JP6794453B2 - モノホスホリル脂質ａを生産する細菌、及びそれを利用したヘキサ−アシル化されたモノホスホリル脂質ａの生産方法 - Google Patents

モノホスホリル脂質ａを生産する細菌、及びそれを利用したヘキサ−アシル化されたモノホスホリル脂質ａの生産方法 Download PDF

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Description

本発明は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ：monophosphoryl lipid Ａ）を生産する細菌、及びそれを利用したＭＬＡ生産方法に関する。
脂質多糖類（ＬＰＳ：lipopolysaccharide）は、グラム陰性細菌のペブチドグリカンを覆い包む外膜の構成成分中の一つである。該ＬＰＳは、脂質Ａと、それに共有結合で接合されたさまざまな種類の糖を含む分子である。ＬＰＳ成分のうち脂質Ａは、エンドトキシンとして知られており、グラム陰性細菌の毒性を担当する。
脂質Ａは、ｍｌ当たりピコグラムの量で、細胞（例えば、単核球または大食球）を活性化させるので、免疫系を活性化させる非常に力強い刺戟剤である。脂質Ａ、その誘導体、またはその変異体は、例えば、ワクチンの成分（アジュバント）として使用されもする。モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）は、アジュバント、アレルギー免疫治療、癌免疫治療に使用されており、または痴呆の予防及び治療に効果がある。また、ＭＬＡのうちヘキサ−アシル化されたモノホスホリル脂質Ａ（hexa-acylated-monophosphoryl lipid Ａ）、ペンタ−アシル化されたモノホスホリル脂質Ａ（penta-acylated-monophosphoryl lipid Ａ）及び３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＬＡ：３−Ｏ−desacyl−４’−monophosphoryll ipid Ａ）が、前述の用途に有効であると報告された。脂質Ａは、大腸菌のようなグラム陰性細菌の膜に存在する。膜に存在する脂質Ａは、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネート（Ｋｄｏ：２−keto−３−deoxy−Ｄ−manno−octulosonate）のような糖に接合する。従って、脂質Ａを遊離（free）形態で得るために、ＬＰＳの他の成分を取り除いて分離しなければならない。例えば、細菌膜からＬＰＳを抽出した後、ＬＰＳを、酸存在下で加熱し、Ｋｄｏと１−リン酸基とを除去することによってＭＬＡを得るか、あるいは化学的過程によってＭＬＡを合成することができる。しかし、かような方法は、過程が複雑であって収率が低いという問題がある。
それにより、既存方法に比べ、簡単であって酸加水分解なしに、ＭＬＡ及び誘導体を生産する方法を開発する必要がある。
本発明は、ＭＬＡを生産する細菌を提供する。
本発明が解決しようとする課題は、またＭＬＡの生産方法を提供する。
前記課題を解決するために、本発明は、ＬｐｘＥポリペプチドを含むモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を生産する細菌を提供する。
一様相によるＬｐｘＥポリペプチドを含むモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を生産する細菌、及びそれを利用してのＭＬＡ生産方法によれば、簡単であり、酸加水分解及び／または塩基加水分解なしに、ＭＬＡを生産することができる。
細菌において、１−脱リン酸−Ｋｄｏ２−脂質Ａの生合成経路を示す模式図である。 ＥｃＬｐｘＬ及びＥｃＬｐｘＭを含むＰＣＲ産物を製造する方法を示す模式図である。 大腸菌株ＫＨＳＣ００３を製造する方法を示す模式図である。 脂質のＴＬＣ結果を示す写真である（レーン１：大腸菌Ｗ３１１０において、酸性加水分解によって得られた脂質、レーン２：ｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥを含んだ大腸菌Ｗ３１１０において、酸性加水分解によって得られた脂質、レーン３：ｐＢＡＤ３３．１を含んだ大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出された脂質、レーン４：ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥを含んだ大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出された脂質）。 脂質のＴＬＣ結果を示す写真である（レーン１：大腸菌Ｗ３１１０において、酸性加水分解によって得られた脂質、レーン２：ｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを含んだ大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出された脂質、レーン３：ｐＢＡＤ３３．１を含んだ大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出された脂質）。 ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥに形質転換された大腸菌ＫＨＳＣ００３の脂質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight）／ＭＳで分析した結果を示すグラフである。 図４Ａで検出された脱リン酸−脂質Ａ（ｍ／ｚ：１７１６．３６）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳで分析した結果を示すグラフである。 ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥまたはｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥに形質転換された大腸菌ＫＨＳＣ００３において、ＭＬＡを生成する過程を示す模式図である。
本出願は、２０１６年１月６日付けで韓国特許庁に出願された韓国特許出願第１０−２０１６−０００１７０８号に対する優先権を主張し、記載された内容は、本明細書に全て参照として挿入される。
本明細書に記載された用語「発現増大（increase expression）」は、特定遺伝子の発現産物、例えば、細胞において、遺伝子によって暗号化されたｍＲＮＡまたはタンパク質の検出可能な増加をいう。本明細書に記載された用語「親細菌性細胞（parent bacterial cell）」は、特定の遺伝的変形を有さない同一タイプの細菌性細胞を意味する。野生型細胞が遺伝的変形に使用される場合、親細菌性細胞は、「野生型」細胞でもある。例えば、遺伝子の発現を増大させる遺伝的変形を含む細菌は、親細菌性細胞の発現レベルに比べ、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上または約１００％以上さらに高いレベルの発現を有することができる。細胞において、発現産物の増加は、当該技術分野で知られた方法でも検証される。発現産物のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質のような発現産物の活性または量を測定することによって決定される。
本明細書に記載された用語「発現減少（decrease expression）」は、特定遺伝子の発現産物、例えば、細胞において、遺伝子によって暗号化されたｍＲＮＡまたはタンパク質の検出可能な減少をいう。明細書に記載された用語「親細菌性細胞（parent bacterial cell）」は、特定の遺伝的変形を有さない同一タイプの細菌性細胞を意味する。野生型細胞が遺伝的変形に使用される場合、親細菌性細胞は、「野生型」細胞でもある。例えば、遺伝子の発現を増大させる遺伝的変形を含む細菌は、親細菌性細胞の発現レベルに比べ、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上または約１００％以上さらに低いレベルの発現を有することができる。細胞において、発現産物の減少は、当該技術分野で知られた方法によっても検証される。発現産物のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質のような発現産物の活性または量を測定することによって決定される。
本明細書に記載された用語「破壊（disruption）」、「破壊された（disrupted）」、及びそれと類似したものは、遺伝的変形により、当該遺伝子の発現が減少したものをいう。破壊は、参照遺伝子の発現を完全になくした（nullify）遺伝的変形によって引き起こされる（以下、遺伝子の「不活性化」という）。また、破壊は、発現を完全になくさず、減少したレベルの遺伝子の発現を引き起こす遺伝的変形を含む（以下、遺伝子の「減衰（attenuation）”という）。かような意味で、発現は、遺伝子産物の転写だけではなく、活性遺伝子産物の翻訳をいう。従って、不活性化は、遺伝子が転写または翻訳されず、遺伝子の産物が発現されない場合、及び遺伝子が転写及び翻訳されても、遺伝子産物が機能的ではない場合を含む。類似して、減衰は、遺伝子の転写及び／または翻訳が低減した場合だけではなく、転写及び／または翻訳は低減しないが、遺伝子産物がさらに低い活性レベルを有する場合を含む。本明細書において、用語「遺伝子の機能的産物（functional product of a gene）」は、遺伝子産物（例えば、タンパク質または酵素）が生化学的または生理的な機能（例えば、酵素活性）を有することを意味する。遺伝子の破壊は、遺伝子の機能的破壊として、遺伝的に変形された細胞で母細胞または野生型細胞と比べて生化学的または生理的な機能が低減したり完全になくなったりすることを含む。
遺伝的変形は、細胞内において、ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオシドを導入する変形、母細胞の遺伝的物質に変化を起こす化学的変形（化合物への露出）を含み、母細胞の遺伝物質の１以上のヌクレオチドを置換、追加（すなわち、挿入）または欠失させる変形を含む。遺伝的変形は、参照された種の異種変形または同種変形を含む。遺伝的変形は、ポリペプチドに対するコーディング領域の変形を含む。また、遺伝的変形は、遺伝子の発現またはオペロンの機能を変更する非コーディング調節領域の変形を含む。非コーディング領域は、５’−非コーディング配列（コーディング配列の５’）及び３’−非コーディング配列（コーディング配列の３’）を含む。
遺伝子の破壊は、遺伝工学的方法、例えば、相同性組み換え、特異的突然変異法（directed mutagenesis）または特異的分子進化法（directed molecular evolution）によっても行われる。細胞が複数の同一遺伝子、または遺伝子の２以上パラログ（paralog）を含む場合、１以上の遺伝子は、破壊される。例えば、遺伝的変形は、遺伝子配列を含んだベクターで細胞を形質転換し、その後、細胞を培養し、細胞の外在的（exogenous）核酸、及び内在的（endogenous）遺伝子の相同性組み換えを引き起こし、それにより、内在的遺伝子を破壊させる段階を含む。相同組み換えをなした細胞は、選別マーカーを利用することにより、スクリーニング（選別）される。
本明細書に記載された「遺伝子（gene）」は、特定タンパク質を暗号化する核酸断片をいい、１以上の調節性配列、例えば、５’−非コーディング配列及び３’−非コーディング配列（コーディング配列に係わる位置において、３’及び５’）を選択的に含んでもよい。
本明細書に記載された核酸またはポリペプチドの用語「配列同一性（sequence identity）」は、２つの相応する配列を整列し（align）、可能な限り多く互いにマッチ（match）させた後、特定領域に係わる２つの相応する配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性のレベルをいう。配列同一性は、特定比較可能な領域の２つの最適に整列された相応する配列を比較することによって測定される値であり、比較可能な領域において、前記配列の部分は、参照配列と比較し、挿入されていたり欠失されていたりする。一具体例において、配列同一性の百分率は、全体比較可能な領域において、２つの最適に整列された相応する配列を比較し、アミノ酸または核酸が２つの配列において、同一位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチされた位置の数を、比較可能な範囲内において、全ての位置の総数（すなわち、範囲サイズ（range size）に分け、かつその結果に１００を乗じ、配列同一性の百分率を得ることによっても算出される。配列同一性の百分率は、公知の配列比較プログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ and ＢＬＡＳＴＰ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Main Workbench（ＣＬＣ ｂｉｏ．）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）を利用することによっても決定される。
同一であるか、あるいは類似した機能または活性を有することができる他種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを確認する場合、配列同一性の類似度（similarity）が利用されもする。例えば、類似の配列は、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有することができる。
本明細書に記載された用語「外在的（exogenous）」、及びそれと類似したものは、宿主細胞に導入された参照物質（例えば、核酸）または参照活性をいう。核酸は、適切な方式で、宿主内に外在的に導入される。例えば、核酸は、宿主細胞内に導入され、宿主染色体内にも挿入され、または前記核酸は、非染色体性遺伝物質、例えば、宿主染色体内に統合（integrate）されない発現ベクター（例えば、プラスミド）として宿主に導入される。タンパク質を暗号化する核酸は、発現可能な形態（すなわち、核酸が転写されたり翻訳されたりする形態）で導入されなければならない。外在的遺伝子は、相同性遺伝子、すなわち、内在的遺伝子と同一遺伝子、または異種（heterologous）遺伝子を含んでもよい。
一様相は、親細菌性細胞に比べ、ＬｐｘＥポリペプチドを暗号化する遺伝子の発現を増大させる遺伝的変形を含むモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ：monophosphoryl lipid Ａ）を生産する細菌を提供する。前記細菌は、ＭＬＡを生産する活性が向上したものでもある。前記細菌は、遺伝的に操作されたり組み換えられたりしたものでもある。
前記脂質Ａは、２個のグルコサミン（炭水化物または糖）に付着されたアシル鎖によってなっており、一般的には、各グルコサミンに１つのリン酸基を含む。２つのジサッカライドは、β（１→６）結合によっても連結される。前記アシル鎖は、グルコサミンジサッカライドのＣ−２，Ｃ−２’，Ｃ−３及びＣ−３’位置において、ヒドロキシ残基群から選択されたヒドロキシ残基に直接付着する。前記アシル鎖は、例えば、そのＣ−３位置に、ヒドロキシ残基を有することができ、さらなるアシル鎖が、前記アシル鎖に位置したヒドロキシ残基に付着する。付着されたアシル鎖は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。前記脂質Ａは、２，３，４，５，６または７アシル鎖を含んでもよい。前記アシル鎖は、８ないし３０の炭素原子を有することができる。例えば、前記アシル鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１以上、２５以上または３０以上の炭素の長さを有することができる。大腸菌の脂質Ａモイエティは、ヘキサ−アシル化されたビス−１，４’−リン酸化されたグルコサミンジサッカライドからなり、それは、Ｃ−２、Ｃ−２’、Ｃ−３及びＣ−３’において、（Ｒ）−３−ヒドロキシミリスチル残基を有する。近い（distal）グルコサミンモイエティにおいて、最初の（３）−ヒドロキシアシル鎖は、二つともラウリン酸及びミリスチン酸（myristic acid）でエステル化され、Ｃ−６位置での最初のヒドロキシ基は、二量体３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクト−２−ウロソン酸（ＫＤＯ：３−deoxy−Ｄ−manno−oct−２−ulosonicacid）炭化水素モイエティを介して、ポリサッカライドに連結される。Ｎ．メニンギチジス（Ｎ．meningitidis）の脂質Ａは、合成方式でヘキサ−アシル化され、一方、腸内細菌は、非対称的にヘキサ−アシル化された脂質Ａを有する。また、Ｎ．メニンギチジスの多数の脂肪酸は、大腸菌のもの比べてさらに短い。
前記ＭＬＡは、１個のリン酸基のみグルコサミンジサッカライドのＣ−１またはＣ−４’に連結されたモノホスホリル脂質Ａをいう。前記ＭＬＡは、トリ−アシル化されたＭＬＡ、テトラ−アシル化されたＭＬＡ、ペンタ−アシル化されたＭＬＡ、ヘキサ−アシル化されたＭＬＡ、またはヘプタ−アシル化されたＭＬＡでもある。例えば、前記ＭＬＡは、１−脱リン酸−脂質Ａ、１−脱リン酸−ペンタ−アシル脂質Ａ、３−Ｏ−脱アシル−４’−ＭＬＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、またはそれらの組み合わせでもある。その場合、脂質Ａは、大腸菌の脂質Ａでもある。前記３Ｄ−ＭＬＡは、１−脱リン酸−３−Ｏ−脱アシル−脂質Ａと知られている。
前記ＭＬＡは、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネート（Ｋｄｏ：２−keto−３−deoxy−Ｄ−manno−octulosonate）を含まなくともよい。Ｋｄｏは、ＬＰＳの構成成分である。
前記ＭＬＡは、生きている細菌の膜、例えば、外膜に存在するものでもある。
前記細菌は、ＬｐｘＥポリペプチドを暗号化する増加されたコピー数を含んでもよい。前記細菌は、ＬｐｘＥポリペプチドを暗号化する１以上の外在的ポリヌクレオチドを含んでもよい。
前記ＬｐｘＥポリペプチドは、ＥＣ ３．１．３．−に属する。前記ＬｐｘＥは、脂質リン酸ホスファターゼのファミリに属する。前記ＬｐｘＥは、３個アミノ酸からなる（tripartite）活性部位と、６個の膜通過ヘリックスとを含んでもよい。脂質リン酸ホスファターゼは、加水分解酵素（hydrolase）、具体的には、リン酸モノエステル結合に特異的に作用する加水分解酵素であり、リン酸基を含有する脂質から、リン酸基（phosphate group）を除去することができる。前記ＬｐｘＥは、具体的には、１−位置を脱リン酸化させるリン酸ホスファターゼでもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、アキフェクス（Aquifex）属細菌、ヘリコバクター（Helicobacter）属細菌、フランシセラ（Francisella）属細菌、ボルデテラ（Bordetella）属細菌、ブルセラ（Brucella）属細菌、リゾビウム（Rhizobium）属細菌、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属細菌、レジオネラ（Legionella）属細菌、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌、クロロビウム（Chlorobium）属細菌、ロドスピリルム（Rhodospirillum）属細菌、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）属細菌、クロロバキュラム（Chlorobaculum）属細菌、ペロディクチオン（Pelodictyon）属細菌、シュードビブリオ（Pseudovibro）属細菌、ファエオスピリルム（Phaeospirillum）属細菌、シントロフォバクター（Syntrophobacter）属細菌、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌、ポルフィロモナス（Porphyromonas）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、リンノハビタンス（Limnohabitans）属細菌及びサーモデスルフォバクテリア（Thermodesulfobacteria）属細菌からなるグループから選択された細菌のＬｐｘＥポリペプチドでもある。前記アキフェクス（Aquifex）属細菌は、アキフェクスエオリクス（Aquifex aeolicus）またはアキフェクスピロフィルス（Aquifex pyrophilus）を含む。アキフェクス属細菌は、好熱性細菌であり、約８５℃ないし９５℃の温度でも良好に生長することができる。前記アキフェクス属細菌は、アキフェクスエオリクス（Aquifex aeolicus）でもある。前記ヘリコバクター属細菌は、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）でもある。例えば、前記ＬｐｘＥポリペプチドは、アキフェクスエオリクス由来ＬｐｘＥポリペプチド（ＡａＬｐｘＥ）またはヘリコバクターピロリ由来ＬｐｘＥポリペプチド（ＨｐＬｐｘＥ）でもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、配列番号９または配列番号１７のアミノ酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＥポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１６の核酸配列、または配列番号１０または配列番号１６の核酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによって暗号化されるものでもある。
前記細菌は、親細菌性細胞に比べ、ＬｐｘＬポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＬｐｘＭポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現が増大した遺伝的変形をさらに含んでもよい。
前記細菌は、ＬｐｘＬポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＬｐｘＭポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせのコピー数増加を含んでもよい。前記細菌は、ＬｐｘＬポリペプチドを暗号化する外在的ポリヌクレオチド、ＬｐｘＭポリペプチドを暗号化する外在的ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
前記ＬｐｘＬポリペプチドは、ＥＣ２．３．１．２４１に属することができる。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、脂質Ａ生合成ラウロイル転移酵素（lauroyltransferase）であり、ラウロイル−アシル伝達タンパク質（ＡＣＰ：acyl carrier protein）からＫｄｏ２−脂質ＩＶＡにラウレート（laurate）を転移し、Ｋｄｏ２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡを形成することを触媒する酵素である。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、エシェリキア（Escherichia）属細菌、シゲラ（Shigella）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、カンピロバクター（Campylobacter）属細菌、ネイセリア（Neisseria）属細菌、ヘモフィルス（Haemophilus）属細菌、エロモナス（Aeromonas）属細菌、フランシセラ（Francisella）属細菌、エルシニア（Yersinia）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、ボルデテラ（Bordetella）属細菌、レジオネラ（Legionella）属細菌、コリネバクテリア（Corynebacteria）属細菌、シトロバクター（Citrobacter）属細菌、クラミジア（Chlamydia）属細菌、ブルセラ（Brucella）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、バクテロイド（Bacteroides）属細菌、プレボテラ（Prevotella）属細菌、ヘリコバクター（Helicobacter）属細菌、バークホルデリア（Burkholderia）属細菌、ポルフィロモナス（Porphyromonas）属細菌、リゾビウム（Rhizobium）属細菌、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、アシネトバクター（Acinetobacter）属細菌、シェワネラ（Shewanella）属細菌、キセノラブダス（Xenorhabdus）属細菌、フォトバクテリウム（Photobacterium）属細菌、リソバクター（Lysobacter）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌及びビブリオ（Vibrio）属細菌からなるグループから選択された細菌のＬｐｘＬポリペプチドでもある。例えば、前記ＬｐｘＬポリペプチドは、大腸菌のＬｐｘＬポリペプチド（ＥｃＬｐｘＬ）でもある。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＬポリペプチドは、配列番号２の核酸配列、または配列番号２の核酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによって暗号化されるものでもある。
前記ＬｐｘＭポリペプチドは、ＥＣ２．３．１．２４３に属することができる。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、脂質Ａ生合成ミリストイル転移酵素（myristoyltransferase）であり、ミリストイル−アシル伝達タンパク質からＫｄｏ２−ラウロイル−脂質ＩＶＡにミリステート（myristate）を転移し、Ｋｄｏ２−脂質Ａを形成することを触媒する酵素である。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、エシェリキア属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ネイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、バクテロイド属細菌、プレボテラ属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌、セラチア属細菌、アシネトバクター属細菌、シェワネラ属細菌、キセノラブダス属細菌、フォトバクテリウム属細菌、リソバクター属細菌、エンテロバクター属細菌及びビブリオ属細菌からなるグループから選択された細菌のＬｐｘＭポリペプチドでもある。例えば、前記ＬｐｘＭポリペプチドは、大腸菌のＬｐｘＭポリペプチド（ＥｃＬｐｘＭ）でもある。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＭポリペプチドは、配列番号６の核酸配列、または配列番号６の核酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによって暗号化されるものでもある。
前記用語「細菌（bacteria）」は、原核細菌をいう。前記細菌は、グラム陰性（Gram-negative）細菌でもある。グラム陰性細菌は、グラム染色法に使用されるクリスタルバイオレットで染色されない。グラム陰性細菌の膜は、それぞれの二重膜からなる外膜と内膜とによってなっており、薄いペブチドグリカン層が存在する。前記細菌は、エシェリキア属細菌、アキフェックス（Aquifex）属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ネイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌、クロロビウム（Chlorobium）属細菌、ロドスピリルム（Rhodospirillum）属細菌、マグネトスピリルム（Magnetospirillum）属細菌、クロロバクルム（Chlorobaculum）属細菌、ペロディクチオン（Pelodictyon）属細菌、シュードビブリオ（Pseudovibro）属細菌、ファエオスピリルム（Phaeospirillum）属細菌、シントロフォバクター（Syntrophobacter）属細菌、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌、ビブリオ属細菌、ラルストニア属細菌、リンノハビタンス属細菌及びサーモデスルフォバクテリア属細菌からなるグループから選択された細菌でもある。該細菌は、例えば、大腸菌でもある。
前記細菌は、Ｋｄｏ生合成経路に係わるポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドの発現を減少させる遺伝的変形をさらに含んでもよい。Ｋｄｏ生合成経路に係わる前記ポリペプチドは、ＫｄｔＡ、ＫｄｓＢ、ＫｄｓＣ、ＫｄｓＡ、ＧｕｔＱ、ＫｐｓＦ、ＫｐｓＵ及びＫｄｓＤからなる群から選択されたポリペプチドでもある。前記ＫｄｔＡは、またＷａａＡをいう。細菌において、ＫｄｔＡポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＢポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＣポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＡポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＧｕｔＱポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｐｓＦポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｐｓＵポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＤポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせのうちいずれか１以上が破壊されたものでもある。前記細菌において、ＬｐｘＴポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＰａｇＰポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｔＡポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせが破壊されたものでもある。
前記ＬｐｘＴポリペプチドは、ＥＣ２．７．４．２９に属することができる。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、内膜タンパク質（inner membrane protein）ＬｐｘＴでもある。前記ＬｐｘＴは、リン酸基転移酵素であり、ウンデカプレニルピロホスフェート（undecaprenylpyrophosphate）のリン酸基を、脂質Ａの１−リン酸基に転移し、脂質Ａ１−ピロホスフェートを合成するポリペプチドである。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、エシェリキア属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ネイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌及びビブリオ属細菌からなるグループから選択された細菌のＬｐｘＴポリペプチドでもある。例えば、前記ＬｐｘＴポリペプチドは、大腸菌のＬｐｘＴポリペプチド（ＥｃＬｐｘＴ）でもある。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、または配列番号２０のアミノ酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＬｐｘＴポリペプチドは、配列番号２１の核酸配列、または配列番号２１の核酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによって暗号化されるものでもある。
前記ＰａｇＰポリペプチドは、ＥＣ２．３．１．２５１に属することができる。前記ＰａｇＰポリペプチドは、脂質Ａパルミトイル転移酵素（palmitoyltransferase）であり、パルミテート（palmitate）を含むヘプタ−アシル脂質Ａ種類の生合成に必要なポリペプチドでもある。前記ＰａｇＰポリペプチドは、グリセロリン脂質のｓｎ−１位置から、脂質Ａの位置２の（Ｒ）−３−ヒドロキシミリステート鎖の遊離ヒドロキシ基にパルミテート鎖（１６：０）を転移することを触媒する酵素である。前記ＰａｇＰポリペプチドは、エシェリキア属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ネイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌及びビブリオ属細菌からなるグループから選択された細菌のＰａｇＰポリペプチドでもある。例えば、前記ＰａｇＰポリペプチドは、大腸菌のＰａｇＰポリペプチド（ＥｃＰａｇＰ）でもある。前記ＰａｇＰポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、または配列番号２６のアミノ酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＰａｇＰポリペプチドは、配列番号２７の核酸配列、または配列番号２７の核酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコーディングされるものでもある。
前記ＫｄｔＡポリペプチドは、ＥＣ２．４．９９．１２．、ＥＣ２．４．９９．１３．、ＥＣ２．４．９９．１４．及び／またはＥＣ２．４．９９．１５に属することができる。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、脂質ＩＶＡにＫｄｏの転移を触媒させる酵素でもある。例えば、前記ＫｄｔＡポリペプチドは、大腸菌のＫｄｔＡポリペプチド（ＥｃＫｄｔＡ）でもある。ＥｃＫｄｔＡは、２つのＫｄｏのｌｉｐｉｄ ＩＶＡへの伝達を触媒することができる。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２２のアミノ酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドでもある。前記ＫｄｔＡポリペプチドは、配列番号２３の核酸配列、または配列番号２３の核酸配列と、約９９％、約９７％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％または約１０％、またはそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドによって暗号化されるものでもある。
他の様相は、前述の細菌を培養して培養物を得る段階と、前記培養物からＭＬＡを分離する段階と、を含むＭＬＡの生産方法を提供する。
前記方法は、親細菌性細胞に比べ、ＬｐｘＥポリペプチドを暗号化する遺伝子の発現を増大させる遺伝的変形を含むモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ：monophosphoryl lipid Ａ）を生産する細菌を培養して培養液を得る段階を含んでもよい。
前記ＬｐｘＥポリペプチド、ＭＬＡ及び細菌は、前述の通りである。
該培養方法は、公知の方法を利用しても遂行されるものでもある。培養液の種類、培養温度及び培養条件などは、公知されたものでもある。該培養温度は、例えば、約１０℃ないし約４３℃、約２０℃ないし約４３℃、約２０℃ないし約４０℃、約２５℃ないし約４３℃、約２５℃ないし約３５℃、約２７℃ないし約３３℃、約１０℃ないし約１５℃、約１５℃ないし約２０℃、約２０℃ないし約２５℃、約２５℃ないし約３０℃、約３０℃ないし約３３℃、約３３℃ないし約３７℃、約３７℃ないし約４０℃、または約４０℃ないし約４３℃ でもある。前記細菌は、バッチ（batch）、流加培養（fed-batch culture）または連続モード（continuous mode）によっても培養される。培養は、 静置（stationary）されるか、あるいは振盪条件で行われる。該培養時間は、例えば、約１時間ないし約１週間、約３時間ないし約６日、約６時間ないし約５日、約９時間ないし約４日、約１２時間ないし約３日、約１８時間ないし約２日、約１日、または一晩中でもある。培地は、抗生物質を含んでもよい。前記抗生物質は、例えば、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、またはそれらの組み合わせでもある。
前記方法は、ＭＬＡを分離する段階を含んでもよい。前記分離する段階は、培養物から細菌を分離する段階を含んでもよい。該培養物から細菌を得る方法は、公知の方法を利用しても遂行される。例えば、遠心分離を介して、培養物から細菌を得ることができる。得られた細菌は、緩衝液によっても洗浄される。
前記方法は、得られた細菌からＭＬＡを得る段階を含む。
前記ＭＬＡは、細菌の脂質からも分離される。脂質を得る方法は、公知されたものでもある。ＭＬＡは、物理的または化学的な方法によっても得られる。該物理的方法は、例えば、超音波または冷解凍反復を行うことができる。該化学的方法は、有機溶媒を使用して抽出するものでもある。該有機溶媒の例は、クロロホルム、フェノール、石油エーテル（petroleum ether）、ジクロロメタン（dichloromethane）、メタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。脂質を抽出する方法の例は、Bligh & Dyer抽出法（Bligh, E. G. and Dyer, W. J., Can. J. Biochem. Physiol., 1959, vol. 37, pp. 911-917）でもある。前記方法は、脂質からＭＬＡを精製する段階をさらに含んでもよい。前記方法は、得られた脂質Ａが遊離された形態、すなわち、Ｋｄｏモイエティに接合された形態ではないために、Ｋｄｏモイエティを除去する加水分解段階を含まないこともある。
前記１−脱リン酸−脂質Ａ、１−脱リン酸−テトラ−アシル脂質Ａ、１−脱リン酸−ペンタ−アシル脂質Ａ、３Ｄ−ＭＬＡ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
以下、添付された図面を参照し、本発明の望ましい実施例について詳細に説明する。それと係わり、本具体例は、他の形態を有することができ、ここに記載された説明に制限されるものであると解釈されることがあってはならない。従って、以下の具体例は、図面を参照し、本発明の様態について説明するために説明されるものに過ぎない。本明細書に使用されているように、用語「及び／または」は、１以上の関連列挙された項目の任意、及び全ての組み合わせを含む。
以下、本発明について、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
実施例１．大腸菌ＬｐｘＬ及び大腸菌ＬｐｘＭをコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターの準備
１．１．ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭの準備
大腸菌ＬｐｘＬポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを得るために、大腸菌Ｗ３１１０ゲノム（GenBank Accession Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１８．１）（ＡＴＣＣ）から、下記プライマー対を利用した第１重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を行い、リボソーム結合部位（ＲＢＳ：ribosome binding site）を含んだＥｃＬｐｘＬポリペプチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＢＡＡ３５８５２．１、配列番号１）をコーディングするポリヌクレオチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＡＰ００９０４８．１（ｃ１１１８１５９．．１１１７２３９、配列番号２）を増幅した（図２Ａ）。
ＬｐｘＬフォワードプライマーＰ１： 配列番号３
ＬｐｘＬリバースプライマーＰ２： 配列番号４
大腸菌ＬｐｘＭポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを得るために、前記大腸菌Ｗ３１１０ゲノムから、下記プライマー対を利用した第２ ＰＣＲを行い、ＲＢＳを含んだＥｃＬｐｘＭポリペプチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＢＡＡ１５６６３．１、配列番号５）をコーディングするポリヌクレオチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＡＰ００９０４８．１（ｃ１９４１９０７．．１９４０９３６、配列番号６）を増幅した（図２Ａ）。
ＬｐｘＭフォワードプライマーＰ３： 配列番号７
ＬｐｘＭリバースプライマーＰ４： 配列番号８
前記第１ ＰＣＲから得られたＥｃＬｐｘＬポリヌクレオチド、及び第２ ＰＣＲから得られたＥｃＬｐｘＭポリヌクレオチドをテンプレートにし、前記ＬｐｘＬフォワードプライマーＰ１及びＬｐｘＭリバースプライマーＰ４を利用した第３ ＰＣＲを行い、ＥｃＬｐｘＬポリヌクレオチドとＥｃＬｐｘＭポリヌクレオチドとが融合されたＥｃＬｐｘＬＥｘＬｐｘＭポリヌクレオチドを増幅した。
前記ＰＣＲのために、ＫＯＤホットスタートＤＮＡ重合酵素（Novagen）を利用し、Ｔ３０００ thermocycler（Biometra）において行った。
増幅された産物、をＤｏｋＤｏ−Ｐｒｅｐ ＰＣＲ purification kit（ＥＬＰＩＳ）を使用して精製し、精製された産物を、ｐＷＳＫ２９プラスミド（Wang, R. F., and Kushner, S. R., Gene (1991), vol. 100, pp. 195-199）に導入した。クローニングされたプラスミドを、大腸菌ＤＨ５αに電気穿孔法（electroporation）で形質転換させ、ＬＢ−アンピシリンプレートで選別した。クローニングされたプラスミドを、ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｘＬｐｘＭと命名した。
１．２．ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥの準備
１．２．１．ｐＥＴ２１−ＡａＬｐｘＥの準備
アキフェクスエオリクスＬｐｘＥ（Aquifex aeolicus ＬｐｘＥ：ＡａＬｐｘＥ）ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを得るために、アキフェクスエオリクスＶＦ５ゲノム（GenBank Accession Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１８．１）（ＡＴＣＣ）から、下記プライマー対を使用して、ＡａＬｐｘＥポリペプチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿２１４１６９．１、配列番号９）をコーディングするポリヌクレオチド（GenBank Accession Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１８．１：１１９９３１７．．１１９９８４１、配列番号１０）を増幅した。
ＡａＬｐｘＥフォワードプライマー：配列番号１１
ＡａＬｐｘＥリバースプライマー：配列番号１２
１．１に記載されているようにＰＣＲを行い、増幅された産物を精製した。精製された産物をｐＥＴ２１ａプラスミド（Novagen）のＮｄｅＩ制限酵素サイト及びＸｈｏＩ制限酵素サイトに導入した。クローニングされたプラスミドを、１．１に記載されているように、大腸菌ＤＨ５αに形質転換及び選別した。クローニングされたプラスミドをｐＥＴ２１−ＡａＬｐｘＥと命名した。
１．２．２．ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥの準備
１．２．１で準備されたｐＥＴ２１−ＡａＬｐｘＥをテンプレートとして使用して、下記プライマー対を使用して、ＡａＬｐｘＥをコーディングするポリヌクレオチドを増幅した。
ＡａＬｐｘＥフォワードプライマー：配列番号１３
ＡａＬｐｘＥリバースプライマー：配列番号１４
ＰＣＲのために、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を利用し、Ｔ３０００ thermocycler（Biometra）において行った。
１．１に記載されているようにＰＣＲを行い、増幅された産物を精製した。精製された産物を、ｐＢＡＤ３３．１（Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry(2010), vol. 49(19), pp. 4126-4137）のＮｄｅＩ制限酵素サイト及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングした。クローニングされたプラスミドを、１．１に記載されているように大腸菌に形質転換して選別した。クローニングされたプラスミドをｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥと命名した。
１．２．３．ｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥの準備
ヘリコバクターピロリＬｐｘＥ（Helicobactor pylori ＬｐｘＥ：ＨｐＬｐｘＥ）遺伝子であるｈｐ００２１において、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を欠失させるために、１７Ｓｅｒポリヌクレオチド配列（配列番号１５）を、ＡＧＣからＴＣＧに、沈黙（silent）突然変異されたポリヌクレオチド配列（配列番号１６）に、統合された（integrated）ＤＮＡ技法（ｍＢｉｏｔｅｃｈ，ＲＯＫ）を利用して合成した。かように合成されたＤＮＡをテンプレートにするプライマー対を使用して、ＨｐＬｐｘＥアミノ酸配列（配列番号１７）をコーディングするポリヌクレオチドを増幅した。
フォワードプライマー：配列番号１８
リバースプライマー：配列番号１９
ＰＣＲのために、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を利用し、Ｔ３０００サーモサイクラ（Biometra）において行った。
１．１に記載されているようにＰＣＲを行い、増幅された産物を精製した。精製された産物を、ｐＢＡＤ３３．１（Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry(2010), vol. 49(19), pp. 4126-4137）のＸｂａＩ制限酵素サイト及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトにクローニングした。クローニングされたプラスミドを、１．１に記載されているように大腸菌に形質転換して選別した。クローニングされたプラスミドをｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥと命名した。
実施例２．大腸菌ＫＨＳＣ００３（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ、ｋｄｔＡ：：ｋａｎ、△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、Ｗ３１１０）ストレインの準備
２．１．ｌｐｘＴ遺伝子がゲノムから除去された大腸菌の準備
大腸菌ゲノムにおいて、ＬｐｘＴポリペプチド（配列番号２０）をコーディングするｌｐｘＴ遺伝子（配列番号２１）にカナマイシンカセットが挿入された大腸菌株Ｗ３１１０、ｌｐｘＴ：：ｋａｎに、ｐＣＰ２０プラスミド（Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner PNAS (2000), vol. 97, pp. 6640-6645）を、１．１に記載されているように大腸菌に形質転換し、ＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ固体培地に接種し、４２℃の温度で選別し、ｌｐｘＴとカナマイシンカセットとが除去された大腸菌株、すなわち、△ｌｐｘＴ、Ｗ３１１０を準備した（図２Ｂの段階１）。
２．２．ｐａｇＰ及びｌｐｘＴ遺伝子がゲノムから除去された大腸菌の準備
大腸菌ゲノムにおいて、ｐａｇＰ遺伝子にカナマイシンカセットが挿入された大腸菌株（ＪＷ０６１７（ｐａｇＰ：：ｋａｎ））からＰ１ウイルスを準備した（Current Protocols in Molecular Biology (2007), 1. 16. 1-1. 16. 24, Unit 1. 16）。２．１に記載されているように準備された△ｌｐｘＴ、Ｗ３１１０にＰ１ウイルスを形質導入させ、ＬＢ−カナマイシン固体培地で選別し、ｐａｇＰ遺伝子の代わりにｐａｇＰ：：ｋａｎが挿入された大腸菌株、すなわち、△ｌｐｘＴ、ｐａｇＰ：：ｋａｎ、Ｗ３１１０を準備した（Current Protocols in Molecular Biology (2007), 1. 16. 1-1. 16. 24, Unit 1. 16）（図２Ｂの段階２）。
ｐＣＰ２０プラスミド（Kirill A. Datsenko, and Barry L. Wanner, PNAS (2000), vol. 97, pp. 6640-6645）を、前記△ｌｐｘＴ、ｐａｇＰ：：ｋａｎ、Ｗ３１１０に形質転換させ、ＬＢ−アンピシリン固体培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ固体培地に接種し、４２℃の温度で選別し、ｐａｇＰとカナマイシンカセットとが除去された大腸菌株、すなわち、△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、Ｗ３１１０を準備した（図２Ｂの段階３）。
２．３．大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ、△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、Ｗ３１１０ストレインの準備
１．１に記載されているように準備されたｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭプラスミドを、２．２に記載されているように準備された△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、Ｗ３１１０に、電気穿孔法で形質転換させた。形質転換された大腸菌をＬＢ−アンピシリン固体培地で選別し、大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ、△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、Ｗ３１１０ストレインを準備した（図２Ｂの段階４）。
２．４．大腸菌ＫＨＳＣ００３ストレインの準備
大腸菌染色体において、ＫｄｔＡポリペプチド（配列番号２２）をコーディングするｋｄｔＡ遺伝子（配列番号２３）にカナマイシンカセットが挿入されており、ｐＥｃＫｄｔＡプラスミドを含んでいる大腸菌、すなわち、ＨＳＣ１／ｐＥｃＫｄｔ（Chung, H. S., and Raetz, C. R., Biochemistry (2010), vol. 49(19), pp. 4126-4137）からＰ１ウイルスを準備した（Current Protocols in Molecular Biology (2007)−1. 16. 1-1. 16. 24, Unit 1. 16）。前記Ｐ１ウイルスを、２．３に記載されているように準備された大腸菌ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ、△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、Ｗ３１１０ストレインに形質導入し、ＬＢ−カナマイシン／アンピシリン固体培地で選別した（図２Ｂの段階５）。選別された大腸菌をＫＨＳＣ００３（ｐＷＳＫ２９−ＥｃＬｐｘＬＥｃＬｐｘＭ、△ｌｐｘＴ、△ｐａｇＰ、ｋｄｔＡ：：ｋａｎ、Ｗ３１１０）と命名した。
実施例３．ＡａＬｐｘＥ、ＨｐＬｐｘＥまたはＦｎＬｐｘＥが導入された大腸菌の脂質の確認
３．１．Ｗ３１１０、ｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥに形質転換された大腸菌Ｗ３１１０から酸加水分解を介した脂質の抽出
比較実験のために、ｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥを形質転換するか、あるいは形質転換していない大腸菌株Ｗ３１１０を準備した。
具体的には、ＦｎＬｐｘＥポリペプチド（ｇｉ｜１１８４２２９２９｜ｇｂ｜ＡＢＫ８９３１９．１、フランシセラノビサイダＵ１１２脂質Ａホスファターゼ、配列番号２４）をコーディングするポリヌクレオチド（ｇｂ｜ＣＰ０００４３９．１｜：４１４９４１−４１５６６０フランシセラノビサイダＵ１１２、配列番号２５）を増幅するｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥ（Wang, X., Karbarz, M. J., McGrath, S. C., Cotter, R. J., and Raetz, C. R., J Biol Chem (2004), vol. 279 (47), pp. 49470-49478）を準備した。準備されたｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥを、大腸菌株Ｗ３１１０に電気穿孔法によって形質転換し、形質転換された大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ固体培地で選別した。選別されたコロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩中培養した。培養液を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌの新鮮なＬＢ液体培地に接種し、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）が０．０６になるように希釈した。希釈された培養液を、ＯＤ６００が１．０になるまで３７℃で培養した後、培養液を、常温で、４，０００ｘｇの速度で約２０分間遠心分離し、培養された大腸菌株Ｗ３１１０を得た。
形質転換されていない大腸菌株Ｗ３１１０を新鮮なＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩中培養した。２００ｍｌの新鮮なＬＢ液体培地で、ＯＤ６００が０．０６になるように希釈した。希釈された培養液を、ＯＤ６００が１．０になるまで３７℃で培養した後、培養液を、常温で、４，０００ｘｇで約２０分間遠心分離し、培養された大腸菌株Ｗ３１１０を得た。得られた大腸菌、ｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥ／Ｗ３１１０、ｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥ／Ｗ３１１０を、それぞれ３０ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、８ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。再懸濁された大腸菌に、１０ｍｌのクロロホルム（ＥＭＤ millipore）、及び２０ｍｌのメタノール（ＥＭＤ millipore）を加え、時を見て振盪 しながら、約１時間常温でインキュベーションした。その後、インキュベーションされた混合物を、常温で２，５００ｘｇの速度で約３０分間遠心分離した。遠心分離された混合物の上澄み液を捨て、ペレットを、３０ｍｌの１：２：０．８（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール：ＰＢＳ溶液で再懸濁した。再懸濁された混合物を、常温で、２，５００ｘｇの速度で約３０分間遠心分離し、遠心分離された混合物の上澄み液を捨てた。該ペレットを同じ方法で、２回さらに洗浄し、遠心分離された混合物の上澄み液を除去した。洗浄されたペレットを、１８ｍｌの１２．５ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）（Sigma-Aldrich）で再懸濁し、超音波を照射（sonic irradiation）した。超音波が照射された溶液を、密閉された状態で、１００℃の温度で気密煮沸で約３０分間加熱した後、室温に冷却させた。冷却された溶液に、２０ｍｌのクロロホルム（ＥＭＤ millipore）、及び２０ｍｌのメタノール（ＥＭＤ millipore）を添加して完全に混合した後、室温で、２，５００ｘｇの速度で、約２０分間遠心分離した。遠心分離された混合物のうち有機溶媒層を分離させ、上部の水性層に、事前に平衡化された有機溶媒層を添加し、有機溶媒層を２回抽出した。該有機溶媒層をプーリング（pooling）し、回転蒸発機で乾燥させて脂質を得た。得られた脂質を、５ｍｌの４：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールに溶解させ、水槽で超音波を照射した。超音波が照射された脂質を新たな試験管で移し、得られた脂質を、常温で、窒素ガス下で乾燥させた後、−８０℃で保管した。
３．２．ｐＢＤＡ３３．１またはｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥまたはｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥに形質転換された大腸菌ＫＨＳＣ００３から脂質の抽出
１．２．２に記載されているように準備されたプラスミドｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥまたはｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを、２．４に記載されているように準備した大腸菌ＫＨＳＣ００３に形質転換させ、大腸菌膜の脂質を確認した。陰性対照群として、ベクターｐＢＡＤ３３．１を形質転換した大腸菌ＫＨＳＣ００３を利用した。
具体的には、ベクターｐＢＡＤ３３．１、１．２．２に記載されているように準備したｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥ、または１．２．３に記載されているように準備したｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを、２．４に記載されているように準備した大腸菌株ＫＨＳＣ００３に電気穿孔法で形質転換させた。ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥを含んだＫＨＳＣ００３を、ブダペスト条約の国際寄託機関であるKorea Research Institute of Bioscience and Biotechnologyに、２０１６年１１月１８日付けで寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１３１５５ＢＰ）。ｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを含んだＫＨＳＣ００３を、ブダペスト条約の国際寄託機関であるKorea Research Institute of Bioscience and Biotechnologyに、２０１６年１１月１８日付けで寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１３１５６ＢＰ）。
形質転換された大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ＥＭＤ millipore）と、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Sigma-Aldrich）を含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩中培養した。培養液を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１ｍＭイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（ＵＢＰ Ｂｉｏ）を含む２００ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、ＯＤ６００が０．０６ないし０．１になるように希釈し、ＯＤ６００が０．５ないし０．６になるまで培養した。培養液を、常温で、４，０００ｘｇの速度で約２０分間遠心分離して大腸菌を得て、得られた大腸菌を、３０ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、８ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。再懸濁された大腸菌に、１０ｍｌのクロロホルム、及び２０ｍｌのメタノールを加え、時を見て振盪しながら、約１時間、常温でインキュベーションした。インキュベーションされた混合物を、常温で、２，５００ｘｇの速度で約３０分間遠心分離し、上澄み液を得た。得られた上澄み液に、１０ｍｌのクロロホルム、及び１０ｍｌの水を加えて完全に混合した後、常温で、２，５００ｘｇの速度で約２０分間遠心分離した。遠心分離された混合物において有機溶媒層を分離させ、上部の水性層に事前に平衡化された有機溶媒層を添加し、有機溶媒層を２回抽出した。該有機溶媒層をプーリングし、回転蒸発機で乾燥させて脂質を得た。得られた脂質を、５ｍｌの４：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールに溶解させ、水槽で超音波を照射した。超音波が照射された脂質を新たな試験管で移して、得られた脂質を、常温で窒素ガス下で乾燥させた後、−８０℃で保管した。
３．３．脂質のＴＬＣ分析
薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ：thin layerchromatography：ＴＬＣ）を行うために、３．１または３．２に記載されているように、２００ｍｌの大腸菌培養液から脂質を得て、得られた総脂質の１／３を、２００μｌの４：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールに溶解させた。その後、５ないし１５μｌを、１０ｘ１０ｃｍ ＨＰＴＬＣプレート（ＥＭＤ Chemicals）にスポッティング（spotting）し、４０：２５：４：２（ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノール：水：アンモニウムヒドロキシド（３０％から２０％）の溶媒で展開させた。展開されたプレートを乾燥させ、１０％（ｖ／ｖ）硫酸（エタノール中）に噴霧して視覚化させ、３００℃のホットプレートで焦がした。脂質のＴＬＣ結果を、図３Ａ及び図３Ｂに示した（図３Ａにおいて、レーン１：大腸菌Ｗ３１１０から抽出されたＬＰＳの酸性加水分解によって得られた脂質、レーン２：ｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥを含有した大腸菌Ｗ３１１０から抽出されたＬＰＳの酸性加水分解によって得られた脂質、レーン３：ｐＢＡＤ３３．１を含有した大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出して得られた脂質、レーン４：ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥを含有した大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出して得られた脂質、及び図３Ｂにおいて、レーン１：大腸菌Ｗ３１１０から抽出されたＬＰＳの酸性加水分解によって得られた脂質、レーン２：ｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを含有した大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出して得られた脂質、レーン３：ｐＢＡＤ３３．１を含有した大腸菌ＫＨＳＣ００３から抽出して得られた脂質）。
図３に示されているように、酸加水分解過程を経た大腸菌Ｗ３１１０から脂質Ａが検出され（図３Ａにおけるレーン１）、酸加水分解過程を経たｐＷＳＫ２９−ＦｎＬｐｘＥを含む大腸菌Ｗ３１１０から、１−脱リン酸−脂質Ａ（１−dephospho−lipid Ａ）が検出された（図３Ａにおけるレーン２）。また、大腸菌ＫＨＳＣ００３から検出された脂質Ａが検出され（図３Ａにおけるレーン３）、及びｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥまたはｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを含む大腸菌ＫＨＳＣ００３から検出された１−脱リン酸−脂質Ａ（１−dephospho−lipid Ａ）が検出された（図３Ａにおけるレーン４、または図３Ｂにおけるレーン２）。従って、大腸菌ＫＨＳＣ００３に、ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥまたはｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥを形質転換させた大腸菌の膜は、１−脱リン酸−脂質Ａを含むので、膜に、１−脱リン酸−脂質Ａを含む生きている大腸菌を得る可能性があることを確認した。ｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥ 、すなわち、ｐＢＡＤ３３．１−ＨｐＬｐｘＥ／ＫＨＳＣ００３を含んだ大腸菌ＫＨＳＣ００３を、ブダペスト条約の国際寄託機関であるＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures）に、２０１６年１１月２３日付けで寄託番号ＫＣＴＣ１３１５６ＢＰで国際寄託した。
３．４．脂質Ａ及び１−脱リン酸−脂質ＡのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight）質量分析
３．２に記載されているように得られた脂質を、４：１（ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノールで再懸濁し、再懸濁された脂質試料を、韓国基礎科学支援研究院のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（matrix-assisted laser desorption and ionization-time off light）質量分析を依頼して質量分析した。
具体的には、１０ｍｇ／ｍｌの２,５−ジヒドロベンゾ酸（ＤＨＢ：dihydroxybenzoic acid）溶液（Sigma-Aldrich）と、アセトニトリル（Sigma-Aldrich）とを１：４で混合した溶液をマトリックスとして利用した。１μｌのマトリックス溶液を、試料台（sample stub）に塗布し、さらに１μｌの再懸濁された脂質試料をスポッティングして真空で乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機（Shimadzu Biotech Axima Resonance）を使用し、脂質試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。該質量分析データを、ｍＭａｓｓソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／www.mmass.org／）を使用して分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析結果を図４Ａに示し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳ結果を図４Ｂに示した（ｘ軸：単位質量当たり電荷量（ｍ／ｚ：mass-to-charge ratio、ｙ軸：相対的強度（％））。
図４Ａ及び図４Ｂに図示されているように、大腸菌ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥに形質転換されたＫＨＳＣ００３から、Ｋｄｏを含まないモノホスホリル脂質Ａ、すなわち、１−脱リン酸−脂質Ａ（実際単位質量１７１６．２５）が検出されることを確認した。従って、大腸菌において、ＥｃＬｐｘＭ，ＥｃＬｐｘＬ，ＡａＬｐｘＥポリペプチドを発現させることにより、膜に、１−脱リン酸−脂質Ａを含む生きている大腸菌を得る可能性があるということを確認した。ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥ、すなわち、ｐＢＡＤ３３．１−ＡａＬｐｘＥ／ＫＨＳＣ００３を含んだ大腸菌ＫＨＳＣ００３を、ブダペスト条約の国際寄託機関であるＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures）に、２０１６年１１月１８日付けで寄託番号ＫＣＴＣ１３１５５ＢＰで国際寄託した。
寄託機関の名称：Korean Collection for Type Cultures
寄託番号：ＫＣＴＣ１３１５５ＢＰ
寄託日：２０１６．１１．１８．
外１
外２
寄託機関の名称：Korean Collection for Type Cultures
寄託番号：ＫＣＴＣ１３１５６ＢＰ
寄託日：２０１６．１１．１８．
外３
外４
本明細書に記載された具体例は、限定の目的ではなく、説明としての意味にのみ考慮されなければならないと理解されなければならない。各具体例の特徴または様相に係わる説明は、一般的に、他の具体例における類似した特徴または様相に利用可能であると考慮されなければならない。
１以上の具体例が図面に係わる参照として記載されるが、当該技術分野の当業者であるならば、特許請求の範囲によって定義される技術思想、及び発明の範囲を外れずに、形態及び具体的な事項に多様な変更が可能であるということを理解するであろう。

Claims (18)

  1. 親細菌性細胞に比べ、ＬｐｘＥポリペプチドを暗号化する遺伝子の発現を増大させる遺伝的変形、および、親細菌性細胞に比べ、ＬｐｘＬポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＬｐｘＭポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせの発現を増大させる遺伝的変形を含み、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネート（Ｋｄｏ）モイエティに接合していないモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を生産する細菌であって、
    前記細菌は、グラム陰性細菌である細菌。
  2. 前記ＭＬＡは、２個アシル鎖ないし７個アシル鎖を含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  3. 前記細菌は、ＬｐｘＥポリペプチドを暗号化する１以上の外在的ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  4. 前記ＭＬＡは、１−脱リン酸−脂質Ａ、１−脱リン酸−テトラ−アシル脂質Ａ、１−脱リン酸−ペンタ−アシル脂質Ａ、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  5. 前記細菌は、ＬｐｘＬポリペプチドを暗号化する外在的ポリヌクレオチド、ＬｐｘＭポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  6. 前記ＬｐｘＥポリペプチドは、ＥＣ３．１．３．−に属することを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  7. 前記ＬｐｘＥポリペプチドは、配列番号９または配列番号１７のアミノ酸配列に、９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  8. 前記ＬｐｘＬポリペプチドは、ＥＣ２．３．１．２４１に属し、前記ＬｐｘＭポリペプチドは、ＥＣ２．３．１．２４３に属することを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  9. 前記ＬｐｘＬポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドであり、前記ＬｐｘＭポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  10. 前記細菌は、エシェリキア属細菌、シゲラ属細菌、サルモネラ属細菌、カンピロバクター属細菌、ネイセリア属細菌、ヘモフィルス属細菌、エロモナス属細菌、フランシセラ属細菌、エルシニア属細菌、クレブシエラ属細菌、ボルデテラ属細菌、レジオネラ属細菌、コリネバクテリア属細菌、シトロバクター属細菌、クラミジア属細菌、ブルセラ属細菌、シュードモナス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バークホルデリア属細菌、アグロバクテリウム属細菌、クロロビウム属細菌、ロドスピリルム属細菌、マグネトスピリルム属細菌、クロロバクルム属細菌、ペロディクチオン属細菌、シュードビブリオ属細菌、ファエオスピリルム属細菌、シントロフォバクター属細菌、ブラディリゾビウム属細菌、ポルフィロモナス属細菌、リゾビウム属細菌、メソリゾビウム属細菌、ビブリオ属細菌、ラルストニア属細菌、リンノハビタンス属細菌及びサーモデスルフォバクテリア属細菌からなるグループから選択された細菌であることを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  11. 前記細菌は、Ｋｄｏ生合成経路に係わるポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドの発現を減少させる遺伝的変形をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  12. Ｋｄｏ生合成経路に係わる前記ポリペプチドは、ＫｄｔＡ、ＫｄｓＢ、ＫｄｓＣ、ＫｄｓＡ、ＧｕｔＱ、ＫｐｓＦ、ＫｐｓＵ及びＫｄｓＤからなる群から選択されたポリペプチドであることを特徴とする請求項１１に記載の細菌。
  13. 前記細菌は、ＫｄｔＡポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＢポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＣポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＡポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＧｕｔＱポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｐｓＦポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｐｓＵポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｓＤポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせのうちいずれか１以上が破壊されたことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  14. 前記細菌は、ＬｐｘＴポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＰａｇＰポリペプチドを暗号化する遺伝子、ＫｄｔＡポリペプチドを暗号化する遺伝子、またはそれらの組み合わせが破壊されたことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
  15. 請求項１に記載の細菌を培養して培養物を得る段階と、
    前記培養物からＭＬＡを分離する段階と、を含む、Ｋｄｏモイエティに接合していないＭＬＡの生産方法。
  16. 前記分離する段階は、前記細菌性細胞からＭＬＡを分離する段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記培養する段階は、バッチ、流加、または連続モードで培養する段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  18. 前記ＭＬＡは、１−脱リン酸−脂質Ａ、１−脱リン酸−ペンタ−アシル脂質Ａ、１−脱リン酸−テトラ−アシル脂質Ａ、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
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