CN102450214B - 一种黑麦草胚性愈伤组织的筛选和保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种获得黑麦草（LoliumL.）胚性愈伤组织及其再生能力保持的方法。愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；从成熟胚诱导愈伤组织，培养1月后，再经过4次继代培养，培养时间为2月，每2周继代1次；然后进行愈伤组织分化植株再生培养，分化出的植株继续进行继代培养，不能分化的愈伤组织扔弃；取再生后继代培养植株的茎节分生区进行第2次愈伤组织诱导，培养1月；愈伤组织再经过继代培养2月，每2周更换一次培养基，然后进行愈伤组织分化植株再生培养，不能分化的愈伤组织淘汰扔弃；对经过第2次分化再生的植株进行长期继代培养，在需要愈伤组织进行相关研究时，取这样的植株茎节分生区诱导并继代后获得需要的愈伤组织。本发明操作简单易行，能获得稳定的、高频的分化再生效率。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程组织培养技术领域，具体涉及一种获得黑麦草(Lolium L.)胚性愈伤组织及其再生能力保持的方法，并涉及相关的黑麦草愈伤组织诱导、离体再生等。
背景技术
黑麦草属植物中，广泛栽培的是多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和一年生黑麦草(Lolium multiflorum L.)，在世界各地均有种植，在我国属于引进栽培，是优良的牧草和草坪草，因此利用转基因技术对其进行遗传改良，具有重要意义。
转基因技术最重要的基础，是组织培养技术。目前对黑麦草的遗传转化，大多数是对其愈伤组织进行转化，然后筛选、分化，从而获得转基因植株。因此，获得具有分化能力的愈伤组织，是最终获得再生植株的关键。
黑麦草属单子叶禾本科植物。单子叶植物愈伤组织诱导，通常使用幼胚作为外植体，这样获得的愈伤组织具有较高的分化率，如小麦、玉米、水稻、大麦等。然而黑麦草成熟种子胚非常小，直径约0.5～1.0mm；幼胚更小，直径不足1.0mm，而且受季节限制，取材非常困难。因此黑麦草诱导愈伤组织，通常是以成熟种子胚为外植体【马欣荣博士论文，2006，四川大学；Bajaj S等，2006；专利(马欣荣，CN200510020540.7ZL)】。
植物组织诱导愈伤组织的能力，以及愈伤组织的分化再生能力，存在品种间、个体间的差异。从黑麦草成熟胚诱导的愈伤组织，品种不同，存在较大差异，约有10～80％的愈伤组织不能分化再生成植株，并且随着愈伤组织继代时间增加，分化能力随之下降。继代一年的愈伤组织，几乎不能再生出苗。这亦是转基因研究的瓶颈之一。
因此，探索一种能获得较高分化率、能分化再生出植株的胚性愈伤组织，并且以一种方式能长期保存胚性愈伤组织的方法，非常必要。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能长期保存具有分化再生能力的黑麦草愈伤组织的方法，为多年生黑麦草遗传改良、新材料的创造和培育，以及基因功能研究打下基础。
本发明提供了一种长期保持黑麦草愈伤组织再生能力的方法，包括如下几个步骤：愈伤组织诱导和继代培养、愈伤组织分化再生、植株继代、再生植株茎节分生组织区愈伤组织二次诱导、愈伤组织二次分化再生、植株的长期继代保存等步骤，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；愈伤组织继代培养后分化再生并淘汰不能分化的愈伤组织；再生植株继代培养后取分生组织区进行第二次愈伤组织诱导；二次诱导的愈伤组织进行分化再生，并再次淘汰不能分化的愈伤组织。这样获得的植株可以进行长期继代保存。在需要愈伤组织进行相关研究时，取这样的植株茎节分生区再次诱导的愈伤组织，经过2～4次继代培养后，具有很高的分化能力，分化能力维持在80～100％。简言之，本方法是通过对重复筛选胚性愈伤组织后获得的植株，进行长期继代培养，来保存胚性愈伤组织的。在整个培养过程中，植物生长调节剂的添加非常重要。
具体而言，在本发明的方法中可以使用的黑麦草包括，例如，多年生黑麦草品种5个，多福、雅晴、顶峰、匹克、百舸；一年生黑麦草1个，特高。这些品种均可购自市场。取出这些黑麦草的成熟胚，在含5～7mg/L的2，4-D和0.1mg/L的KT的诱导培养基上诱导出愈伤组织。
将诱导出的愈伤组织继代培养4次，2周/次，共2月。然后在含有0.1mg/L的2，4-D和0.5mg/L的6-BA的分化再生培养基中进行愈伤组织分化再生，1月后筛选，淘汰不能分化的愈伤组织。将分化再生出来的植株转移到试管中进行继代培养，植株在含有1～2mg/L的6-BA继代培养基中扩增培养2次，2周1次，1月。
在第一次分化再生及继代扩增繁殖完成后，本发明的方法进一步包括对再生植株进行第二次愈伤组织诱导及继代培养的步骤。这一次诱导，是取植株茎节的分生组织区为外植体进行愈伤组织的再次诱导，诱导培养基同上。诱导培养时间为1月。之后继代培养4次，2周1次，共2月。
之后，本发明的方法还包括第二次分化再生。将上一步骤中获得的愈伤组织转接到分化培养基中，分化培养基同上，再次进行愈伤组织的分化再生，培养1次，1月后筛选，淘汰不能分化的愈伤组织。将再次分化再生出来的植株转移到试管中进行继代培养。这样获得的植株可以进行长期的继代培养。继代方法为2周1次，继代培养基同上。
之后，本发明还包括，在经过1年以上的长期继代培养，取其植株茎节分生区再次诱导愈伤组织，经过2～4次继代培养后，2周/次，具有很高的分化能力，分化能力维持在80-100％。
简言之，本方法是通过重复筛选胚性愈伤组织后获得的植株，进行长期继代培养，来保存胚性愈伤组织的。在整个培养过程中，植物生长调节剂的添加非常重要。
所使用的培养基中用结冷胶作为凝固剂。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述植株继代培养基为含有30g/L的蔗糖、1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤(6-BA)的MS培养基。
结果，本发明采用上述步骤获得的再生植株，在进行长期继代培养后，从其中胚轴分生区诱导的愈伤组织，继代培养2个月后，仍然具有较强的分化能力。因此，这种再生植株，可以作为一种胚性愈伤组织的保存方式。在需要愈伤组织进行相关研究时，再次诱导愈伤并继代，即可获得分化率高达80％～95％的愈伤组织。
该方法的建立，为获得高分化率的胚性愈伤组织提供了保障，为其他相关研究如黑麦草的遗传改良等，打下基础。
本发明方法的优点：能获得分化能力很强的胚性愈伤组织，并可以通过再生植株的形式得以长期保存。保证了后续研究中愈伤组织的分化率。操作简单易行，能获得稳定的、高频的分化再生效率。
具体实施方式
下面实施例用于本发明的进一步说明，但是这些具体实验是示例性的，不能将它们视为对本发明的限制。
1.材料
选用多年生黑麦草品种雅晴，购自百绿国际草业有限公司。
2.方法
如下所有操作均在无菌条件下进行。
2.1从黑麦草成熟种子胚诱导愈伤组织及培养
愈伤组织诱导、继代培养的方法基本与我们已经获得的专利“多年生黑麦草的遗传转化方法(CN200510020540.7ZL)”相同。具体操作如下：
①将黑麦草的成熟种子用70％(V/V)乙醇漂洗1min，然后浸泡于活性氯含量2-4％的次氯酸钠溶液中，振荡15min，之后用无菌水洗涤4-5次；
②无菌水中室温浸泡4～6hr；
③超净台上剥取成熟胚，接种于诱导培养基上，23℃～25℃暗培养；
④1个月后，将生长良好的愈伤组织置于继代培养基中培养，23℃～25℃暗培养；继代4次，2周/次。
2.2第一次愈伤组织分化、植株再生
①植株再生
继代培养2月后，将愈伤组织置于愈伤组织分化培养基上，25℃光照培养，光周期为16hr光照/8hr暗，进行分化培养。
②植株继代培养
分化培养1月后，淘汰不能分化的愈伤组织，并将再生植株转入含有2mg/L的6-BA的继代培养基中扩增培养2次，2周1次，1月。
经过多次实验，优化出的培养基，在原有基础上有改进，见表1。
表1.组织培养中使用的培养基
2.3第二次愈伤组织的诱导及培养
取上述继代扩增后的植株茎节分生组织区(根茎之间约2mm)为外植体，置于愈伤组诱导培养基中进行诱导，诱导培养基同上。诱导培养时间为1月。之后继代培养4次，2周1次，共2月，继代培养基同上。诱导及继代均在23℃～25℃中暗培养。
2.4第二次愈伤组织分化、植株再生
①植株再生
愈伤组织继代培养2月后，再次进行愈伤组织的分化再生。将愈伤组织置于愈伤组织分化培养基上，分化培养基同上，25℃光照培养，光周期为16hr光照/8hr暗进行分化培养。
②植株继代培养
分化培养1月后，淘汰不能分化的愈伤组织。将再次分化再生出来的植株转移到试管中进行继代培养。继代方法为2周1次，继代培养基同上。
这样获得的植株可以进行长期的继代培养。
2.5从长期培养的植株茎节诱导愈伤组织
在经过1年以上的长期继代培养，取其植株茎节分生区再次诱导愈伤组织，经过2～4次继代培养后，2周1次。之后进行分化，并分析愈伤组织的再生能力。
简言之，本方法是通过重复筛选胚性愈伤组织后获得的植株，进行长期继代培养，来保存胚性愈伤组织的。在整个培养过程中，植物生长调节剂的添加非常重要。
3.结果
3.1第一次愈伤组织的诱导和继代
用上述诱导黑麦草愈伤组织的方法，约一半的成熟胚能够诱导产生愈伤组织，诱导率可以达到50％。诱导出的愈伤组织，通常疏松、色泽浅。经过4次，2周1次的继代培养后，部分愈伤组织长成较致密、奶黄色的愈伤组织，部分愈伤组织疏松色浅。
3.2第一次愈伤组织的分化再生
继代后的愈伤组织进行第一次分化再生，就品种雅晴而言，分化率约为30％。淘汰不能分化的愈伤组织，将再生植株转接到植株继代培养基中进行繁殖。
3.3第二次愈伤组织的诱导和继代
从再生植株茎节分生组织诱导愈伤，诱导率达70％以上，继代培养4次后，大多数愈伤组织生长成为致密、奶黄色的愈伤组织。
3.4第二次愈伤组织分化植株再生
将上述继代培养后的愈伤组织进行分化再生培养，2月后，再生频率达到了70％，将不能分化的愈伤组织淘汰。再生植株进行长期培养。
3.5从长期培养的植株茎节诱导的愈伤组织分化能力分析
上述二次诱导分化获得的再生植株，经过1年的继代培养，从其植株茎节诱导的愈伤组织，经过2～4次继代培养后，再进行分化培养，获得较高的分化效率，80-95％的愈伤组织能分化再生出植株，具有很强的分化能力。
因此，通过保存从胚性愈伤组织获得的再生植株，从而达到保存胚性愈伤组织的目的，是切实可行的。
高频分化率的愈伤组织，为进一步研究奠定了良好的基础。
小结
本发明提供了一种筛选胚性愈伤组织，并长期保存具有分化再生能力的黑麦草愈伤组织的方法，其保存方式是通过再生植株的形式得以长期保存。需要时，即可从植株茎节分生区诱导，从而获得高频分化率的愈伤组织，保证了后续研究中愈伤组织的分化率。操作简单易行，能获得稳定的、高频的分化再生效率。
为多年生黑麦草遗传改良、新材料的创造和培育，以及基因功能研究打下基础。
Claims (1)
1.一种多年生黑麦草胚性愈伤组织的筛选和保存方法，包括从成熟胚诱导愈伤组织及其继代培养、愈伤组织分化再生、植株继代、再生植株茎节分生组织区愈伤组织二次诱导、愈伤组织二次分化再生、植株的长期继代保存及长期保存的植株茎节分生组织区愈伤组织诱导及其继代和分化再生，其特征是：愈伤组织诱导所用的材料是黑麦草的成熟种子胚；从成熟胚诱导愈伤组织，培养1月后，再经过4次继代培养，培养时间为2月，每2周继代1次；然后进行愈伤组织分化植株再生培养，分化出的植株继续进行继代培养，不能分化的愈伤组织扔弃；取再生后继代培养植株的茎节分生组织区进行第2次愈伤组织诱导，培养1月；愈伤组织再经过继代培养2月，每2周更换一次培养基，然后进行愈伤组织分化植株再生培养，不能分化的愈伤组织淘汰扔弃；对经过第2次分化再生的植株进行长期继代培养，在需要愈伤组织进行相关研究时，取这样的植株茎节分生组织区诱导并继代后获得需要的愈伤组织；愈伤组织诱导培养基成分为：MS基本培养基+5~7mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和0.1mg/L的激动素（KT）+麦芽糖30g/L+结冷胶2.4g/L，pH 5.8；愈伤组织继代培养基成分为：MS基本培养基+3mg/L 2,4-D+麦芽糖30g/L+结冷胶2.4g/L，pH 5.8；
愈伤组织分化植株再生培养基成分为：MS基本培养基+0.1mg/L 2,4-D和0.5mg/L 6-苄基嘌呤（6-BA）+蔗糖40g/L+结冷胶2.4g/L，pH 5.8；
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