CN104186321B - 梨试管苗的生根培养方法及培养基 - Google Patents

梨试管苗的生根培养方法及培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供梨试管苗的生根培养方法及培养基，属于植物细胞工程技术领域。生根培养方法为：将梨试管苗依次进行增殖培养、壮苗培养、诱导生根培养、大量生根培养；诱导生根培养：将壮苗培养后获得的组培苗依次接种至生根培养基A和生根培养基B中进行培养，得到生根苗；大量生根培养：将生根苗接种至生根培养基C中进行培养；生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基；生根培养基B是1/4QL培养基；生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基。本发明还提供上述方法中的培养基。本发明生根培养方法，能够获得具有较高增殖率、生根率、平均生根数和较长平均根长的生根试管苗。

Description

梨试管苗的生根培养方法及培养基
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及梨试管苗的生根培养方法及培养基。
背景技术
梨(Pyrusspp.)是重要的木本经济果树，在我国水果产量中，仅次于苹果、柑橘，居第三位。近几年，根据各地目前品种中存在的主要问题和将来发展的需要，梨树育种工作取得初步成果，育成众多优良品种。如何大规模扩大新品种栽培面积，推广新品种在市场的上应用，成为目前亟待解决的问题。近几十年来，植物组织培养技术，尤其是脱毒和微繁殖技术已被广泛地应用于农业，并成为现代农业生产中一项最基本的技术。利用此技术可使苗木繁殖世代短、繁殖系数高，还可保持原来品种的优良特性。但许多植物材料离体生根技术还未解决，其理论体系还不完善，从而阻碍了脱毒和微繁殖技术在生产中推广。目前有关梨及其砧木的离体培养已有部分探索，但梨属于难生根果树，繁殖系数低，试管苗生根困难，不能适应生产发展的需要。
发明内容
本发明的目的是提供梨试管苗的生根培养方法，能够获得具有较高增殖率、生根率、平均生根数和较长平均根长的生根试管苗。
本发明的另一目的是梨试管苗的生根培养方法中的培养基。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
梨试管苗的生根培养方法，将梨试管苗依次进行增殖培养、壮苗培养、诱导生根培养、大量生根培养；所述诱导生根培养的方法为：将壮苗培养后获得的组培苗依次接种至生根培养基A和生根培养基B中进行培养，得到生根苗；所述大量生根培养的方法为：将所述生根苗接种至生根培养基C中进行培养；
所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基,pH为5.5-5.8，所述IAA的终浓度为0.4-0.6mg/L，所述BA的终浓度为0.8-1.2mg/L，所述NAA的终浓度为0.05-0.15mg/L；
所述生根培养基B是1/4QL培养基；
所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，pH为5.5-5.8，所述IBA的终浓度为2.5-3.5mg/L。
在本发明中，所述增殖培养的方法为：将梨试管苗采用增殖培养基进行培养，所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，PH值为5.5-5.8，所述BA的终浓度为0.2-0.7mg/L，NAA的终浓度为0.01-0.03mg/L；所述增殖培养的条件为：培养温度22-25℃，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，培养时间为28-32天。
在本发明中，所述壮苗培养方法为：将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到继代培养基中进行培养，得到组培苗；所述继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；所述壮苗培养的条件为：培养温度22-25℃，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，每隔14-16天更换新鲜的继代培养基，培养时间为28-32天。
在本发明中，所述诱导生根培养的方法为：将壮苗培养后获得的组培苗转接到生根培养基A中，在22-26℃、黑暗条件下培养7-12d，转入生根培养基B中，在22-25℃条件下，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，培养25-35天，获得生根苗。
在本发明中，所述大量生根培养的方法为：将所述生根苗转接至生根培养基C中进行培养，获得生根试管苗；所述大量生根培养的条件为：培养温度为22-25℃，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，培养时间为40-50d。
本发明还提供用于梨试管苗生根培养的培养基，由如下培养基中的全部或部分组成：
(1)增殖培养基
所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，pH值为5.5-5.8，所述BA的终浓度为0.2-0.7mg/L，NAA的终浓度为0.01-0.03mg/L；
(2)继代培养基
继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；
(3)生根培养基
所述生根培养基包括生根培养基A、B和C；
所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基,pH为5.5-5.8，所述IAA的终浓度为0.4-0.6mg/L，所述BA的终浓度为0.8-1.2mg/L，所述NAA的终浓度为0.05-0.15mg/L；
所述生根培养基B是1/4QL培养基；
所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，pH为5.5-5.8，所述IBA的终浓度为2.5-3.5mg/L。
本发明梨试管苗的生根培养方法，克服了梨苗扦插繁殖系数低、高度杂合、取样难等缺点，经过增殖培养和壮苗培养后，利用诱导生根和大量生根两步法培养，可以获得大量无性系生根试管苗，其遗传性状稳定、叶片深绿色，与只采用第一步或第二步生根法比较，本发明所获得的生根试管苗的增殖率和生根率显著提高，平均根长和平均根数显著增加，同时具有取材容易，移栽后成活率高等特点，为理论研究、生产推广和扩大栽培面积提供了大量的生根试管苗。
附图说明
图1是经过增殖培养后的梨试管苗。
图2是壮苗培养后获得的组培苗。
图3：诱导生根培养后获得的生根苗。
图4：经过大量生根培养后获得的生根试管苗。
图5：生根试管苗经炼苗后的图片。
图6：生根试管苗移栽后的图片。
具体实施实例
BA：苄氨基腺嘌呤；NAA：1-萘乙酸；IAA：吲哚-3-乙酸；IBA：3-吲哚丁酸。
MS培养基的组成：(1)大量元素：NH4NO31650mg/L，KNO31900mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4170mg/L；(2)微量元素：MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，KI0.083mg/L，H3BO36.2mg/L；(3)铁盐：Na2EDTA37.3mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L；(4)有机物质：烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L。MS培养基的溶剂为水。
1/3MS培养基：成分与MS培养基相同，其中大量元素的浓度取MS培养基中相同成分的1/3，其他成分的浓度同MS培养基。
QL培养基的组成：(1)大量元素：NH4NO3400mg/L，KH2PO4270mg/L，CaNO3833.77mg/L，MgSO4175.79mg/L；(2)微量元素：H3BO36.2mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，MnSO4·H2O0.76mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，KI0.08mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L；(3)铁盐：Na2EDTA37.3mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L；(4)有机物质：肌醇29.61mg/L，盐酸硫胺素0.118mg/L。QL培养基的溶剂为水。
1/4QL培养基：成分与QL培养基相同，其中大量元素的浓度取QL培养基中相同成分的1/4，其他成分的浓度同QL培养基。
实施例1
以梨试管苗进行生根培养。进行试验的梨为砧木杜梨、豆梨以及品种‘苏翠1号’和‘苏翠2号’。采用如下方法获得砧木杜梨、豆梨以及品种‘苏翠1号’和‘苏翠2号’的试管苗：在1/3MS培养基中添加终浓度为20-30g/L蔗糖和终浓度为5-7g/L琼脂，取各品种组培苗，剪取2cm新稍接种于上述培养基中，在22℃-25℃条件下培养，每天光照16h、黑暗8h，光照强度为1500-2000lx，每15d继代一次，继代2次，得到各品种的生根备用试管苗。
将砧木杜梨、豆梨以及品种‘苏翠1号’和‘苏翠2号’的生根备用试管苗，分别进行生根培养，具体方法如下：
1)增殖培养：剪取生根备用试管苗的新稍，转接到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基是在MS培养基中添加BA、NAA、蔗糖和琼脂后形成的固体培养基，其中BA终浓度为0.5mg/L、NAA终浓度为0.02mg/L、蔗糖终浓度为20-30g/L、琼脂终浓度为5-7g/L，pH＝5.5-5.8。培养条件：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养时间为30天。从图1可以看出，经增殖培养后的试管苗长出许多丛生芽，增殖系数较高。
2)壮苗培养：将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到继代培养基中进行培养，获得组培苗。继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基中添加蔗糖和琼脂后获得的固体培养基，其中蔗糖的终浓度为20-30g/L，琼脂的终浓度为5-7g/L，pH＝5.5-5.8。培养条件为：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，每隔15天更换新鲜的继代培养基，培养时间为30天。从图2可以看出，壮苗培养后获得的组培苗茎干健壮，叶片平展、深绿色，植株生长正常。
3)诱导生根培养：将步骤2)获得的组培苗转接到生根培养基A中，在25℃、黑暗条件下培养10d，转入生根培养基B中，在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养30天，获得生根苗。生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA、NAA、蔗糖和琼脂后得到的培养基,pH＝5.5-5.8，IAA的终浓度为0.5mg/L，所述BA的终浓度为1.0mg/L，NAA的终浓度为0.1mg/L，蔗糖终浓度为20-30g/L，琼脂终浓度为5-7g/L。生根培养基B是1/4QL培养基。从图3可以看出，组培苗被诱导生根，且组培苗根基部生长正常无膨大现象。
4)大量生根培养：将步骤3)获得的生根苗转接至生根培养基C中进行培养，获得大量生根的试管苗。大量生根培养的条件为：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养45d。生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA和蔗糖后得到的液体培养基，pH＝5.5-5.8，IBA的终浓度为3.0mg/L、蔗糖的终浓度为20-30g/L。从图4可以看出，经大量生根培养获得的生根试管苗平均根长、平均根数得到显著提高。
各品种梨的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长如表1所示。可以看到，采用本发明生根培养方法获得的各品种梨的增殖率为100％，生根率较高，平均生根数较多，平均根长较长。
表1各品种梨生根试管苗的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长
品种 增殖率(％) 生根率(％) 平均生根数(个) 平均根长(cm)
杜梨 100 92.98％ 21 10.45
豆梨 100 92.45％ 19 11.25
苏翠1号 100 89.75％ 18 9.85
苏翠2号 100 91.45％ 18 9.65
将各品种生根试管苗，在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，空气湿度80-90％，开瓶炼苗。开瓶炼苗时间为8-10d，从图5可以看出植株生长正常，无污染。
将大量生根的试管苗，经开瓶炼苗后，移栽于蛭石：珍珠岩：营养土＝1:1:1的营养盒中，25d后统计成活率，植株的成活率为80-92％，生长状况良好，从图6可以看出植株地上部生长旺盛、叶片深绿色。
实施例2
将砧木杜梨、豆梨以及品种‘苏翠1号’和‘苏翠2号’的生根备用试管苗(实施例1中方法获得)，分别进行生根培养，具体方法如下：
1)增殖培养：剪取生根备用试管苗的新稍，转接到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基是在MS培养基中添加BA、NAA、蔗糖和琼脂后形成的固体培养基，其中BA终浓度为0.5mg/L、NAA终浓度为0.02mg/L、蔗糖终浓度为20-30g/L、琼脂终浓度为5-7g/L，pH＝5.5-5.8。培养条件：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养时间为30天。
2)壮苗培养：将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到壮苗培养基中进行培养，获得组培苗。壮苗培养基是1/3MS或1/4QL培养基中添加蔗糖和琼脂后获得的固体培养基，其中蔗糖的终浓度为20-30g/L，琼脂的终浓度为5-7g/L，pH＝5.5-5.8。培养条件为：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，每隔15天更换新鲜的壮苗培养基，培养时间为30天。
3)诱导生根培养：将步骤2)获得的组培苗转接到生根培养基A中，在25℃、黑暗条件下培养10d，转入生根培养基B中，在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养30天，获得生根苗。生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA、NAA、蔗糖和琼脂后得到的培养基,pH＝5.5-5.8，IAA的终浓度为0.5mg/L，所述BA的终浓度为1.0mg/L，NAA的终浓度为0.1mg/L，蔗糖终浓度为20-30g/L，琼脂终浓度为5-7g/L；生根培养基B是1/4QL培养基。
各品种梨的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长如表1所示。可以看到，采用上述生根培养方法获得的各品种梨的增殖率为100％，生根率较低，平均生根数较少，平均根长较短，显著影响了移栽后的成活率。
表2各品种梨生根试管苗的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长
品种 增殖率(％) 生根率(％) 平均生根数(个) 平均根长(cm)
杜梨 100 81.12 4 4.8
豆梨 100 68.25 4 5.2
苏翠1号 100 75.79 3 4.6
苏翠2号 100 78.67 3 5.0
实施例3
将砧木杜梨、豆梨以及品种‘苏翠1号’和‘苏翠2号’的生根备用试管苗(实施例1中方法获得)，分别进行生根培养，具体方法如下：
1)增殖培养：剪取生根备用试管苗的新稍，转接到增殖培养基中进行增殖培养。增殖培养基是在MS培养基中添加BA、NAA、蔗糖和琼脂后形成的固体培养基，其中BA终浓度为0.5mg/L、NAA终浓度为0.02mg/L、蔗糖终浓度为20-30g/L、琼脂终浓度为5-7g/L，pH＝5.5-5.8。培养条件：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养时间为30天。
2)壮苗培养：将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到壮苗培养基中进行培养，获得组培苗。壮苗培养基是1/3MS或1/4QL培养基中添加蔗糖和琼脂后获得的固体培养基，其中蔗糖的终浓度为20-30g/L，琼脂的终浓度为5-7g/L，pH＝5.5-5.8。培养条件为：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，每隔15天更换新鲜的壮苗培养基，培养时间为30天。
3)大量生根培养：将步骤2)获得的组培苗转接到生根培养基C中进行培养，获得大量生根的试管苗。大量生根培养的条件为：在22-25℃条件下，每天光照16h、黑暗8h，光照强度1500-2000lx，培养45d。生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA和蔗糖后得到的液体培养基，pH＝5.5-5.8，IBA的终浓度为3.0mg/L、蔗糖的终浓度为20-30g/L。
各品种梨的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长如表3所示。可以看到，采用本发明生根培养方法获得的各品种梨的增殖率为100％，生根率不高，平均生根数较少，平均根长较短，显著影响了移栽后的成活率。
表3各品种梨生根试管苗的增殖率、生根率、平均生根数及平均根长
品种 增殖率(％) 生根率(％) 平均生根数(个) 平均根长(cm)
杜梨 100 54.69 10 6.2
豆梨 100 49.58 10 5.8
苏翠1号 100 45.36 10 6.1
苏翠2号 100 49.62 10 6.0
通过对比实施例1、2和3，可以看出经增殖培养和壮苗培养后得到的同样生长状况的组培苗，实施例1采用诱导生根和大量生根两步法，相较于实施例2和实施例3的方法，试管苗的生根率、平均根长、平均生根数均显著高于后两者，同时较好的根部生长状况也有利于提高其移栽成活率。

Claims (5)

1.梨试管苗的生根培养方法，其特征在于将梨试管苗依次进行增殖培养、壮苗培养和诱导生根培养、大量生根培养；所述诱导生根培养的方法为：将壮苗培养后获得的组培苗依次接种至生根培养基A和生根培养基B中进行培养，得到生根苗；所述大量生根培养的方法为：将所述生根苗接种至生根培养基C中进行培养；
所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基，pH为5.5-5.8，所述IAA的终浓度为0.4-0.6mg/L，所述BA的终浓度为0.8-1.2mg/L，所述NAA的终浓度为0.05-0.15mg/L；
所述生根培养基B是1/4QL培养基；
所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，pH为5.5-5.8，所述IBA的终浓度为2.5-3.5mg/L；
所述增殖培养的方法为：将梨试管苗采用增殖培养基进行培养，所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，pH值为5.5-5.8，所述BA的终浓度为0.2-0.7mg/L，NAA的终浓度为0.01-0.03mg/L；
所述壮苗培养方法为：将增殖培养后的梨试管苗剪掉基部，转接到继代培养基中进行培养，得到组培苗；所述继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；所述诱导生根培养的方法为：将壮苗培养后获得的组培苗转接到生根培养基A中，在22-26℃、黑暗条件下培养7-12d，转入生根培养基B中，在22-25℃条件下，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，培养25-35天，获得生根苗。
2.根据权利要求1所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述增殖培养的条件为：培养温度22-25℃，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，培养时间为28-32天。
3.根据权利要求1或2所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述壮苗培养的条件为：培养温度22-25℃，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，每隔14-16天更换新鲜的继代培养基，培养时间为28-32天。
4.根据权利要求3所述梨试管苗的生根培养方法，其特征在于所述大量生根培养的方法为：将所述生根苗转接至生根培养基C中进行培养，获得生根试管苗；所述大量生根培养的条件为：培养温度为22-25℃，每天光照15-16h，黑暗8-9h，光照强度1500-2000lx，培养时间为40-50d。
5.用于权利要求1所述梨试管苗的生根培养方法的培养基，由如下培养基组成：
（1）增殖培养基
所述增殖培养基是在MS培养基中添加BA和NAA后得到的培养基，pH值为5.5-5.8，所述BA的终浓度为0.2-0.7mg/L，NAA的终浓度为0.01-0.03mg/L；
（2）继代培养基
继代培养基是1/3MS或1/4QL培养基；
（3）生根培养基
所述生根培养基由生根培养基A、B和C组成；
所述生根培养基A是在1/4QL培养基中添加IAA、BA和NAA后得到的培养基，pH为5.5-5.8，所述IAA的终浓度为0.4-0.6mg/L，所述BA的终浓度为0.8-1.2mg/L，所述NAA的终浓度为0.05-0.15mg/L；
所述生根培养基B是1/4QL培养基；
所述生根培养基C是在1/3MS培养基中添加IBA后得到的液体培养基，pH为5.5-5.8，所述IBA的终浓度为2.5-3.5mg/L。
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