CN108496802A - 一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物愈伤组织培育技术领域，具体涉及一种南果梨愈伤组织的培养方法及应用。该方法先将南果梨果实用体积分数70％乙醇溶液和1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒，无菌水清洗，得到无菌果实；然后采用特定的诱导培养基和继代培养基进行培养，最终得到南果梨愈伤组织。本发明培养的南果梨愈伤组织生长能力旺盛呈白色疏松状，质地较软，分散性好，且生长速度快。克服了现有方法培养出的南果梨愈伤组织质地较硬，生长缓慢且易老化变黑的问题。

Description

一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用
技术领域
本发明属于植物愈伤组织培育技术领域，具体涉及一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用。
背景技术
由于南果梨童期较长，给利用其果实进行基因定位的GUS染色实验，验证蛋白互作的免疫共沉淀实验，验证转录因子与启动子互作的染色质免疫共沉淀实验及验证基因功能的基因沉默与过表达等实验带来了很大难度。而植物愈伤组织很好地解决了上述问题，如李通等在《Plant Cell》上发表的《The Jasmonate-Activated Transcription FactorMdMYC2Regulates ETHYLENE RESPONSE FACTOR and Ethylene Biosynthetic Genes toPromote Ethylene Biosynthesis during Apple Fruit Ripening》即为利用苹果的愈伤组织进行的免疫共沉淀及染色质免疫共沉淀实验，这就为植物生理活性研究提供了新思路。
愈伤组织是指由母体外植体组织脱分化而不断增殖产生的一团不定性的疏松排列的薄壁细胞。参考文献《不同激素种类和配比对杜梨组培继代苗愈伤组织发生及状态的影响》利用愈伤组织的诱导来获得植物的代谢物质是国内外研究的重要技术手段，因此建立南果梨愈伤组织培养体系显得尤为必要。然而目前报道的南果梨愈伤组织是用叶、子房及茎段诱导的，由于南果梨果实细胞水分含量较大，传统的植物愈伤组织诱导及继代激素配比并不适用于南果梨愈伤组织的培养，目前还没有研究使用南果梨果实诱导愈伤组织。我们参考培养晋蜜梨果实愈伤的诱导及继代浓度，发现诱导培养基无法诱导出南果梨果实愈伤组织，继代培养基上生长的愈伤组织质地较硬，且易老化变黑。因此，需要对现有的愈伤组织培养方法进行改进，以适应南果梨果实诱导愈伤组织。
发明内容
本发明的目的是提供一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用，解决了现有技术中南果梨果实无法诱导出愈伤组织；或生长的愈伤组织质地较硬，易老化变黑的问题。
本发明提供的一种南果梨愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：S1，取成熟且完整的南果梨果实，依次用体积分数70％乙醇溶液和1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒，无菌水清洗，得到无菌果实；
S2，将所述无菌果实去皮，然后切下果肉，平铺到诱导培养基中，25～28℃暗培养，直至长出愈伤组织，得到带有愈伤组织的果肉；
所述诱导培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入2mg的2,4-D和1.5mg的6-BA；
S3，取出带有愈伤组织的果肉，切下愈伤组织，置于继代培养基中，25～28℃暗培养，28-32d继代一次，直至获得白色疏松的南果梨愈伤组织。
优选的，上述南果梨愈伤组织的培养方法，S1的具体步骤为：南果梨果实保留2～4cm长的果柄，先在体积分数70％乙醇溶液浸泡消毒1min，再放入1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，无菌水清洗4～5次，得到无菌果实。
优选的，上述南果梨愈伤组织的培养方法，S2中，切下的果肉的厚度为1mm。
优选的，上述南果梨愈伤组织的培养方法，S3中，所述继代培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入2.5mg的2,4-D和1mg的6-BA。
本发明还提供了一种所述的培养方法培养的南果梨愈伤组织。
本发明还提供了一种所述的南果梨愈伤组织在GUS染色、免疫共沉淀、Pull-down、染色质免疫共沉淀及基因稳定性遗传实验中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的南果梨愈伤组织、培养方法及应用，具有以下有益效果：
以南果梨果实为材料，采用现有技术培养的愈伤组织在继代初期呈暗黄色，之后逐渐呈棕黄色且质地较硬，长势缓慢，20d左右总体积仅为1-2cm，不呈颗粒状，30d左右会老化变黑。而采用本发明方法培养的南果梨愈伤组织生长能力旺盛，生长速度快，20d左右可长至总体积约5-6cm3，分散性好，呈白色疏松状且质地较软，30d颜色才变为暗黄色。克服了现有技术南果梨愈伤组织质地较硬，生长缓慢且易老化变黑的问题。
附图说明
图1为实施例1诱导培养出的带有愈伤组织的果肉；
图2为实施例1继代培养出的南果梨愈伤组织；
图3为对比例1继代培养30d时的南果梨愈伤组织。
具体实施方式
下面对发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。此外，本发明下述实施例中采用的MS固体培养基等各种试剂均为市售。
本发明提供了一种南果梨愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
S1，取成熟且完整的南果梨果实，依次用体积分数70％乙醇溶液和1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒，无菌水清洗，得到无菌果实；
S2，将所述无菌果实去皮，然后切下果肉，平铺到诱导培养基中，25～28℃暗培养，直至长出愈伤组织，得到带有愈伤组织的果肉；
所述诱导培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入2mg的2,4-D和1mg的6-BA；
S3，取出带有愈伤组织的果肉，切下愈伤组织，置于继代培养基中，25～28℃暗培养，直至获得白色疏松的南果梨愈伤组织，符合要求的南果梨愈伤组织表现为生长能力旺盛，白色疏松，分散性好，生长速度快。
优选的，本发明一种南果梨愈伤组织的培养方法，包括以下实施例。
实施例1
一种南果梨愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
S1，取成熟且完整的南果梨果实(开花后134d产生的果实)，南果梨果实保留2cm长的果柄，先在体积分数70％乙醇溶液浸泡消毒1min，再放入1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，无菌水清洗4次，得到无菌果实。
S2，将所述无菌果实去皮，然后切下1mm厚、长0.5cm、宽0.4cm的果肉，平铺到诱导培养基中，25℃暗培养20d，直至长出愈伤组织，得到带有愈伤组织的果肉，如图1所示；
所述诱导培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基(市售MS固体培养基，不含琼脂和蔗糖)，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，用1mol/L的NaOH调pH至6.0，然后加入2mg的2,4-D和1.5mg的6-BA；121℃下高压灭菌20min，现配现用；
S3，在超净工作台中，用镊子取出带有愈伤组织的果肉，在玻璃培养皿上，用手术刀切下浅黄色的愈伤组织，置于继代培养基中，25℃暗培养，28d继代一次，直至获得白色疏松的南果梨愈伤组织，如图2所示；20d左右可长至体积约5-6cm3，分散性好，呈白色疏松状且质地较软，30d颜色才变为暗黄色。
所述继代培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至6.0，然后加入2.5mg的2,4-D和1mg的6-BA；121℃下高压灭菌20min，现配现用。
实施例2
一种南果梨愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：
S1，取成熟且完整的南果梨果实(开花后134d产生的果实)，南果梨果实保留3cm长的果柄，先在体积分数70％乙醇溶液浸泡消毒1min，再放入1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，无菌水清洗5次，得到无菌果实。
S2，将所述无菌果实去皮，然后切下1mm厚、长0.8cm、宽0.6cm的果肉，平铺到诱导培养基中，28℃暗培养20d，直至长出愈伤组织，得到带有愈伤组织的果肉；
所述诱导培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基(市售MS固体培养基，不含琼脂和蔗糖)，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，用1mol/L的NaOH调pH至5.8，然后加入2mg的2,4-D和1.5mg的6-BA；121℃下高压灭菌20min，现配现用；
S3，在超净工作台中，用镊子取出带有愈伤组织的果肉，在玻璃培养皿上，用手术刀切下浅黄色的愈伤组织，置于继代培养基中，28℃暗培养，32d继代一次，直至获得白色疏松的南果梨愈伤组织；20d左右可长至体积约5-6cm3，分散性好，呈白色疏松状且质地较软，30d颜色才变为暗黄色。
所述继代培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至6.1，然后加入2.5mg的2,4-D和1mg的6-BA；121℃下高压灭菌20min，现配现用。
由于南果梨果实具有较多石细胞的特殊情况，参考其他文献(《油桃果实愈伤组织诱导与继代培养研究》、《梨果实愈伤组织对致腐真菌侵染的生理晌应机制研究》、《不同激素种类和配比对杜梨组培继代苗愈伤组织发生及状态的影响》)培养的南果梨愈伤组织很难存活，生长势很差，生长及其缓慢，质地较硬，颜色暗黄且易老化变黑。以《油桃果实愈伤组织诱导与继代培养研究》中所述方法作为对比例1，诱导培养出的带有愈伤组织的果肉如图3所示，继代初期呈暗黄色，之后逐渐呈棕黄色，20d左右总体积仅为1-2cm3，不呈颗粒状，30d左右会老化变黑，且质地较硬，长势缓慢。相比之下，本发明针对南果梨果实，培养出的南果梨愈伤组织生长势好，生长速度快，质地松软，呈白色颗粒状，利于该愈伤组织进行GUS染色、免疫共沉淀、Pull-down、基因稳定性遗传实验。
需要说明的是，本发明中涉及到数值范围时，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种南果梨愈伤组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，取成熟且完整的南果梨果实，依次用体积分数70％乙醇溶液和1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒，无菌水清洗，得到无菌果实；
S2，将所述无菌果实去皮，然后切下果肉，平铺到诱导培养基中，25～28℃暗培养，直至长出愈伤组织，得到带有愈伤组织的果肉；
所述诱导培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入2mg的2,4-D和1.5mg的6-BA；
S3，取出带有愈伤组织的果肉，切下愈伤组织，置于继代培养基中，25～28℃暗培养，28-32d继代一次，直至获得白色疏松南果梨愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的南果梨愈伤组织的培养方法，其特征在于，S1的具体步骤为：南果梨果实保留2～4cm长的果柄，先在体积分数70％乙醇溶液中浸泡消毒1min，再放入1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，无菌水清洗4～5次，得到无菌果实。
3.根据权利要求1所述的南果梨愈伤组织的培养方法，其特征在于，S2中，切下的果肉的厚度为1mm。
4.根据权利要求1所述的南果梨愈伤组织的培养方法，其特征在于，S3中，所述继代培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入2.5mg的2,4-D和1mg的6-BA。
5.根据权利要求1～4任一项所述的培养方法培养的南果梨愈伤组织。
6.根据权利要求5所述的南果梨愈伤组织在GUS染色、免疫共沉淀、Pull-down、染色质免疫共沉淀及基因稳定性遗传实验中应用。
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