPORATION <120> Composition For Detecting White Spot Syndrom Virus and Method of Detecting White Spot Syndrom Virus Using the Same <130> P21-B301 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggtcccgtcc tcatctcag 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctgccttgcc ggaaatta 18 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 3 agccatgaag aatgccgtct atcacaca 28 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gatgcggatc ttgtcatca 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tgttgttcca caccttgaat 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 6 tcccgtggag ggccgagcac tcga 24

Claims (12)

  1. 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 또는 6의 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 또는 6의 서열인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 검체에서 추출된 핵산을 흰반점 증후군 바이러스 (white spot syndrome virus; WSSV)의 VP664 및/또는 VP28 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로 증폭시키는 단계를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 검출방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 서열 및/또는 서열번호 4 및 5의 서열인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물에 결합하는 프로브를 추가로 포함하는 검출방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3 또는 6의 서열인 것을 특징으로 하는 검출방법.

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