CN104726389A

CN104726389A - 一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌及其构建方法

Info

Publication number: CN104726389A
Application number: CN201510175613.3A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 韩雪萍; 赵广
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2035-04-14
Also published as: CN104726389B

Abstract

本发明公开了一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明提供的大肠杆菌是过表达以下任意一种或几种蛋白：醛脱氢酶A、ATP依赖的蛋白水解亚单位、琥珀酰转移酶、伴侣蛋白、寡肽透过酶、羟基丁酮磷酸合酶、超氧化物歧化酶或单链DNA结合蛋白。同时，本发明还提供了构建上述大肠杆菌的方法。本发明所提供的大肠杆菌通过表达内源蛋白，可以提高大肠杆菌在3HP胁迫下的存活率。利用本发明所提供的方法构建获得的大肠杆菌对3HP的耐受性明显提高，提高幅度可以达到111％，这对生物法生产3HP意义重大。

Description

一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

3-羟基丙酸(3HP)是一种重要的平台化合物，被美国能源部列为世界上最具开发潜力的12种化工产品之一。3HP可用来合成丙烯酸、丙二醇、丙烯酰胺等，他们当前市场价值合计达到100亿美元。3HP可以通过化学法和生物法合成，与化学法相比，生物合成法具有成本低、操作简单、条件温和、绿色环保等优点大肠杆菌工程菌株生产3HP已经被多次报道。尽管有了这些报道，但是3HP的生物生产仍有很多问题。首先3HP的毒性对细胞生长的影响被认为是商业化的一个关键障碍。一般而言，有机酸不分解可以直接扩散出大肠杆菌的细胞膜，细胞质的pH(大约7.5)远大于大部分有机酸的pKa值，这时有机酸需要分解才能扩散，这会破坏细胞质的pH值和阴离子池。细胞内部增加酸度会损害嘌呤碱基的完整性和使重要酶变性，两者都会严重降低细胞活力。大肠杆菌具有五个主要耐酸性(AR)系统，以抵消酸压力。虽然对耐酸系统知之甚少，但是AR1系统至少需要信号因子σ^s和cAMP受体蛋白(CRP)二者之一才能起作用。AR2-AR5路径分别依赖于细胞外谷氨酸，精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸。在每个系统中，胞质脱羧酶催化一个质子依赖的氨基酸脱羧反应，膜内底物和膜外产物的交换促进反应的持续。

醛脱氢酶A(AldA)是一个代谢过程的中间酶，ATP依赖的蛋白水解亚单位(ClpP)催化蛋白或者多肽水解的酶亚单位，琥珀酰转移酶(DapD)参与琥珀酸的合成，伴侣蛋白(HscA)协助大分子结构折叠、组装、解体的蛋白质，寡肽透过酶(OppA)与寡肽结合，协助寡肽穿过生物膜，羟基丁酮磷酸合酶(RibB)运输辅因子和小分子，超氧化物歧化酶(SodB)有解毒作用，单链DNA结合蛋白(SSB)是DNA复制所必须的酶。目前，没有相关报道表明，AldA、ClpP、DapD、HscA、OppA、RibB、SodB、SSB的过表达会提高大肠杆菌的抗酸性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌及其构建方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌。该大肠杆菌是过表达以下任一一种或几种蛋白：醛脱氢酶A、ATP依赖的蛋白水解亚单位、琥珀酰转移酶、伴侣蛋白、寡肽透过酶、羟基丁酮磷酸合酶、超氧化物歧化酶或单链DNA结合蛋白。

优选地，所述过表达是将编码醛脱氢酶A基因、ATP依赖的蛋白水解亚单位基因、琥珀酰转移酶基因、伴侣蛋白基因、寡肽透过酶基因、羟基丁酮磷酸合酶基因、超氧化物歧化酶基因或单链DNA结合蛋白基因中一种或几种转入到宿主菌中通过IPTG诱导实现过表达。

优选地，所述醛脱氢酶A基因，是醛脱氢酶A基因aldA；所述ATP依赖的蛋白水解亚单位基因，是ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP；所述琥珀酰转移酶基因，是琥珀酰转移酶基因dapD；所述伴侣蛋白基因，是伴侣蛋白基因hscA；所述寡肽透过酶基因，是寡肽透过酶基因oppA；所述羟基丁酮磷酸合酶基因，是羟基丁酮磷酸合酶基因ribB；所述超氧化物歧化酶基因，是超氧化物歧化酶基因sodB；所述单链DNA结合蛋白基因，是单链DNA结合蛋白基因ssb。

优选地，所述所有基因均来源于E.coli BL21(DE3)。

优选地，所述醛脱氢酶A，NCBI的蛋白编号为EHY09191；所述ATP依赖的ATP依赖的蛋白水解亚单位，NCBI的蛋白编号为EHY12102；所述琥珀酰转移酶，NCBI的蛋白编号为EHY12268；所述伴侣蛋白，NCBI的蛋白编号为EHY07424；所述寡肽透过酶，NCBI的蛋白编号为EHY09046；所述羟基丁酮磷酸合酶，NCBI的蛋白编号为EHY05769；所述超氧化物歧化酶，NCBI的蛋白编号为EHY07747；所述单链DNA结合蛋白，NCBI的蛋白编号为EHY07615。

本发明的另一目的在于提供一种所述大肠杆菌的构建方法，该方法是以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR扩增醛脱氢酶A基因aldA、ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP、琥珀酰转移酶基因dapD、伴侣蛋白基因hscA、寡肽透过酶基因oppA、羟基丁酮磷酸合酶基因ribB、超氧化物歧化酶基因sodB、单链DNA结合蛋白基因ssb中任一一种或几种基因，扩增结束后回收目的片段，利用目的片段分别构建表达载体，再将构建好的表达载体转化到宿主细胞中，获得重组菌，培养并利用IPTG诱导重组菌过表达转入基因编码的蛋白。

优选地，所述方法的步骤如下：

1)以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR扩增目的基因，扩增结束后获得扩增产物；

所述目的基因为醛脱氢酶A基因aldA、ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP、琥珀酰转移酶基因dapD、伴侣蛋白基因hscA、寡肽透过酶基因oppA、羟基丁酮磷酸合酶基因ribB、超氧化物歧化酶基因sodB、单链DNA结合蛋白基因ssb中任一一种或几种基因

2)回收步骤1)所述扩增产物中的目的片段，分别与质粒载体pTrcHis2B构建表达载体；

3)将步骤2)所得的表达载体转化到宿主细胞中，获得重组菌；

4)培养步骤3)所得重组菌，培养并利用IPTG诱导重组菌过表达目的基因编码的蛋白。

优选地，步骤1)所述PCR扩增，醛脱氢酶A基因aldA所用引物的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2或SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24所示；ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP所用引物的序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.26所示；琥珀酰转移酶基因dapD所用引物的序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；伴侣蛋白基因hscA所用引物的序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；寡肽透过酶基因oppA所用引物的序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示；羟基丁酮磷酸合酶基因ribB所用引物的序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；超氧化物歧化酶基因sodB所用引物的序列如SEQID NO.13-SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示；单链DNA结合蛋白基因ssb的引物序列如SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示或SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22所示。

优选地，步骤3)所述宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

优选地，步骤4)所述培养并利用IPTG诱导重组菌过表达目的基因编码的蛋白，是将重组菌与M9培养基以1:100的比例接种后，培养至OD₆₀₀为0.5，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃下过表达2h。

通过PCR(聚合酶链式反应)扩增醛脱氢酶A基因(aldA)，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和质粒pTrcHis2B，酶切产物回收后，将载体和基因按摩尔比1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6-12小时，连接产物42℃下热激转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板培养，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆培养后提取质粒，进行酶切和测序鉴定后，转化宿主E.coli BL21(DE3)，得到目的菌株。

其它目的菌株分别携带clpP，dapD，hscA，oppA，ribB，sodB，ssb基因中的一种两种或三种，构建方法同上；还有一个携带空载体pTrcHis2B作为对照菌。

所述aldA，clpP，dapD，hscA，oppA，ribB，sodB，ssb基因皆来源于E.coli BL21(DE3)。

本发明提供的提高大肠杆菌在3HP胁迫下存活率的方法，是将构建好的大肠杆菌和携带空载体的对照菌在适宜的培养基中进行活化种子液，将种子液以1:100的比例接入含有氨苄青霉素的基本培养基中，37℃，180rpm/min的条件下培养至OD₆₀₀在0.5左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，诱导目的蛋白表达2小时，加入5g/L的3HP。37℃，半个小时后，对菌液进行梯度稀释，稀释到10^-5，每个梯度取3μL点到含有氨苄青霉素的板子上。37℃，过夜培养，进行计数并计算存活率。与对照菌相比，过表达AldA，ClpP，DapD，HscA，OppA，RibB，SodB，SSB的菌株存活率都显著提高。说明过表达上述蛋白可以提高大肠杆菌在3HP胁迫下的存活率。

培养基配方：

1)LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。接种时补加100μg/mL氨苄青霉素。

2)M9基本培养基配方：47.7mM Na₂HPO₄，22mM KH₂PO₄，18.7mM NH₄Cl，8.6mMNaCl，2mM MgSO₄，0.1mM CaCl，0.4％葡萄糖。接种时补加100μg/mL氨苄青霉素。

其中Na₂HPO₄，KH₂PO₄，NH₄Cl，NaCl混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L，115℃，20min单独灭菌；CaCl储液为1M，MgSO₄·7H₂O储液为200g/L，121℃，20min分别单独灭菌，抗生素配成10％的溶液，用0.22μm滤菌膜过滤除菌，转接种子液时分别补加上述单独除菌的葡萄糖、CaCl、MgSO₄·7H₂O及抗生素。

本发明有益效果：

1)通过过表达内源蛋白，可以提高大肠杆菌在3HP胁迫下的存活率。

2)通过本方法，大肠杆菌对3HP的耐受性明显提高，提高幅度可以达到111％，这对生物法生产3HP意义重大。

缩写和定义

3-羟基丙酸：3HP

2维电泳：2D

AR：酸抗性系统

醛脱氢酶A及编码基因：AldA，aldA

蛋白水解亚单位及编码基因：ClpP，clpP

琥珀酰转移酶及编码基因：DapD，dapD

伴侣蛋白及编码基因：HscA，hscA

寡肽透过酶及编码基因：OppA，oppA

羟基丁酮磷酸合酶及编码基因：RibB，ribB

超氧化物歧化酶及编码基因：SodB，sodB

单链DNA结合蛋白及编码基因：SSB，ssb

氨苄青霉素：Amp

“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

“存活率”，酸胁迫单位体积的细胞数占非酸胁迫单位体积细胞数的比重。

“酸胁迫”，细胞生长的环境中由于酸过多引起pH的降低，对细胞是一种不利的生长环境。

附图说明

图1为本发明的技术流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相对应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

实施例1

通过大肠杆菌体内过表达AldA，ClpP，DapD，HscA，OppA，RibB，SodB，SSB实现其在3HP胁迫下的存活率(技术流程见图1)。

1.1)抗酸性的蛋白

通过在大肠杆菌细胞内过表达AldA，ClpP，DapD，HscA，OppA，RibB，SodB，SSB，可以提高其对3HP的耐受性。

1.2)单基因表达载体的构建(以pTrcHis2B-aldA为例)

以E.coli BL21(DE3)为模板，869和870为引物，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增醛脱氢酶A基因(aldA)，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后用NcoI、EcoRI分别酶切基因和载体pTrcHis2B，酶切产物回收后，将载体和基因按摩尔比1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6-12小时，连接产物42℃下热激转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板培养，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆培养后提取质粒，进行酶切和测序鉴定。

需要构建的其它表达载体：pTrcHis2B-clpP，pTrcHis2B-dapD，pTrcHis2B-hscA，pTrcHis2B-oppA，pTrcHis2B-ribB，pTrcHis2B-sodB，pTrcHis2B-ssb。构建方法同上，引物分别用：873，874；844，845；846，847；848，849；850，851；852，853；854，855。

引物序列和酶切位点见表1。

表1实施例1-3用到的所有引物及其酶切位点

1.3)目的菌株的构建

将上述构建好的载体转化宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到目的菌株。

将空载体pTrcHis2B转化到E.coli BL21(DE3)，作为对照菌株。

1.4)存活率的测定

将上述构建好的大肠杆菌的和携带空载体的对照菌在LB培养基中活化种子液，将种子液以1:100的比例接入含有氨苄青霉素的基本培养基中，37℃，180rpm/min的条件下培养至OD₆₀₀在0.5左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，诱导目的蛋白表达2小时，加入5g/L的3HP。37℃，半个小时后，对菌液进行梯度稀释，每个梯度取3μL点到含有氨苄青霉素的板子上。37℃，过夜培养，计数并计算存活率。与对照菌相比，过表达AldA，ClpP，DapD，HscA，OppA，RibB，SodB，SSB的菌株存活率分别提高70％，100％，80％，48％，73％，84％，82％，86％。详情见表2。

表2过表达蛋白后存活率提高情况

实施例2

本实施提供了3种同时过表达2种蛋白的大肠杆菌。大肠杆菌的制备过程与实施例1基本相同，区别在于，分别将基因DapD和基因AldA、基因HscA和基因ClpP以及基因RibB和基因SodB同时导入到宿主菌中，获得E.coli BL21(pTrcHis2B-dapD-aldA)、E.coliBL21(pTrcHis2B-hscA-clpP)和E.coli BL21(pTrcHis2B-ribB-sodB)三株同时过表达2种蛋白的重组大肠杆菌。

双基因表达载体的构建方法如下(以pTrcHis2B-dapD-aldA为例)：

以E.coli BL21(DE3)为模板，10007和10008为引物，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增醛脱氢酶A基因(aldA)，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后用SacI、KpnI分别酶切基因和载体pTrcHis2B-dapD，酶切产物回收后，将载体和基因按摩尔比1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6-12小时，连接产物42℃下热激转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板培养，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆培养后提取质粒，进行酶切和测序鉴定。

需要构建的其它表达载体：pTrcHis2B-hscA-clpP，pTrcHis2B-ribB-sodB。构建方法同上，引物分别用表1中的10009，10010；10003，10004。载体分别用：pTrcHis2B-hscA、pTrcHis2B-ribB。

测定三株重组菌存活率的方法同实施案例1，结果如下，E.coli BL21(pTrcHis2B-dapD-aldA)菌株在3HP存在下的存活率为85％，E.coli BL21(pTrcHis2B-hscA-clpP)菌株在3HP存在下的存活率为90％，E.coli BL21(pTrcHis2B-ribB-sodB)菌株在3HP存在下的存活率为86％。相对于对照分别提高93％、104％、95％。

实施例3

本实施提供了2种同时过表达3种蛋白的大肠杆菌。大肠杆菌的制备过程与实施例1、2基本相同，区别在于，分别将基因DapD、基因AldA和基因OppA以及基因HscA、基因ClpP和基因SSB同时导入到宿主菌中，获得E.coli BL21(pTrcHis2B-dapD-aldA-oppA)和E.coliBL21(pTrcHis2B-hscA-clpP-ssb)两株同时过表达3种蛋白的重组大肠杆菌。

携带三个基因表达载体的构建方法如下(以pTrcHis2B-dapD-aldA-oppA为例)：

以E.coli BL21(DE3)为模板，10001和10002为引物，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增寡肽透过酶基因(oppA)，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后用XhoI、HindⅢ分别酶切基因和载体pTrcHis2B-dapD-aldA，酶切产物回收后，将载体和基因按摩尔比1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6-12小时，连接产物42℃下热激转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板培养，PCR筛选阳性克隆；阳性克隆培养后提取质粒，进行酶切和测序鉴定。

需要构建的其它表达载体：pTrcHis2B-hscA-clpP-ssb。构建方法同上，引物用：10005，10006，载体用pTrcHis2B-hscA-clpP。

测定两株重组菌存活率的方法同实施案例1，结果如下，E.coliBL21(pTrcHis2B-dapD-aldA-oppA)菌株在3HP存在下的存活率为90％，E.coliBL21(pTrcHis2B-hscA-clpP-ssb)菌株在3HP存在下的存活率为93％，相对于对照分别提高104％、111％。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种3-羟基丙酸耐受性提高的大肠杆菌，其特征在于，过表达以下任一一种或几种蛋白：醛脱氢酶A、ATP依赖的蛋白水解亚单位、琥珀酰转移酶、伴侣蛋白、寡肽透过酶、羟基丁酮磷酸合酶、超氧化物歧化酶或单链DNA结合蛋白。

2.权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，所述过表达，是将编码醛脱氢酶A基因、ATP依赖的蛋白水解亚单位基因、琥珀酰转移酶基因、伴侣蛋白基因、寡肽透过酶基因、羟基丁酮磷酸合酶基因、超氧化物歧化酶基因或单链DNA结合蛋白基因中一种或几种转入到宿主菌中通过IPTG诱导实现过表达。

3.权利要求2所述大肠杆菌，其特征在于，所述醛脱氢酶A基因，是醛脱氢酶A基因aldA；所述ATP依赖的蛋白水解亚单位基因，是ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP；所述琥珀酰转移酶基因，是琥珀酰转移酶基因dapD；所述伴侣蛋白基因，是伴侣蛋白基因hscA；所述寡肽透过酶基因，是寡肽透过酶基因oppA；所述羟基丁酮磷酸合酶基因，是羟基丁酮磷酸合酶基因ribB；所述超氧化物歧化酶基因，是超氧化物歧化酶基因sodB；所述单链DNA结合蛋白基因，是单链DNA结合蛋白基因ssb。

4.权利要求3所述大肠杆菌，其特征在于，所述所有基因，均来源于E.coli BL21(DE3)。

5.权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，所述醛脱氢酶A，NCBI的蛋白编号为EHY09191；所述ATP依赖的ATP依赖的蛋白水解亚单位，NCBI的蛋白编号为EHY12102；所述琥珀酰转移酶，NCBI的蛋白编号为EHY12268；所述伴侣蛋白，NCBI的蛋白编号为EHY07424；所述寡肽透过酶，NCBI的蛋白编号为EHY09046；所述羟基丁酮磷酸合酶，NCBI的蛋白编号为EHY05769；所述超氧化物歧化酶，NCBI的蛋白编号为EHY07747；所述单链DNA结合蛋白，NCBI的蛋白编号为EHY07615。

6.一种权利要求1所述大肠杆菌的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR扩增醛脱氢酶A基因aldA、ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP、琥珀酰转移酶基因dapD、伴侣蛋白基因hscA、寡肽透过酶基因oppA、羟基丁酮磷酸合酶基因ribB、超氧化物歧化酶基因sodB、单链DNA结合蛋白基因ssb中任一一种或几种基因，扩增结束后回收目的片段，利用目的片段分别构建表达载体，再将构建好的表达载体转化到宿主细胞中，获得重组菌，培养并利用IPTG诱导重组菌过表达转入基因编码的蛋白。

7.权利要求6所述方法，其特征在于，步骤如下：

所述目的基因为醛脱氢酶A基因aldA、ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP、琥珀酰转移酶基因dapD、伴侣蛋白基因hscA、寡肽透过酶基因oppA、羟基丁酮磷酸合酶基因ribB、超氧化物歧化酶基因sodB、单链DNA结合蛋白基因ssb中任一一种或几种基因；

3)将步骤2)所得的表达载体转化到宿主细胞中，获得重组菌；

4)培养步骤3)所得重组菌，并利用IPTG诱导重组菌过表达目的基因编码的蛋白。

8.权利要求7所述方法，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增，醛脱氢酶A基因aldA所用引物的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24所示；ATP依赖的蛋白水解亚单位基因clpP所用引物的序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.26所示；琥珀酰转移酶基因dapD所用引物的序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；伴侣蛋白基因hscA所用引物的序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；寡肽透过酶基因oppA所用引物的序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示；羟基丁酮磷酸合酶基因ribB所用引物的序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；超氧化物歧化酶基因sodB所用引物的序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.19-SEQ ID NO.20所示；单链DNA结合蛋白基因ssb的引物序列如SEQ ID NO.15-SEQID NO.16所示或SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22所示。

9.权利要求7所述方法，其特征在于，步骤3)所述宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

10.权利要求7所述方法，其特征在于，步骤4)所述培养并利用IPTG诱导重组菌过表达目的基因编码的蛋白，是将重组菌与M9培养基以1:100的比例接种后，培养至OD₆₀₀为0.5，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃下过表达2h。