CN108668892A - 东北红豆杉组培苗生根方法 - Google Patents

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程广有
唐晓杰
林蔚
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Abstract

本发明公开了一种东北红豆杉组培苗生根方法，包括以下步骤：取东北红豆杉组培苗，无菌条件下用无菌水清洗后接种到一号培养基中培养一周，然后将组培苗转移到二号培养基；组培苗在二号培养基中培养一周后转移到三号培养基；组培苗在三号培养基中培养一周后转移到四号培养基；组培苗在四号培养基中培养两周后陆续生根。本发明先通过液体培养基振荡培养，促进组培苗中的生根抑制物质释放排出，然后再使用固体培养基静置培养，培养基中添加促进生根物质，使组培苗内激素平衡改变，促进生根的生长调节物质含量增加，不定根诱导被启动。生根时间短，生根率高，解决了东北红豆杉诱导生根困难的问题。

Description

东北红豆杉组培苗生根方法
技术领域
本发明涉及植物组培领域，特别涉及一种东北红豆杉组培苗生根方法。
背景技术
东北红豆杉(Taxus cuspidata)属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus) 常绿针叶乔木。东北红豆杉天然种群数量的稀少，被列为国家一级重点保护的野生珍稀濒危植物。
选择具有初生分生能力的红豆杉组织(嫩枝、顶芽、腋芽、茎尖、离体胚等)，经体外培养可直接诱导发芽或生根，可以形成完整植株。影响外植体芽诱导效率的因素主要有种属、取材季节、部位、培养基配比、外源激素浓度，常选用WPM、B5、MS、DCR等作基本培养基，为防止褐变，可添加0.2％-0.5％的活性炭粉(AC)。以枝条为外植体时，多选用处于生长旺盛期或长有营养芽的嫩枝，这样有利于茎芽的诱导增殖。激素配比对诱导结果影响较大，但遵循愈伤组织诱导及有利于生根。目前尚未见系统的诱导红豆杉外植体生根发芽最佳条件的报道，研究结果主要集中于芽的诱导，如用TIBA(2，3，5-三碘苯甲酸) 诱导南方红豆杉新梢，3.0mg/L时诱导率可达100％，另外单独添加0.1mg/LZT 和0.01mg/L6-BA时效果也十分理想；而关于红豆杉外植体诱导生根方面的研究则不如芽诱导那么丰富，当前技术只能保证可以诱导出不定根，如喜马拉雅红豆杉的枝条在添加3.5mg/LIBA的MS和8mg/LIBA的1/2MS培养基上培养， 60-80d后可诱导生根。总的来说，分裂素浓度控制在1-4mg/L利于出芽，而生根则受外植体树龄和IBA影响较大，且诱导生根困难。红豆杉组培苗的生根还有待进一步研究。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种东北红豆杉组培苗生根方法。所述技术方案如下：
一方面，一种东北红豆杉组培苗生根方法，包括以下步骤：取东北红豆杉组培苗，无菌条件下用无菌水清洗后接种到一号培养基中培养一周，然后将组培苗转移到二号培养基；组培苗在二号培养基中培养一周后转移到三号培养基；组培苗在三号培养基中培养一周后转移到四号培养基；组培苗在四号培养基中培养两周后陆续生根；
一号培养基包括：无菌水和0.1mg/L IBA(吲哚丁酸)；
二号培养基包括：不含琼脂的1/4MS培养基和0.1mg/LIBA；
三号培养基包括：不含琼脂的1/4MS培养基和0.2mg/LIBA；
四号培养基包括：含琼脂的1/4MS培养基、0.2mg/LIBA、2％蔗糖和活性炭粉末5g/L。
进一步的，一号培养基、二号培养基、三号培养基和四号培养基pH值均为 5.8。
进一步的，一号培养基、二号培养基和三号培养基均置于振荡培养箱内振荡培养。
进一步的，四号培养基置于培养室培养架上培养。
进一步的，在一号培养基、二号培养基和三号培养基中的培养条件相同，均为：培养温度23±2℃，光照强度3000-4000lx，光照时间14h。
进一步的，在培养室培养架上的培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度 3000-4000lx，光照时间14h。
进一步的，取高度2cm以上的组培苗，无菌条件下用无菌水清洗后接种到一号培养基中。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的东北红豆杉组培苗生根方法，先通过液体培养基振荡培养，促进组培苗中的生根抑制物质释放排出，然后再使用固体培养基静置培养，培养基中添加促进生根物质，使组培苗内激素平衡改变，促进生根的生长调节物质含量增加，不定根诱导被启动。本发明的方法生根时间短，生根率高，解决了东北红豆杉诱导生根困难的问题，为东北红豆杉繁育工作的研究提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中IBA浓度对生根率的影响结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
一、培养基种类与东北红豆杉组培苗生根
分别用MS培养基、White培养基和改良的MS培养基为基本培养基，各培养基中均添加0.5mg·L-1吲哚丁酸，30g·L-1的蔗糖，调整培养基pH＝5.5。用上述三种培养基诱导东北红豆杉组培苗生根，培养3周均未见不定根发生。
二、营养物质与东北红豆杉组培苗生根
MS培养基中营养物质含量分别为：MS(正常营养物质含量)、1/2MS(MS 营养物质50％)和1/4MS(MS培养基营养物质25％)，在各培养基中分别加入 30g·L-1的蔗糖，调整培养基pH＝5.5。用上述三种培养基诱导东北红豆杉组培苗生根，培养4周时，MS和1/2MS中的组培苗均未生根，1/4MS培养基有少量东北红豆杉组培苗生根。
三、生长调节物质与东北红豆杉生根
东北红豆杉芽体伸长生长时，未见不定根发生。芽体停止伸长生长，部分木质化以后，才从芽体基部发生不定根。因此，常常是将芽体转移到生根培养基上，培养2个月后，甚至更长时间才开始发生不定根。
不定根发生的形式有两种，一种是皮层直接生根，另一种是愈伤组织生根。以愈伤组织生根型居多。
不定根发生率与激素种类和浓度有着密切的关系。诱导不定根实验设计： 1/2MS分别加入吲哚丁酸IBA(0、1、2、3、4、5、6mg/L)、奈乙酸NAA(0、 1、2、3、4、5、6mg/L)和生根粉ABT1#(0、1、2、3、4、5、6mg/L)，加入 2％蔗糖，培养基酸碱度为pH5.8，每瓶接种东北红豆杉组培芽苗5株，每个处理30瓶。接种后至于培养室内培养，温度23±2℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h。培养6周后调查不定根发生状况，结果见表1。
表1生长调节剂诱导东北红豆杉不定根调查表
通过表1可以看出，在吲哚丁酸(IBA)、奈乙酸(NAA)、生根粉ABT1#的对比试验中，IBA促进生根的效果好于NAA和ABT1#。并且在一定浓度范围内，芽体生根率与IBA浓度呈正相关，即IBA含量较高时，不定根发生率也较高。如图1所示，IBA浓度在3mg·L-1以下时，生根率很低；IBA质量浓度为4mg·L-1时，生根率迅速增大，在5mg·L-1时达最大(72.3％)。
由于生根所需要的时间较长，培养物褐变现象很普遍，芽体轻度褐变并未影响不定根的发生。将培养物不断转移到新鲜培养基中，或者在培养基中加入适量的活性炭(0.5％)，可在一定程度上减少褐色分泌物含量，促进生根。
综上，东北红豆杉幼嫩芽体，不定根发生较缓慢，通常是先在基部形成大量愈伤组织，并且随着培养时间的延长，大部分愈伤组织发生褐变。产生褐变的原因主要是培养物分泌大量酚类物质的原故，这些酚类物质抑制不定根的发生。从本试验结果看，愈伤组织生根型较多，可能是生长素用量较高的缘故。愈伤组织生根型移栽成活率较皮层生根型低。从树龄较小的母树上剪取的芽体，不定根发生率较高。从1年生的植株上剪取的外植体生根率高达83％，而母树年龄为30a时，外植体生根率仅为41％。说明东北红豆杉个体发育状况影响外植体的生根，即存在较强的年龄效应。在进行组织培养或扦插繁殖时，从幼小的植株上剪取外植体，可以提高不定根发生率。同时，用来诱导不定根的芽体太幼嫩不利于生根，需要部分木质化之后，才能发生不定根。在生根培养基中加入适宜的激素可以促进不定根的发生。低浓度的IBA促进生根效果不明显，这可能与芽体生根时间较长有关。
实施例2
1、培养基准备
①液体培养基
一号培养基：无菌水+0.1mg/LIBA。
二号培养基：1/4MS(无琼脂)+0.1mg/LIBA。
三号培养基：1/4MS(无琼脂)+0.2mg/LIBA。
②固体培养基
四号培养基：1/4MS(有琼脂)+0.2mg/LIBA+蔗糖2％+活性炭粉末5g/L。
将上述一号至四号培养基的酸碱度均调节至pH5.8，并在121℃下灭菌 18min，冷却备用。
2、不定根诱导
选择较粗壮的无根东北红豆杉组培苗，高度2cm以上，在超净工作台上，取出选择的组培苗，利用无菌水洗净组培苗上黏附的培养基。然后将组培苗接种到一号培养基中，每瓶接种5-6株无根组培苗，盖上培育瓶盖，放在振荡培养箱内振荡培养，培养温度23±2℃，光照强度3000-4000lx，光照时间14h。
培养一周后，将组培苗转移到二号培养基中，置于振荡培养箱中，采用与一号培养基相同的培养条件振荡培养。
在二号培养基中培养一周后，将组培苗转移到三号培养基中，置于振荡培养箱中，采用与一号培养基相同的培养条件振荡培养。
在三号培养基中培养一周后，将组培苗转移到四号培养基中，放在培养室内培养架上培养，培养温度23±2℃，光照强度3000-4000lx，光照时间14h。
在四号培养基中培养二周后，组培苗陆续生根，四周后生根率达到96％。
东北红豆杉组培苗生根率低的主要原因是植株内还有抑制生根物质，比如脱落酸、分类物质等，这些抑制生根的物质易溶于水。将东北红豆杉组培苗接种到液体培养基进行诱导不定根实验，接种后3天，培养基中开始出现褐色物质，说明东北红豆杉组培苗向培养基中释放了分泌物。其中一部分生根抑制物从组培苗中释放出来。震荡培养既可以加快这些物质的释放，又能够增加培养基中的氧含量，而氧气是植物生根所必须的。同时，培养基中的促进生根物质——吲哚丁酸被组培苗吸收。抑制生根物质排出与促进生根物质吸入，导致东北红豆杉组培苗内激素平衡改变，促进生根的生长调节物质含量增加，不定根诱导被启动。
本发明的东北红豆杉组培苗生根方法，先通过液体培养基振荡培养，促进组培苗中的生根抑制物质释放排出，然后再使用固体培养基静置培养，培养基中添加促进生根物质，使组培苗内激素平衡改变，促进生根的生长调节物质含量增加，不定根诱导被启动。本发明的方法生根时间短，生根率高，解决了东北红豆杉诱导生根困难的问题，为东北红豆杉繁育工作的研究提供了基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，包括以下步骤：取东北红豆杉组培苗，无菌条件下用无菌水清洗后接种到一号培养基中培养一周，然后将所述组培苗转移到二号培养基；所述组培苗在所述二号培养基中培养一周后转移到三号培养基；所述组培苗在所述三号培养基中培养一周后转移到四号培养基；所述组培苗在所述四号培养基中培养两周后陆续生根；
所述一号培养基包括：无菌水和0.1mg/LIBA；
所述二号培养基包括：不含琼脂的1/4MS培养基和0.1mg/LIBA；
所述三号培养基包括：不含琼脂的1/4MS培养基和0.2mg/LIBA；
所述四号培养基包括：含琼脂的1/4MS培养基、0.2mg/LIBA、2％蔗糖和活性炭粉末5g/L。
2.如权利要求1所述的一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，所述一号培养基、所述二号培养基、所述三号培养基和所述四号培养基pH值均为5.8。
3.如权利要求2所述的一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，所述一号培养基、所述二号培养基和所述三号培养基均置于振荡培养箱内振荡培养。
4.如权利要求3所述的一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，所述四号培养基置于培养室培养架上培养。
5.如权利要求4所述的一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，在所述一号培养基、所述二号培养基和所述三号培养基中的培养条件相同，均为：培养温度23±2℃，光照强度3000-4000lx，光照时间14h。
6.如权利要求5所述的一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，在所述培养室培养架上的培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度3000-4000lx，光照时间14h。
7.如权利要求1所述的一种东北红豆杉组培苗生根方法，其特征在于，取高度2cm以上的组培苗，无菌条件下用无菌水清洗组培苗，然后接种到一号培养基中。
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