DE69919406T2

DE69919406T2 - Nac1- ein pflanzengen, das für einen transkriptionsfaktor kodiert, welcher an der entwicklung der kotyledonen und seitenwurzeln beteiligt ist

Info

Publication number: DE69919406T2
Application number: DE69919406T
Authority: DE
Inventors: Qi Xie; Nam-Hai Chua
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 1999-02-11
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2019-02-12
Also published as: WO2000047742A1; EP1151103B1; AU3284499A; ES2226428T3; PT1151103E; CN1201007C; CA2360416A1; DE69919406D1; CN1354793A; AU768692B2; NO20013688L; NO20013688D0; ATE273392T1; EP1151103A1; DK1151103T3; NZ514072A; US6844486B1

Description

Die NAC-Gene (einschließlich NAM, ATAF1, ATAF2 und CUC2) gehören zu einer relativ großen Genfamilie, die bisher nur in Pflanzen gefunden wurde. Diese Gene kodieren für Proteine, die hinsichtlich ihren ~170 N-terminalen Aminosäuren konserviert sind, während sie an ihren C-Termini hoch divergent sind. Die bisherigen genetischen Studien bei der Petunie (Souer et al., 1996) und Arabidopsis (Aida et al., 1997) haben zu der Vermutung geführt, dass einige Mitglieder der NAC-Familie eine Rolle bei der Bildung der Spross- und Blütenmeristeme spielen.
Embryonen der Petunie, welche die no apikal meristem (nam) -Mutation tragen, können kein apikales Sprossmeristem bilden. Gelegentlich tragen die Sprosse an den nam-Keimlingen Blüten, die zehn anstelle von fünf Primordien in dem zweiten Quirl ausbilden. Doppelmutanten mit dem homöotischen Gen green petals (grüne Petalen) zeigen, dass nam unabhängig von der Organidentität in dem Quirl 2 wirkt und auch die Primordienzahl im Quirl 3 beeinflusst. Überraschenderweise akkumuliert nam mRNA in den Zellen an der Grenze zwischen den Meristemen und den Primordien. Es wurde gezeigt, dass nam eine Rolle bei der Bestimmung der Lage der Meristeme und der Primordien spielt (Souer et al., 1996).
Mutationen in CUC1 und CUC2 (für CUP-SHAPED COTYLEDON = schalenförmige Kotyledonen), die Gene von Arabidopsis sind, bewirken Defekte bei der Trennung der Kotyledonen (embryonale Organe) den Sepalen und den Stamen (Blühorgane) sowie bei der Bildung der apikalen Sprossmeristeme. Diese Defekte treten am augenscheinlichsten in der Doppelmutante auf. Die Phänotypen der Mutanten lassen einen gemeinsamen Mechanismus für die Trennung von benachbarten Organen innerhalb des gleichen Quirls sowohl in den Embryonen wie auch in den Blüten vermuten. Das CUC2-Gen wurde kloniert und es wurde gefunden, dass es für ein Protein kodiert, das homolog zu dem NAM-Protein der Petunie ist (Aida et al., 1997).
Die Publikation und andere Materialien, die hier erwähnt werden zur Darstellung des technischen Hintergrundes der Erfindung, oder zusätzliche Details hinsichtlich der Praxis sind in der angehangenen Referenzliste aufgeführt.
Ein neues Mitglied der Arabidopsis NAC-Familie, NAC1, wird beschrieben. Dieses Gen wurde ursprünglich isoliert durch die Fähigkeit seiner cDNAs die Zellmorphologie des Hefes S. pombe bei Überexpression zu verändern (Xia et al., 1996). Eine Northern-Analyse zeigte, dass NAC1 in einer gewebespezifischen Weise mit hohen Niveaus in der Wurzel und mit niedrigen Niveaus in den Blättern exprimiert wird. In situ Ganzpräparat-Experimente zeigten die Expression in aktiv sich teilenden Wurzel- und Sprossmeristemen.
NAC1 teilt eine hohe Aminosäure-Sequenzhomologie mit anderen Mitgliedern der NAC-Genprodukte an dem N-Terminus. In vitro DNA-Bindungsstudien unter Verwendung eines rekombinanten GST-NAC1-Proteins und verschiedenen, abgestumpften NAC1-Derivaten zeigten eine Interaktion zwischen der -90 Region des 35S-Promoters und der konservierten, N-terminalen Domäne des Proteins. Interessanterweise zeigten Hefeassays, dass der C-Terminus von NAC1, der zu einer GAL4 DNA-Bindungsdomäne verschmolzen ist, die Transkription aktivieren kann. Die Analyse von verschiedenen Deletionsfusionen ergab, dass die Transaktivierungsdomäne in dem C-Terminus des NAC1 -Proteins lokalisiert ist. Ferner zeigten Zwei-Hybrid-Assays, dass NAC1 homodimerisieren kann, und dass die Dimerisierungsdomäne in der konservierten N-terminalen Region des Proteins lokalisiert ist. Eine 21 Basenpaar lange, wahrscheinlich zweigeteilte Kernlokalisierungs-Signalsequenz wurde in der N-terminalen, konservierten NAC-Domäne gefunden. Transgenische Arabidopsis wurden unter Verwendung eines GFP-NAC1 Fusionskonstruktes unter der Kontrolle eines Dexamethason (Dex) induzierbaren Promoter-GVG-Systems erzeugt. Die Analyse der transgenischen Linien, welche ein GFP-NAC1 Fusionsprotein unter der Dex-Induktionsbedingung exprimierten, ergab eine Kernlokalisierung des chimären Polypeptides in vivo. Diese Daten zeigen, dass NAC1 zu einer neu identifizierten Familie von Transkriptionsfaktoren gehört.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine transgenische Pflanze, die ein Gen umfasst, dass für NAC1 oder ein funktionell äquivalentes Protein (dies bedeutet ein Protein, das an die gleichen DNA-Bindungsstellen wie NAC1 bindet, und das zu wenigstens 70 % identisch mit NAC1 ist, vorzugsweise zu 80 identisch, mehr bevorzugt zu 90 % identisch und am meisten bevorzugt wenigstens 95 % identisch zu NAC1 ist) kodiert, was zu einer transgenischen Pflanze führt, die größer wächst als eine nicht-transgenische Pflanze. Die Pflanze kann größer werden, da sie schwerer ist, da sie größere Blätter hat, da sie dickere Stängel hat, da sie mehr Wurzeln und/oder da sie größere Wurzeln hat. Ein zweiter Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das für NAC1 oder ein funktionell äquivalentes Protein kodiert, wobei die Pflanzen, die für dieses Gen transgenisch sind, größer wachsen als eine nicht-transgenische Pflanze.
Ein dritter Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung ist NAC1 oder ein funktionell äquivalentes Protein, wobei eine Pflanze, die für ein Gen transgenisch gemacht worden ist, das für NAC1 oder das funktionell äquivalente Protein davon kodiert, größer wachsen wird als eine Pflanze, die nicht-transgenisch ist.
Ein weiterer Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine transgenische Pflanzenzelle, die ein Gen enthält, das für NAC1 oder ein funktionell äquivalentes Protein kodiert, wodurch die Pflanzenzelle größer wachsen wird als eine nicht-transgenische Pflanze.
1. Gewebespezifische Expression des NAC1-Gens. Autoradiographie von RNA-Gelblots, die 10 ig von Gesamt-RNAs enthalten, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurden, wie markiert. Die Keimlinge wurden von zwei Wochen alten Pflanzen geerntet. Stängelblätter (Blatt), Hauptstängel und laterale Stängel (Stängel), Blütencluster (Blüte) und Schoten von verschiedenen Stadien wurden von 35 bis 40 Tage alten, in Erde herangezogenen Pflanzen geerntet. Wurzeln wurden von zwei Wochen alten Keimlingen mit vertikalem Wachstum auf SM-Platten genommen. Der Filter wurde hybridisiert mit radiomarkiertem C-Terminus von NAC1 und dann wieder hybridisiert mit der radiomarkierten 18S rDNA-Probe als Ladekontrolle.
2. In situ Ganzpräparatstudie von NAC1 in Keimlingen und Blüten. Eine in situ Ganzpräparathybridisierung wurde für Keimlinge und Blüten mit einer Digoxigenin-markierten (DIG), C-terminalen, spezifischen Antisense-Probe (A, B, C, D und E) und mit einer DIG-markierten Senseprobe (F und G) durchgeführt. A und F waren 12 Tage alte Keimlinge, Das Wurzelmaterial stammte von einem 12 Tage alten Keimling und D ist ein 7 Tage alter Keimling.
Die Blüten wurden von 40 Tage alten, in Erde aufgezogenen Pflanzen genommen.
3. GST-NAC1 Fusionsprotein, das an die CaMV 35S Promoter -90 Region bindet. (A) Affinität des GST-NAC1 Fusionsproteins, das an die 35S Promoter -90 Regionen bindet. Die Menge der Proteine war wie folgt: Spur 1 ,500 ng GST Protein. Spuren 2 bis 9 sind NAC1 Fusionsproteine. Spuren 2 und 6, 10 ng; Spuren 3 und 7, 100 ng; Spuren 4 und 8, 250 ng; Spuren 5 und 9, 500 ng. Als kalter Konkurrent wurde das gleiche, nicht-markierte DNA-Fragment verwendet. (B) Karte von verschiedenen Deletionen der NAC1-Fusion an GST. (C) Verschiedene Deletionen von dem NAC1 -Fusionsprotein, das an die -90 Region des CaMV 35S Promoter bindet. 20 ng von jedem rekombinierten Protein wurde verwendet.
4. Spezifische Interaktion zwischen NAC1 und NAC1 in dem Zwei-Hybridsystem-Assay der Hefe. Hefe HF7c-Zellen wurden co-transformiert mit Plasmiden, die GAL4^BD alleine oder die GAL4^BD -NAC1 Fusion exprimierten, und mit Plasmiden, die GAL4^AD alleine oder fusioniert mit NAC1 exprimierten. (A) Zellen wurden auf Platten ausgestrichen mit oder ohne Histidin plus 10 mM 3-AT (Sigma) gemäß der in der Mitte der Figur gezeigten Verteilung. Die Fähigkeit zum Wachstum in Abwesenheit von Histidin hängt von der funktionellen Rekonstitution der GAL4-Aktivität ab. (B) Karte von verschiedenen Deletionen von der NAC1-Proteinfusion an den pGA Vektor. (C) Fähigkeit zur Interaktion zwischen den verschiedenen Deletionen der NAC1-Versionen in dem Zwei-Hybridsystem-Assay.
5. Lokalisierung der Transaktivierungsdomäne in dem NAC1-Protein. Verschiedene Deletionsversionen von NAC1 wurden in dem Gal4-DANN Bindungsvektor kloniert und in den Hefestamm HF7c transformiert. Die Transformationsmischung wurde auf MM-Platten mit Histidin oder ohne Histidin und ergänzt mit den notwendigen Aminosäuren gegeben. Die Ergebnisse wurden von Platten nach drei Tagen Wachstum genommen.
6. Wirkung der Überexpression von NAC1 in Pflanzen. (A) Wildtyppflanzen, die in Abwesenheit von Dex herangezogen wurden. (B) Wildtyppflanzen, die in Gegenwart von Dex herangezogen wurden. (C) Transgenische Pflanzen, die in Abwesenheit von Dex herangezogen wurden. (D) Transgenische Pflanzen, die in Gegenwart von Dex herangezogen wurden.
7. Entwicklungsveränderungen in den Kotyledonen in C-terminalen, spezifischen Antisense-Pflanzen. SEM zeigt die abaxiale Oberfläche der Kotyledonen. A und D (Detail) sind Wildtyppflanzen, B und E (Detail) zeigen keinen deutlichen Phänotyp, C und F, G (Detail) sind deutliche Phänotype. Felder mit A, B und C zeigen die Regionen, die detailliert dargestellt sind.
8. Wildtypsamen und Samen von transgenischen Pflanzen mit Antisense-NAC1 wurden auf MS oder MS plus Dex-Medium gekeimt. (A) Wildtyp in Abwesenheit von Dex; (B) Wildtyp mit Dex induziert; (C) transgenisch in Abwesenheit von Dex; (D) transgenisch mit Dex induziert.
Das nac1-Gen wurde in einer Studie zur Isolation von Proteinen des pflanzlichen Cytoskeletts und von Proteinen in Zusammenhang mit dem Zellzyklus und der Polarität isoliert, wobei Schizosaccharomyces pombe verwendet wurde. Eine A. thaliana cDNA Bibliothek unter der Kontrolle des Thiamin-reprimierbaren nmt1 Promoters von pREP5N wurde in Zellen des Wildtyps von S. pombe transformiert. Ein Transformant zeigte verlängerte Zellen und mehrere Septimas, wenn der Promoter reprimiert war. Ein cDNA-Klon wurde aus diesem Transformanten isoliert und in S. pombe retransformiert, um die Veränderung der Zellform aufgrund der Expression der cDNA zu bestätigen. Die isolierte cDNA (At012) kodiert für einen einzelnen offenen Leserahmen (ORF) von 324 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 2). Die wahrscheinliche Proteinsequenz wurde gegen GenBank untersucht. Eine BLAST-Recherche ergab, dass das Protein neu ist. Der N-Terminus des Proteins enthält eine NAC-Domäne, was eine Domäne darstellt, die in Mitglieder der NAC-Genfamilie gefunden wird (NAM, ATAF1, ATAF2, CUC2). Diese Domäne deckt die ersten 175 Aminosäuren des Proteins ab. Der Rest des Proteins, der durch nac1 kodiert wird, zeigt keine hohe Homologie zu einer bekannten Sequenz.
Homologien für Polypeptide werden typischerweise bestimmt unter Verwendung einer Sequenzanalysen-Software, siehe zum Beispiel "Sequence Analysis Software Package" der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. Die Proteinanalysen-Software vergleicht ähnliche Sequenzen unter Messung der Homologie, die aufgrund von verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen vorliegt. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen mit den folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin und Phenylalanin, Tyrosin.
Die NAC-Genfamilie wurde bisher nur in Pflanzen identifiziert. Diese Gene kodieren für Proteine, die im N-Terminus hoch konserviert vorliegen, die aber im Rest des Proteins variieren. Die ersten beiden Mitglieder, ATAF1 und ATAF2, stammen von Arabidopsis und wurden isoliert aufgrund ihrer Fähigkeit zur Aktivierung des 35S Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) -Promoters in der Hefe (H. Hirt, GenBank Zugangsummern X74755 und X74756). SENUS cDNA, isoliert bei Studien zur Blattseneszenz in der Tomate (GenBank Zugangsummer Z75524; John et al., 1997), und das NAM-Protein (Souer et al., 1996), das Produkt des nam-Gens bei der Petunie, sind erforderlich für eine ordentliche Entwicklung der apikalen Sprossmeristeme. Es wurde vorgeschlagen, dass sie den Meristemort bestimmen. CUC2 (Aida et al., 1997) ist ein Mitglied der NAM-Familie und ist ein Arabidopsis-Homologes von NAM. Das Arabidopsis-NAP-Protein ist auch ein Mitglied der Familie (Sablowski und Meyerowitz, 1998). Schließlich sind GRAB1 (GenBank Zugangsnummer AJ010829) und GRAB2 (GenBank Zugangsnummer AJO10830) zwei vor kurzem publizierte Mitglieder der NAC-Familie. Diese stammen vom Weizen und können mit dem RepA-Protein des Weizenzwergvirus (WDV) interagieren. Die transgenische Überexpression von den GRAB1- und den GRAB2-Genen unter der Kontrolle des 35S-Promoters kann in der Weizenzellkultur die WDV-Replikation hemmen.
Die hier vorliegende Arbeit unterteilt die NAC-Domäne in fünf Blöcke auf Basis der Konservierung und der Ladung von jedem Block. Die Sequenzausrichtung des NAC1-Proteins mit all diesen Proteinen ergab, dass NAC1 ähnliche Merkmale mit anderen NAC-Familienmitgliedern besitzt, die zu der kürzlich identifizierten NAC-Domäne korrespondieren.
Die genomische Struktur von nac1 wurde durch Vergleich der genomischen Sequenz mit der cDNA-Sequenz analysiert. Das NAC1-Gen ist auf dem Chromosom 1 lokalisiert. Es umfasst zwei Introns in der N-terminalen Kodierungsregion. Das erste Intron ist 1215 Basenpaare lang und tritt innerhalb des Kodons für die Aminosäure 67 auf. Das zweite Intron ist 102 Basenpaare lang und ist zwischen den Kodons für die Aminosäuren 160 und 161 angeordnet. Eine Domänensuche wurde durchgeführt und führte zu der Identifizierung eines wahrscheinlich zweigeteilten Kernlokalisierungssignals innerhalb der NAC-Domäne von NAC1. Diese 21 Aminosäure lange Signalsequenz erstreckt sich von der Aminosäure 117 bis zu der Aminosäure 137 und wurde hier zum ersten Mal in einem Mitglied der NAC-Familie gefunden. Durch Durchführung der gleichen Suche mit den anderen berichteten NAC-Familienmitgliedern ergab sich, dass kein ähnliches Signal detektiert werden konnte. In einer Reis-EST-Datenbank wurden NAC-Homologien gesehen, während aber in anderen Organismen, wie Säugetiere, Drosophila und Hefe, keine Homologe erkannt wurden.
Regulierung des NAC1-Gens während der Entwicklung
Um die Rolle des NAC1-Gens während der Pflanzenentwicklung zu untersuchen, wurde sein Expressionsmuster mit einer Northern-Analyse unter einer spezifischen nac1-Probe analysiert. Da Mitglieder der NAC-Familie selbst auf dem DNA-Niveau am N-Terminus sehr konserviert sind, wurde eine C-terminale Probe verwendet. 10 ig der Gesamt-RNA von jedem Gewebe wurde für die Hybridisierung verwendet. Ein relativ hohes Maß der Expression von nac1-RNA wurde in den Wurzeln (1 ) nachgewiesen. Eine niedrige Expression wurde in zwei Wochen alten Keimlingen gesehen, die das gesamte vegetative Gewebe enthalten. Eine sehr niedrige Expression wurde in dem Material detektiert, das von Stängeln und Blättern abstammte. Keine Expression wurde nachgewiesen in verschiedenen Schotenstadien und in verschieden reifen Blüten und Infloreszenzen, wobei dies selbst für eine lange Exposition gilt.
In situ Ganzpräparatstudien von 7 und 12 Tage alten Pflanzen wurden durchgeführt unter Verwendung von Senseproben und Antisenseproben zu der C-terminalen Kodierungsregion des Gens. Die nac1 Expression wurde in sich aktiv teilenden Wurzeln und apikalen Sprossmeristemen gesehen (2). Die Expression war insbesondere groß in der Teilungsregion der Wurzelspitze (2A und 2B) sowie in der Bildungsregion für die lateralen Wurzeln (2C). Eine niedrige Expression wurde in Kotyledonen und in jungen Blättern nachgewiesen. Diese Ergebnisse korrespondieren alle mit den Northern-Ergebnissen. Keine deutlich spezifische Hybridisierung wurde in den Blüten nachgewiesen (2E). Ferner wurde auch kein Signal in den Schoten und in den Stängeln (Daten nicht gezeigt) gesehen. Kein spezifisches Signal wurde in Keimlingen beobachtet, die mit Sense-RNA-Probe hybridisiert wurden (2F und 2G).
DNA-Bindung und DNA-Bindungsdomänen
Die zwei ersten Gene der NAC-Familie, ATAF1 und ATAF2, wurden aufgrund ihrer Fähigkeit zur Aktivierung des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 35S-Promoterkonstruktes in Hefe kloniert. Diese beiden Proteine, wie auch die anderen Gene der NAC-Familie, sind in der N-terminalen NAC-Domäne konserviert. Die GRAB1- und GRAB2-Proteine aus dem Weizen binden auch an die 35S Promoter -500 Region. Der CaMV 35S Promoter enthält verschiedene, bekannte DNA-Bindungselemente. Eine Reihe von pflanzlichen Transkriptionsfaktoren wurden hinsichtlich ihrer Bindung an verschiedene Elemente in der regulatorischen Region des Promoters identifiziert.
Die -90 Region des 35S Promoters wurde zunächst als Probe verwendet, um zu testen, ob das NAC1-Protein an den 35S Promoter binden kann, nac1 wurde in den GST Fusionsvektor pGEX-4-2T kloniert und in E. coli transformiert. Das rekombinante GST Fusionsprotein wurde gereinigt und ein Test wurde durchgeführt, um die spezifische Bindung an DNA zu testen. Da ein GST Fusionsprotein überprüft wurde, wurde GST selbst als Kontrolle verwendet. GST hat keine Fähigkeit zur Bindung an die -90 Region des 35S Promoters, selbst wenn 500 ng des gereinigten Proteins verwendet wurden (siehe 3A). Verschiedene Mengen an gereinigtem GSTNAC1 Protein wurden getestet. Die Bindung wurde selbst mit so wenig wie 10 ng des Proteins nachgewiesen und zwar nach nur 4 Stunden Filmexposition (3A). Es muss angemerkt werden, dass das gereinigte GST Protein nur etwa 10 % der intakten GST Fusionsform enthielt. Das meiste Protein wurde während des bakteriellen Wachstums und der Reinigung abgebaut. Dies beruht darauf, dass nach Zugabe von IPTG zur Induktion der Proteinexpression, die Bakterien nicht gut wachsen können und das Protein vor der Reinigung abgebaut wird. Die Zugabe von kalter 35S Promoter-Konkurrenz DNA im Überschuss hob die Bildung des DNA-Proteinkomplexes in einer konzentrationsabhängigen Weise auf (3A). Diese Ergebnisse zeigen, dass das NAC1-Protein spezifisch an die -90 Region des 35S Promoters bindet.
Die Bindung von NAC1 an ein AS-1 Element und an eine Mutantenform des Elementes, -83 bis -63 des 35S Promoters, wurde auch getestet. Pflanzliche Zip-Transkriptionsfaktoren wurden hinsichtlich ihrer Bindung an diese Region identifiziert. Die Bindungsaffinität wurde reduziert und es wurde kein klarer Unterschied zwischen dem ursprünglichen AS-1 Element und der mutierten Form gefunden. Dieses Ergebnis belegt, dass NAC1 eine unterschiedliche DNA-Bindungsstelle als die bZIP-Transkriptionsfaktoren hat, und dass die Sequenzen um das AS-1 Element für die spezifische Bindung von NAC1 wichtig sind.
Um die DNA-Bindungsdomäne von NAC1 zu testen, wurden verschiedene Deletionsformen von nac1 in den GST Fusionsvektor kloniert und die Fusionsproteine wurden isoliert, um die DNA-Bindungsfähigkeit an die -90 Region des 35S Promoters zu testen. 20 ng von jedem Protein wurden bei diesem Test verwendet. Die Ergebnisse sind in der 3C gezeigt. Die abgestumpfte Form von GSTNAC1 enthielt die ersten 199 Aminosäuren, die intakte NAC-Domäne. Dies führte zu einer ähnlichen Bindung spezifisch zu der DNA-Probe. Eine abgestumpfte Version, die nur die ersten drei intakten Blöcke der NAC-Domäne und ein Teil des Blockes IV enthielt, zeigte keine DNA-Bindungsfähigkeit. In ähnlicher Weise führte die komplimentäre Form zu dieser Deletionsform, der Rest des Proteins, der Teile des Blockes IV und den intakten Block V enthält, zu keiner Bindung an die DNA-Probe. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die DNA-Bindungsdomäne in der NAC-Domäne lokalisiert ist und das der Block IV für die DNA-Bindung wichtig ist, während der Block V für eine DNA-Bindung nicht ausreichend ist.
NAC1 Homodimere und die Dimerisierungsdomäne
Transkriptionsfaktoren bilden in der Regel Dimere, wenn sie an DNA binden. Um zu bestimmen, ob NAC1 Dimere bildet, wurde eine Zwei-Hybrid-Technik verwendet. Dieses Verfahren wurde effizient verwendet zur Testung von Dimerisierungen und zum Studium von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, einschließlich der Dimerisierung. Intaktes NAC1 wurde an eine Gal4 DNA Aktivierungsdomäne sowie an eine DNA-Bindungsdomäne gebunden und in eine Reporterhefe co-transformiert. Eine klare Interaktion wurde beobachtet, wenn NAC1 durch beide Vektoren exprimiert wurde. Die Hefe war zu einem Wachstum von 3 Tagen selbst dann fähig, wenn 10 mM 3-AT zugesetzt wurde, um nicht-spezifische Interaktionen zu blockieren (4A). Es muss angemerkt werden, dass NAC1 in einem geringen Umfang das System autoaktivieren kann, so dass die Hefe sehr langsam wachsen kann (4A), wenn NAC1 nur in dem DNA-Bindungsvektor exprimiert wird.
Um die Region von NAC1 zu identifizieren, die für die Dimerisierung notwendig ist, wurde eine Reihe von Deletionen hergestellt und ihre Fähigkeit zur Bildung von Komplexen in der Hefe analysiert. Zunächst wurde eine Deletion des C-Terminus von der Aminosäure 200 bis zum Ende des Proteins hergestellt. Dies lässt ein Protein aus den ersten 199 Aminosäuren übrig. Dieses Proteinfragment aus 199 Aminosäuren enthält die intakte NAC-Domäne und ist in der Lage, Dimere mit intakter NAC1 zu bilden. Diese 199 Aminosäure-Version ergab kein Hintergrundsignal wie die Wildtypversion von NAC1 mit voller Länge. Deshalb wurde die Version mit den 199 Aminosäuren als der fixierte Partner zum Test der anderen Deletionen verwendet. Eine Reihe von verschiedenen Deletionen in dem Aktivierungsdomänenvektor wurden hergestellt (4B). Wenn die gleiche Deletion (Fehlen der Sequenz jenseits der Aminosäure 199) in pGA hergestellt wurde, war die Wechselwirkung so stark wie bei dem intakten Protein. Wenn die Deletion den Block IV der NAC-Domäne beeinflusste und das Konstrukt nur die ersten drei intakten Blöcke der NAC-Domäne enthielt, war die Bildung von Dimeren zerstört (4C). Eine Deletion des N-Terminus, die nur die letzte Hälfte des Blocks IV und den intakten Block V übrig lässt, führte zu einem Protein, das zur Dimerbildung nicht in der Lage war. Diese Daten unterstützen sehr stark die Schlussfolgerung, dass die NAM-Domäne von NAC1 die Dimerisierungsdomäne enthält. Der Block IV ist wichtig für die Dimerbildung, während der Block V nicht ausreichend ist, um ein Dimer zu bilden. Das NAC1-Protein kann Homodimere bilden, wobei dies durch Gelfiltration bestätigt wurde. Wenn die Bakterien ein Protein von den ersten 199 Aminosäuren von NAC1 exprimierten, lief das gereinigte Peptid mit der kompletten NAC-Domäne doppelt so schnell in einem nativen Gel als in einem Denaturierungsgel.
Transaktivierung und die Transaktivierungsdomäne
In dem Zwei-Hybrid-Assay der Hefe wurde gefunden, dass NAC1 das System in einem geringen Maße autoaktivieren kann, während dies die C-terminale Deletion nicht kann. Es wurde deshalb ein modifiziertes ein-Hybrid-Verfahren mit dem Hybridtranskriptionsfaktor verwendet, um die Aktivierungsdomäne des NAC1-Gens zu identifizieren. Der Vektor pGBT8, der nur die Gal4 DNA Bindungsdomäne enthält, aber keine Aktivierungsdomäne, wurde verwendet. Verschiedene Deletionen des NAC1-Gens wurden in dieses Plasmid mittels einer Fusion an die Gal4 DNA Bindungsdomäne kloniert und die erzielten Plasmide wurden in Hefe transformiert, welche das UAS_gal7 -CYC1-HIS3 Reportergen enthielt. Die Selektion wurde auf Histidin-Minus-Platten durchgeführt. Wenn der Teil des Fusionsproteins eine Aktivierungsaktivität enthält, sollte die Gal4 Transkription wiederhergestellt werden und sollte den Promoter von HIS3 anschalten. Mit der Histidinsynthese kann die Hefe auf dem Medium ohne Histidin wachsen. Die Gal4 Aktivierungsdomäne wurde als positive Kontrolle verwendet und gab die volle Aktivität, wie dies in der 5 dargestellt ist. Wie oben erwähnt, gab das komplette NAC1-Protein nur eine niedrige Aktivierungsaktivität, Die N-terminale Fusion, welche die ersten 132 Aminosäuren oder die ersten 199 Aminosäuren enthielt, zeigte keine Aktivität. In ähnlicher Weise zeigte eine Fusion mit einem Peptidfragment der Aminosäuren 143-199 keine Aktivität. Im Gegensatz dazu aktivierte eine Fusion, welche die Aminosäuren 133 bis zu dem Carboxyterminus enthielt, vollständig das Reportergen, das ein Signal erzeugte, das so stark war wie der Gal4 Transkriptionsfaktor der positiven Kontrolle, Die Verwendung einer Fusion, die nur die Aminosäuren 143-269 enthielt, zeigte auch die volle Aktivität. Dies ist eine sehr saure Aminosäureregion. Die C-terminale Fusion, welche nur die letzten 54 Aminosäuren enthielt, zeigte nur eine geringe Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierungsdomäne von NAC1 in dem C-Terminus liegt.
Da die NAC-Familie bisher nur in Pflanzen und nicht in anderen Organismen nachgewiesen wurde, war es wichtig, die Transaktivierungsaktivität in Pflanzen zu überprüfen. Ein in vivo Experiment wurde durchgeführt, um die Aktivierungsdomäne zu überprüfen. Es wurden zwei Plasmide hergestellt. Das erste Plasmid trug eine Gal4 DNA-Bindungs MCS-Nos terminale Kassette, die mit einem CaMV 35S Promoter verknüpft war. Das zu testende Gen kann in MCS im Leserahmen mit der Gal4 DNA-Bindungsdomäne kloniert werden. Das andere Plasmid enthielt das Reportergenkonstrukt 6xUAS-TATA-Luc, das die Luciferase exprimieren kann, wenn etwas Protein an das 6xUAS-Element zur Aktivierung des Promoters binden kann. Ein Co-Bombardement mit den zwei Plasmiden zusammen mit verschiedenen Kombinationen zeigte, dass das System reproduzierbar und anwendbar ist. Als positive Kontrolle wurde die Aktivierungsdomäne aus dem Virus VP16 verwendet, die eine sehr hohe Aktivität ergab. Im Gegensatz dazu gab weder das zweite Plasmid (pTALuc) alleine oder in Verbindung mit dem Vektor pGal eine signifikante Luciferaseaktivität. Ein ähnliches Ergebnis wurde erzielt wie mit dem Hefesystem. Die volle Transaktivierungsaktivität wurde in dem Plasmid mit den Aminosäuren 143-269 identifiziert. Die letzten 54 Aminosäuren gaben auch eine geringe Aktivität. Der N-Terminus von NAC1 gab keine Aktivität. Dies gilt auch für die Vektorkontrolle selbst. Sowohl in der Hefe wie in den pflanzlichen Systemen wurde gezeigt, dass NAC1 eine Transaktivierungsdomäne enthält und die Region entsprechend zu dieser Aktivität zwischen den Aminosäuren 142-269 liegt.
Transgenische Arabidopsis-Pflanzen, die NAC1 überexprimieren und unterexprimieren
Bei dieser Untersuchung wurde ein Glucocorticoid-induzierbares, transgenisches System verwendet, wie es zuvor schon beschrieben wurde (Aoyama und Chua, 1997). Ein Glucocorticoid-regulierter Transkriptionsfaktor wird durch GVG kodiert, dessen Transkription von dem CaMV 35S Promoter kontrolliert wird. Die Transkription des Transgens wird gesteuert durch den Glucocorticoid-aktivierten Promoter (6XUAS_gal4). Die 1287 Basenpaar lange, NAC1 vollständig kodierende cDNA (SEQ ID Nr. 1 ) wurde in den binären pflanzlichen Transformationsvektor pTA7002 in beiden Richtungen kloniert und getrennt in den Arabidopsis thaliana lansberg-Ökotyp transformiert, wobei ein Wurzeltrans-formationsverfahren verwendet wurde. Überexprimierende und unterexprimierende transgenische Linien wurden mit Hygromycin enthaltenden Medien selektiert. Sechs unabhängige transgenische Linien mit Überexpression und vier unabhängige Linien mit Unterexpression wurden selektiert. Alle Linien segregierten für einen T-DNA Locus gemäß den Segregationsverhältnissen der Hygromycinresistenz.
Die sechs überexprimierende, transgenische Pflanzen zeigten drei verschiedene Phänotypen. Vier Linien waren von einem Phänotyp, während die verbleibenden zwei Linien jeweils einen verschiedenen Phänotyp zeigten. Diese beiden Phänotypen waren ähnlich den Antisense-Pflanzen, die unten beschrieben werden. Studien für die ersten vier Linien mit gleichem Phänotyp zeigten, dass diese Pflanzen schneller und größer wuchsen als die nicht-transgenischen Pflanzen und zwar sowohl unter in vitro Bedingungen als auch in Erde. Es wurden mehr laterale Wurzeln gebildet, wenn induzierende Bedingungen verwendet wurden, wie ein Wachstum an vertikalen Platten oder im Plantcon. Es werden Daten für die in vitro Wachstumsbedingungen präsentiert. Keimlinge mit verschiedenem Alter wurden von dem MS-Medium auf MS-Medium und auf MS-Medium plus 10 iM Dexamethason (Dex) transferiert und nach einer Woche wurde das Wachstum überprüft. Zehn Pflanzen von jeder homozygoten Linie wurden nach Entfernung des Agars oder der Erde von den Pflanzen gewogen. Eine Woche alte Keimlinge, die auf das Dex-Medium transferiert wurden, waren um das 1,1 bis 1,3-fache schwerer als die nicht-induzierten Pflanzen. 15 Tage alte Keimlinge waren um das 1,3 bis 1,8-fache schwerer und 25 Tage alte Keimlinge waren um das 1,4 bis 2,6-fache schwerer. Das erhöhte Gewicht bei den induzierten Pflanzen ergab sich aus größeren Blättern, dickeren Stängeln und mehr Wurzeln, wobei die Blattgröße der bedeutendste Faktor war. Epidermale Blattzellen von verschiedenen Teilen der Pflanze wurden mit dem Scanning-Elektronenmikroskop (SEM) analysiert. Das SEM zeigte, dass die Zellgröße von alten Blättern größer war als die Zellgröße der Kontrolle, während es keinen deutlichen Unterschied hinsichtlich der Zellgröße bei neu gewachsenen Blättern gab. Vertikal gewachsene Wurzeln einer repräsentativen Linie sind in der 6 gezeigt. Es werden mehr und längere laterale Wurzeln in den Dex-induzierten Linien produziert. Die Gesamt-RNA wurde aus 48 Stunden induzierten Pflanzen und Scheinkontrollen isoliert und mittels Northern-Blots gemessen, wobei die C-terminale spezifische Probe für nac1 verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass alle vier transgenische Linien das Transgen exprimieren. Die transgene mRNA-Größe ist größer als die native mRNA-Größe und kann einfach unterschieden werden.
Die zwei restlichen Linien mit Überexpression sowie die vier ausgewählten Linien der transgenischen Antisense-Pflanzen zeigten einigen Anteil an den verschiedenen Kombinationen der Phänotype. Eine der zwei Überexprimierungslinien und eine der Antisense-Linien zeigten im Keimlingsstadium einen Phänotyp mit nach oben gebogenen Kotyledonen. Keine deutlichen Phänotypen wurden im späten vegetativen Infloreszenz-Entwicklungsstadium entdeckt. Zwei Antisense-Linien zeigten sehr typische Phänotypen im Keimlingsstadium sowie die cuc2-Mutante. In diesem Fall wurden einzelne, herzförmige und fusionierte Kotyledonen sowie stärkere Rosettenkeimlinge mit einem niedrigen Prozentsatz bei etwa 7-10 % der Keimlinge entdeckt. Die meisten von diesen Keimlingen, die kein apikales Sprossmeristem herstellen können, starben später.
Eine der Antisenselinien und eine Überexpressionslinie zeigten keine Unterschiede zu den nicht-induzierten Pflanzen während allen Keimlingsstadien und vegetativen Wachstumsstaden. Im Stadium der Infloreszenzentwicklung waren jedoch die Blühorgane, insbesondere die Petalen und die Stamen, betroffen. Die Phänotypen wurden in den ersten Blüten der Infloreszenz gefunden. Diese Blüten hatten kurze Petalen und Stamen und in den deutlicheren Phänotypen konnten sich die Blüten überhaupt nicht öffnen. Einige von diesen Phänotypen konnten die Blüte öffnen, wobei aber nur kurze Stamen deutlich gesehen werden konnten. Diese Blüten waren männlich und weiblich-steril. Dieser Typ des Phänotyps überlappt mit der Überexpression eines anderen Arabidopsis-NAC-Familienmitgliedes – dem NAP-Gen.
Transgenische Arabidopsis-Pflanze mit Unterexpression des C-terminalen, spezifischen NAC1-Gens.
Da die Mitglieder der NAC-Genfamilie an dem N-Terminus hochkonserviert sind und zwar nicht nur auf dem Aminosäure-Niveau, sondern auch auf dem Nukleotidsequenz-Niveau, werden Antisense-Nukleinsäuren bei dieser Region die homologen Gene beeinflussen, wie dies für die Petunie gezeigt ist. Deshalb wurden C-terminale, spezifische, Antisense-Konstrukte unter Verwendung des Vektors pTA7002 hergestellt unc, wie oben beschrieben, in Arabidopsis transformiert. Für dieses Konstrukt wurde das 0,6 kb BamHl-Notl C-terminate Fragment verwendet. Northern-Blots entwickelten nur eine Bande entsprechend dem NAC1-Gen in allen Geweben, wenn dieses Fragment als Probe für die vier der sechs homozygoten Linien, welche für die Analyse ausgewählt wurden, verwendet wurde. Alle Linien zeigten ähnliche Phänotypen, wobei hauptsächlich die Kotyledonen- und Wurzelentwicklung beeinflusst war. Bei den anderen Stadien des Pflanzenwachstums wurden keine deutlichen Phänotypen entdeckt. Eine repräsentative Linie der C-spezifischen Antisense-Pflanzen wird hier beschrieben. Kotyledonen von Wildtyp-Keimlingen oder von nicht-induzierten Keimlingen zeigten eine Krümmung leicht nach unten und eine glatte Oberfläche. In der ersten Woche der Keimung wurde bei der Kotyledonenentwicklung kein deutlicher Phänotyp entdeckt, während bei 10 Tage alten Keimlingen 20 bis 25 % der Kotyledonen den nach oben gekrümmten Phänotyp zeigten. Einige der Keimlinge zeigten auch einen zurückgebogenen Phänotyp. Das Phänomen kann einfach unter dem Lichtmikroskop beobachtet werden oder direkt mit dem Auge. In einem späteren Stadium können schwarze Flecken auf der Oberfläche der Kotyledonen erkannt werden. Die abaxicalen epidermalen Zellen wurden mit SEM untersucht und es wurde eine abnormale Zellexpansion über die gesamte Kotyledonoberfläche gefunden, wobei aber verschiedene Niveaus der Ausbildung erkannt wurden (7). Diese Zellen haben ihre normale Puzzleähnliche Struktur verloren und wurden durcheinandergebracht durch verschiedene Zellgrößen und Zellformen (7C, 7F und 7G). Die Kotyledonen von diesen 75 bis 80 % der Keimlinge, die keinen ernsthaften oder deutlichen nach oben gebogenen Phänotyp unter dem Lichtmikroskop zeigten, wurden auch mit SEM überprüft. Die SEM-Ergebnisse zeigten, dass die Oberflächenzellen von diesen Kotyledonen auch abnormal waren. Die Zellen schauten geschwollen und mehr ausgebreitet aus.
Die Wurzelphänotypen konnten einfach bei Keimlingen mit vertikalem Wachstum nachgewiesen werden. Die Samen wurden auf MS-Medium oder auf MS plus Dex-Medium gekeimt. Nach einer Woche Keimung wurden die Keimlinge auf das gleiche frische Medium transferiert und wuchsen weiter für eine weitere Woche und wurden dann getestet. Wenige Wurzeln wurden bei Keimlingen produziert, welche die C-terminale Antisense-Expression enthielten. Drei Linien hatten kurze oder nur wenige laterale Wurzeln und eine Linie zeigte keine laterale Wurzelausbildung. Diese Keimlinge, die kurze oder nur wenige laterale Wurzeln zeigten, wurden mit dem Mikroskop überprüft und es wurde gefunden, dass die lateralen Wurzeln initiiert worden waren, aber sich dann nicht verlängerten. Deshalb sahen die Keimlinge so aus, als wenn sie weniger Wurzeln im Vergleich zu den nicht-induzierten Keimlingen enthielten (8). Ähnliche Ergebnisse wurden von C-terminalen Antisense-Pflanzen, die in Flüssigkeit aufwuchsen, erzielt. Eine Woche alte Keimlinge wurde zu flüssigem MS-Medium oder zu MS plus Dex-Medium gegeben und nach 12 Tagen Wachstum waren die nicht-induzierten Wurzeln größer als die induzierten Wurzeln der Keimlinge.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail anhand der folgenden Beispiele erläutert, die nur für die Darstellung hier präsentiert werden und welche die Erfindung in keiner Weise beschränken sollen. Standarttechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, oder die hier spezifisch beschriebenen Techniken wurden verwendet.
Beispiel 1
Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen
Ein Arabidopsis thaliana lansberg-Ökotyp wurde für die Experimente verwendet. Samen wurden oberflächensterilisiert mit 20 % Bleiche plus 0,01 Triton X-100 und wurden dann mit sterilem Wasser dreimal gewaschen. Nach dem letzten Waschgang wurde 0,15 % Agarose dem Samen zugesetzt und sie wurden auf MS oder MS plus Dexamethason (Dex) mit verschiedenen Konzentrationen und mit 3 % Saccharose aufgebracht. Die Platten wurden bei 4° C für 2 Tage inkubiert und in einen Gewebekulturraum bei 22° C unter Langtagbedingungen (16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit) transferiert. Nach 2 bis 3 Wochen wurden die Keimlinge in Erde gepflanzt und wuchsen in einer Wachstumskammer mit einer Fotoperiode von 16 Std. Licht/8 Std. Dunkelheit bei 22° C und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit heran.
Für die Dex-Behandlung wurce Dexamethason (Sigma) in DMSO gelöst, um eine 100 mM Dexamethason-Stammlösung herzustellen, die bei -20° C aufbewahrt wurde. Für das in vitro Wachstum der Pflanzen wurde Dex den Platten mit 0,1, 1 und 10 iM zugesetzt. Dex wurde kontinuierlich dem Medium einmal pro Woche zugegeben. Photocon und Plantcon wurden verwendet. Dex wurde zunächst in sterilem Wasser mit 1/25 des Volumens des Mediums gelöst und dann zu der Oberfläche des Mediums zugegeben. Für die Behandlung der in Erde herangezogenen Pflanzen wurde Dex zu sterilem Wasser zugesetzt, das 0,01 % Triton X-100 zu 30 iM enthielt. Dann wurde das Wasser über die Oberflächen der Pflanzen einmal alle zwei Tage gesprüht. Für die Scheinkontrollen wurde steriles Wasser mit 0,01 % Triton X-100 auf die gleiche Zahl von Pflanzen gesprüht.
Beispiel 2
Tranformationskonstrukte und Pflanzentransformation
Das binäre Transformationsplasmid pTA7002, welches das komplette Glucocorticoid-induzierbare Zwei-Komponentensystem (Aoyama und Chua, 1997) enthielt, wurde als Vektor verwendet. Für die Überexpression und die vollständigen Antisense-Konstrukte wurde ein 1287 Basenpaar langes Sall-Notl Fragment, das die komplette NAC1 kodierende cDNA enthielt, mit einem glatten Ende versehen und in den pTA7002 Vektor kloniert, der mit Xhol geschnitten war und mit der alkalischen Phosphatase aus dem Kalbsdarm behandelt war. Um ein C-terminales spezifisches Antisense-Konstrukt herzustellen wurde das 605 Basenpaar lange BamHI-Notl Fragment, das die C-terminale spezifische Region von NAC1 kodierender cDNA enthielt, mit einem stumpfen Ende versehen und in den pTA7002 Vektor, wie oben erwähnt, kloniert. Für die transgenischen Konstrukte, welche eine GFP-NAC1 Fusionskassette enthielten, wurde ein Nael-Sall Fragment, das durch PCR erzeugt und gerade die NAC1 Kodierungsregion enthielt, in einen GFP Zwischenfusionsvektor pGFP2(GA)5II kloniert, der mit Nael und Sall geschnitten war, um das Plasmid pGFPNAC1 herzustellen. Dann wurde die GFPNAC1-Fusion durch Xbal plus Pacl herausgeschnitten und in den pTA7002 Vektor unter Verwendung des gleichen Verfahrens, das oben beschrieben ist, kloniert. Wurzeln von Arabidopsis thaliana lansberg wurden als Pflanzenmaterial für die Transformation verwendet (Valvekens et al., 1988). T2-Samen wurden auf SM-Platten gekeimt, die 20 ig/mL Hygromycin B enthielten, um resistente Pflanzen zu selektieren. Die Pflanzen wurden in Erde gebracht, um homozygote T3-Samen zu erzeugen. Zwei unabhängige Linien von homozygoten T4-Pflanzen mit einer Einzelinsertion von jedem Konstrukt wurden für die Detailanalyse verwendet.
Beispiel 3
Northern Analyse und in situ Ganzpräparatanalyse
Die Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Geweben unter Verwendung des Qiagen RNA-Herstellungskits isoliert. Die Northern-Blotanalyse wurde gemäß Nagy et al. (1988) durchgeführt. Für die Proben wurde ein PCR-Fragment, das die Aminosäuren 200 bis 324 abdeckte, mit α-³²Ρ dCTP unter Verwendung eines Redi-primed Labelingkits (Amersham International) markiert. Ganze Pflanzen oder Blüten wurden für die in situ Ganzpräparathybridisierungen fixiert, Antisense-RNA von der C-terminalen spezifischen Region von NAC1 wurde markiert mit Digoxigenin UTP (Boehringer Biochemica, Mannheim, Deutschland). Die Hybridisierung wurde mit dem anti-Digoxigenin Fab-Fragment, das mit der alkalischen Phosphatase verbunden war, nachgewiesen. Als Kontrollproben wurden Sense-Transkripte von dem gleichen Klon unter Verwendung der T3-Transkriptase hergestellt.
Beispiel 4
Zwei-Hybrid-Analyse bei der Hefe
Eine Zwei-Hybrid-Analyse (Bartel et al., 1993; Fields und Song, 1989; Chevray und Nathans, 1992; Lee et al., 1995) wurde für die Dimerisierungsanalyse benutzt. Der Hefestamm HF7c (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trpl-901 leu2-3,112 ga14-542 gal 80-538 LYS2::GALI_UAS-GALI_TATA-HIS3 URA3::GAL4_17mers(x3)-CyCI_TATA-LacZ, der die zwei Reportergene LacZ und HIS3 enthält, wurde verwendet. Die Hefe-Cotransformation mit den Plasmiden, welche die Gal4 DNA Bindungsdomäne und die Gal4 Aktivierungsdomänefusion trugen, wurde mit Methoden durchgeführt, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Siehe zum Beispiel Burke und Olson, 1986; Rudolph et al., 1985; Sakai et al., 1984. Die anderen Bedingungen wurden im Detail hier beschrieben und sind im Stand der Technik gut bekannt. Um die Interaktion zwischen den zwei Fusionsproteinen zu bestätigen, wurde die α-Galactosidaseaktivität durch einen Replica-Filtertest überprüft.
Die zwei Versionen von NAC1 wurden in den Gal4 DNA Bindungsdomänenvektor pGBT8, ein Derivat von pGBT9 (Clontech), kloniert, der einen mehr vielseitigeren Polylinker enthält. Das Plasmid pGBNAC11-324 enthielt den kompletten offenen Leserahmen für NAC1, der an die Gal4 DNA Bindungsdomäne fusioniert war. Das Plasmid pGBNAC11-199 enthält nur die Nukleinsäure, die für die ersten 199 Aminosäuren kodiert, auf dem gleichen Vektor. Verschiedene abgestumpfte Versionen von NAC1 wurden mit dem Gal4 Aktivierungsdomänenvektor pGAD424 fusioniert. Das Plasmid pGANAC11-324 enthält den kompletten offenen Leserahmen für NAC1. Das Plasmid pFANAC11-199 enthält die Nukleinsäure, die für die ersten 199 Aminosäuren von NAC1 kodiert. Das Plasmid pGANAC11-142 enthält die Nukleinsäure, die für die ersten 142 Aminosäuren von NAC1 kodiert, und das Plasmid pGANAC1143-324 enthält die Nukleinsäure, die für die Aminosäuren von 143 bis zu dem C-Terminus des Peptides kodieren.
Beispiel 5
Transfektion von epidermalen Zellen mit Hilfe der Partikelkanone
Petalen wurden in 2 × 2 cm große Stücke geschnitten und auf einen Filter gegeben, der mit flüssigem MS-Medium gesättigt war, 2 ig von jeder Plasmidkombination wurden für jeden Schuss in einem Vakuum von 27 Zoll Quecksilber unter Verwendung eines Heliumdruckes von 1100 psi verwendet. Nach Beschuss durch die Partikelkanone wurden die Platten in einem Pflanzenanzuchtraum über Nacht (16 Std.) inkubiert und 50 mM Luciferin (Promega) wurde auf das Material gesprüht. Die Ergebnisse wurden nach 10-minütiger Inkubation genommen.
Beispiel 6
Herstellung der GST-Fusionsproteine und DNA-Bindung
Das PCR-Produkt, welches die komplette Kodierungsregion des NAC1-Gens enthielt, wurde kloniert in pGEX-4-2T, um das pGST-NAC1-Fusionskonstrukt herzustellen. GST-NAC1 1-199 wurde erzeugt durch Schneiden von pGST-NAC1 mit BamHI und Sall und wurde mit Klenow behandelt und wieder verbunden, um pGST-NAC1 1-199 herzustellen, das nur die ersten 199 Aminosäuren des NAC1-Proteins enthält. GST-NAC1 1-132 wurde erzielt durch Schneiden von pGST-NAC1 mit Xhol plus Sall und wurde wieder verbunden. GST-NAC1 133-324 wurde hergestellt durch Klonieren eines Xhol-Notl Fragmentes von dem ursprünglichen cDNA Klon in pGEX-4-2T. Die Plasmide wurden transformiert in E. coli BL21 (DE3). Die Transformanten wuchsen bis zu einer optischen Dichte (OD₆₀₀) von 0,6 bis 0,9 und wurden dann bei 30° C für 4 Std. und durch Zugabe von IPTG von 0,4 mM induziert, um das Fusionsprotein zu exprimieren. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und dann wieder re-suspendiert in GST-Puffer (GCB: 50 mM Tris-HCI bei pH 8,0; 200 mM NaC1; 1 mM EDTA; 1 Triton X-100; 10 mM α-Mercaptoethanol, 5 μg/mL von jeweils Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin; und 1 mM PMSF). Die Zellen wurden durch Beschallung auf Eis (5 × 30 Sek.) lysiert und die Lysate wurden durch Zentrifugation (15 Min. bei 12,000 Umdrehungen pro Min.) gereinigt. Das Fusionsprotein wurde durch Affinitäts-chromatographie auf Glutathion-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia) wiedergewonnen. Die DNA-Bindungsreaktion enthielt 2 × 10⁵ cpm DNA-Probe. 5 iL von 4 × Reaktionspuffer (100 mM NaCl, 40 mM HEPES; pH 7,5; 2 mM EDTA; 20 Glycerin; 140 mM α-Mercaptoethanol), 0,5 ig poly dldC (Pharmacia), 1 iL 1 Nonidet P40 und verschiedene Mengen von Proteinen in einem Gesamtvolumen von 20 iL. 10 iL der Reaktion wurden auf einem 4-6 % ½ TBE nativen Gel verwendet. Ein 100 Basenpaar BamHI Fragment, das die 35S-90 Region enthielt, wurde mit α-³²PdCTP in einer Klenow-Markierungsreaktion markiert.
Referenzliste

Aida M, et al. (1 997). The Plant Cell 9: 841-857.
Aoyama T und Chua N-H. (1997). Plant J. 11: 605-612
Bartel PL, et al. (1993). "Using the 2-hybrid system to detect protein-protein interactions." In Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, Oxford University Press, Seiten 153-179.
Burke DT und Olson MV (1986). DNA 5: 325-332.
Chevray PM und Nathans DN (1992). Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89: 5789-5793.
Fields S und Song O-K (1989). Nature 340: 245-246.
John I, et al. (1997). Plant Mol. Biol. 33: 641-651.
Lee JE, et al. (1995). Science 268: 836-844.
Nagy F, et al. (1988). In Plant Molecular Biology Manual, B4 (Gelvin S und Schilperoort R, Hrsg.). Dordrecht, The Netherlands; Kluwer Academic Publishers, Seiten 1-12.
Rudolph H, et al. (1985). Gene 36: 87-95.
Sablowski RWM und Meyerowitz EM (1998). Cell 92: 93-103,
Sakai K, et al. (1984). Mol. Cell. Biol. 4: 651-656.
Souer E, et al. (1996). Cell 85: 159-170,
Valvekens D, et al. (1988). Proc. Natl, Acad. Sci. USA 85: 5536-5540.
Xia Q, et al. (1 996). Plant J. 10: 761-769.

Sequenzliste

Claims

Isolierte Nukleinsäure, welche die Basen 89-1060 von Seq ID Nr. 1 umfasst.
Isoliertes Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die durch Seq ID Nr. 2 dargestellt ist.
Isoliertes Protein, welches zu wenigstens 70 % identisch mit dem Protein nach Anspruch 2 ist, wobei das isolierte Protein ein funktionelles Homologe von NAC1 ist und Dimere bilden kann, an die gleichen DNA-Bindungsstellen wie NAC1 bindet und eine Pflanze, welche mit einer Nukleinsäure transformiert ist, welche für das Protein kodiert, veranlasst, größer zu wachsen als eine Pflanze, die nicht mit einer Nukleinsäure transformiert ist, welche für das Protein kodiert.
Nukleinsäure, die für das Protein nach Anspruch 3 kodiert.
Transgenische Pflanze, die transgen hinsichtlich einer Nukleinsäure ist, welche die Nukleinsäure nach Anspruch 4 umfasst.
Transgenische Pflanzenzelle, die transgen hinsichtlich einer Nukleinsäure ist, welche die Nukleinsäure nach Anspruch 4 umfasst.
Verfahren zum Heranziehen einer Pflanze, das die Transformation dieser Pflanze mit der Nukleinsäure nach Anspruch 4 und das Anbauen dieser Pflanze umfasst, wobei diese Pflanze größer als eine Wildtyppflanze wachsen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäure durch einen Glucocorticoid aktivierten Promoter kontrolliert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Pflanze mit einem Glucocorticoid behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Glucocorticoid Dexamethason ist.
Verfahren zum Heranziehen einer genetisch veränderten Pflanze, die größer als die Wildtypversion dieser Pflanze ist, umfassend das Überexprimieren des NAC1-Polypeptides von SEQ ID Nr. 2 in dieser veränderten Pflanze, wobei die Expression von NAC1 dazu führt, dass die genetisch veränderte Pflanze größer als die Wildtyppflanze wächst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die veränderte Pflanze größere Blätter als die Wildtypversion produziert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die veränderte Pflanze größere Wurzeln als die Wildtypversion produziert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die veränderte Pflanze mehr laterale Wurzeln als die Wildtypversion produziert.
Verfahren zum Heranziehen einer genetisch veränderten Pflanze, die größer als die Wildtypversion dieser Pflanze ist, umfassend das Überexprimieren eines Proteins nach Anspruch 3 in dieser veränderten Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die veränderte Pflanze größere Blätter als die Wildtypversion produziert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die veränderte Pflanze größere Wurzeln als die Wildtypversion produziert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die veränderte Pflanze mehr laterale Wurzeln als die Wildtypversion produziert.
Transgenische Pflanze, hergestellt durch Insertion einer Nukleinsäure nach Anspruch 4 in eine Wildtyppflanze.