CN109777812A - 十字花科显性无花瓣基因及其显性无花瓣种质的创制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及植物花瓣表型的调控基因领域及其应用。具体地，本发明公开了十字花科植物显性无花瓣突变基因的产生方法、使得十字花科植物显著减小或花瓣缺失的方法，以及十字花科植物显性无花瓣基因在产生显性无花瓣表型种质材料中的应用。

Description

十字花科显性无花瓣基因及其显性无花瓣种质的创制方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及植物花瓣表型的调控基因领域及其应用。具体地，本发明公开了十字花科植物的显性无花瓣基因和显性无花瓣突变种质的产生方法、及其在创制植物显性无花瓣种质材料中的应用。

背景技术

十字花科植物的花瓣是菌核病传播的重要媒介，因此，无花瓣种质的获得，对于培育无花瓣品种具有十分重要的意义。

例如，对于油菜，已有的研究表明，油菜花瓣性状受2-4对基因控制，其中2 对主效基因，1-2对微效基因。张彦锋等(2011)研究发现，隐性无花瓣油菜的表型是由于3对AP3基因功能缺失引起的，其中2对B.AP3.a基因为主效基因，而 B.AP3.b基因为冗余基因。B.AP3.a基因调控花瓣、雄蕊的正常发育，对B.AP3.b 基因具有上位效应。当2对B.AP3.a和1对B.AP3.b基因功能缺失时，仅1对B.AP3.b 基因表达，调控雄蕊的正常发育，由此产生油菜无花瓣表型。拟南芥的花瓣也受1对AP3即AtAP3基因控制，AtAP3基因功能缺失引起花瓣萼片化、雄蕊心皮化同源异型突变。

目前油菜、拟南芥等十字花科植物或农作物的无花瓣材料均来自于自然突变，由于AP3基因功能缺失引起的无花瓣表型属于隐性遗传，用这种材料无法配制无花瓣杂交品种，因而，限制了该类型无花瓣材料的应用。

因此，挖掘显性无花瓣基因，对于创制无花瓣种质具有重要的作用。本申请发掘了一个十字花科显性无花瓣基因，创制了十字花科显性无花瓣材料，为十字花科植物无花瓣种质的创制提供了一种新方法。

发明内容

本申请的发明人惊讶地发现，当十字花科植物，例如油菜控制花瓣的主控基因BnAP3(CDS长度699bp，编码232个氨基酸)的第6个外显子(45bp核苷酸序列，编码15个氨基酸)部分或全部缺失，造成了它编码的转录因子K-Box 结构域的K3区段部分或全部缺失，产生了形成显性无花瓣表型的新功能。因此，可以用该基因来创制显性无花瓣油菜材料；类似地，删除拟南芥AtAP3的第6 个外显子转化拟南芥Col-0，转化植株雄蕊发育正常，但花瓣发生萼片化同源异型转变，且严重变小，该突变的无花瓣基因AtAP3-K产生的无花瓣表型也属于显性遗传。

因此，本发明首次涉及创制十字花科显性无花瓣表型基因的方法、创制的十字花科显性无花瓣基因以及该十字花科显性无花瓣基因在创制十字花科无花瓣显性种质中的应用。

在本发明的一个方面，本发明涉及创制十字花科显性无花瓣表型基因的方法。具体地，所述方法包括将野生十字花科植物的花瓣主效基因，例如油菜 (Brassica napus L)的BnAP3基因(核酸序列SEQ ID NO:1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因AtAP3(核酸序列SEQ ID NO:3)的第6个外显子完全或部分缺失。所述的第6个外显子的编码序列长度为约45bp，其编码15个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述的无花瓣性状显性基因为BnAP3-K，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示。在另一个实施方案中，所述的无花瓣性状显性基因为AtAP3-K，核酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的一个方面涉及产生十字花科无花瓣植物的表达载体，所述表达载体含有十字花科显性无花瓣表型基因。所述核酸构建体中十字花科显性无花瓣表型基因在宿主植物中的表达，使得植物的表型为无花瓣性状。在一个实施方案中，十字花科显性无花瓣表型基因为油菜BnAP3-K基因。在另一个实施方案中，所述十字花科显性无花瓣表型基因为拟南芥AtAP3-K基因。在一个方面中，在所述核酸构建体中十字花科显性无花瓣表型基因的启动子为35S启动子。所述核酸构建体选自载体质粒。在一个实施方案中，所述植物表达载体为Cam-35S-BnAP3-K。在另一个实施方案中，所述植物表达载体为 Cam-35S-AtAP3-K。

在本发明的另外一个方面，本发明涉及包含表达十字花科显性无花瓣表型基因的核酸构建体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是农杆菌细胞或植物细胞。在一个实施方案中，所述植物细胞是全能植物细胞或非全能植物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞包含的核酸构建体为植物表达载体 Cam-35S-BnAP3-K或Cam-35S-AtAP3-K。

在本发明的另外一个方面，本发明涉及十字花科植物无花瓣性状显性基因在创制无花瓣植物中的应用。在一个实施方案中，所述的植物为十字花科芸薹属植物：油菜、白菜、甘蓝、萝卜、芥菜。在另一个实施方案中，所述的植物为十字花科模式植物拟南芥。

在本发明的一个方面，本发明涉及一种使十字花科植物的花瓣显著变小或变为无花瓣的方法，其特征在于使所述十字花科植物的花瓣主效基因的第6个外显子的核酸序列部分或完全缺失。在本发明的一个实施方案中，所述十字花科植物为芸薹属植物油菜，所述花瓣主效基因的核酸序列为SEQ ID NO:1，其中所述第6个外显子的核酸序列为SEQ IDNO:5所示的序列。在本发明的一个进一步的实施方案中，所述十字花科植物为模式植物拟南芥，所述花瓣主效基因的核酸序列为SEQ ID NO:3，所述第6个外显子的核酸序列为SEQ IDNO:5所示的序列。

本发明的另一个方面涉及一种使花瓣变小或缺失的十字花科植物的显性花瓣主效基因，其特征在于与十字花科植物野生花瓣主效基因相比，其部分或完全缺失了所述十字花科植物的野生花瓣主效基因的第6个外显子的核酸序列。在一个实施方案中，所述第6个外显子的核酸序列为SEQ IDNO:5所示的序列。在另一个实施方案中，所述十字花科植物显性花瓣主效基因的核酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

本发明的又一个方面涉及本申请的十字花科植物显性花瓣主效基因在构建显性无花瓣植物种质资源中的用途。在一个实施方案中，所述显性无花瓣植物种质资源的创建是通过用含有所述显性花瓣主效基因的核酸构建体的农杆菌转化十字花科植物完成的。

附图说明

图1是油菜显性无花瓣植株和野生型油菜的花瓣对比图。该图证实了 BnAP3-K对转化的油菜植株花瓣表型的影响。图1A是野生型油菜植株K407的油菜植株花瓣表型图，作为阴性对照；图1B是转化了BnAP3-K的K407植株的图，图中该植物呈现典型的无花瓣表型。

图2是本发明的显性无花瓣性状基因AtAP3-K的相关序列的示意图，在图示意性显示了拟南芥花瓣野生型基因AtAP3、其cDNA序列以及显性无花瓣性状基因AtAP3-K核酸序列。

图3是显性无花瓣拟南芥植株和野生型拟南芥植株的花瓣对比图。该图证实了性状突变基因AtAP3-K的表达使得拟南芥植株的花瓣表型为无花瓣。图3A 是野生型拟南芥植株的花瓣表型的图，作为阴性对照，图3B是用含有正常AtAP3 基因的植物表达载体转化拟南芥Col-0其子代植株的花瓣表型的图，其显示花瓣为正常表型。图3C是含有显性无花瓣性状基因AtAP3-K的植物表达载体转化的拟南芥Col-0的子代植株的花瓣表型的图，该图显示花瓣显著变小，且呈现鲜明的萼片化特征。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例，说明本发明证实了十字花科植物控制花瓣的主效基因AP3缺失第6个外显子后能够使得十字花科植物，例如芸薹属植物，花瓣呈现典型的无花瓣表型，而且，还可以通过将该突变的基因AP3-K转到野生型十字花科植株中获得无花瓣植株，用于种质资源的创新。

实施例1油菜显性无花瓣基因在无花瓣种质资源创新中的应用

发明人将油菜的野生型油菜无花瓣基因(即BnAP3(核酸序列为SEQ ID NO:1))的第6个外显子(SEQ ID NO:5)缺失，将获得的突变的基因BnAP3-K (核酸序列为SEQ ID NO:2)构建植物表达载体Cam-35S-BnAP3-K(核酸序列为SEQ ID NO:7)转化野生型油菜K407(花瓣正常)(图1B)，同时以野生型油菜无花瓣基因构建的表达载体Cam-35S-BnAP3(核酸序列为SEQ ID NO:6) 转化野生型油菜K407作为对照(图1A)。结果表明，转基因植株呈现典型的无花瓣表型，且雄蕊发育正常。这证实了克隆到的BnAP3-K基因是显性无花瓣基因，而且可用来创制油菜显性无花瓣材料(图1B)，而转化了正常基因BnAP3 的油菜花瓣表型正常(图1A)。

实施例2拟南芥显性无花瓣基因产生及其在拟南芥花瓣变异种质资源创新中的应用

为了进一步证实花瓣的AP3基因缺失或部分缺失第6个外显子获得的基因能够用来创制其他十字花科植物的显性无花瓣材料，发明人通过位点突变，缺失拟南芥AP3基因(即AtAP3)的第6个外显子(SEQ ID NO:5)，获得了突变的AtAP3-K基因(图2)，并构建植物表达载体Cam-35S-AtAP3-K(核酸序列为SEQ ID NO:9)，将该表达载体转化花瓣正常的拟南芥Col-0，同时用正常 AtAP3基因构建植物表达载体Cam-35S-AtAP3(核酸序列为SEQ ID NO:8)转化野生型拟南芥作为对照(图3A)。结果表明：用正常AtAP3基因转化野生型拟南芥，植株花瓣正常，只是由于AtAP3基因过表达导致雄蕊增多(图3B)。用AtAP3-K转化的拟南芥植株，花瓣显著变小，且具有了花瓣萼片化同源异型转变的鲜明特征(图3C)，这证实了AP3转录因子的第6个外显子缺失影响花瓣的发育，而且这还证实了利用该AtAP3-K基因可以创制显性无花瓣变异材料。

以上2个实施例表明，通过缺失十字花科植物的AP3基因的第6个外显子的核苷酸序列，产生的AP3-K基因能够使得该十字花科植物呈现无花瓣表型，从而可以直接用来创制十字花科植物显性无花瓣种质资源。

序列表

<110> 陕西省杂交油菜研究中心

河南大学

<120> 十字花科显性无花瓣基因及其显性无花瓣种质的创制方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 699

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 1

atggcgagag ggaagatcca gatcaagagg atagagaacc agaccaaccg acaagtaacg 60

tattccaaga gaagaaatgg tctgttcaag aaagctcacg agcttacggt tttgtgtgat 120

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<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 2

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<211> 699

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

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<210> 4

<211> 654

<212> DNA

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<400> 4

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<210> 5

<211> 45

<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

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cgtcttgagg atgaaatgga aaacactttc aaactcgttc gcgagcgcaa gttcaaatct 1140

cttgggaatc agatcgagac caccaagaaa aaggaactaa gagctgaaga tcctcactat 1200

ggactagtag acaatggagg agattacgac tcagttcttg gataccaaat cgaagggtca 1260

cgtgcttacg ctcttcgttt ccaccagaac catcaccact attaccccaa ccatggcctt 1320

catgcaccct ctgcctctga catcattacc ttccatcttc ttgaataa 1368

Claims (10)

1.一种使十字花科植物的花瓣显著变小或变为无花瓣的方法，其特征在于使所述十字花科植物的花瓣主效基因的第6个外显子的核酸序列部分或完全缺失。

2.权利要求1所述的方法，其中所述十字花科植物为芸薹属植物。

3.权利要求2所述的方法，其中所述十字花科植物为模式植物拟南芥和芸薹属植物为油菜。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述第6个外显子的核酸序列为SEQ ID NO:5所示的序列。

5.权利要求4所述的方法，其中所述芸薹属植物为油菜，所述花瓣主效基因的核酸序列为SEQ ID NO:1。

6.权利要求4所述的方法，其中所述十字花科植物为模式植物拟南芥，所述花瓣主效基因AP3的核酸序列为SEQ ID NO:3。

7.一种使花瓣变小或花瓣缺失的十字花科植物显性无花瓣基因，其特征在于通过将十字花科植物的花瓣主效基因的第6个外显子的核酸序列缺失或部分缺失获得的。

8.权利要求7所述的十字花科植物显性无花瓣基因，其中所述第6个外显子的核酸序列为SEQ ID NO:5所示的序列。

9.权利要求7或8所述的十字花科植物显性无花瓣基因，所述十字花科植物显性无花瓣基因的核酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

10.权利要求7-9任一项所述的十字花科植物显性无花瓣基因在创制显性无花瓣植物种质资源中的用途。