CN103130883B - 与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物穗形相关的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗形相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明通过克隆SPEDJ基因，深入了解水稻穗形态建成特别是末端枝梗的发育问题，探索生物物质由源到库输送的决定因素，最终解决“理想株形”的深层理论问题，将有望为作物高产育种指引新方向。
Description
技术领域
本发明涉及与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
在禾本科中，花序的主轴叫作穗轴(rachis)(Bell，AD(1991)Plant Form：AnIllustrated Guide to Flowering Plant Morphology，Oxford University Press，New York.p.184-191.)，着生于穗轴上的侧向分枝枝梗叫作一级枝梗，顺此方式类推，着生于一级枝梗上的更下一级分枝叫作二级枝梗。“枝梗”这个专业名字仅仅用于花序分枝具有足够长度支撑超过一个小穗的结构，当枝梗短到仅包含一个小穗(至少一朵花及其连接的花柄)时，只能被叫作花序梗(peduncle)(Ikeda，K，Sunohara H and Nagato Y(2004)Development Course of Inflorescence and Spikelet in Rice.Breed.Sci.54：147-156)，而更加短到只包含一朵小花时，就叫作花梗(pedicel)。
水稻花序特别是枝梗的发育是一个整体全局的过程，是由初级到高级按照分生组织的类型一层层地整体调节的，也就是说，只有主穗轴完成了分化，才会启动一级枝梗分化；所有一级枝梗分化完成后才启动伸长程序并同时进入下一级枝梗的分化；所有次级枝梗完成分化后才同时启动小穗的分化。在这个过程中，枝梗的伸长受到了严格的时间限制，总是迟后于各种原基的分化，这与一般生命组织先出现分裂生长的现象完全不同(Ikeda，K，Sunohara H and Nagato Y(2004)Development Course ofInflorescence and Spikelet in Rice.Breed.Sci.54：147-156)。
水稻花序发育中，先决性的，也是最为关键性的事件就是枝梗的发育。这一发育问题在育种实践上也显得极为重要。多年来在传统育种实践中形成的一些先进育种理论，例如直立穗形具有增产潜力(Chen Wenfu，Xu Zhenjin，Zhang Longbu，et al.(2000)Theories and practices of rice breeding for super high yield.Proceedings of InternationalConference on Engineering and Technological Science[C].378-382)，稀重穗具有解决源库不匹配矛盾而充分利用能量的特点(周开达，马玉清，刘太清，等(1995)杂交水稻亚种间重穗型组合选育。四川农业大学学报13(4)：403-407)，密直穗能大幅增产(HuangX，Qian Q，Liu Z，Sun H，He S，Luo D，Xia G，Chu C，Li J，Fu X(2009)Natural variation atthe DEP1 locus enhances grain yield in rice.Nature Genetics 41：494-497)等，部是以枝梗为基础的穗形改良才能达到的目标。因此，只有弄清楚枝梗的发育过程与分子机理，并借助分子生物学的工具，才能够通过分子育种的方法，有的放矢地达到更高产的育种目标。
从发育过程与结构来看，水稻的枝梗发育涉及到四个层面：穗轴(rachis)，一级枝梗(primary branches)，二级枝梗(secondary branches)，花梗(pedicels)。水稻花序发育需要形成三类分生组织：穗轴枝梗分生组织，侧生穗分生组织与顶生穗分生组织。穗轴、一级枝梗和二级枝梗均来自同一类分生组织，而花梗分别来自两种穗分生组织。顶生穗的花梗可以直接由枝梗分化出来，而侧生穗花梗必须直接来源于枝梗侧生分生组织的形成。到目前为止，已经发现了超过17种类型的水稻穗型突变体。参与这些花序形态控制的主要基因早在多年前就已经报道了20多种(Kinoshita T，Takahashi M(1991)The one hundredth report of genetical studies on the rice plant.Linkage studies andfuture prospects.J.Fac.Agric.Hokkaido Univ.65：1-61)，这些基因的克隆，已经为理解穗部形态的建成提供了越来越清晰的分子机理，使作物高产育种沿着分子设计理想株形的目标大大靠近了一步。特别是对于控制水稻穗轴、一、二级枝梗发生与发育的分子生物学机理已经比较明确；对花梗的发育，LAX1只能解释侧生穗的花梗来源(OikawaT and Kyozuka J(2009)Two-Step Regulation of LAX PANICLE1 Protein Accumulation inAxillary Meristem Formation in Rice.PLANT CELL 21(4)：1095-1108)，FZP基因控制的穗分生组织的分化信息中包含所有花梗发育信息(Komatsu M，Maekawa M，Shimamoto K，and Kyozuka J(2001)The LAX1 and FRIZZY PANICLE 2GenesDetermine the Inflorescence Architecture of Rice by Controlling Rachis-Branch andSpikelet Development.Developmental Biology 23：364-373)，但是这些基因都不能解释花梗因为长度缩短而形成的一种水稻突变体——簇生穗突变体。
1957年，Jodon(Jodon NE(1957)Inheritance of some of the more striking charactersin rice.J.Hered.48(4)：181-192)最早报导发现簇生穗突变体Cl。该突变体的整体观上表现为小花失去正常的在枝梗上分级排列的特性，而呈2到5个小穗并生在一起的簇生状态。发现者根据其外观形状将之描述为“簇生穗”。除了这一命名外，还有人将之命名为“复粒稻”(田翠，张涛，蒋开锋，杨莉，杨乾华，万先齐，郑家奎(1010)水稻小穗簇生突变体的遗传分析及其基因的初步定位。分子植物育种8：29-34)，也有研究者特别地把只在一级枝梗上有两粒穗簇生，其他部位正常的簇生型突变体命名为“麦颖稻”(陈红旗，刘刚，朱旭东，等(2002).水稻簇生穗突变体的鉴定及遗传.南京农业大学学报25(3)：116-118)。从以上发表文献中不同名字的突变体的初步遗传定位结果来看(郑雷英，朱旭东，钱前，赵忠，张建军，胡筱荷，林鸿宣，罗达(2003)水稻穗部突变体CL的形态和定位分析。科学通报48：264-267)，除了定位精度的差异以外，都落在相同的染色体比较狭窄的区段内，因此可以推测，国内目前已经定位的几个簇生穗基因都是等位的。
育种学上具有深远影响的源库流理论，一直指引着作物的育种实践。流的物质环节主要在于茎节和枝梗。水稻矮化增产的结果表明，其主要是通过减少营养体源而扩大生殖体库的优化结果，故推测穗枝梗可能是主要的流环节之一。
发明内容
本本发明的一个目的是提供与植物穗形相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物穗形相关的蛋白，名称为SPEDJ，来源于水稻(Oryza sativaL.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗形相关的由(a)衍生的蛋白质。
序列表中的序列1由123个氨基酸残基组成。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(a)中的SPEDJ蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的SPEDJ衍生蛋白可人工合成，也可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失和/或增加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到编码基因，再进行生物表达得到。
所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)序列表中序列3所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
序列表中的序列2由372个核苷酸组成，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的SPEDJ蛋白。
上述严格条件可为：在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，65℃下进行DNA或RNA杂交实验并洗膜。
含有所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在载体pZh01的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体。
扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列5所示。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比，穗形改变的转基因植物。
所述穗形改变体现为：与所述目的植物相比，所述转基因植物花序的各级枝梗末端小穗的花梗长度缩短和/或所述转基因植物的末端果梗伸长被抑制。
所述与植物穗形相关的蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥；所述单子叶植物为水稻。
本发明通过克隆SPEDJ基因，深入了解植物穗形态建成特别是末端枝梗的发育问题，探索生物物质由源到库输送的决定因素，最终解决“理想株形”的深层理论问题，将有望为作物高产育种指引新方向。
附图说明
图1为SPED突变体的穗部形态遗传以及发育示意图。
图2为SPEDJ基因的特异STS标记-CSPJ320B的PCR分析。
图3为重组表达载体p35S：：SPEDJ示意图。
图4为转SPEDJ基因水稻植株的花梗形态。
图5为对转SPEDJ基因水稻植株采用潮霉素基因标记和SPEDJ基因的STS标签检测结果。
图6为转SPEDJ基因水稻T1代植株的RT-PCR分析结果。
图7为转SPEDJ基因水稻T1代植株的Southern杂交分析结果。
图8为转SPEDJ基因拟南芥的表型分析结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与水稻穗形相关的SPEDJ基因的获得
一、SPED突变体性状
在夏季自然条件下，SPED突变体营养生长状态无异常，但是穗部形态发生改变，主要有两方面：一是从小穗着生状态来看，原本呈梯级分布于一二级枝梗上的谷粒(颖花)，在顶部的部分簇生成一团，一般有3到5粒簇生，而一二级枝梗上从顶部往下数3到5粒以下部位的小穗仍然按一定剃度距离着生在枝梗上；二是从末端枝梗性状来看，所有直接连接小穗的花梗都极度缩短到1.0毫米左右，另外每级花序梗从上往下数有1到3节缩短，其中缩短1节花序梗表现为小穗呈3粒簇生，缩短2节有4粒簇生，最多可以有3节花序梗缩短致5粒簇生，并且所有的次级枝梗都表现为缩短(图1中A)。图1中B为野生型植株的穗型。
以9311F1代为材料自交繁殖后，统计F2中突变体植株的各穗花梗长度进行分析，发现突变体植株仅在第1穗与第6穗有1到2毫米的超突变体亲本变化，其他各级花梗都在1毫米左右(图1中C和D)。并且除了花梗缩短以外，其他花序梗并不缩短。由此可以归纳得到SPED突变体花序枝梗的发育模式：花梗和上部花序梗的伸长发育强烈抑制，子粒呈现3粒以上严重簇生，如SPED突变体亲本；或只有花梗严重缩短，上部花序梗伸长发育不受抑制，从而使花序子粒形态呈现2粒簇生，如在9311的遗传背景中(图1C中上部分)。
二、与植物穗形相关的基因SPEDJ的遗传分析与初步定位
在北京实验场，以突变体SPED为父本，分别与9311、R498、R549、R527、Balila、K1/Pita等品种杂交，获得F1后播种于海南陵水自交繁殖，获得F2代种子，取部分F2种子在北京种植，并调查突变性状分离，统计数据。杂交组合以及遗传分析结果如表1。
表1 遗传分析所采用杂交组合以及分析结果
结果表明，SPED突变体性状是由单基因显性控制遗传的。从簇生程度进行表型评价，SPED在不同的遗传背景中呈现情况有不同；从花梗缩短的表型来评价，则SPED在所有的遗传背景中均呈现完全显性。进而以突变体SPED为父本与9311杂交，其F1种子于海南陵水自交繁殖，获得F2代种子在北京种植，建立一个总单株数为5298株F2代群体，其中1318株表型为野生型的单株被用来进行作图分析。
初步定位步骤：采集F2代群体中野生型表型的单株叶片，分别抽取DNA。各取6株野生型和突变表型F2代单株DNA，分别等量混合构成野生型DNA池和突变体DNA池。在http://www.gramene.org/microsat/ssr.html以及http://ricelab.plbr.cornell.edu/publications/2005/IRGSP/supplementaltable18.xls网站上均匀选取水稻12条染色体上的110个SSR标记对亲本以及野生型DNA池和突变体DNA池进行SSR标记连锁分析。对在亲本与野生型DNA池和突变体DNA池中均能扩增到多态性一致的SSR引物，再扩大群体进行验证。进行初步验证以确定初步定位区间。经98个野生型单株的小群体连锁分析，SPEDJ基因被限定在水稻第6号染色体下臂两个SSR分子标记RM5957和RM3827之间，定位区间约为2.5Mbp。这两个标记分别检测到6株和4株交换单株。
三、STS标记的创制以及SPEDJ基因的精细定位
在上述水稻SSR标记数据库中选取RM5957和RM3827(见表2)标记之间的SSR标记，对98株初步定位群体中筛选到的交换单株进行筛选。所用多态引物分别为RM275，RM20384，RM20297，RM20303，RM20311，RM20315，RM1340(见表2)。其中RM275和RM1340分别从RM5957和RM3827标记为交换的单株中检测到3株和1株交换株。采用这两个标记分别从1318株野生型定位群体中筛选出交换株。通过位置检索，在gramene网站数据库中(http://www.gramene.org/Oryza_sativa/Location/)从上述标记区间挑选更多的SSR引物，对筛选出来的交换株进行染色体步移。在标记染色体步移到区间距离约为300K时，通过NCBI网站比对这一区间内indica与japonica的序列，对相互之间具有10bp以上的缺失的序列设计STS(sequence taggedsites)引物，共获得6对多态性好的STS标记(CSP1、CSP4、CSP7、CSP8、CSP25和CSP30)(见表2)，它们的扩增片段为100bp到500bp不等，最终将目标区间聚焦到19.2Kb的范围。
表2 本发明过程中所创制的标记和引物
四、SPEDJ基因预测及其STS标签CSPJ320B的创制
用Genescan软件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)对定位区间19.2kb的序列进行基因预测，发现一个非移码的372bp内嵌ORF，称为SPEDJ。根据该基因在数据库中的序列设计引物，以SPED突变体和9311亲本DNA为模板高保真PCR扩增后克隆测序，克隆测序结果表明，SPEDJ基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由372个碱基组成，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中序列1由123个氨基酸残基组成，将该蛋白质命名为SPEDJ。
设计了能特异区分SPEDJ基因的STS标记CSPJ320B(该标记的引物序列见表2)，经过PCR条件摸索，在94℃ 2min；94℃ 45s，64℃ 45s，72℃ 20s，35cycle；72℃ 5min的热循环条件下，使用华美Taq polymerase buffer配方配制反应体系，分别以SPED突变体、野生型9311和野生型TP309基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增结果见图2，从图2可见，在SPED突变体中可得到140bp的特异扩增条带，而在野生型9311和野生型TP309中无该特异扩增条带。
实施例2、转SPEDJ基因植物的穗形分析
一、转SPEDJ基因水稻植株的穗形分析
根据上述实施例1扩增得到的SPEDJ基因设计引物，加入BamHI和SalI酶切位点，引物序列如下：
SPEDJ-F：GGGGATCCGAAGCAATTCCATGCAATGAGG(下划线为BamHI酶切位点)(序列表中序列4)，
SPEDJ-R：GTGTCGACGGTCCAGTCAAACTAATGG(下划线为SalI酶切位点)(序列表中序列5)，
用SPEDJ-F和SPEDJ-R作为引物，以SPED突变体叶片基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得455bp扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。在该序列两端各添加BamHI和SalI酶切位点。将产物经BamHI和SalI双酶切后，连接到表达载体pZH01(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS 16by RNA interference.Xiao H etal.Plant Molecular Biology.2003，52：957-966)的BamHI和SalI酶切位点间，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pZH01的BamHI和SalI酶切位点间插入了序列表中序列2所示的SPEDJ基因片段，证明重组表达载体构建正确，将该重组表达载体命名为p35S：：SPEDJ，构建过程如图3所示。将重组表达载体p35S：：SPEDJ采用农杆菌介导的方法转化水稻TP309(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：A receptor kinase-like proteinencoded by the rice disease resistance gene，Xa21.Song WY et al.Science.1995，270(5243)：1804-6)植株，得到转SPEDJ基因水稻T0代植株。转基因具体方法见PlantMolecular Biology，2003，52：957-966。
同时，按照获得转SPED基因水稻的方法，将空载体pZH01转化水稻植株，得到转空载体对照水稻T0代植株。设水稻TP309植株为野生型对照。
共获得59株潮霉素阳性的转SPEDJ基因水稻T0代植株(图5中A，A图为潮霉素基因在部分转化水稻中的分子检测结果，其中，泳道1：p35S：：SPEDJ；泳道2：9311；泳道3：TP309；泳道4-10：突变体表型T0代植株；泳道11-16：野生型表型T1代植株)，其中具有STS标记CSPJ320B检测阳性(图5中B，B图为STS标签引物-CSPJ320B在部分转化水稻中的分子检测结果，其中，泳道1：p35S：：SPEDJ；泳道2：9311；泳道3：TP309；泳道4-10：突变体表型T0代植株；泳道11-16：野生型表型T1代植株)，表现出顶端穗簇生的转SPEDJ基因T0代转化植株为22株(图4中A、B和C；A图左侧为转SPEDJ基因T0代转化植株，A图右侧为受体植株TP309，A图下方为穗部局部放大图；B图为转SPEDJ基因T0代转化植株穗部的整体外观、簇生形态以及各级花梗形态；C图为转SPEDJ基因T0代转化植株花序枝梗整体形态，以及花梗缩短后与水稻TP309植株之间的长度差异，图中数字单位为毫米)。转空载体对照水稻T0代植株与野生型对照植株的表型一致。
获得来源于10个转SPEDJ基因水稻T0株系的表型稳定的转SPEDJ基因水稻T1代植株。用SPEDJ引物对(SPEDJ-F和SPEDJ-R)和CSPJ320B引物对(见表1)对转SPEDJ基因水稻T1代转基因植株进行RT-PCR表达分析，结果显示SPEDJ基因的引物在转SPEDJ基因水稻T1代转基因植株以及野生型水稻TP309植株的cDNA中均能检测到特异带，且过表达并没有使植株体内的SPEDJ的总体RNA丰度发生明显改变，而STS标记CSPJ320B的引物只能在转SPEDJ基因水稻T1代转基因植株中检测到特异带(图6)。
经表型鉴定，这些转SPEDJ基因水稻T1代植株的花序均表现为各级枝梗末端小穗两粒簇生，且这些小穗的花梗长度上出现显著缩短变异，其长度基本上保持在2毫米左右，而其它农艺性状没有变化，即转基因植株的花序在穗形大小、枝梗数量与密度，着生模式，以及非小穗直接着生的花序梗的长度都没有明显变化，表明转SPEDJ基因水稻植株的两粒簇生是由于花梗缩短导致的。
随机选取3个簇生突变表型能稳定遗传的T1单株进行Southern杂交分析，结果显示这三个单株中的SPEDJ外源片段均为单拷贝插入。在BamHI与XbaI单酶切下，来源亲本即SPED突变体亲本和TP309野生型亲本植株都能分别切出3.1Kb和3.5Kb的单拷贝内源片段，而T1代突变体能分别特异切出5.4Kb和6.8Kb的单拷贝含插入外源DNA的片段(图7，λ/HindIII：λ/HindIII DNA Marker；SPED：SPED突变体亲本；TP309：TP309野生型亲本；1，2，3：3个具有突变体表型的T1代植株；箭头所示为内源片段与含插入DNA片段)。
二、转SPEDJ基因拟南芥植株的穗形分析
按照实验一中获得转SPEDJ基因水稻植株的方法，将重组表达载体35S：：SPEDJ采用农杆菌介导的方法转化拟南芥Columbia-0(col-0)(购自The ArabidopsisInformation Resource(TAIR，拟南芥资源中心)，目录号为CS39697，http://www.arabidopsis.org/)，得到转SPEDJ基因拟南芥T0代植株，同时，按照获得转SPED基因拟南芥的方法，将空载体pZH01转化拟南芥col-0，得到转空载体对照拟南芥T0代植株。同时，设拟南芥col-0为野生型对照。相对野生型对照，转SPEDJ基因拟南芥T0代植株的生长能力显著减弱，花序发育过早形成末端花而终止继续生长(图8)，其中图8中(a)为转SPEDJ基因的拟南芥T0代植株，7中(d)至图8中(g)是T0代转基因植株的几种果荚着生的形态；图8中(b)和图8中(c)是野生型拟南芥col-0及其花序末端形态；在转SPEDJ基因拟南芥T0代的花序主枝(图8中(d))以及侧生枝顶端(图8中(e))均过早形成终端花而使花序发育停止。此外，在花序中部偶尔出现果梗间节极度缩短，出现二荚并生的表型(图8中(g)：转SPEDJ基因拟南芥T0代果梗间节缩短形成二荚(花)并生形态)。转SPEDJ基因拟南芥T0代植株最为显著且特有的发育异常是，易在侧生分枝的末端形成无果梗以及部分果荚伸出障碍的末端花(图8中(f)：转SPEDJ基因拟南芥T0代果梗伸出障碍末端花形态)。可见，SPEDJ对拟南芥的花序发育具有控制作用，主要表现在抑制末端果梗的伸长发育。
在拟南芥的转化中，经潮霉素筛选共获得3株T0代，其中有一株具有突变体表型的T0代被潮霉素基因标记以及SPED基因的STS标记检测为阳性(图8中(a))。表明SPEDJ基因成功整合到了野生型受体中。
Claims (3)
1.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示的DNA 分子导入目的植物中，得到与所述目的植物相比，花梗改变的转基因植物；
所述花梗改变体现为：与所述目的植物相比，所述转基因植物花序的各级枝梗末端小穗的花梗长度缩短；
所述目的植物为水稻。
2.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列2所示DNA分子导入目的植物中，得到与所述目的植物相比，果梗改变的转基因植物；
所述果梗改变体现为：与所述目的植物相比，所述转基因植物的末端果梗伸长被抑制；
所述目的植物为拟南芥。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：序列表中序列2所示DNA分子通过重组表达载体导入目的植物中；
所述重组表达载体是载体pZH01的多克隆位点插入序列表中序列2所示DNA分子得到的。
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