CN106857253A

CN106857253A - 一种有效的荸荠病毒脱毒方法

Info

Publication number: CN106857253A
Application number: CN201710075170.XA
Authority: CN
Inventors: 赖小芳; 王伯诚; 林太赟; 唐兴国; 陈伟强; 贝道正; 王健康
Original assignee: Taizhou Plain Research Of Agricultural Science Institute
Current assignee: Taizhou Plain Research Of Agricultural Science Institute
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2017-02-10
Publication date: 2017-06-20

Abstract

本发明属于植物组培技术领域，涉及一种有效的荸荠病毒脱毒方法，包括以下步骤：组培快繁生产组培增殖苗、对增殖苗进行热处理、对热处理后存活的芽苗进行茎尖切割，最后经检测确定无病毒后方可应用到农业生产中。优点是：本发明采用荸荠组培增殖苗热处理与茎尖切割培养相结合的方法进行脱毒，可剥取和切割较大的茎尖进行培养，提高茎尖培养成活率。热处理的作用在于钝化病毒活性，减缓病毒侵染(上行)到茎尖的速度，甚至使病毒失去感染能力；而且通过热处理之后的茎尖生长速度加快，茎尖未被病毒侵染的区域扩大，就可剥取和切割更大的茎尖进行培养，再通过优胜劣汰，提纯出生命力旺盛的株芽，使得荸荠茎尖脱毒的成功率提高10‑15倍。

Description

一种有效的荸荠病毒脱毒方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，特指一种有效的荸荠病毒脱毒方法。

背景技术

荸荠(Eleocharis tuberosa)属莎草科荸荠属宿根性多年生浅水草本植物，古称芍，别名马蹄、地栗、乌芋、凫茈等，以其地下球茎作为食用器官，至今已有3000年左右栽培历史。荸荠皮色暗紫红，肉质洁白，味清甜多汁，松脆爽口消渣，自古有“地下雪梨”之美誉，北方人视之为“江南人参”。荸荠既可作为水果，又可作为蔬菜，是果蔬兼用型的经济作物，具有丰富的营养和保健价值，还有清热、化痰消积、利尿、降压、防癌抗癌等功效，其提取物对细菌、酵母菌和霉菌具有较强抑制作用，是较好的保健食品，可加工成淀粉、罐头、饴糖等，还可作酿酒原料，加工后的废渣可用作饲料。

荸荠生长适应性较强，原产中国南方和印度。在国外，荸荠主要野生分布于东南亚、美洲、欧洲和大洋洲等国家的池沼、滩涂等低洼地带；在中国，除高寒地区外，其分布几乎遍及全国各个省区，而经济栽培则主要在长江流域及其以南地区。目前，荸荠栽培已经形成了几个著名产区，如广西桂林、浙江余杭、江苏高邮和苏州、福建福州、湖北孝感、团风和沙洋、安徽庐江县杨柳乡和宣舟等。荸荠由于产量高，效益好，同时还可以起到轮作改良土壤的作用，因此备受农民青睐。目前，我国荸荠生产发展很快，面积和产量都逐年增加。据不完全统计，我国现有荸荠种植面积约为60多万亩，年总产量96万吨左右，主要供应国内市场，部分用于加工，制成罐头、淀粉、荸荠冻、荸荠露、蜜饯等，产品在国内外市场十分畅销。我国的清水荸荠罐头在国际市场上占有重要的地位.其中2003年销往欧美各国及港澳、东南亚市场达8.5万吨，是世界最大的荸荠罐头出口国家。

近年来，随着农业种植业结构的调整，荸荠的栽培面积和产量不断增加，但是单位面积产量则有逐年下降的趋势。荸荠生产之所以会出现“两高(栽培面积增加、总产量增加)一低(单位面积产量下降)”的现象，主要是由于长期采用传统的无性繁殖方法，造成荸荠球茎中病菌毒素的累积和品质退化。主要表现为：球茎小而不圆整、大果率低、畸形果多、食味变差、常见下凹部花心变黑、底部开裂，在田间还常出现雄荸荠、植株矮化、丛生而不结球等，严重制约着当地荸荠产量和经济效益的提高，也影响荸荠生产的进一步发展。同时目前对于荸荠的这些问题仅限于栽培层面的改变，即“优选留种、培育壮苗、适时移栽、合理密植、精细管理、适时采收”，虽能取得一定的成效，但不能从根本上解决荸荠种球中病菌毒素的累积和品质退化的实质性问题。我们采用实验室植物组织培养的技术来实现荸荠除菌脱毒，可以长久保持优良荸荠种质资源的特有性状，是对优良荸荠品种进行提纯复壮、提高产量的最佳途径。

荸荠一般采用茎尖切割培养进行脱毒，但茎尖脱毒要求切割长度在0.3-0.5mm之间，这样的长度对荸荠来说是很难切取的，因为荸荠不同其它植物，因荸荠的叶片已退化，我们看到的一丛丛的葱不是叶片，而是叶状茎，荸荠的叶原基很难寻找，自然茎尖也很难切割，即使切取成功，培养过程也特别缓慢而且容易死亡，成功率微乎其微。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的荸荠病毒脱毒方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种有效的荸荠病毒脱毒方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)组培快繁生产组培增殖苗：选用芽头健壮、大小均匀、无病无溃烂的荸荠种球，清洗后剥掉种球顶芽的叶鞘，先用小刀挖取带一点种球果肉的顶芽，再剔除多余果肉，小心切出5mm左右的顶芽，放入每100ml含有1滴吐温-80的0.1％升汞溶液中，浸泡搅拌9-10min，再用无菌水冲洗4-6遍，然后放在无菌接种盘上，用无菌的滤纸吸干表面的水分，将顶芽先接到诱导培养基中培养，再接到增殖培养基中培养，培养室温度为25±2℃，光照强度为1800lx，光照时间为10h/d，生产出组培增殖苗；诱导培养基配方为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L，增殖培养基配方为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L；

(2)热处理：将步骤(1)生产出的2-3cm高的增殖苗，放进光温培养箱中进行热处理，热处理温度为38.1-39.0℃，光照强度2000Lx，光照时间13h/d，培养箱内的相对湿度为79-82％，每天隔着玻璃观察，看着增殖苗因高温强光逐渐死去变少，当芽苗存活率为2-3％时，再将存活的芽苗从光温培养箱中拿出，放回到常规培养室中存放3-5d，恢复成正常生长状态的增殖苗；

(3)茎尖切割培养：在经过消毒的解剖镜下切取步骤(2)正常生长状态的增殖苗的茎尖0.5-1.0mm，接种到配方为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L的增殖培养基中培养，75d后分生出丛生芽，在此基础上再进行增殖培养，培养出的丛苗均为脱毒增殖苗。

上述的清洗是用1.5％洗衣粉溶液浸泡10-15min，洗净荸荠种球表面泥土及杂菌，再用自来水冲洗0.8-1.2h。

上述的步骤(3)之后还有步骤(4)组培苗病毒检测：将步骤(3)生产的脱毒组培增殖苗样品采用超薄切片法制样，在日本JEOL公司JEM-1230型透射电子显微镜下观察，细胞结构完好，各细胞器正常，在细胞质和细胞核内未观察到病毒样颗粒及异样内含体结构；用负染色法电镜观察也未见病毒颗粒。只有经过正规的检测部门确定无病毒后再进行规模化组培快繁生产。

上述的步骤(4)之后还有步骤(5)生根苗的培养：将经过检测确定无病毒的增殖苗进行快繁，再进行生根培养，生根培养基的配方为1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L，然后可将生产出的生根脱毒苗应用到农业生产中；所述的诱导、增殖和生根培养基每升均添加琼脂粉5g、蔗糖30g，pH值5.8。

本发明相比现有技术突出且有益的技术效果是：

1、本发明采用荸荠组培增殖苗热处理与茎尖切割培养相结合方法进行脱毒，可剥取和切割较大的茎尖进行培养，大大地提高茎尖培养的成活率。

2、本发明步骤(2)的热处理的作用：热处理的作用在于钝化病毒活性，减缓病毒侵染(上行)到茎尖的速度，甚至使病毒失去感染能力；而且通过热处理之后的茎尖生长速度加快(分生组织的细胞分裂加速)。这样经过热处理之后，茎尖未被病毒侵染的区域扩大，就可剥取和切割更大的茎尖进行培养，大大提高茎尖培养成活率，再通过优胜劣汰，提纯出生命力旺盛的株芽，使得荸荠茎尖脱毒的成功率提高10-15倍。这是本发明成功的关键和独到之处。

3、本发明步骤(3)的茎尖培养原理是：病毒在植物体内是通过维管束输导组织进行传播的，而茎尖分生组织还未形成维管束，加上热处理后茎尖剧烈的新陈代谢活动，激素含量高，抑制了病毒的传播复制，多次的实验经验告诉我们，愈靠近茎尖病毒浓度愈低，从而获得无毒苗的可能性就愈大。

具体实施方式

下面以具体实施的例子对本发明作进一步描述：

本方法是将荸荠组培增殖苗先进行热处理，再剥取和切割较大的茎尖进行培养，达到脱毒增殖目的。

一种有效的荸荠病毒脱毒方法，包括以下步骤：

(1)组培快繁生产组培增殖苗：培养材料为地方品种‘店头荸荠’，选用芽头健壮、大小均匀、无病无溃烂的荸荠种球，先用1.5％洗衣粉浸泡12min，洗净种球表面泥土与杂菌，再用自来水冲洗1h；清洗后把球茎顶芽的叶鞘剥掉，用小刀挖取带一点球茎果肉的顶芽，小心剔除多余果肉，切出5mm左右的顶芽，放入每100ml含有1滴吐温-80的0.1％升汞溶液中，浸泡搅拌9min，再用无菌水冲洗5遍，然后放在无菌接种盘上，用无菌的滤纸吸干表面的水分，先将顶芽接到诱导培养基中培养，成功后再转接到增殖培养基中培养，培养室温度为25±2℃，光照强度为1800lx，光照时间为10h/d，生产出组培增殖苗；诱导培养基配方为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L，增殖培养基配方为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L；

(2)热处理：将步骤(1)生产出的2-3cm高度的组培增殖苗(所述的组培增殖苗一般有50-100株以上)放进光温培养箱中进行热处理，数量12瓶，每瓶3株，共36株，热处理温度为38.1-39.0℃，光照强度2000Lx，光照时间13h/d，培养箱内的相对湿度为79-82％，每天隔着玻璃观察，看着组培苗逐渐死去，直至仅有1-3芽存活(成活率2-3％)时，将仅存活1-3芽的组培增殖苗从光温培养箱中拿出，放回到常规培养室中存放4d，恢复成一株正常生长状态的组培增殖苗；

(3)茎尖切割培养：在经过消毒的解剖镜下切取步骤(2)正常生长状态的组培增殖苗的茎尖0.5-1.0mm，接种到配方为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L的增殖培养基中培养，75d后分生出3个丛生芽，此阶段切下的茎尖的培养成活率为33.3％，在此基础上进行增殖扩繁，培养出的丛苗均为脱毒增殖苗。

上述的步骤(3)之后还有步骤(4)组培苗病毒检测：将步骤(3)培养的组培增殖苗，经浙江大学分析测试中心检测，送检的增殖苗样品达到完全脱毒要求。检测结论为：送检荸荠脱毒组培苗样品采用超薄切片法制样，在日本JEOL公司JEM-1230型透射电子显微镜下观察，细胞结构完好，各细胞器正常，在细胞质和细胞核内未观察到病毒样颗粒及异样内含体结构；用负染色法电镜观察也未见病毒颗粒。只有经过正规的检测部门确定无病毒后再进行规模化组培快繁生产。

上述的步骤(4)之后还有步骤(5)生根苗的培养：将经过检测确定为无病毒的增殖苗后进行快速快繁，然后再进行生根培养，生根培养基的配方为1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L，最后可将生产出的生根脱毒苗应用到农业生产中。所述的诱导、增殖和生根培养基每升均添加琼脂粉5g、蔗糖30g，pH值5.8。

实验结果表明：适宜的诱导培养基配方为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L；增殖培养基配方为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L，增殖系数达11.2；生根培养基配方为1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L，生根率达100％，每升培养基内均添加琼脂粉5g、蔗糖30g，pH值5.8。

上述实例仅为本发明的较佳实施例子，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种有效的荸荠病毒脱毒方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)组培快繁生产组培增殖苗：选用芽头健壮、大小均匀、无病无溃烂的荸荠种球，清洗后剥掉种球顶芽的叶鞘，先用小刀挖取带一点种球果肉的顶芽，再剔除多余果肉，小心切出5mm左右的顶芽，放入每100ml含有1滴吐温-80的0.1％升汞溶液中，浸泡搅拌9-10min，再用无菌水冲洗4-6遍，然后放在无菌接种盘上，用无菌的滤纸吸干表面的水分，先将顶芽接到诱导培养基中培养，成功后再转接到增殖培养基中培养，培养室温度为25±2℃，光照强度为1800lx，光照时间为10h/d，生产出组培增殖苗；诱导培养基配方为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L，增殖培养基配方为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.01mg/L；

(2)热处理：将步骤(1)生产出的2-3cm高的增殖苗，放进光温培养箱中进行热处理，热处理温度为38.1-39.0℃，光照强度2000Lx，光照时间13h/d，培养箱内的相对湿度为79-82％，每天隔着玻璃观察，看着增殖苗因高温强光逐渐死去变少，当芽苗存活率为2-3％时，将存活的芽苗从光温培养箱中拿出，放回到常规培养室中存放3-5d，恢复成正常生长状态的增殖苗；

2.根据权利要求1所述的一种有效的荸荠病毒脱毒方法，其特征在于：所述的清洗是用1.5％洗衣粉溶液浸泡10-15min，洗净荸荠种球表面泥土及杂菌，再用自来水冲洗0.8-1.2h。

3.根据权利要求1任一项所述的一种有效的荸荠病毒脱毒方法，其特征在于：所述的步骤(3)之后还有步骤(4)组培苗病毒检测：将步骤(3)生产的脱毒组培增殖苗样品采用超薄切片法制样，在透射电子显微镜下观察，细胞结构完好，各细胞器正常，在细胞质和细胞核内未观察到病毒样颗粒及异样内含体结构；用负染色法电镜观察也未见病毒颗粒。只有经过正规的检测部门确定无病毒后再进行规模化组培快繁生产。

4.根据权利要求3所述的一种有效的荸荠病毒脱毒方法，其特征在于：所述的步骤(4)之后还有步骤(5)生根苗的培养：将经过检测确定无病毒的增殖苗进行快繁，再进行生根培养，生根培养基的配方为1/2MS+NAA0.03mg/L+AC1000mg/L，然后可将生产出的生根脱毒苗应用到农业生产中；所述的诱导、增殖和生根培养基每升均添加琼脂粉5g、蔗糖30g，pH值5.8。