CN104186313A - 苹果果肉愈伤组织的诱导培养基及其诱导增殖培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苹果果肉愈伤组织的诱导培养基，包括MS+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且培养基的pH值为5.8。同时公开了其诱导增殖培养基培养方法。本发明所述的苹果果肉愈伤组织的诱导培养基及其诱导增殖培养方法使得果肉愈伤诱导率达到了100%，为苹果的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为苹果基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为苹果果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。

Description

苹果果肉愈伤组织的诱导培养基及其诱导增殖培养方法

技术领域

本发明涉及果肉愈伤组织的诱导培养基及其诱导增殖培养方法，尤其是涉及一种苹果果肉愈伤组织的诱导培养基及其诱导增殖培养方法，属于植物生物技术领域。 

背景技术

苹果(Malus domestica Borkh)作为世界主要栽培果树之一已有几千年的栽培历史，其遗传背景复杂、杂和度高、生命周期长、童期长、自交亲和性差、杂交繁殖模式复杂等诸多问题，给遗传育种研究带来了很大障碍。传统遗传育种方法的局限性使苹果育种进程缓慢。随着苹果分子生物学研究的不断深入和发，分子生物学手段为苹果的遗传研究和育种工作提供了有利工具(姚玉新等，2004，果树学报，21(6)：586～591)。 

目前很多国家都开展了苹果基因组的研究，苹果基因组研究的方向主要涉及抗性、树体生长习性、果实品质和果实生产特性四个大方面，其中苹果重要经济性状尤其是与果实品质形成相关的分子机理研究也成为苹果基因组研究的热点，而在苹果的分子机理研究方面，愈伤组织成为常用的试验材料，也是基因工程研究中进行基因转化所必需的试验材料。愈伤组织是指外植体在离体培养条件下，形成的一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团，在培养过程中，经过诱导分化可以发育成完整的再生植株。愈伤组织是植物的外植体经过脱分化形成的，多种外植体都可以经过组织培养诱导形成愈伤组织，而植物愈伤组织因为具有以下特点而被广泛应用于植物分子机理和基因工程研究中。愈伤组织的特点：①无性繁殖，大量扩繁；②为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供材料；③为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础；④为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操对象；⑤为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系。(Paula Alayón-Luaces等，2012，Plant Science (185–186)：169～175)。 

苹果的愈伤组织培养研究目前已经有很多，对于苹果来说几乎所有器官和组织都可以作为外植体，经过组织培养诱导出愈伤组织。但是就目前的研究来看，对苹果愈伤组织的研究多集中于研究叶片的愈伤组织，已经有多篇关于苹果叶片愈伤组织诱导的报道(崔美等，2012，山东农业科学，44(3)：17～20；高兵，2005，南京农业大学硕士学位论文)。因此苹果叶片愈伤组织培养技术已经有一整套完整的体系。然而，随着苹果分子生物学研究的不断深入，仅仅研究单一器官或者组织的的愈伤组织培养，显然不能满足研究需要，目前苹果的研究中，对果实品质形成以及果实成熟发育的分子机理研究是一大热点，因此，培养苹果果肉的愈伤组织是研究苹果果实品质形成以及果实成熟发育分子机理的一条非常重要的途径。 

‘金冠’(Malus×domestica Borkh.‘Golden Delicious’)又名金帅、黄香蕉、黄元帅，适应性广，丰产性好，栽培技术相对简单，果实品质优良。是国内外广泛栽培的苹果品种，也深受广大消费者的喜爱。目前对‘金冠’果实品质的研究也越来越多，但是目前还未见有相关‘金冠’果实果肉愈伤组织培养方法的相关报道。 

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的发明目的在于提供一种高效快速的‘金冠’苹果果肉愈伤组织的诱导培养基及其诱导增殖培养方法。 

本发明采取的技术方案为： 

一种苹果果肉愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，包括MS+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且培养基的pH值为5.8。 

进一步，1L诱导培养基中MS培养基粉剂的用量为4.4g。 

一种苹果果肉愈伤组织的诱导增殖培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 

(1)外植体的选取及处理：将苹果花后40-60天的果实进行消毒处理；消毒完成后用无菌手术刀片小心削去果皮，从果皮至果心将苹果果肉分为外、中、内三个部分，将三部分的果肉切成0.5mm的薄片后用直径0.5cm的打孔器将果 肉打成圆片，后接种于愈伤组织诱导培养基中； 

(2)外植体增殖培养：将接种于愈伤组织诱导培养基中的果肉圆片在黑暗培养箱中，温度为25℃的条件下，培养30-35天后，在无菌条件下切下果肉圆片周围长出的愈伤组织，然后接种于愈伤组织增殖培养基中，培养30-35天。 

更进一步，步骤(1)所述的苹果果实消毒处理的具体步骤为：将苹果果实的表面用流水冲洗干净，然后在无菌条件下，用浓度为75％的乙醇消毒2min后，用无菌去离子水冲洗3次，再用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液消毒8min，然后再用无菌去离子水冲洗4-5次，最后用无菌滤纸吸干苹果果实的表面水分。 

且步骤(2)所述的愈伤组织增殖培养基包括MS+0.5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且pH值为5.8。 

本发明的有益效果为：本发明所述的苹果果肉的增殖培养基及其增殖培养方法使得果肉愈伤诱导率达到了100％，为苹果的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为苹果基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为苹果果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。 

附图说明

图1为本发明所述的经过诱导增殖培养后的苹果果肉愈伤组织的示意图。 

具体实施方式

现在参考附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。 

供试材料：所用植物材料是‘金冠’苹果花后20-40天、40-60天、60-80天的果实。 

果肉愈伤组织质量评价指标分别为： 

(1)愈伤组织的颗粒大小 

以培养45天的果肉愈伤组织为准，测量不同培养基和不同培养条件下诱导果肉愈伤组织的大小，愈伤组织的直径小于3mm为不合格愈伤组织，愈伤组织直径大于3mm为合格。 

(2)愈伤组织的颗粒散碎度 

步骤(1)筛选完成后，筛选出大小合适的愈伤组织。颗粒散碎表示:愈伤组 织容易松散，不紧密，愈伤组织表面毛刺状不平滑。颗粒致密表示:愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰。 

(3)愈伤组织的色泽 

根据愈伤组织生长的具体情况分为四个等级 

a、白色 

一般颜色很白的愈伤组织表现为苍白色，这种颜色的愈伤组织整体特征是组织松软，容易松散，而且类似于组织培养中植株的玻璃化的表现，愈伤组织往往出现水渍化的情况，这种愈伤组织培养一段时间后细胞逐渐死亡，因此白色的愈伤组织是不合格的。 

b、黄白色 

黄白色愈伤组织没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度高，愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构，是合格质量好的愈伤组织。 

c、深黄色 

深黄色愈伤组织虽然也没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度也比较高，但是深黄色愈伤组织培养一段时间以后很容易褐化，褐化以后组织容易死亡，也是不合格的愈伤组织。 

d、褐色 

这类愈伤组织从培养之初就开始呈现褐色，表现出明显的褐化，褐化的愈伤组织不具备再生的能力，一段时间后细胞也会死亡，也是不合格的愈伤组织。 

(4)愈伤组织的再分化能力 

愈伤组织分化能力好坏取决于前面三个步骤，大小适中、组织颗粒致密、硬度较高、颜色黄白色的愈伤组织具有很强的分化能力，分化出的愈伤组织也有很高的质量，否则愈伤组织分化能力弱，分化出来的愈伤组织质量也不好。 

愈伤组织诱导培养基的配方筛选： 

将苹果‘金冠’的花后果肉分别接种于附加不同浓度的2,4-D、6-BA的MS培养基上研究不同配比的植物生长调节剂对苹果‘金冠’果肉愈伤组织诱导培养的影响，培养基中附加蔗糖(20g/L)、琼脂粉(6g/L)，如表1所示。 

表1 不同的激素配比对‘金冠’果实愈伤组织的诱导的影响 

由表1的结果可知：培养基中添加2,4-D和6-BA的浓度分别是1.5mg/L和0.4mg/L时，产生的愈伤组织大小适中，组织紧密。颜色黄白色，组织分化能力强，愈伤组织诱导率达到100％，是最合适的果肉愈伤组织诱导激素配比。愈伤组织诱导培养基的配方为MS+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且培养基的pH值为5.8。 

以上所述的培养基配方中： 

MS：MS是MS培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。具体配方可参照此书：(曹孜义等，实用植物组织培养教程，1996，甘肃科学技术出版社)。在‘金冠’苹果果肉愈伤组织的诱导培养中我们使用由美国sigma公司生产MS培养基粉剂(Murashige and Skoog basal salt mixture)，此MS培养基粉剂要求每配制一升培养基添加4.4克粉剂，在本培养基的配制中，每配制一 升‘金冠’苹果果肉愈伤组织的诱导培养基需要加入MS培养基粉剂4.4克。 

2,4-D：2,4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效，是组织培养中常用的植物生长调节剂。培养基中2,4-D浓度的差异对愈伤组织的诱导和形成类型有重要影响，2,4-D为多种植物愈伤组织的诱导脱分化所必需。在诱导培养基中，通常添加1-6mg/L的2,4-D以诱导植物各种外植体细胞的脱分化，形成愈伤组织。本试验中添加1.5mg/L的2,4-D就能够很好的诱导‘金冠’苹果果实愈伤组织的形成，将2,4-D配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。 

6-BA：6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。但是一般在诱导愈伤组织发生时浓度不宜过高，本试验中添加0.4mg/L的6-BA就能够很好的诱导‘金冠’苹果果实愈伤组织的形成，将6-BA配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。 

蔗糖：蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，使用工业生产的分析纯的蔗糖。一般的组织培养中，蔗糖都是添加30g/L,在本试验中，因为所选植物材料是果肉，果肉本身含有糖分，因此培养时蔗糖浓度不宜过高，本试验中所用蔗糖为20g/L。 

琼脂粉：琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用。一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。 

培养基pH值：‘金冠’苹果果肉愈伤组织的培养对pH值的要求比较严格，过高或者过低都会造成植株生长不好，或者死亡，因此一定要精准调节PH值到5.8。 

将苹果‘金冠’的三个不同生长时期(花后20-40天、40-60天、60-80天的果实)的果肉分别接种于MS+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的培养基上研究不同的果实生长时期对苹果‘金冠’果实愈伤组织诱导的影响，具体如表2所示： 

表2 果实的不同生长时期对‘金冠’果实愈伤组织的诱导的影响 

如表2所示：果实的不同生长时期对愈伤组织的诱导有很大的影响，从试验结果可以看出，花后40-60天的果实比较容易诱导愈伤组织，诱导率达到100％，而果实生长期过短，愈伤组织质量不好，诱导率低，生长期过长果肉老化，愈伤组织容易褐化，因此诱导愈伤组织最合适的果实生长时期应该在花后40-60天。 

将苹果‘金冠’的果肉接种于MS+2,4-D(1.5mg/L)+6-BA(0.4mg/L)+蔗糖(20g/L)+琼脂粉(6g/L)的培养基上，一部分在光照环境下培养，一部分在完全遮光的黑暗条件下培养，研究光照和暗培养对苹果‘金冠’果实愈伤组织诱导的影响，具体如表3所示： 

表3 不同培养条件对‘金冠’果实愈伤组织的诱导的影响 

由表3可知：果实的愈伤组织培养不同于叶片或者其他外植体愈伤组织，需要在完全黑暗的条件下培养，在试验中，如果按照我们平时普通外植体愈伤培养的条件培养果实愈伤，得到的愈伤不仅质量差，而且愈伤诱导率非常低，而在完全黑暗条件下培养的愈伤，诱导率可以达到100％，愈伤质量也很好，因此，果实愈伤培养不需要光照。 

因此，具体的‘金冠’苹果果肉愈伤组织的增殖培养步骤如下： 

(1)外植体的选取及处理：将苹果花后40-60天的果实进行消毒处理，消 毒处理的具体步骤为：将苹果果实的表面用流水冲洗干净，然后在无菌条件下，用浓度为75％的乙醇消毒2min后，用无菌去离子水冲洗3次，再用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液消毒8min，然后再用无菌去离子水冲洗4-5次，最后用无菌滤纸吸干苹果果实的表面水分；消毒完成后用无菌手术刀片小心削去果皮，从果皮至果心将苹果果肉分为外、中、内三个部分，将三部分的果肉切成0.5mm的薄片后用直径0.5cm的打孔器将果肉打成圆片，后接种于愈伤组织诱导培养基中。 

(2)外植体增殖培养：将接种于愈伤组织诱导培养基中的果肉圆片在黑暗培养箱中，温度为25℃的条件下，培养30-35天后，果实圆片周围长出不规则形状的愈伤组织，在无菌条件下切下果肉圆片周围长出的愈伤组织，然后接种于愈伤组织增殖培养基中，其中，愈伤组织增殖培养基包括MS+0.5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且pH值为5.8，培养30-35天后，愈伤体积变为原来体积的3-4倍，增殖后的愈伤组织一部分用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于增殖培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。 

图1为本发明所述的经过诱导增殖培养后的苹果果肉愈伤组织的示意图。如图1所示：经过上述诱导增殖培养方法培养后的金冠’苹果果肉愈伤组织紧密，大小适中，颜色黄白色，是质量好的愈伤组织。 

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，上述说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。 

Claims (5)

1.苹果果肉愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，包括MS+1.5 mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且培养基的pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的苹果果肉愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，1L增殖培养基中MS培养基粉剂的用量为4.4g。

3.苹果果肉愈伤组织的诱导增殖培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选取及处理：将苹果花后40-60天的果实进行消毒处理；消毒完成后用无菌手术刀片小心削去果皮，从果皮至果心将苹果果肉分为外、中、内三个部分，将三部分的果肉切成0.5mm的薄片后用直径0.5cm的打孔器将果肉打成圆片，后接种于愈伤组织诱导培养基中；

（2）外植体增殖培养：将接种于愈伤组织诱导培养基中的果肉圆片在黑暗培养箱中，温度为25℃的条件下，培养30-35天后，在无菌条件下切下果肉圆片周围长出的愈伤组织，然后接种于愈伤组织增殖培养基中，培养30-35天。

4.根据权利要求3所述的苹果果肉愈伤组织的诱导增殖培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的苹果果实消毒处理的具体步骤为：将苹果果实的表面用流水冲洗干净，然后在无菌条件下，用浓度为75%的乙醇消毒2min后，用无菌去离子水冲洗3次，再用质量浓度为10%的次氯酸钠溶液消毒8min，然后再用无菌去离子水冲洗4-5次，最后用无菌滤纸吸干苹果果实的表面水分。

5.根据权利要求3所述的苹果果肉愈伤组织的诱导增殖培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的愈伤组织增殖培养基包括MS+0.5 mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，且pH值为5.8。