CN110042143A - 一种离体枝条接种对梨火疫病抗病性快速鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物保护技术领域，具体公开了一种离体枝条接种对梨火疫病抗病性快速鉴定的方法，其方法包括如下步骤：(1)梨火疫病菌接种液的制备；(2)离体枝条制备；(3)接种；(4)品种抗病性评价。本发明提供的对梨火疫病抗病性的鉴定和评价方法，将发病症状和分子生物学技术定量病原相结合，不仅快速简便、规范实用，结果准确可靠，适合于对大批量材料进行抗并行的快速鉴定和筛选。

Description

一种离体枝条接种对梨火疫病抗病性快速鉴定的方法
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，具体的说，本发明涉及一种离体枝条接种对梨火疫病抗病性快速鉴定的方法。
背景技术
梨火疫病是蔷薇科仁果类果树上的一种毁灭性病害，是我国一类进境植物检疫危险性有害生物，危害40余属的220多种植物，其中最感病的寄主是梨、苹果、山楂等。梨火疫病菌（Erwinia amylovora）侵染花、叶及新梢、枝干及果实，病害流行严重时从花器、嫩梢很快扩展到枝条、主干，直至根部，导致果树几周内死亡，果园被毁，经济损失惨重。梨火疫病现已在世界上60多个国家都有发生，目前国内还没有梨火疫病的发生，但相邻的日本、韩国、哈萨克斯坦等国家已经有梨火疫病的分布，随着世界贸易的日益增长，梨火疫病的人为和自然传播已对中国的果品生产和进出境贸易构成了潜在威胁。“梨火疫病”作为世界上最早发现的植物细菌病害，国外开展了大量研究。对“梨火疫病”防治技术包括加强检疫、修剪和铲除发病植株、药剂防治、抗病品种、生物防治及利用基因工程技术提高果树抗病性等措施。该病害寄主范围广、传播途径多、传染性强，至今无特效药剂和单一的防控措施，仍然未得到有效的控制。世界各地苹果和梨的商业化生产集中种植，品种单一，缺乏抗病性品种也是病害难以控制的重要原因之一，至今依然是梨、苹果产区主要关注的问题。
国外大量的研究表明，筛选出抗病的砧木、接穗，培育出优良的抗病品种在生产中栽培推广是对梨火疫病最经济、有效的防控措施。美国研究表明，在东方梨中有品种对梨火疫病具有抗病性，并已经培育出抗梨火疫病的新品种雪兰多梨；德国筛选出2个抗病的梨属变种。梨、苹果在中国大面积分布，明确我国种植的梨、苹果等蔷薇科果树对梨火疫病的抗病性水平，掌握种质资源抗病性信息，对于抗梨火疫病品种选育及果树生产的可持续发展具有重要意义。因此，建立一套快速简便、规范准确、实用性强的抗病性鉴定技术是抗病育种的关键。
目前测定寄主植物对梨火疫病菌抗病性的方法各异，主要采用果园病圃、果园自然感病和对果园苗木、盆栽幼苗、组培无菌苗、离体枝条、花器和幼果进行人工接种病原菌等方法。果园病圃、果园自然感病鉴定周期长、占地多、鉴定材料数量有限；病圃和果园的自然病原分布不均，还受到气候和传播媒介等各种环境因素的影响，难以获得准确、稳定的测定结果。尤其是该病害为重大检疫性病害，无法在非疫区无隔离的果园开展寄主抗病性鉴定试验。采用人工接种测定寄主抗病性的方法快速简便、鉴定材料数量不受限制，且在隔离的条件下，环境条件可控，适应大量筛选抗源材料的需要。现有的对果园苗木、盆栽幼苗、组培无菌苗、离体枝条、花器和幼果进行人工接种病原菌的方法，各具有不同的缺陷，评价寄主抗病水平的指标也不尽相同。大多方法都是采用统计发病枝条数占接种总枝条数的百分比（发病率%）、发病枝条病斑长度占接种枝条长度的比例对寄主抗/感病性进行分级，缺乏对病原菌在不同寄主内的增殖数量来定量反应寄主的抗性差异。梨幼果接种法是梨火疫病抗病性测定最经典的方法，目前仍在广泛使用。通过针刺在果肉切面上接种病原菌，依据接种后目测在梨幼果半果果肉表面菌脓的产生时间和产生量表示梨果实的抗病力。该法难以对发病状况进行量化统计，不能准确对其抗病性进行评级。至今现有的各种方法对不同寄主对梨火疫病菌的抗病性测定没有统一、明确的评价方法。
本发明以不同梨、苹果品种（种质）当年生幼嫩的离体枝条扦插水培，接种强致病力的病原菌株，通过比较病原菌接种后不同梨、苹果品种的枝条发病率、病情指数，结合实时荧光PCR定量检测病原菌在寄主内的数量，制定抗病性评价指标，综合、准确评估供试寄主材料的抗病性水平。
发明内容
本发明目的在于提供一套简易、高效、鉴定结果准确的测定梨、苹果等果树对梨火疫病菌抗病性鉴定的方法，为抗病种质资源和育种材料的筛选、评价，提高果树的抗病育种效率。
为实现上述目的，本发明提供了一种离体枝条接种对梨火疫病抗病性快速鉴定的方法，具体步骤包括：
1.梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌经过致病力测定为强致病力的菌株接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液利用灭菌水稀释至108作为接种液。
2.离体枝条制备：选择待测样品的当年生幼嫩枝条作为供试材料，将供试枝条截至50cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl无菌盐水的三角瓶中水培。
3.接种：用灭菌手术刀在枝条3-4片叶的叶腋处切开一个约5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的梨火疫病原菌接种液滴在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴在伤口部位，再用保鲜膜包裹，每个待测梨或苹果品种（种质）接种30个离体枝条，以无菌水代替菌液作为对照。
4.品种抗病性评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，12h光照条件的人工气候箱（室）中培养，枝条接种后每天观察发病情况，接种10d后对接种枝条进行病情调查，计算发病率和病情指数，同时结合接种枝条病原菌荧光定量PCR检测结果，根据梨火疫病抗病性等级划分标准，综合评估供试品种的抗病水平。
5.根据本发明具体实施方式的梨火疫病品种抗病性评价方法，其中所述的接种枝条病情调查分级标准为：0级，枝条无病斑，叶片正常；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1%～5%，叶片变黑褐色，不脱落；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的5.1%~15%，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的15.1%~30%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅶ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的30.1%~50%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅸ级，枝条病斑长度占接种枝条长度＞50.1%，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
6.根据本发明具体实施方式的梨火疫病菌抗病性评价方法，其中所述的发病率及病情指数计算方法如下：发病率（%）=（发病枝条数/接种枝条数）×100%；病情指数（DI）=[∑（各级病株数×相应病级）/接种总株数×最高病级]×100。
7.根据本发明具体实施方式的梨火疫病菌抗病性评价方法，其中所述的接种枝条梨火疫病菌定量PCR检测方法如下：将接种枝条经表面消毒后，截取接种口发病部位上下各1cm组织剪碎，浸泡于5 mL 0.5% NaCl溶液中过夜，吸取1mL菌悬液采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取浸提液中细菌DNA作为PCR模板，利用Erwinia amylovora特异性引物对P29TF：5’-CACTGATGGTGCCGTTG-3’，P29TR：5’-CGCCAGGATAGTCGCATA-3’进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR检测体系为25µL：TB Green Premix DimerEraser为12.5µL，10 µmol/L的上下游引物各0.5µL，ROX 0.5µL，DNA模板1µL，补足灭菌ddH2O至25µL；荧光定量PCR检测反应程序为：95 ℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃收集荧光；反应结束后，利用分析软件，设置基线和阈值，获取检测样品的Ct值。
8.根据本发明的具体实施方式的梨火疫病菌抗病性评价方法，将抗病性等级分为高抗（HR）、抗病（R）、耐病（T）、中感（MS）、感病（S）和高感（HS）。其划分标准为：高抗（HR）：发病率<5%，病情指数0～5，Ct值>35；抗病（R）：发病率5.1%～15%，病情指数5.1～15，Ct值33～35；耐病（T）：发病率15.1%～40%，病情指数15.1～30，Ct值29～33；中感（MS）：发病率40.1%～75%，病情指数30.1～60，Ct值27～29；感病（S）：发病率75.1%～90%，病情指数60.1～80，Ct值25～27；高感（HS）：发病率≥90.1%，病情指数>80.1，Ct＜25。
本项发明与现有技术相比，其优势在于：
1.本发明的梨火疫病抗病性鉴定采用在梨或苹果等果树的当年生幼嫩离体枝条上，伤口法接种梨火疫病菌强致病力菌株的菌液，培养于人工气候箱（室）中观察发病情况。伤口大小一致、接种量一致，接种后发病迅速、均匀、症状显著，鉴定结果稳定性好，重复性、可靠性得到保证。
2.本发明的梨火疫病抗病性鉴定分级标准规范、明确。本发明比较不同材料接种病原菌后的枝条发病率、病情指数，结合实时荧光PCR定量检测病原菌数量，制定综合的鉴定寄主材料的抗病性评价指标。将接种材料发病率、发病程度，与实时荧光PCR定量检测病原菌在植物组织内的存在数量相结合，对鉴定寄主材料的抗病性等级进行科学、精确的划分。
3.本发明的梨火疫病抗病性鉴定方法，操作方法简单，方便快捷，获得鉴定结果只需12-15d；并且不受季节限制，可在实验室周年进行。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
本发明供试梨火疫病病菌（Erwinia amylovora）菌株均由新疆出入境检验检疫局技术中心提供。具体信息见表1。
表1 供试E.amylovora菌株信息
实施例1梨火疫病菌不同菌株致病力测定
1.梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌株E.a 0001、E.a 0017、E.a 0019、E.a0033、E.a0032接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液利用灭菌水稀释至108作为接种液。
2.离体枝条制备：选择梨火疫病高感病品种香梨的当年新生枝条作为供试枝条，将供试枝条截至50cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl无菌盐水的三角瓶中。
3.接种：用灭菌手术刀在枝条3~4片叶的叶腋处切开一个约5 mm的伤口，取一小块约2cm2灭菌脱脂棉蘸取2mL的待测菌液贴在伤口部位，再用保鲜膜包裹。以无菌水代替菌液作为对照，每处理重复30个离体枝条。
4.接种结果观察与致病力评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，光照12h的人工气候箱中培养。枝条接种后每天连续观察发病情况，接种10d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数，判断致病力类型。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价方法，其中，接种枝条病情调查分级标准为：0级，枝条无病斑，叶片正常；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1%～5%，叶片变黑褐色，不脱落；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的5.1%~15%，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的15.1%~30%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅶ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的30.1%~50%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅸ级，枝条病斑长度占接种枝条长度＞50.1%，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价方法，其中，病情指数计算方法如下：病情指数（DI）＝ [∑（各级病株数×相应病级)/接种总株数×最高病级]×100。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价方法，其中，发病率计算方法如下：发病率（%）=（发病株数/接种总株数）×100％。
本实施例所述的接种结果观察与致病力评价方法，其中，待测菌株的致病力类型分为强致病力，较强致病力，中致病力，弱致病力，其划分标准为，强致病力：DI≧70；较强致病力：DI，36～69；中度致病力：DI，16～35，弱致病力：DI，1～15。
5.结果分析：将5株地理来源不同，分离寄主不同的梨火疫病菌株接种于高度感病的品种库尔勒香梨枝条上，均引起发病症状。统计发病枝条数量、测量枝条病斑长度统计发病枝条数、测量枝条病斑长度，计算发病率、病情指数。结果表明，5个E. amylovora菌株对库尔勒香梨均有致病力，不同菌株的致病力存在差异。E.a 0001（DI=91.85）、E.a 0017（DI=91.11）为强致病力菌株。E.a 0019、E.a 0033、E.a 0032属于较强致病力菌株。致病力小依次为E.a 0001＞E.a 00017＞E.a 0032＞E.a 0033＞E.a 0019。
实施例2不同梨品种（种质）离体枝条接种E. amylovora 的抗病等级划分
1.梨火疫病菌接种液的制备：依据实施例1的测定结果，将E.a 0001菌株确定为强致病力菌株，以该菌株作为抗病性测定的供试菌株。将梨火疫病菌株E.a 0001接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液利用灭菌水稀释至108作为接种液。
2.离体枝条制备：采集表2所列的21个供试梨品种（种质）的当年生幼嫩枝条为接种材料，将供试枝条截至50cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3.接种：用灭菌手术刀在枝条3~4片叶的叶腋处切开一个约5mm的伤口，取一小块约2cm2灭菌脱脂棉蘸取2mL的待测菌液贴在伤口部位，再用保鲜膜包裹。以无菌水代替菌液作为对照，每处理重复30个离体枝条。
4.接种枝条发病观察和发病等级统计：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，12h光照的人工气候箱中培养，枝条接种后每天观察发病情况，接种10d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数、发病率。接种枝条病情调查分级标准，发病率、病情指数计算方法同实施例1。
5.接种枝条中梨火疫病菌的定量PCR检测：将接种枝条经表面消毒后，截取接种口发病部位上下各1cm组织剪碎，浸泡于5 mL 0.5% NaCl溶液中过夜，吸取1mL菌悬液采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取浸提液中细菌DNA作为PCR模板，利用Erwinia amylovora特异性引物对P29TF：5’-CACTGATGGTGCCGTTG-3’，P29TR：5’-CGCCAGGATAGTCGCATA-3’进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR检测体系为25µL：TB Green Premix DimerEraser为12.5µL，10 µmol/L的上下游引物各0.5µL，ROX 0.5µL， DNA模板1µL，补足灭菌ddH2O至25µL；荧光定量PCR检测反应程序为：95 ℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃收集荧光；反应结束后，利用分析软件，设置基线和阈值，获取检测样品的Ct值。
6.梨火疫病抗病性评价：将抗病性等级分为高抗（HR）、抗病（R）、耐病（T）、中感（MS）、感病（S）和高感（HS）。其划分标准为：高抗（HR）：发病率<5%，病情指数0～5，Ct值>35；抗病（R）：发病率5.1%～15%，病情指数5.1～15，Ct值33～35；耐病（T）：发病率15.1%～40%，病情指数15.1～30，Ct值29～33；中感（MS）：发病率40.1%～75%，病情指数30.1～60，Ct值27～29；感病（S）：发病率75.1%～90%，病情指数60.1～80，Ct值25～27；高感（HS）：发病率≥90.1%，病情指数>80.1，Ct＜25。
7.结果与分析：接种结果表明，21个供试梨品种（种质）接种E. a 0001菌株后均不同程度发病，统计发病枝条数、测量枝条病斑长度，计算发病率、病情指数，将结果列于表2。结果表明接种枝条的发病率为15%～100%，病情指数在5.00～91.11之间。供试的21个梨品种（种质）间的抗病性有显著差异。其中未发现高抗品种，抗病品种为晋酥、绿梨，耐病品种为棉梨、霍城冬黄梨、八月酥、库车阿木特，中感品种为黄酸梨、红安久、金川雪、褐色句句梨，感病品种为雪花、棋盘梨、红香酥、早酥、红香梨、杜梨、新梨7号，高感品种为香梨、砀山梨、黑酸梨、金花梨。
表2 不同梨品种（种质）对梨火疫病菌的抗性鉴定结果
实施例3 不同苹果品种（种质）离体枝条接种E. amylovora 的抗病等级划分
1. 梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌株E.a 0001接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液利用灭菌水稀释至108作为接种液。
2. 离体枝条制备：采集表3所列的19个供试苹果品种（种质）的当年生幼嫩枝条为接种材料，将供试枝条截至50cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl灭菌盐水的三角瓶中。
3. 接种：用灭菌手术刀在枝条3~4片叶的叶腋处切开一个约5mm 的伤口，取一小块约2cm2灭菌脱脂棉蘸取2mL的待测菌液贴在伤口部位，再用保鲜膜包裹。以无菌水代替菌液作为对照，每处理重复30个离体枝条。
4.接种枝条发病观察和发病等级统计：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，12h光照的人工气候箱中培养，枝条接种后每天观察发病情况，接种10d后对接种枝条进行病情调查，计算病情指数、发病率。接种枝条病情调查分级标准，发病率、病情指数计算方法同实施例1。
5. 接种枝条中梨火疫病菌的定量PCR检测：将接种枝条经表面消毒后，截取接种口发病部位上下各1cm组织剪碎，浸泡于5 mL 0.5% NaCl溶液中过夜，吸取1mL菌悬液采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取浸提液中细菌DNA作为PCR模板，利用Erwinia amylovora特异性引物对P29TF：5’-CACTGATGGTGCCGTTG-3’，P29TR：5’-CGCCAGGATAGTCGCATA-3’进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR检测体系为25µL：TB Green Premix DimerEraser为12.5µL，10 µmol/L的上下游引物各0.5µL，ROX 0.5µL， DNA模板1µL，补足灭菌ddH2O至25µL；荧光定量PCR检测反应程序为：95 ℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃收集荧光；反应结束后，利用分析软件，设置基线和阈值，获取检测样品的Ct值。
6. 梨火疫病抗病性评价：将抗病性等级分为高抗（HR）、抗病（R）、耐病（T）、中感（MS）、感病（S）和高感（HS）。其划分标准为：高抗（HR）：发病率<5%，病情指数0～5，Ct值>35；抗病（R）：发病率5.1%～15%，病情指数5.1～15，Ct值33～35；耐病（T）：发病率15.1%～40%，病情指数15.1～30，Ct值29～33；中感（MS）：发病率40.1%～75%，病情指数30.1～60，Ct值27～29；感病（S）：发病率75.1%～90%，病情指数60.1～80，Ct值25～27；高感（HS）：发病率≥90.1%，病情指数>80.1，Ct＜25。
7. 结果与分析：接种结果表明，19个供试苹果品种（种质）接种E.a0001菌株后均不同程度发病，统计发病枝条数、测量枝条病斑长度，计算发病率、病情指数，将结果列于表3。结果表明接种枝条的发病率为0～75%，病情指数在0～63.52之间。供试的19个供试苹果品种（种质）间的抗病性有显著差异。其中未发现高感品种，感病品种为顶红，中感品种为大红海棠、嘎啦、香蕉黄、乔纳金、红肉果、塔尔阿尔玛、克孜阿尔玛、北海道王、桑归奇阿尔玛，耐病品种为冬白果、白海棠、美国8号，抗病品种为北斗红将军、秋富，高抗品种为金富、野苹果15号、夏红肉、短枝新红星。
表3 不同苹果品种（种质）对梨火疫病菌的抗性鉴定结果
实施例4：本发明的抗病性鉴定结果与文献中果园抗病性鉴定结果的比较
在梨火疫病专著《Fire Blight-A BACTERIAL DISEASE OF ROSACEOUS PLANTS》（UNITED STATES OF DEPARTMENT OF AGRICULTURE, U.S. Government Printing Office）中，采用果园自然发病法将梨、苹果等果树的品种抗病性分为4类（见表4）：高抗，中抗，感病，易感，并对世界各地400个品种（种质）的抗病性进行了评价。
将本实施例2和实施例3中部分品种的抗病性测定结果与该文献中的抗病性评价比较，表5可见，本研究供试的3个梨品种，2个苹果品种抗病性等级与文献中的果园自然发病法的评价结果基本一致，证明本发明提供的鉴定方法能够快速、准确地鉴定梨火疫病的抗病品种和感病品种。
表4 果园自然发病法划分品种抗病性
表5 离体枝条接种与果园自然感病法抗病性鉴定结果比较

Claims (5)

1.一种离体枝条接种对梨火疫病抗病性快速鉴定的方法，其特征在于通过以下步骤实现：
（1）梨火疫病菌接种液的制备：将梨火疫病菌经过致病力测定为强致病力的菌株接种于NA+5%蔗糖培养基上，28.5℃培养48h活化，挑取单菌落接种于NA+5%蔗糖培养液中，28.5℃、160 rpm/min振荡培养12h，测定OD600值为1.2左右的菌液利用灭菌水稀释至108作为接种液；
（2）离体枝条制备：选择待测样品的当年生幼嫩枝条作为供试材料，将供试枝条截至50cm左右的茎段，用75%酒精消毒后，将其1/3插入装有0.5‰NaCl无菌盐水的三角瓶中水培；
（3）接种：用灭菌手术刀在枝条3-4片叶的叶腋处切开一个约5mm2的伤口，用移液枪吸取2mL的梨火疫病原菌接种液滴在一块约2cm2灭菌脱脂棉片上，将棉片贴在伤口部位，再用保鲜膜包裹，每个待测梨或苹果品种（种质）接种30个离体枝条，以无菌水代替菌液作为对照；
（4）品种抗病性评价：将接种后的离体枝条置于相对湿度75%，温度28.5℃，12h光照条件的人工气候箱（室）中培养，枝条接种后每天观察发病情况，接种10d后对接种枝条进行病情调查，计算发病率和病情指数，同时结合接种枝条病原菌荧光定量PCR检测结果，根据梨火疫病抗病性等级划分标准，综合评估供试品种的抗病水平。
2.如权利要求1所述的梨火疫病品种抗病性评价方法，其特征在于，所述的接种枝条病情调查分级标准为：0级，枝条无病斑，叶片正常；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1%~5%，叶片变黑褐色，不脱落；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的5.1%~15%，叶片变黑褐色，个别叶片脱落；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的15.1%~30%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅶ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的30.1%~50%，叶片变黑褐色，约三分之一叶片脱落；Ⅸ级，枝条病斑长度占接种枝条长度＞50.1%，叶片变黑褐色，二分之一及以上叶片脱落。
3.如权利要求1所述的梨火疫病品种抗病性评价方法，其特征在于，所述的发病率及病情指数计算方法如下：发病率（%）=（发病枝条数/接种枝条数）×100%；病情指数=[∑（各级病株数×相应病级）/接种总株数×最高病级]×100。
4.如权利要求1所述的梨火疫病品种抗病性评价方法，其特征在于，所述的梨火疫病菌定量PCR检测方法如下：将接种枝条经表面消毒后，截取接种口发病部位上下各1cm组织剪碎，浸泡于5 mL 0.5% NaCl溶液中过夜，吸取1mL菌悬液采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取浸提液中细菌DNA作为PCR模板，利用Erwinia amylovora特异性引物对P29TF：5’-CACTGATGGTGCCGTTG-3’，P29TR：5’-CGCCAGGATAGTCGCATA-3’进行实时荧光定量PCR检测；实时荧光定量PCR检测体系为25µL：TB Green Premix DimerEraser为12.5µL，10 µmol/L的上下游引物各0.5µL，ROX 0.5µL，DNA模板1µL，补足灭菌ddH2O至25µL；荧光定量PCR检测反应程序为：95 ℃预变性30s；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃收集荧光；反应结束后，利用分析软件，设置基线和阈值，获取检测样品的Ct值。
5.如权利要求1所述的梨火疫病品种抗病性评价方法，其特征在于，所述的梨火疫病抗病性等级划分标准将抗病性等级分为高抗、抗病、耐病、中感、感病和高感；其划分标准为：高抗：发病率<5%，病情指数0～5，Ct值>35；抗病：发病率5.1%～15%，病情指数5.1～15，Ct值33～35；耐病：发病率15.1%～40%，病情指数15.1～30，Ct值29～33；中感：发病率40.1%～75%，病情指数30.1～60，Ct值27～29；感病：发病率75.1%～90%，病情指数60.1～80，Ct值25～27；高感：发病率≥90.1%，病情指数>80.1，Ct＜25。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471741A (zh) * 2020-06-10 2020-07-31 南京农业大学 一种快速鉴定梨树轮纹病抗性的方法
CN113767805A (zh) * 2021-08-27 2021-12-10 中国农业科学院果树研究所 一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法
CN114009326A (zh) * 2021-11-05 2022-02-08 河北省农林科学院滨海农业研究所 一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. PAPRSTEIN等: "testing of resistance to Erwinia amylovora in an in vitro culture assay", 《ACTA HORTICULTURAE》 *
H. SALM等: "Real-time PCR for detection and quantification of Erwinia amylovora, the causal agent of fireblight", 《PLANT PATHOLOGY》 *
J. KORBA等: "resistance of apple varieties and selections to Erwinia amylovora in the Czech Republic", 《PLANT PROTECT. SCI.》 *
刘华威等: "梨种质对梨火疫病的抗性研究", 《植物遗传资源学报》 *
张乐等: "用离体巴梨枝条测定梨火疫病菌的致病性", 《植物检疫》 *
李洪涛等: "我国20个梨品种（种质）对国外梨火疫病菌的抗病性评价", 《果树学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471741A (zh) * 2020-06-10 2020-07-31 南京农业大学 一种快速鉴定梨树轮纹病抗性的方法
CN113767805A (zh) * 2021-08-27 2021-12-10 中国农业科学院果树研究所 一种利用田间小区鉴定苹果火疫病抗性的方法
CN114009326A (zh) * 2021-11-05 2022-02-08 河北省农林科学院滨海农业研究所 一种植物离体水培耐盐性快速鉴定的方法

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