CN111587688A - 一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法 - Google Patents

一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法,涉及一种猕猴桃资源的离体保存繁育技术领域。本方法包括：A、接穗准备；B、砧木培育；C、无菌嫁接；D、嫁接体生根培养；E、嫁接苗移栽。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：①可周年进行，人为控制生长环境条件，为猕猴桃种质资源的及时保存繁育提供了新途径；②操作简单易行、成活率高、应用范围广，可保存多种作物育种材料。③水培萌芽进行接穗准备，方便快捷，节约时间，提高效率。④依赖砧木的优良适应性，目标猕猴桃保育株系的保种成活率可达95%以上。

Description

一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法
技术领域
本发明涉及资源的保存繁育技术领域，具体涉及一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法。
背景技术
猕猴桃[Actinidia chinensis Planch]是猕猴桃科，猕猴桃属大型落叶木质藤本植物。猕猴桃果实质地柔软，口感酸甜，营养丰富，是老年人、儿童、体弱多病者的滋补果品，被誉为“水果之王”。它含有丰富的维生素C、维生素A、维生素E以及钾、镁、纤维素，世界上消费量最大的前26种水果中，猕猴桃最为丰富全面。近年来，猕猴桃种质资源收集保存与育种研究都取得了突出性的进展，但新材料的保存困难影响着猕猴桃整个保育研究的顺利推进。在传统育种及组织培养过程中猕猴桃都存在相关育种中间材料保存难、生根难、成活率低，野外引种材料因其道地性而导致引种栽培成活率低，以及季节因素影响引种及特异猕猴桃材料的嫁接、扦插栽培成活率低等多种问题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，以快速有效的保存猕猴桃育种过程中获得的中间材料，也为猕猴桃引种工作提供有效的资源保育途径。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
具体地说，本方法包括下列步骤：
A、接穗准备：取待保存繁育的猕猴桃硬枝于室内水培，硬枝切取成长20-30cm的截段，硬枝形态学上端切口用石蜡密封，形态学下端5-8cm浸泡于装有含0.1%-0.2%多菌灵、30-50mg/L萘乙酸的水溶液敞口瓶中，2-3d更换一次水溶液，给予3500-4000Lux的光照，温度控制在18-25℃,7-15d萌芽，取萌发后生长3-5d的幼嫩腋芽于超净工作台上进行消毒处理，去掉嫩芽的叶片，切取长0.5-1.0cm的茎段接种于快繁培养基上培养，15-20d后茎段腋芽快繁出芽，并于基部再生出多个芽，45d为一个继代周期，长势一致的组培苗经过壮苗培养即可成为接穗；
B、砧木培育：室内保育的优良砧木离体材料经过壮苗培养，选取主茎高度达2-4cm，茎杆直径0.1-0.4 cm的健壮幼苗即可用于嫁接；
C、无菌嫁接：将砧木主茎从试管内取出，超净工作台上置于无菌滤纸上去掉顶端，切取成单个含1-2个腋芽、长1.5-2.5cm的茎段，去掉茎段上叶片，套上塑料软管，拉滑至形态学下端，形态学上端切口中央向下横切一刀，深0.5-0.8cm；同时取出接穗主茎，同样切取成单个含2-3个腋芽、长度为0.5-1.5cm的茎段，去掉形态学下端基部1-2片叶，并削成楔形，迅速插入砧木横切口中，保证二者一端的形成层对齐，再轻轻拉上塑料软管至嫁接口处固定即完成嫁接操作；
D、嫁接体生根培养：处理好的嫁接材料夹取砧木基部插入生根培养基进行生根诱导；
E、嫁接苗移栽：嫁接处理7d后，接穗腋芽开始萌动，有萌发迹象，7-12d，砧木基部再生形成肉眼可见根生长点，25-30d接穗腋芽萌发伸展，肉眼可见嫁接口愈合良好，愈合处膨大，砧木基部生根良好，取出嫁接苗，洗净根部培养基，蘸取1%的多菌灵溶液5-10s，而后移栽到育苗营养钵中，移栽后管理按照常规组培苗的移栽管理操作进行。
本发明的创新之处在于提供了一种猕猴桃资源的离体保存方法。猕猴桃育种过程中获得的突变株、杂种胚抢救、体细胞再生植株、茎尖培养植株等无菌苗直接定植成活率低、生根难，野外猕猴桃引种材料的道地性、引种栽培成活率低，季节因素影响引种及特异猕猴桃材料的嫁接、扦插栽培成活率，本离体保存繁育方法可解决这些问题。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：
①可周年进行，人为控制生长环境条件，为猕猴桃种质资源的及时保存繁育提供了新途径；
②操作简单易行、成活率高、应用范围广，可保存多种作物育种材料。
③水培萌芽进行接穗准备，方便快捷，节约时间，提高效率。
④依赖砧木的优良适应性，目标猕猴桃保育株系的保种成活率可达到95%以上。
具体实施方式
一、方法
1、步骤A中的培养条件
待保育接穗的准备，其无菌体系建立所用培养基MS + TDZ 1.0-3.0 mg/L + NAA 0.1-1.0mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0，培养条件为8h/d光照，光照强度2500-3000lux，温度22-26℃。壮苗培养用配方为MS + TDZ0.2-0.8 mg/L + NAA 0.01-0.05 mg/L+ 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0培养条件为10-12h/d光照，光照强度3000-3500lux，温度22-26℃。
2、步骤B中的培养条件
砧木的培育，其无菌体系建立所用培养基MS + 6-BA 1.0-3.0 mg/L +IBA1.0-3.0mg/L+ 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，继代培养用配方为MS +6-BA 0.1-1.0 mg/L + IABA 0.01-0.2mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0。培养条件为12h/d光照，光照强度3000-3500lux，温度22-26℃。
3、步骤C中的塑料软管
塑料软管使用前需经121℃灭菌20分钟后晾干备用。
4、步骤D中的培养条件
嫁接体的生根培养，其培养基选用1/2MS + IBA 0.1 -0.8mg/L + 30%蔗糖 + 1.2%琼脂，培养条件为8h/d光照，光照强度2500-3500lux，温度22-26℃。
5、步骤E中驯化室
驯化室为智能温室。
二、实施例
本方法包括下列步骤：
A、接穗准备：取待保存繁育的猕猴桃资源的硬枝于室内水培，硬枝切取成长20-30cm的截段，硬枝形态学上端切口用石蜡密封，形态学下端5-8cm浸泡于装有含0.1%-0.2%多菌灵、30-50mg/L萘乙酸的水溶液敞口瓶中，2-3d更换一次水溶液，给予3500-4000Lux的光照，温度控制在18-25℃,7-15d萌芽，取萌发后生长3-5d的幼嫩腋芽于超净工作台上进行消毒处理后，去掉嫩芽的叶片，切取长0.5-1.0cm的茎段接种于快繁培养基上进行初代培养，无菌体系建立所用培养基MS + TDZ 1.0-3.0 mg/L + NAA 0.1 -1.0 mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8%琼脂，pH5.5-6.0。15-20d后茎段腋芽快繁出芽，并于基部再生出多个芽，45d为一个继代周期。继代2-3个周期选取长势一致的组培苗经过壮苗培养即可做为接穗，壮苗培养用配方为MS + TDZ 0.2-0.8 mg/L + NAA 0.01-0.05 mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0。接穗离体培养条件为8h/d光照，光照强度2500-3500lux，温度22-26℃；
B、砧木培育：实验室筛选的优良砧木经过离体保存，选取主茎高度达2-4cm，茎杆直径0.1-0.4 cm的健壮幼苗即可用于嫁接。砧木培育其无菌体系建立所用培养基MS + ZT 1.0-3.0 mg/L + IAA 1.0-3.0 mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，继代培养用配方为MS +ZT0.2-1.0 mg/L + IAA 0.02-0.2 mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0。培养条件为12h/d光照，光照强度3000-3500lux，温度22-26℃；
C、无菌嫁接：将砧木主茎从试管内取出，超净工作台上置于无菌滤纸上去掉顶端，切取成单个含1-2个腋芽、长1.5-2.5cm的茎段，去掉茎段上叶片，套上经121℃灭菌20min的塑料软管，拉滑至形态学下端，砧木茎段形态学上端切口中央向下横切一刀，深0.5-0.8cm；同时取出接穗主茎，同样切取成单个含2-3个腋芽、长0.5-1.5cm长的茎段，去掉形态学下端基部1-2片叶，并削成楔形，迅速插入砧木横切口中，保证二者一端的形成层对齐，再轻轻拉上塑料软管至嫁接口处即完成嫁接操作；
D、嫁接体生根培养：完成嫁接操作的嫁接材料夹取砧木基部插入砧木生根培养基进行生根诱导获得完整的植株，生根培养基为1/2MS + IBA 0.1 -0.8 mg/L + 30% 蔗糖 +1.2% 琼脂，培养条件为8h/d光照，光照强度2500-3500lux，温度22-26℃；
E、嫁接苗移栽：嫁接处理7d后，接穗腋芽开始萌动，有萌发迹象，9d后，砧木基部再生形成肉眼可见根生长点，27d接穗腋芽萌发伸展，肉眼可见嫁接口愈合良好，愈合处膨大，砧木基部生根良好，取出嫁接苗，洗净根部培养基，蘸取1%的多菌灵溶液10s，而后移栽到育苗营养钵中，移栽后管理按照常规组培苗的移栽管理操作进行，移栽成活率达96%。

Claims (6)

1.一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，其特征在于包括下列步骤：
A、接穗准备：取待保存繁育的猕猴桃硬枝于室内水培，硬枝切取成长20-30cm的截段，硬枝形态学上端切口用石蜡密封，形态学下端5-8cm浸泡于装有含0.1%-0.2%多菌灵、30-50mg/L萘乙酸的水溶液敞口瓶中，2-3d更换一次水溶液，给予3500-4000Lux的光照，温度控制在18-25℃,7-15d萌芽，取萌发后生长3-5d的幼嫩腋芽于超净工作台上进行消毒处理，去掉嫩芽的叶片，切取长0.5-1.0cm的茎段接种于快繁培养基上培养，15-20d后茎段腋芽快繁出芽，并于基部再生出多个芽，45d为一个继代周期，长势一致的组培苗经过壮苗培养即可成为接穗；
B、砧木培育：室内保育的优良砧木离体材料经过壮苗培养，选取主茎高度达2-4cm，茎杆直径0.1-0.4 cm的健壮幼苗即可用于嫁接；
C、无菌嫁接：将砧木主茎从试管内取出，超净工作台上置于无菌滤纸上去掉顶端，切取成单个含1-2个腋芽、长1.5-2.5cm的茎段，去掉茎段上叶片，套上塑料软管，拉滑至形态学下端，形态学上端切口中央向下横切一刀，深0.5-0.8cm；同时取出接穗主茎，同样切取成单个含2-3个腋芽、长度为0.5-1.5cm的茎段，去掉形态学下端基部1-2片叶，并削成楔形，迅速插入砧木横切口中，保证二者一端的形成层对齐，再轻轻拉上塑料软管至嫁接口处固定即完成嫁接操作；
D、嫁接体生根培养：处理好的嫁接材料夹取砧木基部插入生根培养基进行生根诱导；
E、嫁接苗移栽：嫁接处理7d后，接穗腋芽开始萌动，有萌发迹象，7-12d，砧木基部再生形成肉眼可见根生长点，25-30d接穗腋芽萌发伸展，肉眼可见嫁接口愈合良好，愈合处膨大，砧木基部生根良好，取出嫁接苗，洗净根部培养基，蘸取1%的多菌灵溶液5-10s，而后移栽到育苗营养钵中，移栽后管理按照常规组培苗的移栽管理操作进行。
2.按权利要求1所述的一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，其特征在于 所述步骤A中的接穗准备：
其无菌体系建立所用培养基MS + TDZ 1.0-3.0 mg/L + NAA 0.1 -1.0mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0，培养条件为8h/d光照，光照强度2500-3000lux，温度22-26℃，壮苗培养用配方为MS + TDZ0.2-0.8 mg/L + NAA 0.01-0.05 mg/L + 30% 蔗糖 + 0.8%琼脂，pH5.5-6.0培养条件为10-12h/d光照，光照强度3000-3500lux，温度22-26℃。
3.按权利要求1所述的一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，其特征在于 所述步骤B中的砧木培育：
其无菌体系建立所用培养基MS + 6-BA 1.0-3.0 mg/L +IBA1.0-3.0mg/L + 30% 蔗糖+ 0.8% 琼脂，继代培养用配方为MS +6-BA 0.1-1.0 mg/L + IABA 0.01-0.2 mg/L + 30%蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.5-6.0，培养条件为12h/d光照，光照强度3000-3500lux，温度22-26℃。
4.按权利要求1所述的一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，其特征在于所述步骤C中的塑料软管：
所述塑料软管使用前需经121℃灭菌20分钟后晾干备用。
5.按权利要求1所述的一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，其特征在于 所述步骤D中嫁接体生根培养：
所述砧木生根培养基选用1/2MS + IBA 0.1 -0.8mg/L + 30% 蔗糖 + 1.2% 琼脂，培养条件为8h/d光照，光照强度2500-3500lux，温度22-26℃。
6.如权利要求1所述的一种猕猴桃资源的离体保存繁育方法，其特征在于
所述步骤E中的驯化室：
为智能温室。
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