CN103444522A - 一种丰水梨试管苗生根的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丰水梨试管苗生根的制备方法，其步骤：A、取丰水梨一年生枝茎段培育无菌试管苗：无菌试管苗切成带腋芽茎段进行消毒处理，基部切成斜面插入到腋芽培养培养基中，昼夜光照周期培养；B、无菌试管苗继代增殖：将培养后无菌且生长健壮的腋芽苗从茎段上切下接种于继代培养基中，昼夜光照周期培养；C、将丰水梨试管苗转入生根培养基中，诱导生根；接种到第一生根培养基上先暗培养，再转接到第二生根培养基中光培养获得生根植株，昼夜光照周期培养；D、将完成生根的幼苗于光照培养箱中进行移栽炼苗，成活后移植于盆栽。方法易行，操作简便，解决了丰水梨试管苗组织培养过程中难生根的问题，生根率高、根系发达且移栽成活率高。

Description

一种丰水梨试管苗生根的制备方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体是涉及一种丰水梨试管苗生根的制备方法，适用于利用组织培养方法快速繁殖大量丰水梨自根试管苗，满足种苗市场的需要。
背景技术
丰水梨（Pyrus pyrifolia‘Hosui’）是日本农林省果树试验场1972年命名的优质大果褐皮沙梨品种，亲本为（菊水×八云）×八云，近年已在日本逐渐发展成为主栽品种之一。果重200g-300g，最高达500g，果实圆形或近圆形，果皮黄褐透亮，大型果有综沟。果肉雪白，肉质细嫩，特酥脆，汁多，甜酸适口，风味特好，品质极佳，较耐贮藏。果实发育期为135d-140d，以短果枝结果为主，中、长果枝及腋花芽较多，花芽容易形成，连续结果能力较强，丰产性较好，抗病性中等。
目前欧洲在西洋梨栽培中逐渐采用自根苗代替传统嫁接苗以解决栽培过程中的连作障碍问题。而组织培养是快速繁殖优良自根苗的一条重要途径，试管苗的生根培养则是快繁过程中至关重要的环节。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种丰水梨试管苗生根的制备方法，方法易行，操作简便，解决了丰水梨试管苗组织培养过程中难生根的问题，生根率高、根系发达且移栽成活率高。
为了实现上述的目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种丰水梨试管苗生根的制备方法，该方法包括如下步骤：
本发明的工作过程步骤包括：（A）无菌试管苗培育；（B）试管苗继代增殖；（C）试管苗生根诱导；（D）试管生根苗移栽。
A、取丰水梨一年生枝茎段培育无菌试管苗；其特征在于：步骤（A）所述无菌试管苗培育方法是于生长季剪取大田丰水梨一年生枝，切成带腋芽茎段约1.5cm-2.0cm进行消毒处理（消毒方法为：先用70%（体积比）酒精消毒30s，不断的摇动以便充分消毒。倒掉酒精，用无菌水冲洗2次，每次清洗2min，再用1%-2%（体积比）次氯酸钠溶液（滴入1-2滴吐温）消毒20min，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3-5次），消毒后的茎段上端切成平面，减少水分散失，基部切成斜面插入到腋芽培养培养基中，进行昼夜光照周期培养。光照强度为2000lux-3000lux，培养温度为23℃-27℃，光周期为16h/8h；所述的茎段培养培养基配方为：LP基本培养基+IBA0.4mg/L+6-BA0.5mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+维生素C1.0mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.8g/L，pH：5.8-6.0。所述的生物素和维生素H是同义词，维生素H又称生物素、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必须的水溶性维生素。
B、无菌试管苗继代增殖；步骤（B）所述芽的增殖方法是将培养28d-32d后无菌且生长健壮的腋芽苗从茎段上切下接种于继代培养基中，稍带部分木质部，利于植株生长，以后每28d-32d继代一次，以步骤（A）所述条件进行昼夜光照周期培养。在生长形成1.5cm及以上高度的可进行生根培养的试管苗的同时，可形成2-5个新芽以进行继代增殖培养；所述试管苗继代增殖培养基为：LP基本培养基+IBA0.4mg/L+6-BA0.5mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.8g/L，pH：5.8-6.0。
C、将丰水梨试管苗转入生根培养基中，诱导生根；步骤（C）特征在于：待步骤（B）的试管苗生长到1.5cm及以上，将其切成单株，接种到第一生根培养基上先暗培养6d-8d，再光培养2d-4d，再转接到第二生根培养基中光培养23d-27d获得生根植株，培养条件为步骤（A）所述的昼夜光照周期培养；
所述的第一生根培养基配方为：1/4MS大量元素（包含：KNO3，NH4NO3，MgSO4·7H2O，KH2PO4，CaCl2·2H2O）+1/2MS微量元素（包含：MnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，H3BO3，KI，Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O）+MS铁盐（包含：Na2·EDTA·2H2O，FeSO4·7H2O）+MS有机物（包含：盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、甘氨酸）+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+间苯三酚（PG）80.0mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.0g/L，pH：5.8-6.0。暗培养6d-8d，然后转移至光培养培养2d-4d。
将诱导生根培养8d-12d的丰水梨试管苗转入第二生根继代培养基中培养；所述的生根培养基配方为：LP基本培养基+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L，pH：5.8-6.0。
D、将上述步骤C培养基中完成生根的幼苗于光照培养箱中进行移栽炼苗，成活后可移植于盆栽或大田培养。步骤（D）所述的试管苗移栽方法是：用镊子将生根的试管苗从培养基中取出，用清水小心洗去基部残留的培养基，移栽到装有育苗基质的塑料杯中，保持相对湿度80%以上，待其成活后移入盆栽。其中所用基质为有机肥公司生产的播种育苗专用基质。
1/4MS大量+1/2MS微量是指MS基本培养基大量缩减为原来的1/4，微量减半。MS培养基组分为：KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2·2H2O 400mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO36.2mg/L，KI 0.83mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L，FeSO4·7H2O 27.9mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
LP基本培养基组分为KNO31800mg/L，NH4NO3400mg/L，MgSO4·7H2O 360mg/L，KH2PO4270mg/L，Ca(NO3)2·7H2O 1200mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO36.2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇150mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明的丰水梨组织培养生根方法可使丰水梨组培苗生根率达到80.12%，平均生根数2.97，平均根长3.28cm，移栽成活率高达86%，移栽成活后短期内即可观察到有大量根发生，植株生长状况良好。
本发明的培养基组成对于丰水梨试管苗的生根有显著的作用，所培育出的生根试管苗保持了亲本的优良性状，又具有统一的规格，生长状况良好。本发明的试验方法于室内进行集约化生产，能最大限度的发挥人力、物力和财力，具有较高的生产效率。
本发明对丰水梨自根苗在生产中的推广应用具有重要的价值，具有操作简单、成本低廉的特点。
本发明方法进行丰水梨试管苗繁殖，可节约繁殖材料。取田间材料的一小块组织或器官就可以在短期内生产出大量市场所需的优质苗木，既不损伤原材料又可获得较高的经济效益。并且试管繁殖是一种微型的无性繁殖，其后代遗传性比较一致，能保持原有品种的优良性状，对保质、保纯有着特殊作用，可获得大量的统一规格、高质量的苗木，苗木商品性能良好。
本发明的丰水梨试管苗生根方法可以在人工控制的条件下进行集约化生产，不受自然环境中季节和恶劣天气的影响，所以有更为可观的时间效益，可以在全年连续进行高效率生产。且本发明的丰水梨组织培养生根方法由于种苗在培养瓶中生长，立体摆放，所需的空间小，节省土地。生产可按一定的程序严格执行，生产过程可以微型化、精密化，能最大限度发挥人力、物力和财力，取得较高的生产效率。
将本发明与茎尖培养的方法或热处理的方法相结合可除去绝大多数植物的病毒、真菌和细菌，并获得无病毒苗木，促进丰水梨产业的健康持续发展。
附图说明
图1为一种丰水梨试管苗继代培养28d示意图。
经过28d培养，丰水梨试管苗达到一定高度，并有新芽增生。
图2为一种丰水梨试管苗生根培养35d示意图。
经过35d培养，丰水梨试管苗生根诱导情况良好。
图3为一种不同处理得到的丰水梨组培生根苗移栽状况示意图。
主要为实验过程中经由不同处理所得到的丰水梨组培生根苗生长状况，从中选出较佳的处理。
图4为一种丰水梨生根苗移栽至大田示意图。
丰水梨组培生根苗炼苗成活后可移栽至大田生长。
具体实施方式
实施例1：
一种丰水梨试管苗生根的制备方法，该方法包括如下步骤：
A、取丰水梨一年生枝茎段培育无菌试管苗；其特征在于：步骤（A）所述无菌苗培育方法是于生长季的3月下旬到6月上旬，剪取大田丰水梨一年生枝，用湿抹布包好，带回实验室。剪下枝条叶片，用洗涤剂水浸泡20min，流水冲洗30min以上。然后于超净工作台上进行常规消毒。消毒方法为：先用70%（体积比）酒精消毒30s，不断的摇动以便充分消毒。倒掉酒精，用无菌水冲洗2次，每次清洗2min，再用1%-2%（体积比）次氯酸钠溶液（滴入1-2滴吐温）消毒20min，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3-5次。消毒过程中要不断摇动使茎段充分接触消毒液，以达到充分消毒的目的。消毒后的茎段上端切成平面，减少水分散失，基部切成斜面插入到腋芽培养培养基中，进行昼夜光照周期培养。光照强度为2000lux-3000lux，培养温度为25±2℃，光周期为16h/8h；所述的茎段培养培养基配方为：LP基本培养基+IBA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+维生素C 1.0mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.8g/L，pH：5.8-6.0。所述的生物素和维生素H是同义词，维生素H又称生物素、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必须的水溶性维生素。
B、无菌试管苗继代增殖；步骤（B）所述芽的增殖方法是将培养30d左右后无菌且生长健壮的腋芽苗从茎段上切下接种于继代培养基中，稍带部分木质部，利于植株生长，以后每30d左右继代一次，以步骤（A）所述条件进行昼夜光照周期培养。在生长形成1.5cm及以上高度的可进行生根培养的试管苗的同时，可形成2~5个新芽以进行继代增殖培养；所述的继代培养基配方为：LP基本培养基+IBA 0.4mg/L+6-BA0.5mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.8g/L，pH：5.8-6.0。
C、将丰水梨试管苗转入生根培养基中，诱导生根。步骤（C）所述的生根诱导方法是：待步骤（B）的试管苗生长到1.5cm及以上，将其切成单株，接种到第一生根培养基上先暗培养7d，再光培养3d，再转接到第二生根培养基中光培养25d获得生根植株，培养条件为步骤（A）所述的昼夜光照周期培养；
所述的第一生根培养基配方为：1/4MS大量元素（KNO3475mg/L，NH4NO3412.5mg/L，MgSO4·7H2O92.5mg/L，KH2PO442.5mg/L，CaCl2·2H2O100mg/L）+1/2MS微量元素（MnSO4·4H2O11.15mg/L，ZnSO4·7H2O4.3mg/L，H3BO33.2mg/L，KI0.415mg/L，Na2MoO4·2H2O0.125mg/L，CuSO4·5H2O0.0125mg/L，CoCl2·6H2O0.0125mg/L）+MS  铁盐（Na2·EDTA·2H2O37.3mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L）+MS有机物（盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L）+IBA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+间苯三酚（PG）80.0mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.0g/L，pH：5.8-6.0。暗培养7d，然后转移至光培养养3d。
所述的第二生根培养基配方为：LP基本培养基（培养基组分同发明内容）+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L，pH：5.8-6.0。
D、将上述培养基中完成生根的幼苗于光照培养箱中进行移栽炼苗，成活后可移植于盆栽或大田培养。步骤（D）所述的试管苗移栽方法是：用镊子将生根的试管苗从培养基中取出，用清水小心洗去基部残留的培养基，移栽到装有育苗基质的塑料杯中，保持相对湿度80%以上，待其成活后移入盆栽。其中所用基质为有机肥公司生产的播种育苗专用基质。
本实验丰水梨生根率达到92.0%，平均生根数3.87，平均根长3.75cm。移栽成活后短期内即可观察到有大量根发生，植株生长状况良好。

Claims (3)

1.一种丰水梨试管苗生根的制备方法，其步骤是：
A、取丰水梨一年生枝茎段培育无菌试管苗：无菌试管苗培育方法是于生长季剪取大田丰水梨一年生枝，切成带腋芽茎段1.5cm-2.0cm进行消毒处理，消毒后的茎段上端切成平面，基部切成斜面插入到腋芽培养培养基中，进行昼夜光照周期培养，光照强度为2000lux-3000lux，培养温度为23℃-27℃，光周期为16h/8h；所述的茎段培养培养基为：LP基本培养基+IBA0.4mg/L+6-BA0.5mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+维生素C1.0mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.8g/L，pH：5.8-6.0；
B、无菌试管苗继代增殖：增殖方法是将培养28d-32d后无菌且生长的腋芽苗从茎段上切下接种于继代培养基中，稍带部分木质部，以后每28-32d继代一次，以步骤（A）所述的条件进行昼夜光照周期培养，在生长形成1.5 cm高度的进行生根培养试管苗的同时，形成2-5个新芽以进行继代增殖培养；所述的试管苗继代增殖培养基为：LP基本培养基 + IBA0.4mg/L+6-BA0.5mg/L+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L +蔗糖20.0g/L +琼脂6.8g/L，pH：5.8-6.0；
C、将丰水梨试管苗转入生根培养基中，诱导生根；待步骤（B）的试管苗生长到1.5cm，将其切成单株，接种到第一生根培养基上先暗培养6d-8d，再光培养2d-4d，再转接到第二生根培养基中光培养23d-27d获得生根植株，培养条件为步骤（A）所述的昼夜光照周期培养；
所述的第一生根培养基配方为：1/4MS 大量元素：包含KNO3，NH4NO3，MgSO4·7H2O，KH2PO4，CaCl2·2H2O+1/2MS 微量元素：包含MnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，H3BO3，KI，Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O+MS铁盐：包含Na2·EDTA·2H2O，FeSO4·7H2O+ MS有机物：包含盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、甘氨酸+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+间苯三酚80.0mg/L +泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂6.0g/L，pH：5.8-6.0，暗培养6d-8d，然后转移至光培养养2d-4d；将诱导生根培养8d-12d的丰水梨试管苗转入第二生根继代培养基中培养；所述的生根培养基配方为：LP基本培养基+泛酸钙1.0mg/L+生物素0.1mg/L+核黄素0.5mg/L+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L，pH：5.8-6.0；
D、将步骤C培养基中完成生根的幼苗于光照培养箱中进行移栽炼苗，成活后移植于盆栽或大田培养，所述的试管苗移栽方法是：用镊子将生根的试管苗从培养基中取出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有育苗基质的塑料杯中，成活后移入盆栽。
2.根据权利要求1所述的一种丰水梨试管苗生根的制备方法，其特征在于：所述的1/4MS 大量 + 1/2MS 微量是指MS基本培养基大量缩减为原来的1/4，微量减半，MS培养基组分为：KNO3 1900 mg/L，NH4NO3 1650 mg/L，MgSO4·7H2O 370 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，CaCl2·2H2O 400 mg/L，MnSO4·4H2O 22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，H3BO3  6.2 mg/L，KI 0.83 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025 mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，Na2·EDTA·2H2O37.3mg/L，FeSO4·7H2O 27.9mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种丰水梨试管苗生根的制备方法，其特征在于：所述的LP基本培养基组分为KNO3 1800mg/L，NH4NO3 400mg/L，MgSO4·7H2O 360mg/L，KH2PO4 270mg/L，Ca(NO3)2·7H2O 1200mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO3  6.2mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，盐酸硫胺素 0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇150mg/L，甘氨酸 2.0mg/L。
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