CN104686355A - 提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法，包括苹果茎尖的消毒和灭菌、苹果无菌苗的获得、苹果无菌苗叶片的切割、苹果叶片愈伤组织和芽的诱导、生根培养等步骤。本发明的目的在于提供一种叶片的出愈率和出芽率高的提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法。本发明使每个叶片保持完整性明显提高了叶片的成活率，而且切口总长度相对增加2~4倍，促使每个叶片的出愈率和出芽率比传统方法至少提高2~4倍。

Description

提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法。

背景技术

使用传统方法进行切割每个苹果叶片仅能获得1个外植体，若想获得2个以上的外植体，采用传统方法切割的外植体由于太小很难成活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种叶片的出愈率和出芽率高的提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

⑴ 苹果茎尖的消毒和灭菌

取春季取刚萌动的苹果新梢，用流动的自来水冲洗干净后，剥取茎尖，用75%的酒精消毒30~40s，再用无菌水冲洗干净，然后用0.1％的升汞消毒3~4 min，再用无菌水冲洗3~4遍，用无菌滤纸吸去多余水分后接种；

（2）苹果无菌苗的获得

每个100ml的培养瓶接种5~7个苹果茎尖，培养条件为每天光照12 h，光照强度2000 lx，培养温度26℃；培养30d后获得5~6cm高的苹果无菌苗；

（3）苹果无菌苗叶片的切割

取上述苹果无菌苗充分展开的叶片，在垂直主脉方向两侧各切2~3刀，不切透叶缘和主脉并保持叶片完整，叶片反面朝上平铺在分化培养基上；分化培养基组成是：MS+6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 g/L，pH为5.8；

（4）苹果叶片愈伤组织和芽的诱导

经步骤（3）苹果无菌苗叶片接种10d后，叶片颜色仍为绿色，稍膨大，叶片切口边缘处翘起，多数叶片在切口处形成少量白色或淡绿色的愈伤组织，愈伤组织结构较疏松；随着培养时间的延长，愈伤组织逐渐膨大变多，20d后苹果叶片开始分化形成大量不定芽；

（5）生根培养

待幼芽长到2~3cm大小时，在超净工作台上切下幼芽，将切取的幼芽转入生根培养基上培养；生根培养基为：1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 g/L，pH为5.8。

苹果品种为“鲁加6号”。

本发明处理方法可以使苹果无菌苗的每个叶片保持完整，每个叶片靠近主脉中央有4~8个切口，不仅增加了苹果叶片外植体的存活率，而且也明显提高了叶片的出愈率和出芽率。由于苹果无菌苗叶片较小，使用传统方法进行切割每个苹果叶片仅能获得1个外植体，若想获得2个以上的外植体，采用传统方法切割的外植体由于太小很难成活。与传统切割方法比较，本发明每个苹果无菌苗叶片上至少有4个切口，最高可达8个切口，相对传统切割方法的2个切口，该法使每个叶片保持完整性明显提高了叶片的成活率，而且切口总长度相对增加2~4倍，促使每个叶片的出愈率和出芽率比传统方法至少提高2~4倍。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

一种提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法，依次包括下列步骤：

⑴ 苹果茎尖的消毒和灭菌

苹果品种为“鲁加6号”。取春季取刚萌动的苹果新梢，用流动的自来水冲洗干净后，小心剥取茎尖，用75%的酒精消毒30~40 s，再用无菌水冲洗干净，然后用0.1％的升汞消毒3~4 min，最后用无菌水冲洗3~4遍，用无菌滤纸吸去多余水分后接种。

（2）苹果无菌苗的获得

每个100ml的培养瓶接种5~7个苹果茎尖，培养条件为每天光照12 h，光照强度2 000 lx，培养温度26℃。培养30d后获得5~6cm高的苹果无菌苗。

（3）苹果无菌苗叶片的切割

取上述苹果无菌苗充分展开的叶片，在垂直主脉方向两侧各切2~3刀，注意不要切透叶缘和主脉并保持叶片完整，叶片反面朝上平铺在分化培养基上（即接种培养），分化培养基组成是：MS+6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 g/L，pH为5.8。

（4）苹果叶片愈伤组织和芽的诱导

苹果无菌苗叶片接种10d后，叶片颜色仍为绿色，稍微膨大，叶片切口边缘处翘起，多数叶片在切口处形成少量白色或淡绿色的愈伤组织，愈伤组织结构较疏松；随着培养时间的延长，愈伤组织逐渐膨大变多， 20 d后苹果叶片开始分化形成大量不定芽。

（5）生根培养

待幼芽长到2~3cm大小时，在超净工作台上切下幼芽，尽量将愈伤组织去除干净，将切取的幼芽转入生根培养基上培养。生根培养基为：1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 g/L，pH为5.8。

Claims (2)

1.一种提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

⑴ 苹果茎尖的消毒和灭菌

取春季取刚萌动的苹果新梢，用流动的自来水冲洗干净后，剥取茎尖，用75%的酒精消毒30~40s，再用无菌水冲洗干净，然后用0.1％的升汞消毒3~4 min，再用无菌水冲洗3~4遍，用无菌滤纸吸去多余水分后接种；

（2）苹果无菌苗的获得

每个100ml的培养瓶接种5~7个苹果茎尖，培养条件为每天光照12 h，光照强度2000 lx，培养温度26℃；培养30d后获得5~6cm高的苹果无菌苗；

（3）苹果无菌苗叶片的切割

取上述苹果无菌苗充分展开的叶片，在垂直主脉方向两侧各切2~3刀，不切透叶缘和主脉并保持叶片完整，叶片反面朝上平铺在分化培养基上；分化培养基组成是：MS+6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 g/L，pH为5.8；

（4）苹果叶片愈伤组织和芽的诱导

经步骤（3）苹果无菌苗叶片接种10d后，叶片颜色仍为绿色，稍膨大，叶片切口边缘处翘起，多数叶片在切口处形成少量白色或淡绿色的愈伤组织，愈伤组织结构较疏松；随着培养时间的延长，愈伤组织逐渐膨大变多，20d后苹果叶片开始分化形成大量不定芽；

（5）生根培养

待幼芽长到2~3cm大小时，在超净工作台上切下幼芽，将切取的幼芽转入生根培养基上培养；生根培养基为：1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 g/L，pH为5.8。

2.根据权利要求1所述的提高苹果无菌苗叶片出愈率和出芽率的方法，其特征是：苹果品种为“鲁加6号”。