CN114793897A

CN114793897A - 一种枣果肉愈伤组织及其诱导方法和应用

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Publication number: CN114793897A
Application number: CN202210428919.5A
Authority: CN
Inventors: 刘孟军; 王立新; 赵若雨; 郭晓雪; 朱文慧; 李瑞梅
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2022-04-22
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-04-22
Also published as: CN114793897B

Abstract

本发明提供了一种枣果肉愈伤组织及其诱导方法和应用，属于果肉愈伤技术领域。本发明提供的枣果肉愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：（1）枣果实消毒后去皮，得到枣果肉；（2）枣果肉切分后，接种于愈伤组织诱导培养基，进行培养，得到枣果肉愈伤组织。本发明成功建立了‘相枣’果实愈伤组织及其诱导方法，愈伤组织诱导率达到100%。本发明为研究‘相枣’相关的的分子生物学功能研究提供了一条新的途径，为枣遗传转化研究提供一种新的试验材料，同时也为其他枣果肉愈伤的诱导培养提供了参考和借鉴。

Description

一种枣果肉愈伤组织及其诱导方法和应用

技术领域

本发明涉及果肉愈伤技术领域，尤其涉及一种枣果肉愈伤组织及其诱导方法和应用。

背景技术

枣（Ziziphus jujube Mill.）为鼠李科枣属植物，原产于中国，是中国最古老同时也是发展最快的果树之一，现已成为栽培面积接近苹果和柑橘，产量（占世界99%）居干果中第一位的主栽果树。

我国枣资源丰富，有800多个品种。最初，枣品种是从酸枣中选育而来的，虽然品种选育历史悠久，但育种技术发展缓慢，目前仍以品种选优为主，常规杂交育种方法难以从获得后代中选育出新品种。通过诱导愈伤获得再生植株，可以在短时间内增殖大量的杂交后代，并且可以为选育优良品种提供条件。此外，愈伤组织也可以用于遗传转化、种质资源保存与快繁生产的材料。因此，研究枣不同愈伤组织的诱导对上述功能实现变得至关重要。

目前，在枣方面对于愈伤组织的研究虽然已有很多，但是对于枣愈伤组织的研究多集中在叶片、花药等外植体上。目前还没有通过枣果肉诱导愈伤组织的报道。而对于枣的各种研究中，果实品质的形成以及果实成熟发育的分子机理解析同样是枣研究的一大热点。因此，探究诱导枣果肉愈伤组织可为枣遗传转化研究提供一种新的试验材料，同时也为其他枣果肉愈伤的诱导培养提供了参考和借鉴。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枣果肉愈伤组织及其诱导方法和应用。通过构建枣果肉愈伤组织，为进一步研究果实品质的形成及果实成熟发育的分子机理提供基础，为相关分子生物学及基因工程的研究提供良好的材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种枣果肉愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：

（1）枣果实消毒后去皮，得到枣果肉；

（2）枣果肉切分后，接种于愈伤组织诱导培养基，进行培养，得到枣果肉愈伤组织。

优选的，所述枣果实的品种为相枣。

优选的，所述枣果实处于处于花后14~16天的幼果期。

优选的，所述消毒的方法为：所述枣果实冲洗后，依次用1%氯化汞和75%的酒精消毒。

优选的，所述切分后枣果实呈方形，边长为2~3 cm，厚度为0.6~10 mm。

优选的，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS 4~5 g/L、6-BA 0.8~1.2 mg/L、2,4-D 0.8~1.2 mg/L、蔗糖15~25 g/L、琼脂5~7 g/L，pH为5.7~6.0。

优选的，步骤（2）中所述培养的温度为26~30 ℃，时间为18~25 d。

本发明还提供了一种所述的诱导方法得到的枣果肉愈伤组织。

本发明还提供了一种所述的枣果实愈伤组织作为枣遗传转化试验材料的应用。

本发明所用外植体来自果实，果实的取材只需要统一下幼果发生的时期即可，所得实验材料能够保持高度的一致性，同一个果实上取出的全部果肉培养出的愈伤其年龄和生理状态均可保持一致，这样其产生的愈伤对于后期研究均不会产生很大的误差。另外，在消毒方面由于果肉本身有果皮保护，几乎不带病原菌，因此，只需将其整个带有果皮的果实进行消毒处理即可，且这样的消毒方式并不会对果肉本身带有伤害，而且相同生理状态的果实对其进行愈伤组织诱导，所得愈伤组织性状稳定、增殖能力强，愈伤组织材料可以保持高度的一致性。

本发明成功建立了‘相枣’果实愈伤组织的诱导方法，愈伤组织诱导率达到100%。本发明为为研究‘相枣’相关的分子生物学功能研究提供了一条新的途径，为枣遗传转化研究提供一种新的试验材料，同时也为其他枣果实肉愈伤的诱导培养提供了参考和借鉴。

附图说明

图1为实施例1幼果期‘相枣’果肉诱导的愈伤组织（20 d）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、试验材料

所用的植物材料外植体为‘相枣’幼果期、白熟期、点红期、半红期和全红期的果实。

2、试验方法

将果实表面用流水冲洗25分钟，在超净工作台无菌条件下，每组取30个生长一致的果实，用1 %的氯化汞消毒8分钟，用无菌水冲洗5次，然后用75 %的酒精消毒40分钟，无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干果皮表面的水分，消毒完成后用无菌的手术刀片小心的削去果皮，去除果核，将果肉切成0.8 mm厚2 cm长的方块片状，之后将各组均切分后的果肉片接种于含有不同浓度6-BA（0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L）和2,4-D（1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L）浓度的愈伤组织诱导培养基中，在盖有黑布的组培架上28 ℃培养10天，方块周围会有不规则的愈伤组织长出，将长出愈伤继续接种于增殖培养基（与愈伤组织诱导培养基一样）中继续培养，得到‘相枣’果肉愈伤组织。

愈伤组织诱导培养基组成如下（1 L水）：MS 4.43 g/L+6-BA+2,4-D+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L，pH=5.8。

MS组成为：NH₄NO₃ 1650 mg/L、H₃BO₃ 6.2 mg/L、CaCl₂ 332.2 mg/L、CoCl₂∙6H₂O0.025 mg/L、CuSO₄∙5H₂O 0.025 mg/L、KH₂PO₄170.00 mg/L、 FeSO₄∙7H₂O 27.80 mg/L、C₁₂H₁₇ClN₄OS∙HCl 0.100 mg/L、MnSO₄∙H₂O16.900 mg/L、C₆H₅NO₂0.500 mg/L、KI 0.830 mg/L、C₈H₁₁NO₃∙HCl 0.500 mg/L、C₆H₁₂O₆100.00 mg/L、C₂H₅NO₂2.00 mg/L、Na₂MoO₄∙2H₂O 0.250mg/L、KNO₃1900.00 mg/L、MgSO₄180.70 mg/L、C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈∙2H₂O 37.26 mg/L、ZnSO₄∙7H₂O8.600 mg/L。

‘相枣’果肉愈伤组织质量的评价指标

（1）愈伤组织的颗粒大小

以增殖培养1个月的果肉愈伤组织为准，测量不同培养基诱导果肉愈伤组织的大小，愈伤组织直径大于3毫米为合格。

（2）愈伤组织的颗粒散碎度和颗粒致密度

颗粒散碎表示：愈伤组织容易松散，不紧密，愈伤组织表面毛刺状不光滑；

颗粒致密表示：愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰。

（3）愈伤组织的外观

愈伤组织合格颜色应该为深黄或黄白色；无水渍化现象，组织颗粒致密，硬度较高；愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构。

（4）愈伤组织的再分化能力

愈伤组织分化能力的好坏取决于前面三个步骤，大小适中、组织颗粒致密、硬度较高、颜色黄白色的愈伤组织具有很强的分化能力，分化出的愈伤组织也有很高的质量，否则愈伤组织分化能力强，分化出来的愈伤组织质量也不好。

表1 不同激素浓度对‘相枣’幼果愈伤组织诱导的影响

从表1可知，培养基中添加6-BA和2,4-D的浓度分别是1mg/L和1mg/L时，产生的愈伤组织大小适中，组织紧密，颜色为黄白色，组织分化能力较强，愈伤组织诱导率达到100%，是最适合的果实愈伤组织诱导激素配比。

表2 ‘相枣’果实生长时期对愈伤组织诱导的影响

不同时期	颗粒大小（mm)	颗粒散碎度	颜色	分化能力	愈伤诱导率（%）
						幼果	>3mm	疏松	黄白	最强	100
白熟期	>3mm	疏松	黄白	强	82.8
						点红期	<3mm	紧密	褐黄	一般	61
半红期	<3mm	水渍	褐色	弱	35.6
						全红期	<3mm	紧密水渍	褐色	最弱	12.4

不同生长时期的‘相枣’果实对愈伤组织的诱导能力有很大的影响，由表2可知，幼果期的果实适合诱导愈伤，通过该试验还可以看出对于成熟的果实，其果肉并不适合诱导愈伤。

同时，本发明还对‘临泽大枣’、‘茶壶枣’、‘不落酥’等不同枣品种果肉进行愈伤诱导研究，结果表明：‘相枣’可以成功诱导愈伤，诱导率为100 %，而其余枣的果肉愈伤诱导率仅有10 %-63 %，因此并非所有种类的枣果实均能通过本发明的方法获得果肉愈伤组织。另外，本发明在试验过程中还发现，仅在使用6-BA和2,4-D激素诱导‘相枣’果肉愈伤时，其诱导率可以达到100 %，而使用IBA、NAA、TDZ激素组合诱导时，其诱导率仅有20 %-69 %。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种枣果肉愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）枣果实消毒后去皮，得到枣果肉；

2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述枣果实的品种为相枣。

3.如权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，所述枣果实处于花后14~16天的幼果期。

4.如权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述消毒的方法为：将枣果实用水冲洗后，再依次用1 %氯化汞和75 %的酒精消毒。

5.如权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，所述切分后枣果实呈方形，边长为2~3cm，厚度为0.6~10 mm。

6.如权利要求5所述的诱导方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS4~5 g/L、6-BA 0.8~1.2 mg/L、2,4-D 0.8~1.2 mg/L、蔗糖15~25 g/L、琼脂5~7 g/L，pH为5.7~6.0。

7.如权利要求1~6任一项所述的诱导方法，其特征在于，步骤（2）中所述培养的温度为26~30 ℃，时间为18~25 d。

8.一种权利要求1~7任一项所述的诱导方法得到的枣果肉愈伤组织。

9.一种权利要求8所述的枣果肉愈伤组织作为枣遗传转化试验材料的应用。