CN109988808A - 一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法 - Google Patents

一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物保护技术领域，具体公开了一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法，包括以下步骤：（1）梨火疫病菌接种液的制备；（2）离体枝条制备；（3）接种；（4）接种结果观察与致病力评价。本发明方法简便易行，病原菌致病性表现稳定，重复性好，结果可靠，可准确地反映梨火疫病菌的致病力及其致病强度；在实际操作中，可批量进行，具有占用空间小、节约劳动成本、缩短实验周期的优点。因此，本发明方法适合推广应用。

Description

一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，具体的说，本发明涉及一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法。
背景技术
梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）侵染多种蔷薇科植物造成的最具毁灭性的细菌病害，为我国进境植物检疫性有害生物。该病害1780年首次发生于美国纽约州，目前已扩散分布于世界近60个国家和地区。梨火疫病菌寄主范围广，可以危害蔷薇科40余属的220多种植物，其中最感病的是梨、苹果、山楂等果树，病原菌侵染花器、叶片、嫩梢、幼果、枝条和树干，病菌从病梢可很快扩展到枝条和树干，直至根部，引起花序枯死、枯枝、果实腐烂和整株死亡。果树苗木、候鸟、带菌果实和被污染的包装材料都是重要的传播途径，昆虫、鸟类和风雨是重要的传播介体。病原菌一旦入侵，在寄主植物上定殖，进而扩散蔓延，迅速流行，难以控制和根除，造成严重的经济损失。
我国尚无梨火疫病发生的报道，但最近十年内与我国毗邻的哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和俄罗斯等国相继有发现梨火疫病的报道，进境风险分析显示该病害为我国特高风险有害生物。目前国内对梨火疫病的研究十分有限。库尔勒香梨（Pyrus bretschneideriRehd）属白梨系，原产地新疆库尔勒，已有1400多年的栽培历史，现是新疆梨产业的唯一主栽品种，栽培面积达4.96万hm2，甘肃酒泉地区也有一定栽培品种。该品种具有皮薄肉细、汁多味甜、酥脆爽口、香味浓郁、耐贮力强等优良品质而享誉国内外，是新疆特色经济林果业的重要支柱。研究发现库尔勒香梨对梨火疫病菌高度感病。
梨火疫病病原菌致病力的测定是病原鉴定、病原致病性分化、致病机制和抗病品种选育的重要基础工作。不同地理起源及寄主来源的梨火疫病菌（E.amylovora），其菌株间基因组成、生理特征、生态适应性均有所不同，表现在侵染水平、致病力及寄主范围等具有一定的差异。国外研究发现，分离自不同寄主的菌株之间的毒力差异显著，有强致病力菌株，还存在弱毒力和无毒力菌株。不同菌株和寄主品种间存在着相互作用，依据寄生专化性梨火疫病菌可分为苹果株系、悬钩子株系和亚洲梨株系。从地理分布和起源又可分为美国株系、韩国株系和日本株系等。由于该病害为重要检疫性病害，寄主为多年生木本植物，在非疫区禁止在田间进行病原菌的接种试验，加上病害的发生受到各种环境因素的影响，故在田间难以开展病原菌的致病性试验。因此，在室内人工接种是梨火疫病菌致病力测定的重要手段。关于梨火疫病菌致病力测定至今仍没有统一的鉴别寄主和一套成熟测定方法，致病力类型的划分也无统一的标准。现有的梨火疫病菌致病力测定主要有以下几种方法：（1）幼苗接种法，此方法要在严格附加防虫网纱隔离条件、远离蔷薇科植物的温室（或网室）中，移栽种植梨或苹果树苗，在茎尖生长点或枝条活体上接种测定病菌的致病力。该方法环境条件难以控制，不同树龄、不同生长期的树苗木质化程度不同，人工接种后会出现不发病或发病时间较长等问题，成本高、周期长，难以快速得到理想结果。（2）梨幼果接种法。这是梨火疫病菌致病力测定最经典的方法，目前仍在广泛使用。将未成熟的、直径小于3cm左右的梨幼果横切为二，或用打孔器取果肉切成碟片。通过针刺在果肉切面上接种待测病原菌菌株，依据接种后目测在梨幼果半果或碟片果肉表面菌脓的产生时间和产生量，结合“出现菌脓的半果（碟片数）/接种总数”来表示病原菌的致病力。梨幼果接种虽然显症快，但难以对发病状况进行量化统计，不能准确对菌株致病力强弱进行评级，无法区分致病力差异不大的病原菌株。其次是梨幼果取材时间有限，采集的梨幼果在冰箱冷藏很容易腐烂，限制了该方法难以周年使用。（3）巴梨离体枝条接种法。采用巴梨幼嫩枝条针刺接种病原菌，观察接种孔产生菌脓和枝条变色来判别菌株是否有致病力。该法仅能定性鉴定梨火疫病菌的致病力，但未提出对致病力划分等级。此外，巴梨在我国主要在山东种植，取材有一定局限性。（4）石楠接种法。将梨火疫病菌液注射入石楠的叶片叶肉细胞中，依据能产生过敏性褐斑判断为梨火疫病菌。该法也是一种定性的致病力测定方法。因此，为了准确评估梨火疫病菌的致病力，有必要建立一套高效、简便、准确的测定致病力的方法和划分致病力等级的指标，为梨火疫病的研究、预防和安全防控提供科学基础基础和技术方法。
发明内容
本发明目的在于提供一套取材容易、简便、快速、高效、鉴定结果准确的香梨离体枝条水培法测定梨火疫病菌致病力的方法，准确划分病原菌致病力类型，为防治药剂的筛选、抗病育种及流行病学提供菌种和技术方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法，包括梨火疫病菌接种液的制备、离体枝条制备、接种、接种结果观察与致病力评价，具体步骤包括：
1. 梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病待测菌株接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 r/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液，无菌水稀释至浓度为108CFU/mL作为接种液。
2. 离体枝条制备：选择对梨火疫病极感病品种，健康库尔勒香梨树的当年生新生枝条作为供试材料，将采集的枝条截至30cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3. 接种：用灭菌手术刀在枝条顶端向下第3~4片叶的叶腋处切开一个5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的待测菌液滴加在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴敷在伤口部位，再用保鲜膜包裹保湿，每个待测病原菌菌株接种30个离体枝条，以无菌水代替菌液作为对照。
4. 接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，光照12h的人工气候箱中培养，枝条接种后2d开始每天连续观察发病情况，接种7d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数，判断致病力类型。
5. 根据本发明具体实施方式的梨火疫病菌接种结果观察与致病力评价，其中所述的接种枝条病情调查分级标准为：0级，枝条无病斑，叶片正常；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1%～5%，叶片变黑褐色，不脱落；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的5.1%~15%，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的15.1%~30%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅶ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的30.1%~50%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅸ级，枝条病斑长度占接种枝条长度＞50.1%，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
6. 根据本发明具体实施方式的梨火疫病菌致病力及评价方法，其中所述的病情指数计算方法如下：病情指数(DI)＝ [∑（各级病株数×相应病级）/接种总株数×最高病级]×100。
7. 根据本发明的具体实施方式的梨火疫病菌致病力及评价方法，其中，待测菌株的致病力类型分为强致病力，较强致病力，中致病力，弱致病力。其划分标准为，当病情指数≥70时，为强致病力类型；当病情指数为41～69时为较强致病力类型；当病情指数为16～40时为中度致病力类型；当病情指数为1～15时为弱致病力类型。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1. 本发明取材方便，可周年取幼嫩枝条进行致病力测定。
2.本发明所提供的伤口接种法，操作简便。以发病枝条病斑长度占接种枝条长度百分比、落叶的百分比作为病情调查的分级标准，症状典型，更能科学反映出病情的发展进程，准确的区分不同菌株的致病力差异，鉴定结果准确可靠，病情判别灵敏度高。
3.鉴别周期短。本发明以当年生幼嫩的离体枝条扦插水培作为鉴别材料，伤口法接种3d后开始发病，第7d即可对接种枝条进行病情调查，计算病情指数判断致病力类型。
4.本发明方法病原菌致病性表现稳定，重复性好，结果可靠；在实际操作中，可批量进行，具有占用空间小、节约劳动成本、缩短实验周期的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
本发明供试梨火疫病病菌（Erwinia amylovora）菌株均由新疆出入境检验检疫局技术中心提供。具体信息见表1。
表1 供试E.amylovora菌株信息
实施例1离体枝条不同接种方法对病原菌致病力评价的影响
1. 梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌株E.a 0001、E.a0019和E.a0087接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液用无菌水稀释至浓度为108CFU/mL作为接种液。
2. 离体枝条制备：选择梨火疫病极感病品种库尔勒香梨的当年新生幼嫩枝条作为供试材料，将供试枝条截至30cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3. 接种：本实施例设计4种离体枝条接种方法，以无菌水代替菌液作为对照，每处理重复30个离体枝条，具体如下。
（1）伤口法：用灭菌手术刀在距枝条顶端3～4片叶的叶腋处切开一个约5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的待测菌液滴加在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴敷在伤口部位，再用保鲜膜包裹保湿。
（2）针刺法：用灭菌的牙签蘸取接种菌液，在据枝条顶端枝条3~4片叶的叶腋处，针刺一个深度约为3mm的针孔，刺伤后将牙签拔出，并用保鲜袋保湿培养48小时。
（3）喷雾法：将接种菌悬液装于压力式喷壶内，对枝条进行喷雾至有水滴落下，并用保鲜袋保湿培养48小时。
（4）针刺喷雾法：先用灭菌的牙签蘸取菌悬液，在据枝条顶端3～4片叶的叶腋处针刺一个深度约为3mm的针孔，刺伤后将牙签拔出，再将菌悬液装于压力式喷壶内，对枝条进行喷雾至有水滴落下，并用保鲜袋保湿培养48小时。
4. 接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%、温度28.5℃、光照12h的人工气候箱中培养，枝条接种后每天观察发病情况，接种7d后对接种枝条进行病情调查，统计发病率，计算病情指数、划分致病力类型。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价，其中，接种枝条病情调查分级标准为：
0级，枝条无病斑，叶片正常；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1%～5%，叶片变黑褐色，不脱落；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的5.1%~15%，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的15.1%~30%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅶ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的30.1%~50%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅸ级，枝条病斑长度占接种枝条长度＞50.1%，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价，其中，病情指数计算方法如下：病情指数（DI）＝ [∑（各级病株数×相应病级)/接种总株数×最高病级]×100。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价，其中，发病率计算方法如下：发病率（%）=（发病株数/接种总株数）×100％。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价，其中，待测菌株的致病力类型分为强致病力，较强致病力，中致病力，弱致病力，其划分标准为，当病情指数≥70时，为强致病力类型；当病情指数为41~69时为较强致病力类型；当病情指数为16~40时为中度致病力类型；当病情指数为1~15时为弱致病力类型。
5. 结果与分析：香梨嫩枝经针刺或针刺喷雾法接种7d后，部分枝条仅在针刺伤口部位有少量菌脓产生，无明显溃疡斑产生，仅能通过嫩枝的发病率对病情分级，而3个E. amylovora菌株引起香梨嫩枝发病率分别为33.3%、33.3%和30.0%，因此无法区分3个的菌株致病力强弱。而香梨嫩枝经喷雾法接种7d后表现为叶片变色，枝条上无明显溃疡斑和菌脓产生，症状不易判断，因此无法准确的对病情调查。使用伤口法接种，3个E.amylovora菌株引起的发病率均达到100%，并且发病枝条伤口部位附近产生明显的溃疡斑，通过对溃疡斑长度的测量及病情指数的计算，发现3个E.amylovora菌株的致病力存在一定的差异，其中E.a 0001（病情指数：91.85）属于强致病力毒株，E.a0019（病情指数：62.22）和E.a0087（病情指数：63.30）属于较强致病力毒株。综合以上结果表明，针刺法和针刺喷雾法引起的发病率较低，且无法区分致病力相近的强毒菌株。喷雾法引起的症状不典型，不适于病情的调查和致病力的分级。而采用伤口法接种，更易引起枝条发病，通过对产生溃疡斑大小的比较更能量化、准确区分菌株致病力，因此确定伤口接种法为最佳接种方法。
实施例2 梨火疫病菌致病力测定鉴别寄主的选择
1. 梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌株E.a 0001、E.a 0017、E.a 0055分别接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液无菌水稀释至浓度为108CFU/ml作为接种液。
2. 离体枝条准备：选择梨火疫病感病品种香梨、砀山梨、黑酸梨、杜梨、新梨七号、黄酸梨、褐色句句梨、红安久、霍城冬黄梨、库车阿木特的当年新生幼嫩枝条作为供试材料，将供试枝条截至30cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3. 接种：用灭菌手术刀在距枝条顶端3～4片叶的叶腋处切开一个约5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的待测菌液滴加在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴敷在伤口部位，再用保鲜膜包裹保湿。
4. 接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%、温度28.5℃、光照12h的人工气候箱中培养。枝条接种后每天观察发病情况，接种7 d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数判断致病力类型。病情调查分级标准、病情指数计算方法和致病力类型划分标准同实施例1。
5. 结果与分析：将3个不同来源的梨火疫病菌株E.a 0001、E.a 0017和E.a 0055分别接种不同品种的梨属离体枝条，均引起枝条出现发病症状。接种后第3d即可观察到发病枝条和叶片出现轻微发黑；接种5d后，枝条开始变褐坏死，叶片焦枯、落叶，接种口附近有溃疡斑产生；接种7d后的发病枝条变褐发黑，叶片几乎全部焦枯、大部分叶片脱落，而对照无发病症状出现。统计发病枝条数、测量枝条病斑长度，计算发病率、病情指数，将结果列于表2。
结果表明，3个E.amylovora菌株对测定的10个梨品种均有致病力，不同菌株对不同梨品种的致病力有差异，病情指数在25.37～92.96之间。3个E.amylovora菌株对香梨、砀山梨、黑酸梨、杜梨具有强致病力（DI＞70），对香梨的致病力最强（DI＞90）；其次是砀山梨，黑酸梨；再次是杜梨。3个E.amylovora菌株对新梨7号、黄酸梨、红安久、褐色句句梨具有较强致病力（DI:35.85～66.48）。3个E.amylovora菌株对库车阿木特、霍城冬黄梨具有中度致病力（DI:25.37～32.04）。综合对各供试梨属枝条接种的病情指数均值，香梨为高感品种，最适合作为鉴别寄主应用于梨火疫病菌致病力测定。
表2 三个E.amylovora菌株对不同梨品种的离体枝条接种结果
实施例3：梨火疫病不同菌株的致病力测定
1. 梨火疫病菌接种液的制备：将表1中的10个不同来源的梨火疫病菌株分别接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液用无菌水稀释至浓度为108CFU/ml作为接种液。
2. 离体枝条准备：选择梨火疫病高感品种库尔勒香梨的当年新生枝条为供试枝条，将供试枝条截至30cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3. 接种：用灭菌手术刀在枝条顶端向下第3~4片叶的叶腋处切开一个5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的待测菌液滴加在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴敷在伤口部位，再用保鲜膜包裹保湿，每个待测病原菌菌株接种30个离体枝条，以无菌水代替菌液作为对照。
4. 接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%、温度28.5℃、光照12h的人工气候箱中培养。枝条接种后每天观察发病情况，接种7 d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数判断致病力类型。病情调查分级标准、病情指数计算方法和致病力类型划分标准同实施例1。
5. 结果与分析：将10个不同来源的E. amylovora菌株分别接种于香梨离体枝条，均引起枝条出现发病症状。接种7d后的发病枝条变褐发黑，接种伤口附近产生溃疡斑，叶片几乎全部焦枯、大部分叶片脱落，而对照无发病症状出现。统计发病枝条数、测量枝条病斑长度，计算发病率、病情指数，将结果列于表3。结果表明，10个E.amylovora菌株对测定的香梨品种均有致病力，不同菌株的致病力存在明显差异，病情指数在62.22～95.55之间。其中菌株E.a 0001、E.a 0017、 E.a0027、E.a 0013、E.a 0036、E.a 0042、E.a 0055、E.a 0069属于强致病力毒株，E.a 0019和E.a 0087属于较强致病力毒株，致病力大小依次是E.a 0069> E.a 0013> E.a 0055> E.a 0001> E.a 0017> E.a 0042> E.a 0036> E.a 0027> E.a0087> E.a 0019。
表3 不同E.amylovora菌株的致病力测定结果
实施例4：梨火疫病不同菌株在其他寄主上的致病力测定
1. 梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌株E.a 0001、E.a 0017、E.a 0055分别接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液用无菌水稀释至浓度为108CFU/ml作为接种液。
2. 离体枝条制备：选择苹果不同品种的春稍或秋稍作为供试枝条，将供试枝条截至30cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3. 接种：用灭菌手术刀在枝条顶端向下第3~4片叶的叶腋处切开一个5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的待测菌液滴加在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴敷在伤口部位，再用保鲜膜包裹保湿，每个待测病原菌菌株接种30个离体枝条，以无菌水代替菌液作为对照。
4. 接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%、温度28.5℃、光照12h的人工气候箱中培养。枝条接种后每天观察发病情况，接种7 d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数判断致病力类型。病情调查分级标准、病情指数计算方法和致病力类型划分标准同实施例1。
5. 结果与分析：将3个不同来源的E.a 0001、E.a 0017和E.a0055菌株分别接种不同品种的苹果离体枝条，均引起枝条出现发病症状。接种7 d后部分苹果枝条病变为褐色，叶片发褐干枯，接种伤口附近发黑并且可以看到坏死斑，而对照无发病症状出现。统计发病枝条数、测量枝条病斑长度，计算病情指数，将结果列于表4。
结果表明，E.a 0001、E.a 0017和E.a 0055三个菌株对测定的10个苹果品种均有致病力，不同菌株对不同苹果品种的致病力有差异，病情指数在1.67~66.11之间。3个E.amylovora菌株对测定的10个苹果品种无强致病力。3个E.amylovora菌株对顶红、桑归奇阿尔玛、嘎啦均具有较强的致病力（病情指数＞40），对顶红的致病力最强（病情指数＞63），致病力大小依次为：E.a 0017﹥E.a 0055﹥E.a 0001；其次是桑归奇阿尔玛、嘎啦，E.a0001﹥E.a 0017﹥E.a 0055。E.a 0001菌株对黄香蕉、塔尔阿尔玛、红肉果、克孜阿尔玛、冬白果具有中度致病力（病情指数：24.63～35.56），E.a 0017和E.a 0055二个菌株对黄香蕉、塔尔阿尔玛、红肉果、克孜阿尔玛、具有中度致病力（病情指数：19.44～28.33），对冬白果有弱致病力（病情指数：11.11～12.78），致病力大小依次为：E.a 0001﹥E.a 0055﹥E.a 0017；3个E.amylovora菌株对白海棠、秋富具有弱致病力（病情指数：1.67～16.67），致病力大小依次为：E.a 0001﹥E.a 0055﹥E.a 0017；综合对各供试苹果属枝条接种的病情指数均值，3个E. amylovora菌株致病力的大小依次是E.a 0001﹥E.a 0055﹥E.a 0017。
表4 三个E. amylovora菌株对不同苹果品种的离体枝条接种结果

Claims (4)

1.一种香梨枝条离体水培法测定梨火疫病菌致病力的方法，其特征在于通过以下步骤实现：
（1）梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病待测菌株接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 r/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液，无菌水稀释至浓度为108CFU/mL作为接种液；
（2）离体枝条制备：选择对梨火疫病极感病品种，健康库尔勒香梨树的当年生新生枝条作为供试材料，将采集的枝条截至30cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中；
（3）接种：用灭菌手术刀在枝条顶端向下第3~4片叶的叶腋处切开一个5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的待测菌液滴加在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴敷在伤口部位，再用保鲜膜包裹保湿，每个待测病原菌菌株接种30个离体枝条，以无菌水代替菌液作为对照；
（4）接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，光照12h的人工气候箱中培养，枝条接种后2d开始每天连续观察发病情况，接种7d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数，判断致病力类型。
2.如权利要求1所述的接种结果观察与致病力评价，其特征在于，所述的病情调查分级标准为：0级，枝条无病斑，叶片正常；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1%~5%，叶片变黑褐色，不脱落；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的5.1%~15%，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的15.1%~30%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅶ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的30.1%~50%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅸ级，枝条病斑长度占接种枝条长度＞50.1%，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
3.如权利要求1所述的接种结果观察与致病力评价，其特征在于，所述的病情指数计算方法如下：病情指数（DI）＝ [∑（各级病株数×相应病级）/接种总株数×最高病级]×100。
4.如权利要求1所述的接种结果观察与致病力评价，其特征在于，所述的待测菌株致病力类型分为强致病力，较强致病力，中致病力，弱致病力，其划分标准为，当病情指数≥70时，为强致病力类型；当病情指数为41~69时为较强致病力类型；当病情指数为16~40时为中度致病力类型；当病情指数为1~15时为弱致病力类型。
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