CN110592136A - 一种改变矮牵牛开花节律的分子方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种调控矮牵牛开花时间的分子方法。本发明实现方法：利用花特异性表达启动子和生物钟基因共同调控植物开花节律的分子方法，结合遗传转化的手段实现。包括启动子的合成、LHY基因的扩增、载体构建，以组织与细胞操作技术简单、生活周期短、遗传背景清晰的重要花卉矮牵牛为转基因的模式植物进行遗传转化，最终获得开花时间发生改变的转基因植株。以花特异性表达启动子启动可以调控植物开花节律的生物钟基因LHY在矮牵牛中的表达，获得的转进因植株开花时间与对照相比存在明显差异的新品种。通过对所获得的阳性转基因植株开花时间的统计，发现转基因株系相比较对照植株开花时间推迟近4个小时。

Description

一种改变矮牵牛开花节律的分子方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种调控矮牵牛开花时间的分子技术。

背景技术

开花是植物繁衍后代不可缺少的生理过程，植物自身基因的控制和环境条件的影响共同维持植物-从营养生长向生殖生长转变的时间。高等植物通过感受随季节变化产生的日照时长的波动调节开花时间。而响应日照时长产生的花时改变受到复杂的环境信号和与生物钟相关的时间保持机制的共同调控。生物钟是能够产生近 24小时周期外部节律的内源性机制，使植物体自身的内源节律与外部环境条件达到时间和空间的协同。研究植物开花时间及生物钟基因突变体发现，生物钟基因在植物生长发育、激素信号、开花等生理活动中均发挥调控作用。LHY 是生物钟核心振荡器中的关键成员，在调节光周期方面具有重要作用，缺失或过量表达均会导致植物生物钟节律的改变。

随着生活水平的提高，人们对花卉的需求也日益增加。基因工程育种为花卉品种的改良和创造优新品种，提供了一条方便快捷的途径。花特异性启动子可以使目的基因在花器官中特异的表达，可以针对性的培育花卉的观赏品质。随着研究的深入，花特异性表达启动子的研究和应用受到越来越多的重视。但是多数研究在调控花器官的发育和改良花色方面展开，对于在开花时间方面的研究仍然较少。然而对于一些夜花植物，茉莉花等，开花时间的改变有利于提高其经济和利用价值。鉴于生物钟基因在调控开花时间这一事件中的功能，结合花特异性表达启动子和基因工程育种技术，创造花时改变的优新花卉品种是一条切实可行的策略，利用其培育新的花卉观赏品种在花卉产业中具有良好的发展前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控矮牵牛开花时间的分子方法。利用花特异性启动子proCbLIS和茉莉生物钟基因 JsLHY共同调控植物开花，推迟开花时间，所述JsLHY的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述花特异性启动子proCbLIS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

该方法以遗传转化的手段，利用花特异性启动子和生物钟基因共同调控植物开花的分子方法，包括启动子的合成、 LHY基因的扩增，载体构建。同时以组织与细胞操作技术简单、生活周期短、遗传背景清晰的重要花卉矮牵牛为转基因的模式植物进行遗传转化，获得开花时间发生改变的转基因植株。人工合成花特异性启动子，以其启动可以调控植物开花节律的生物钟基因 LHY 在矮牵牛中的表达，获得的转进因植株开花时间与对照相比存在明显差异的新品种。

具体方法如下：

1、载体构建

（1）花特异性启动子（proCbLIS）的合成：在NCBI上搜索获得相关序列， GeneBank ID为AF067601。经由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成该序列（SEQ ID NO:2）的合成，获得核苷酸产物。SEQ ID NO:2如下：

GAGCTCGCGGCCGCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATCTAAAATAAAATTTAGGTTAAGAAGTGGGTGCAATTTGTTAGGCACCCACTTCTTAATGATCCATGTGTAATGTTTGTTAGGCACGCTAAGCTGGAGTGCACATTATTTGTTGGCTTTGTCTTGATGTGGTAATTTTATTTTTGCCAAATTATCACGTATATTTGCCCGATCGGGCATTCTAATATCTAATCTAAAAATATAATTTTAAGTTAGATAATAATATCTTACGAAATAAACATTTATAATATTTAAAACTAATATTAACTTTTGTCCTTCAAATATTTATTATCGTGTCTTACGTAACACACGAGGTGATTATATATAAATTTAAAACGAATCACAGAAAAATTTATGTCATTAAATAATTATTGATATATATTTTATTTAATTTACTATAATATTATCTACTCGAATCATAATTTTTTTAAGGTATTTTGATTTACAAACGGTTTATTTCAAGTAAAAAACATTTTGGAATGAACATGGATTATATAACATTTCGAACAAGCGTACACCATAAGAAGTTAATTAACAATAATGTGTATATGTTTGTTTAATATATTAATTTAGAAAATGAATTTATATATGATGGTCGAGTGATTGATAATATAATACAAATATACAAGTTTCATTTAATATGCGCGGGTTAGTGGCTAGTTCAAATTACTTCATGAGCTTTTCTATTCAAACATTTACTATTGCATAAGCTGACCCAACTCTTGTATTAACCCTTATAAATTTAAATGATCAGTTTGACCATGACAGATTATATTAATTCCGATTAGATTAATTAATTTATTATAATTGGCAATTAAAACTCATTTATTATATATTATGTATAGTAATAAAATAATTGATGATGTTAGGATGGAAGGGACGGGAGATGAGTGCAGTAATTAAATTAAGGCCACATCCTATCATATCCCAGTCTATAAATACAGATCCAGATCCACTTCATATAAGCAAGCTATCTTCCCAGAAAACCAAACCACCTTAAACAAGACAACCATCTCGAGCCCGGGACTAGT。

（2）构建pK7FWG2.0-proCbLIS空载体。采用酶切连接的方法，将花特异性启动子proCbLIS通过单向限制性内切酶位点SacI和SpeI置换掉表达载体pK7FWG2.0的CaMV35S启动子，获得重构的pK7FWG2.0-proCbLIS表达载体。

（3）茉莉生物钟基因JsLHY的序列扩增：提取茉莉花总RNA，反转录成cDNA。设计特异引物，采用RACE 的扩增方法，对JsLHY完整的ORF序列进行同源扩增。获得的扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶和DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit）分别进行分离纯化。PCR 产物克隆进入pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态细胞并测序。测序结果（SEQ ID NO:1）如下：

ATGGTTCTGGATTTTATTGGACTTGAAGATGGTCAATTCGTTAACCATGGTACATGCATCCTCTAGTGGACGAATATTTCATTTACTTTTGTCCCTGGTTTGGTGCACCAGGTCGTAATCAAGACTAAAACTTTTTTCTGGCGAACTCATTGTAACCTGCATAATTACTATAACCAGGATATTGGCATTTCCGAAGTTGTGTTTTACTTCAGGAATGACCACTTCGAAAATCAACATATGCCCCTGTCGTTATTTTCTTTCACATCAAGATTTTGTTTCATGTTAGGACACTATTTGCGGATGCACAATGTATGTATCTAAAGTTGTGTTCTCTTAATCCAGCTAGAAAAAGAGGCTCTTATTAAAGGAGTTCCAATCGGGCATACTCTTGACATTGAAATTCCTCCTCCACGTCCTAAAAAGAAACCAAGCAATCCTTATCCAAGAAAGACAAGTGCAGGAGGAGCTTCTAGTTTGCACAGAGAGAAGGATGGGAAATTGTCAGCGCCTGTTTCTTCTTTGTATGTACATAAATCCACACTGGACTTGGAGAAAGAACCACATCCTGATATGAAACCCAGTGATGATGGACAGATGGGAGACACTAAGCAGTACCAAGAAGAGGACAGTTGCTCTGAGGCTGTGACCCTTATGAAGACAGATCCTTGTACATCCCCATCTTCAATTAACAGAAGTTCTTTCACGACACCAGTTGCGCCCAGAAACTCGTACAGTGAGTTTCTACAGAGAACTGAGCAGGTGGGTTACGAAGATGAAACAAATGAATCTCATATCACCACCGAACAAAAGGGACATGAGAAAAATAAGATAGATAGCAGCAACCTTTCTCGGGATTTTGGCTTATGTAAAACTTCAAACTTTGAAAATTCTCAAGTTTTACATGAGAAGCCTGTACAAGGAAAAGGAACAAATGAGATGGATCATTCCGAAAATGTTGATACATTGTCAAACAATGTTCAAGCCTCTCACAACTATCCGAGACATGTTGCAGTTCACATTCTTGATGGGAACCCAGGAATGAACACACAAAACATTTCCCAAGATCTAAAATATCCAGAAACTATGTTTCATCAATCAGGTGGTGTTAATGGACGACCAAATCTATTCATGGATCCCACCTCATCTGCTGTTTCCGAACATCAAAGTAATGCATCGAGACCTTCCATTCATCAATCATATCCCAGTTTCCATCCAATCTCGAACCCTTTCCACAATCCAGATGATTACCGATCATTTCTGCACATGTCATCTACATTTTCAAGTCTTATTGTATCTGCTCTGCTACAAAATCCAGCAGCCCATGCTGCTGCAAGCTTTGCAGCTACATATTGGCCATGTACAAACATGGAAACTCCAGCAAACCACCCTGCCGGTGGATTTCAGCCGAGGCAGATAAATTCAGCTCCTAGTATGGCAGCAATTGCTGCAGCTACAGTAGCAGCTGCGACTGCATGGTGGGCAGCCCATGGCTTACTCCCATTATGTGCCCCGTTTCACCCGGGCTTTACCTGTTCTCCCGCATCTGAATCTGCAATCCCAATGGATGCAAGTAAAGATAGAGCAGCTAATACTGAAGGAAGAGAAAACCCTCCGGACAGTCAATATCTAGAACCAGGGTGCTCTGAGGCTATGCAAGAACAGCAGTCAACTCTGAAGTCACCAACATTGTCACTGTCAGATTCTGTTGAAAGTGAAGGTGCAAATGCAAATGTTGGATTAACAGCTACTGAAACTGAACAAACTGCAGATGCAGCTAAGTTGAATGATTCAAACAAGTCAAAAAACAGGAAGAAGGTGGGTCGTTCTTCATGTGGATCCAACACACCTTCCAGCAGTGAAGTTGAGGCACATACTTTGGAGAAGCAACCAAAAGGAAAAGAAGAGAAGCTTGTCAAAGACAAGGAGTCAAAAGAACCTGATGTAAATCAAATAACTGTTGACTTCAGCAATCGACGTGGCAGAAGCACCAGCACTCTAAGTGATTCTTGGAAGGAAGTTTCTCAAGGGGTAACTGTATCTTCTAAAAAATTTTAAATATAAAAATTCTTCTTGTCAACATGTGTGAAAAATCATTTCCCGTTTTTTCCCTTGTCTCTATCCACTTCATGTGCAGGGACGACTGGCTTTCCAGGCACTCTTCTCTAGAGAAGTACTGCCACAAAGTTTTTCCCCACCACATGATTTAGAGAAAAAGGATTTCAAAAATATTGTTAAGGATATAGAAACTGCACAGGAGAAAGATGATTATCGATTGCAGTTAGACCTTAATGGCAAGGAGGGTACCTTTCCCCATAAGCGAGGAATGGAAGGAAATGCTACTCTGACTGGTGACAACAAAGAAGAGGGACTTCTCAGTATGGGTCTTCGATATGCAAAGCTAAAATCTCAGCGAACGGGATTTAAACCGTACAAAAGGTGCTCAGTGGAAGCAAAAGAGAGCTGGGTAAAGGCCAATGGCCAGGAAGAAGAGAAAGGATCCAAGAGATTACGCATAGAAGGAGAGGCTTCCACATAG。

（3）构建 pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY 过表达载体。将分离获得的JsLHY的ORF片段克隆到pENTR™ Directional TOPO®载体构建入门载体pENTR-JsLHY，实验步骤参照pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kit说明书。将入门载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化的细菌涂布于含有50 mg/L Kan的筛选平板上，待长出菌斑后，挑取单克隆进行PCR验证，并送公司测序验证。将构建正确的入门载体质粒与目标载体pK7FWG2.0-proCbLIS进行重组反映，获得融合表达载体pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY，实验步骤参照Gateway®LR ClonaseTM Enzyme Ⅱ Mix 说明书。融合表达载体质粒转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，转化的细菌涂布于含有50 mg/L Spe和50 mg/L Str的筛选平板上。待长出菌斑后，挑取单克隆进行PCR 验证，并送公司测序验证。

（4）采用冻融法将pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY过表达载体转入农杆菌GV3103感受态中。

2、矮牵牛遗传转化

（1）外植体采集及消毒：剪取旺盛生长的矮牵牛植株叶片，用自来水轻柔清洗3遍后备用。在超净工作台中用2% NaClO 浸泡矮牵牛叶片7~10 min，后用无菌水清洗2~3遍。

（2） 预培养：消毒完成后，用手术刀去除叶片的叶脉部分，将叶片切成边长1.5×2cm大小的方块，正面朝下放置于预培养基（4.43 g MS粉+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+2mg/L6-BA +0.2mg/L NAA）上进行预培养。将培养瓶放入组培室，3-4天后叶片拱起，叶片伤口处有组织膨大时开始浸染。

（3）制备浸染液：按照2%体积比，用移液器吸取带有pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY质粒的农杆菌菌液加入含有抗生素Spe（50 mg/L）、Rif（50 mg/L）、Str（50 mg/L） 的液体LB培养基中，28℃振荡培养。当菌液OD 值到达 0.8-1.0 时，用大型冷冻离心机，4 ℃、4000 rmp条件下离心15 min。在超净工作台上去除上清，加入等体积的重悬液（重悬液：1/2MS+150mM/L AS），进行重悬。

（4）共培养：在超净工作台上， 将配置好的浸染液倒入灭菌的培养瓶中，继而将预培养的外植体放入浸染液中，浸泡10 min 左右。取出外植体放在灭菌的滤纸上吸干水分。在共培养基（4.43g MS粉（M519）+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+2 mg/L 6-BA +0.2mg/L NAA +15mg/L AS）表面铺一层灭菌滤纸，将上述外植体放在滤纸上，置于组培室中遮光培养 2~3天。

（5）分化培养：在超净工作台上，将共培养后的外植体放入加有头孢（300mg/L）的灭菌水中轻晃清洗1~2 min，再用无菌水清洗 2~3 遍，放入分化培养基（4.43g MS粉+20g/L蔗糖+8 g/L琼脂+2mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +300 mg/L Cef +100 mg/L Kan）中，置于组培室培养。

（6） 生根培养：分化培养约6周左右，分化苗生长到4~5 cm、着有4~5 片叶时，将其由愈伤组织处切下，伤口需整齐平滑。 继而将分化苗插入生根培养基（1/2MS + 10 g/L蔗糖 + 6 g/L 琼脂 + 0.1 mg/L IBA + 0.1 mg/L NAA + 300 mg/L Cef）进行生根培养。

（7） 移栽上盆：生根培养4周左右分化苗长出发达的根系，开始上盆。使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤及，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，将组培苗移栽至含等比例的草炭、蛭石和珍珠岩的基质中。

3、矮牵牛转基因植株开花情况的观察

移栽后2个月起开始记录植株开花情况，每隔两天，分别在每天6:00 和10:00各统计一次，连续统计一周。发现转基因株系相比较野生型开花时间推迟近4个小时。

本发明的优点在于：本发明利用花特异性表达启动子和生物钟基因共同调控植物开花节律的分子方法，结合遗传转化的手段实现，最终获得开花时间发生改变的转基因植株，以花特异性表达启动子启动可以调控植物开花节律的生物钟基因LHY在矮牵牛中的表达，获得的转进因植株开花时间与对照相比存在明显差异的新品种。通过对所获得的阳性转基因植株开花时间的统计，发现转基因株系相比较对照植株开花时间推迟近4个小时。

附图说明

图1为JsLHY的PCR扩增电泳图；a图是5’RACE 扩增后的电泳图；b图是3’RACE扩增后的电泳图；c图是 JsLHY全长扩增后的电泳图。

图2为转基因植株的PCR验证；泳道M代表Marker；泳道WT代表野生型PCR结果；泳道1-5代表转基因植株的PCR结果。

图3为上午 6:00 转基因矮牵牛植株（LisPro-LHY）和野生型矮牵牛植株（WT）的开花情况。

图4为上午 10:00 转基因矮牵牛植株（LisPro-LHY）和野生型矮牵牛植株（WT）的开花情况。

具体实施方式

1、载体构建

（1）花特异性启动子（proCbLIS）的合成：在NCBI上搜索获得相关序列， GeneBank ID为AF067601。经由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成该序列（SEQ ID NO:2）的合成，获得核苷酸产物。

（2）构建pK7FWG2.0-proCbLIS空载体。采用酶切连接的方法，将花特异性启动子proCbLIS 通过单向限制性内切酶位点SacI和SpeI置换掉表达载体pK7FWG2.0的CaMV35S启动子，获得重构的pK7FWG2.0-proCbLIS表达载体。

（3）茉莉生物钟基因JsLHY的序列扩增：提取茉莉花总RNA，反转录成cDNA。设计特异引物（5’race GSP1:CCAAAATCCCGAGAAAGGTTGCTGCT；5’race GSP2:CTGTCCTCTTCTTGGTACTGCTTAGTGTCT；3’race GSP1:TGGCTTACTCCCATTATGTGCTCCGT；3’raceGSP2:TCCAGCAGTGAAGTTGAGGCACATAC），采用RACE的扩增方法，对JsLHY完整的ORF序列进行同源扩增。获得的扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图1），用DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit）进行纯化。PCR产物克隆进入pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态细胞并测序。测序结果如SEQ ID NO:1。

（3）构建pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY 过表达载体。将分离获得的JsLHY的ORF片段克隆到pENTR™ Directional TOPO®载体构建入门载体pENTR-JsLHY，实验步骤参照pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kit 说明书。 将入门载体转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，转化的细菌涂布于含有 50 mg/LKan的筛选平板上，待长出菌斑后，挑取单克隆进行PCR验证，并送公司测序验证。将构建正确的入门载体质粒与目标载体pK7FWG2.0-proCbLIS进行重组反映，获得融合表达载体pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY，实验步骤参照Gateway® LRClonaseTM Enzyme Ⅱ Mix 说明书。融合表达载体质粒转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，转化的细菌涂布于含有50 mg/L Spe和50 mg/L Str的筛选平板上。待长出菌斑后，挑取单克隆进行PCR验证，并送公司测序验证。

（4）采用冻融法将 pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY 过表达载体转入农杆菌 GV3103感受态中。

2、矮牵牛遗传转化

（1）外植体采集及消毒：剪取旺盛生长的矮牵牛植株叶片，用自来水轻柔清洗 3 遍后备用。在超净工作台中用2% NaClO浸泡矮牵牛叶片7~10 min，后用无菌水清洗2~3遍。

（2） 预培养：消毒完成后，用手术刀去除叶片的叶脉部分，将叶片切成边长1.5×2cm大小的方块，正面朝下放置于预培养基（4.43 g MS粉+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+2mg/L6-BA +0.2mg/L NAA）上进行预培养。将培养瓶放入组培室，3-4 天后叶片拱起，叶片伤口处有组织膨大时开始浸染。

（3）制备浸染液：按照 2%体积比，用移液器吸取带有 pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY质粒的农杆菌菌液加入含有抗生素 Spe（50mg/L）、Rif（50mg/L）、Str（50mg/L）的液体LB培养基中，28 ℃振荡培养。当菌液OD值到达0.8-1.0时，用大型冷冻离心机，4 ℃、4000 rmp条件下离心15 min。在超净工作台上去除上清，加入等体积的重悬液（重悬液：1/2MS+150 mM/L AS），进行重悬，制备得到浸染液。

（4）共培养：在超净工作台上，将配置好的浸染液倒入灭菌的培养瓶中，继而将预培养的外植体放入浸染液中，浸泡10 min左右。取出外植体放在灭菌的滤纸上吸干水分。在共培养基（4.43 g MS粉（M519）+ 20 g/L蔗糖+ 8 g/L琼脂+ 2 mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA+15 mg/L AS）表面铺一层灭菌滤纸，将上述外植体放在滤纸上，置于组培室中遮光培养2~3天。

（5）分化培养：在超净工作台上， 将共培养后的外植体放入加有头孢（300 mg/L）的灭菌水中轻晃清洗 1~2 min，再用无菌水清洗2~3 遍，后取出放在滤纸上吸干表面水分，进而放入分化培养基（4.43g MS 粉+20 g/L 蔗糖+8 g/L 琼脂+2 mg/L 6-BA +0.2 mg/LNAA +300 mg/L Cef +100mg/L Kan）中，置于组培室培养。

（6） 生根培养：分化培养约6周左右，分化苗生长到4~5 cm、着有4~5片叶时，将其由愈伤组织处切下，伤口需整齐平滑。 继而将分化苗插入生根培养基（1/2MS + 10 g/L蔗糖 +6 g/L 琼脂 + 0.1 mg/L IBA + 0.1 mg/L NAA + 300 mg/L Cef）进行生根培养。

（7） 移栽上盆：生根培养4周左右分化苗长出发达的根系，开始上盆。使用长镊子轻柔地将培养基与小苗一起取出，保护根茎部不受伤及，随后以清水轻柔洗去附着在根上的培养基，将组培苗移栽至含等比例的草炭、蛭石和珍珠岩的基质中。

3、矮牵牛转基因植株的阳性鉴定

提取突变体的DNA，以pK7FWG2.0载体上的卡那霉素基因序列（GenBank: LC435709.1）设计特异引物（Kan-f162：GCGTTCAAAAGTCGCCTAAG；Kan-r-775：GCTCTTCGTCCAGATCATCC）进行PCR验证，确定载体转化成功。结果如图2所示。

3、矮牵牛转基因植株开花情况的观察

移栽后2个月起开始记录植株开花情况，间隔两天统计一次。统计过程中，在6:00 —12:00之间每隔两小时统计一次，连续统计一周。结果表明，转基因株系相比较野生型开花时间推迟近 4 个小时（图3、图4、表1）。

表1：矮牵牛Lis：LHY转基因植株开花观察

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种改变矮牵牛开花节律的分子方法

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2536

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggttctgg attttattgg acttgaagat ggtcaattcg ttaaccatgg tacatgcatc 60

ctctagtgga cgaatatttc atttactttt gtccctggtt tggtgcacca ggtcgtaatc 120

aagactaaaa cttttttctg gcgaactcat tgtaacctgc ataattacta taaccaggat 180

attggcattt ccgaagttgt gttttacttc aggaatgacc acttcgaaaa tcaacatatg 240

cccctgtcgt tattttcttt cacatcaaga ttttgtttca tgttaggaca ctatttgcgg 300

atgcacaatg tatgtatcta aagttgtgtt ctcttaatcc agctagaaaa agaggctctt 360

attaaaggag ttccaatcgg gcatactctt gacattgaaa ttcctcctcc acgtcctaaa 420

aagaaaccaa gcaatcctta tccaagaaag acaagtgcag gaggagcttc tagtttgcac 480

agagagaagg atgggaaatt gtcagcgcct gtttcttctt tgtatgtaca taaatccaca 540

ctggacttgg agaaagaacc acatcctgat atgaaaccca gtgatgatgg acagatggga 600

gacactaagc agtaccaaga agaggacagt tgctctgagg ctgtgaccct tatgaagaca 660

gatccttgta catccccatc ttcaattaac agaagttctt tcacgacacc agttgcgccc 720

agaaactcgt acagtgagtt tctacagaga actgagcagg tgggttacga agatgaaaca 780

aatgaatctc atatcaccac cgaacaaaag ggacatgaga aaaataagat agatagcagc 840

aacctttctc gggattttgg cttatgtaaa acttcaaact ttgaaaattc tcaagtttta 900

catgagaagc ctgtacaagg aaaaggaaca aatgagatgg atcattccga aaatgttgat 960

acattgtcaa acaatgttca agcctctcac aactatccga gacatgttgc agttcacatt 1020

cttgatggga acccaggaat gaacacacaa aacatttccc aagatctaaa atatccagaa 1080

actatgtttc atcaatcagg tggtgttaat ggacgaccaa atctattcat ggatcccacc 1140

tcatctgctg tttccgaaca tcaaagtaat gcatcgagac cttccattca tcaatcatat 1200

cccagtttcc atccaatctc gaaccctttc cacaatccag atgattaccg atcatttctg 1260

cacatgtcat ctacattttc aagtcttatt gtatctgctc tgctacaaaa tccagcagcc 1320

catgctgctg caagctttgc agctacatat tggccatgta caaacatgga aactccagca 1380

aaccaccctg ccggtggatt tcagccgagg cagataaatt cagctcctag tatggcagca 1440

attgctgcag ctacagtagc agctgcgact gcatggtggg cagcccatgg cttactccca 1500

ttatgtgccc cgtttcaccc gggctttacc tgttctcccg catctgaatc tgcaatccca 1560

atggatgcaa gtaaagatag agcagctaat actgaaggaa gagaaaaccc tccggacagt 1620

caatatctag aaccagggtg ctctgaggct atgcaagaac agcagtcaac tctgaagtca 1680

ccaacattgt cactgtcaga ttctgttgaa agtgaaggtg caaatgcaaa tgttggatta 1740

acagctactg aaactgaaca aactgcagat gcagctaagt tgaatgattc aaacaagtca 1800

aaaaacagga agaaggtggg tcgttcttca tgtggatcca acacaccttc cagcagtgaa 1860

gttgaggcac atactttgga gaagcaacca aaaggaaaag aagagaagct tgtcaaagac 1920

aaggagtcaa aagaacctga tgtaaatcaa ataactgttg acttcagcaa tcgacgtggc 1980

agaagcacca gcactctaag tgattcttgg aaggaagttt ctcaaggggt aactgtatct 2040

tctaaaaaat tttaaatata aaaattcttc ttgtcaacat gtgtgaaaaa tcatttcccg 2100

ttttttccct tgtctctatc cacttcatgt gcagggacga ctggctttcc aggcactctt 2160

ctctagagaa gtactgccac aaagtttttc cccaccacat gatttagaga aaaaggattt 2220

caaaaatatt gttaaggata tagaaactgc acaggagaaa gatgattatc gattgcagtt 2280

agaccttaat ggcaaggagg gtacctttcc ccataagcga ggaatggaag gaaatgctac 2340

tctgactggt gacaacaaag aagagggact tctcagtatg ggtcttcgat atgcaaagct 2400

aaaatctcag cgaacgggat ttaaaccgta caaaaggtgc tcagtggaag caaaagagag 2460

ctgggtaaag gccaatggcc aggaagaaga gaaaggatcc aagagattac gcatagaagg 2520

agaggcttcc acatag 2536

<210> 2

<211> 1069

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagctcgcgg ccgcaagctt atctaataat gtatcaaaat ctaaaataaa atttaggtta 60

agaagtgggt gcaatttgtt aggcacccac ttcttaatga tccatgtgta atgtttgtta 120

ggcacgctaa gctggagtgc acattatttg ttggctttgt cttgatgtgg taattttatt 180

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tcgaacaagc gtacaccata agaagttaat taacaataat gtgtatatgt ttgtttaata 600

tattaattta gaaaatgaat ttatatatga tggtcgagtg attgataata taatacaaat 660

atacaagttt catttaatat gcgcgggtta gtggctagtt caaattactt catgagcttt 720

tctattcaaa catttactat tgcataagct gacccaactc ttgtattaac ccttataaat 780

ttaaatgatc agtttgacca tgacagatta tattaattcc gattagatta attaatttat 840

tataattggc aattaaaact catttattat atattatgta tagtaataaa ataattgatg 900

atgttaggat ggaagggacg ggagatgagt gcagtaatta aattaaggcc acatcctatc 960

atatcccagt ctataaatac agatccagat ccacttcata taagcaagct atcttcccag 1020

aaaaccaaac caccttaaac aagacaacca tctcgagccc gggactagt 1069

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaaaatccc gagaaaggtt gctgct 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgtcctctt cttggtactg cttagtgtct 30

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggcttactc ccattatgtg ctccgt 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccagcagtg aagttgaggc acatac 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgttcaaaa gtcgcctaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctcttcgtc cagatcatcc 20

Claims (2)

1.一种调控矮牵牛开花时间的方法，其特征在于，利用花特异性启动子proCbLIS和茉莉生物钟基因 JsLHY共同调控植物开花，推迟开花时间，所述JsLHY的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述花特异性启动子proCbLIS的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）合成花特异性启动子proCbLIS；

（2）构建 pK7FWG2.0-proCbLIS 空载体；

（3）扩增茉莉生物钟基因 JsLHY的序列；

（4）构建 pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY 过表达载体；

（5）采用冻融法将 pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY 过表达载体转入农杆菌 GV3103 感受态中；

（6）带有pK7FWG2.0-proCbLIS-JsLHY 过表达载体的农杆菌 GV3103菌液侵染矮牵牛，获得矮牵牛转基因植株。