CN113767805A - 一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于苹果抗病鉴定技术领域，具体涉及一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法。本发明通过对待鉴定的多品种苹果个体进行扩繁，得扩繁苗；待扩繁苗生长高度至50cm时，选择生长势一致的扩繁苗，放置在鉴定池中，接种火疫病菌，根据病情指数判断火疫病抗性。本发明对苹果扩繁得扩繁苗，挑选生长势一致的扩繁苗构建小区，而后接种火疫病菌，鉴定苹果火疫病抗性，避免了苹果生长过程中由于长势不一致造成的检测误差，提升了苹果火疫病抗性鉴定的科学性，解决了苹果火疫病抗性准确性差的问题。
Description
技术领域
本发明属于苹果抗病鉴定技术领域，具体涉及一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法。
背景技术
火疫病是由支链淀粉杆菌(Eriwiniaamylovora)引起的细菌病害，对蔷薇科36个属150多个种致病，危害苹果、梨等果树的花朵、芽、枝条、树干和砧木，最终导致树体死亡，果园减产，严重时甚至造成毁灭性灾害。截至2016年，火疫病已扩散到中亚的苹果种质资源起源地吉尔吉斯斯坦和哈萨克斯坦以及东亚的韩国等地。对苹果火疫病抗性资源的鉴定和筛选至关重要。然而，传统和应用广泛的鉴定苹果火疫病抗性的方法科学性不强，并且检测结果准确度不够。因此，如何提高检测的准确性和科学性，是苹果火疫病抗性鉴定和筛选亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法，可以实现苹果资源火疫病抗性鉴定的可操作性、合理性、准确性和科学性，并且能够在活体状态下进行，符合生产实际条件。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法，包括以下步骤：
对待鉴定的若干品种苹果个体进行扩繁，得扩繁苗；
待扩繁苗生长高度至48～52cm时，选择生长势一致的扩繁苗，分小区放置在鉴定池中，接种火疫病菌Erwiniaamylovara，根据病情指数判断火疫病抗性；
每个小区内包含每个品种苹果的一株扩繁苗。
优选的，所述苹果的品种包括陇东海棠、八棱海棠、栾庄沙果、昭觉山荆子、西蜀海棠、沙金海棠、垂丝海棠、小金海棠、石洞彩苹1#和樱叶海棠中的一种或者多种。
优选的，所述小区的个数为≥1的正整数。
优选的，同一小区中扩繁苗接种火疫病菌的时间相同。
优选的，所述接种的方法包括针刺接种。
优选的，所述扩繁的方式包括嫁接，所述嫁接的方法包括芽接或者枝接。
优选的，所述扩繁时，扩繁基质包括草炭土和土壤；所述草炭土和土壤的质量比为0.5～1：1～2。
优选的，当所述扩繁苗高度不足48～52cm时，使所述扩繁苗继续在育苗地生长，待高度长至48～52cm，进行后续步骤，直至全部完成。
本发明提供了一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法，包括以下步骤：对待鉴定的若干品种苹果个体进行扩繁，得扩繁苗；待扩繁苗生长高度至48～52cm时，选择生长势一致的扩繁苗，分小区放置在鉴定池中，接种火疫病菌，根据病情指数判断火疫病抗性。本发明所述方法可以在温室内周年进行，并且在活体状态下进行苹果火疫病的抗性鉴定，科学性强；通过挑选生长势一致扩繁苗，避免了苹果生长过程中由于长势不一致造成的检测误差，提升了火疫病抗性鉴定的准确性。并且本发明限定扩繁苗生长高度至48～52cm时接种火疫病，此时扩繁苗木质化程度尚低，能够提高鉴定结果的准确性。本发明苹果火疫病病情指数在0～88.89之间，每个苹果品种变异系数为0.00％～27.50％，抗性鉴定结果准确，重复性较好。
附图说明
图1为芽接得到的扩繁苗示意图；
图2为苹果个体在育苗地统一管理培养示意图；
图3为鉴定池中多小区放置扩繁苗示意图；
图4为实施例1完成后接种的苹果单株扩繁苗；
图5为对比例1完成后接种的枝条；
图6为对比例2完成后接种的叶片；
图7为实施例1设计小区接种火疫病菌2周后发病情况，图7左侧为感病苹果品种；图7右侧为抗病苹果品种；
图8为对比例1枝条接种火疫病菌2周后发病情况；
图9为对比例2叶片接种火疫病菌72h后发病情况。
具体实施方式
本发明提供了一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法，包括以下步骤：
对待鉴定的若干品种苹果个体进行扩繁，得扩繁苗；
待扩繁苗生长高度至48～52cm时，选择生长势一致的扩繁苗，分小区放置在鉴定池中，接种火疫病菌，根据病情指数判断火疫病抗性；
每个小区内包含每个品种苹果的一株扩繁苗。
本发明对待鉴定的若干品种苹果个体进行扩繁，得扩繁苗。本发明所述扩繁的方式优选包括嫁接。本发明对所述嫁接的方法并没有特殊限定，优选包括芽接或者枝接。
在本发明中，所述嫁接用砧木优选为苹果砧木，进一步优选为一年生苹果砧木。本发明所述苹果砧木的品种优选为山荆子或M.9。本发明所述砧木的粗度优选为1.0～1.5cm，进一步优选为1.2～1.4cm。
本发明以待鉴定苹果个体的枝条为接穗进行所述嫁接。本发明所述接穗优选为8月份或秋冬季采集的一年生枝条。本发明对所述接穗的预处理并没有特殊限定，可现采现用，也可在4℃环境中保存不超过2周。
本发明在进行所述嫁接时，优选将所述砧木定植于营养钵中，再进行嫁接。本发明所述营养钵优选为口径为15cm的塑料花盆。本发明先定植砧木再进行扩繁能够保证苗木生长的一致性。本发明在所述营养钵内填充基质，所述基质优选包括草炭土和土壤。本发明所述草炭土和土壤的质量比优选为0.5～1：1～2，进一步优选为0.6～0.8：1.4～1.6。本发明所述土壤优选为田间土，进一步优选为田间土表层土。本发明对草炭土和土壤的来源没有特殊要求，优选购自青岛绿生生物科技有限公司。
在本发明的实施例中，以陇东海棠、八棱海棠、栾庄沙果、昭觉山荆子、西蜀海棠、沙金海棠、垂丝海棠、小金海棠、石洞彩苹1#和樱叶海棠作为待鉴定的苹果个体，对本发明利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法进行说明。但是不能理解为本发明只能用于鉴定以上苹果品种。
得扩繁苗后，本发明对扩繁苗进行培养，待扩繁苗生长高度至48～52cm时，选择生长势一致的扩繁苗，分小区放置在鉴定池中，接种火疫病菌，根据病情指数判断火疫病抗性。在本发明中，所述培养优选为将生长势一致的扩繁苗放置在育苗地进行培养。本发明所述生长势一致优选为苗木高度为48～52cm，进一步优选为50cm。本发明所述育苗地培养扩繁苗的方式优选为将不同品种苹果的扩繁苗分行放置，将来自同一待鉴定的苹果品种个体的扩繁苗放置在同一行，每行扩繁苗的个数一致，并对每株扩繁苗进行挂牌标记，避免混淆。本发明对育苗地的选择没有严格要求，能够保证扩繁苗的正常生长即可。经本发明育苗地培养后，来自于同一待鉴定的苹果个体的扩繁苗的成活个数≥10株。本发明对所述扩繁苗进行分行放置时，为节约用地面积，行与行之间可紧挨排列。
在本发明中，分小区放置经育苗地培养后的扩繁苗时，所述小区的个数优选为≥1的正整数。本发明所述分小区放置的具体方式为：经育苗池培养后的扩繁苗生长高度至48～52cm，比较育苗地中每个个体的扩繁苗，选择生长一致的，放置在温室的鉴定池中，组成小区1；所述小区1中包括全部苹果品种的扩繁苗，且每种一株；依次从育苗地中选择生长高度至48～52cm，生长势一致的扩繁苗，组成小区2、3、4……N，其中N为大于等于1的正整数。当所述扩繁苗高度不足48～52cm时，本发明优选使所述扩繁苗继续在育苗地生长，待高度长至48～52cm，进行后续小区设置，直至全部完成。
将扩繁苗放置到鉴定池后，本发明对扩繁苗接种火疫病菌Erwiniaamy lovara(编号为E.a6)，根据病情指数判断火疫病抗性。在本发明中，同一小区中扩繁苗接种所述火疫病菌的时间优选相同。本发明所述接种的方式优选为针刺接种，进一步优选为使用牙签蘸取火疫病菌液接种，或者使用剪刀蘸取火疫病菌液后，在具有生长点的枝梢顶部，剪去最上面刚展开的嫩叶2/3。本发明所述菌液的浓度优选为1×107CFU·mL-1。
在本发明中，所述苹果群体火疫病抗病性划分标准为：高抗：病情指数(0,5]；抗病：病情指数(5,15]；耐病：病情指数(15,30]；中感：病情指数(30,60]；感病：病情指数(60,80]；高感：病情指数(80,∞)；所述抗病性等级分为高抗，抗病，耐病，中感，感病和高感。
本发明分小区放置经育苗地培养后的扩繁苗，接种火疫苗病菌，保证了待鉴定苹果品种生长条件一致、扩繁苗生长势一致，重复性强，结果可靠，可显著提高苹果火疫病鉴定的准确性和科学性。并且限定接种火疫病菌的扩繁苗生长高度至48～52cm，此时扩繁秒木质化程度尚低，进一步提高了鉴定结果的准确性。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
设置小区接种：准备苹果砧木山荆子，定植于塑料花盆中。
分别对陇东海棠、八棱海棠、栾庄沙果、昭觉山荆子、西蜀海棠、沙金海棠、垂丝海棠、小金海棠、石洞彩苹1#和樱叶海棠的苹果单个体进行芽接或者枝接扩繁，每个个体保证扩繁成活10株以上，每株进行挂牌标记；
嫁接成活的苹果扩繁苗邮寄至新疆库尔勒进行培养；
待扩繁苗生长至50cm时，比较群体中每个个体的扩繁苗，选取生长一致的，挑出后放置在鉴定池中，组成小区1，小区1中包含群体的每一个个体；依次从中挑选满足50cm高度的，组成小区2、3、4……；高度不够的继续保留在育苗地生长，待高度满足后，继续进行小区设置，直至全部完成，分小区放置结果如图3所示；
对每个小区内的扩繁个体进行火疫病接种，同一小区的接种时间保持一致。接种完成后的苹果单株扩繁苗如图4所示。
对比例1
枝条接种：分别采集陇东海棠、八棱海棠、栾庄沙果、昭觉山荆子、西蜀海棠、沙金海棠、垂丝海棠、小金海棠、石洞彩苹1#和樱叶海棠的当年生幼嫩枝条10个以上，将枝条截至长度为30cm，插入装有纯净水的培养杯中，利用牙签蘸取菌液，在枝条顶部刚展开的嫩叶叶柄基部的枝干上针刺接种，接种完成后的枝条如图5所示。接种后放置在温度为28℃，相对湿度为75％的培养箱中培养。
对比例2
叶片接种：分别采集陇东海棠、八棱海棠、栾庄沙果、昭觉山荆子、西蜀海棠、沙金海棠、垂丝海棠、小金海棠、石洞彩苹1#和樱叶海棠的当年生和刚展开的嫩叶10个以上，将叶片放置在铺有滤纸的9cm培养皿中，滤纸提前喷水打湿，滤纸上面放置三个牙签搭架，叶片放置在牙签上面，每个培养皿放置一片叶片。接种完成后的叶片如图6所示。；利用牙签蘸取菌液，在叶片的叶片基部的叶柄上进行针刺接种。接种后放置在温度为28℃，相对湿度为75％的培养箱中培养。
测试例1
根据接种火疫菌后枝条或者叶片上出现病斑长度与枝条或叶片总长度的比值进行病情分级，分级标准为：0级，枝条无病斑，叶片正常；1级，病斑长度占总长度的1％～5％，叶片变黑褐色，不脱落；3级，病斑长度占总长度的5.1％～15％，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；5级，病斑长度占总长度的15.1％～30％，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；7级，病斑长度占总长度的30.1％～50％，叶片变黑褐色，约三分之叶片脱落；9级，病斑长度占总长度＞50.1％，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
根据病情分级计算病情指数，病情指数的计算方法为：
病情指数＝[∑(各级病株数×相应病级)/接种总株数×最高病级]×100
将抗病性等级分为高抗，抗病，耐病，中感，感病和高感。苹果群体火疫病抗病性划分标准为：高抗：病情指数(0,5]；抗病：病情指数(5,15]；耐病：病情指数(15,30]；中感：病情指数(30,60]；感病：病情指数(60,80]；高感：病情指数(80.1,∞)。
设计小区接种2周后，第16天上午8:00～12:00测量实施例1接种后的苹果扩繁苗病斑长度，进行病情分级，计算病情指数，将鉴定结果列于下表1，单株扩繁苗发病情况如图7。
表1设计小区接种苹果资源抗火疫病的鉴定结果
由表1可知，设计小区嫁接苗接种2周后，部分种质发病，病情指数在0～88.89之间，选出高抗火疫病资源4份，每份资源10个重复之间的变异系数为0.00％～27.50％，重复性较好。
枝条接种2周后，第16天上午8:00～12:00测量对比例1苹果枝条病斑长度，进行病情分级，计算病情指数，将鉴定结果列于下表2，枝条发病情况如图8。
表2枝条接种苹果资源抗火疫病的鉴定结果
由表2可知，枝条接种2周后，部分种质发病，病情指数在0～91.11之间,10个枝条病情分级变异系数在12.60％～137.88％，系数最高，说明枝条接种重复之间一致性较差。
叶片接种后72小时后，测量对比例2苹果叶片病斑长度，进行病情分级，计算病情指数，将鉴定结果列于下表3。叶片发病情况如图9。
表3叶片接种苹果资源抗火疫病的鉴定结果
由表3可知，叶片接种72小时后，所有种质均发病，病情指数在0～84.44之间，10个种质资源未有抗病资源，10个叶片病情分级的变异系数在21.67％～52.70％，系数较高，说明每份资源叶片发病情况一致性较差。
实施例1，对比例1和2三种方法之间抗病性结果存在差异，相对于叶片和枝条而言，重复小区接种的抗性明显较高，说明活体的抗性高于叶片和枝条，变异系数也低于叶片和枝条，说明小区实验的重复性优于叶片和枝条。另外叶片的接种，容易感染别的菌，对实验结果造成干扰；枝条的接种，由于时间较长，存在枯萎现象。因此三种方法，设计小区活体鉴定方法更准确，重复性好。
由以上实施例可知本发明提供的利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法，在活体状态下进行鉴定，可以在温室内周年进行，通过挑选生长势一致的嫁接苗和扩繁苗，避免了苹果生长过程中由于长势不一致造成的检测误差，提升了火疫病鉴定的准确性和科学性问题。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法，包括以下步骤：
对待鉴定的若干品种苹果个体进行扩繁，得扩繁苗；
待扩繁苗生长高度至48～52cm时，选择生长势一致的扩繁苗，分小区放置在鉴定池中，接种火疫病菌Erwiniaamy lovara，根据病情指数判断火疫病抗性；
每个小区内包含每个品种苹果的一株扩繁苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苹果的品种包括陇东海棠、八棱海棠、栾庄沙果、昭觉山荆子、西蜀海棠、沙金海棠、垂丝海棠、小金海棠、石洞彩苹1#和樱叶海棠中的一种或者多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小区的个数为≥1的正整数。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，同一小区中扩繁苗接种火疫病菌的时间相同。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种的方法包括针刺接种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩繁的方式包括嫁接，所述嫁接的方法包括芽接或者枝接。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述扩繁时，扩繁基质包括草炭土和土壤；所述草炭土和土壤的质量比为0.5～1：1～2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述扩繁苗高度不足48～52cm时，使所述扩繁苗继续在育苗地生长，待高度长至48～52cm，进行后续步骤，直至全部完成。
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