BRPI0720822A2

BRPI0720822A2 - Cepa de e.coli recombinante cj600 que possui produtividade de l-triptofano e processos para a produção da referida cepa e para a produção de l-triptofano

Info

Publication number: BRPI0720822A2
Application number: BRPI0720822-7A
Authority: BR
Inventors: Jae-Yeong Ju; Hyang Choi; Eun-Sung Koh; Ji-Sun Lee; So Young Kim; Chang-Hyun Jin; Young-Hoon Park; Jin-Ho Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2014-05-20
Also published as: US20100028956A1; US8569066B2; EP2115121A1; US20120276639A1; CN101622338B; EP2115121A4; EP3059310A1; CN101622338A; ES2606705T3; WO2008082179A1; EP3059311A1; PL2115121T3; US8945907B2; KR100792095B1; EP2115121B1; BRPI0720822B1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CEPA DE E. COLI RECOMBINANTE CJ600 (KCCM 10812P) QUE POSSUI PRODUTI- VIDADE DE L-TRIPTOFANO E PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DA REFERIDA CEPA E PARA A PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO".

5 Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um micro-organismo que possui produtividade de L-triptofano a um processo para a produção de L-triptofano utilizando o mesmo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma E. coli recombinante que possui produtividade de triptofano produzida 10 por engenharia genética através da perda de sua auxotrofia em relação ao triptofano, do bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina e da intensificação do gene envolvido na biossíntese de triptofano partindo da E. coli KFCC 10066 mutante que possui produtividade de L-fenilalanina e um processo para a produção de L-triptofano utilizando a mesma.

Antecedentes da Técnica

O L-triptofano é um dos aminoácidos fundamentais, que foi utili- zado como um aditivo alimentar ou uma matéria-prima para medicamentos incluindo injeções e alimentos saudáveis, graças ao seu efeito hipnótico ou seu efeito tranquilizante. O L-triptofano foi produzido através de síntese quí- mica, reação enzimática e fermentação por micro-organismos.

Para a síntese química, é necessária uma reação à alta tempe- ratura e à alta pressão e tanto o tipo D quanto o tipo L são incluídos no pro- duto de reação, o que torna o processo de purificação difícil. A reação enzi- mática possui problemas de alto preço de indol e serina utilizados como 25 substratos e de instabilidade da enzima, como mostrado na descrição de patente de Mitsui Toatsu (Publicação de Patente Coreana N2 90-005773).

Portanto, a produção de L-triptofano dependia enormemente da fermentação direta utilizando um micro-organismo. A produção de L- triptofano de acordo com a fermentação convencional por micro-organismos era principalmente realizada em auxotrófico e mutante com mutação de re- gião controle de vários micro-organismos incluindo E. coli e Corynebacteri- um. Com o avanço surpreendente de técnicas do DNA recombinante desde 1980, a via do metabolismo e seu mecanismo de regulação foram divulga- dos. Desde então, os pesquisadores tiveram sucesso no desenvolvimento de cepas recombinantes excelentes utilizando técnicas de manipulação gê- 5 nica, que trouxeram aumento notável na produção.

Algumas das Patentes Coreanas em relação à produção de trip- tofano através da fermentação direta utilizando um micro-organismo descre- vem respectivamente a produção de triptofano através da utilização de ce- pas mutantes que possuem resistência ou auxotrofia ao análogo de triptofa- 10 no (Publicações de Patentes Coreanas N— 87-1813, 90-8251 e 92-7405) e a produção de triptofano através da utilização de cepas recombinantes (Publi- cações de Patentes Coreanas N— 90-5772 e 91-5672). No caso de utilizar uma cepa resistente ao análogo de triptofano, era o objetivo principal supe- rar a inibição de realimentação de enzimas na biossíntese de triptofano. No 15 caso de utilizar uma cepa recombinante, a clonagem de genes envolvidos na biossíntese de triptofano era um objetivo principal. E, os processo anteriores conquistaram um enorme sucesso na verdade. Entretanto, muito embora o processo convencional para a produção de L-triptofano utilizando a E. coli mutante convencional possua uma vantagem de produzir L-triptofano atra- 20 vés do uso de meio de cultura barato, este possui uma desvantagem de bai- xa produtividade de L-triptofano. Os presentes inventores consideraram que a produção de L-triptofano através da fermentação por E. coli CJ285 (KCCM-10534, PCT/KR2004/003030) que foi desenvolvida e mantida pela companhia dos presentes inventores também possui um problema de baixa 25 produtividade. Assim, os presentes inventores consideraram que o desen- volvimento de uma cepa mutante excelente como uma cepa matriz era im- portante para maximizar a produtividade de L-triptofano através de técnicas do DNA recombinante.

Por outro lado, a cepa que produz L-fenilalanina (KFCC 10066, Publicação de Patente Coreana Ng 1985-0001232) foi desenvolvida e manti- da pela companhia dos presentes inventores uma vez que o aminoácido a- romático (L-triptofano, L-fenilalanina e L-tirosina) pode ser sintetizado na via de metabolismo comum. Assim, os presentes inventores consideraram que a manipulação apropriada da cepa anterior através de técnicas de engenharia genética poderia aumentar a produtividade de L-triptofano. Os presentes inventores, portanto, utilizaram a cepa que produz L-fenilalanina (KFCC 5 10066, Publicação de Patente Coreana Nq 1985-0001232) como uma cepa matriz para uma cepa de E. coli recombinante que produz L-triptofano com alto rendimento através da perda da auxotrofia em relação ao triptofano, do bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina e da intensificação do gene envol- vido na biossíntese de triptofano.

Divulgação da Invenção Problema Técnico

A presente invenção fornece uma cepa produtora de triptofano desenvolvida partindo da cepa de E. coli matriz (KFCC 10066) que produz L- fenilalanina através da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB no 15 cromossomo e através da mutação dos genes aroG e trpE genes no cro- mossomo com a finalidade de liberar a auxotrofia em relação ao triptofano, bloquear a biossíntese de L-fenilalanina, mas induzir a produção de triptofa- no.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer um processo para a produção de L-triptofano a uma alta concentração através do cultivo da cepa de E. coli recombinante anterior no meio de fermentação contendo glicose através da fermentação direta.

Solução Técnica

Os objetivos anteriores e outros objetivos da presente invenção podem ser conseguidos através das modalidades a seguir da presente in- venção.

A presente invenção é descrita em detalhes posteriormente aqui.

O processo para a produção de L-triptofano da presente inven- ção compreende as etapas a seguir: liberação da auxotrofia em relação ao triptofano da cepa de E. coli mutante (KFCC 10066) que possui produtivida- de de L-fenilalanina no cromossomo; bloqueio da biossíntese de L- fenilalanina, que é a inativação do gene pheA envolvido na biossíntese de L- fenilalanina, do gene trpR envolvido na regulação da biossíntese de triptofa- no, do gene mtr envolvido na reentrada intracelular do triptofano produzido e do gene tnaAB envolvido na degradação do triptofano produzido; intensifica- ção do gene envolvido na biossíntese de triptofano, que é a mutação do ge- 5 ne aroG que codifica a enzima para a síntese de 3-desoxiarabinose- heptulossonato-7-fosfato (DAHP) no cromossomo e trpE envolvido na bios- síntese de triptofano para a liberação da inibição da realimentação; e confir- mação da produção de L-triptofano partindo da cepa de E. coli recombinante obtida anteriormente no meio de fermentação contendo glicose através da 10 fermentação direta.

A etapa de liberação da auxotrofia em relação ao triptofano in- clui o processo de restauração do gene do operon de triptofano no cromos- somo de uma cepa que produz L-fenilalanina que possui auxotrofia em rela- ção ao triptofano para a forma de uma cepa do tipo selvagem. O gene do 15 operon de triptofano compreende a forma de trpEDCBA e é composto de genes necessários para a conversão de corismato em triptofano, sugerindo que este é necessário para a cepa que produz triptofano. Assim, o gene do operon de triptofano foi selecionado como um gene-alvo que deve ser res- taurado.

A etapa de bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina nesta in-

venção inclui o processo de inativação de genes envolvidos na biossíntese de L-fenilalanina. Aqui, "inativação" indica a deleção de genes pheA, trpR, mtr e tnaAB ativos intracelulares ou a mutação de genes pheA, trpR, mtr e tnaAB de forma a reduzir os níveis das proteínas codificadas por estes ge- nes.

O gene pheA (NCBI gene ID: 16130520) (SEQ. ID. NO: 33) é o gene que codifica a proteína necessária para a biossíntese de L-fenilalanina em E. coli e compete com a via de biossíntese de triptofano no corismato. Portanto, este foi selecionado como um gene-alvo para ser inativado para a produção de uma cepa que produz triptofano.

O gene trpR (NCBI gene ID: 16132210) (SEQ. ID. NO: 34) é o gene que codifica a proteína TrpR necessária para a regulação da biossínte- se do operon de triptofano (trpEDCBA) em E. coli, que se liga ao triptofano endógeno que será funcional como um repressor através da ligação do pro- motor do operon de triptofano. Assim, a inativação desta proteína resulta na superexpressão do mRNA do operon de triptofano, indicando o aumento da 5 concentração de triptofano. Portanto, este foi selecionado como um gene- alvo para ser inativado.

O gene mtr (NCBI gene ID: 16131053) (SEQ. ID. NO: 35) é o gene que codifica a proteína necessária para o influxo de triptofano proveni- ente do exterior das células. Assim, este gene deve ser deletado da cepa que produz triptofano, o que torna o gene um alvo para ser inativado.

O gene tnaAB (NCBI gene ID: 90111643, 16131577) (SEQ. ID. NO: 36 e NO: 37) é composto de tnaA que codifica a proteína necessária para a degradação do triptofano intracelular e tnaB que codifica a proteína envolvida no influxo de triptofano extracelular. Acredita-se que este gene não 15 é necessário para a cultura que produz L-triptofano. Assim, este foi selecio- nado como um gene-alvo para ser inativado.

O micro-organismo da presente invenção é preparado através da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB que existem no cromosso- mo de um micro-organismo que possui produtividade de L-triptofano. Para 20 inativar tais genes, a mutação é induzida através da utilização de um raio tal como UV ou um reagente químico. E dos mutantes, é selecionada uma cepa que possui genes inativados que codificam pheA, trpR, mtr e tnaAB. A inati- vação pode ser realizada através de técnicas do DNA recombinante. Por exemplo, a inativação pode ser conseguida através da inserção da sequên- 25 cia de nucleotídeos ou do vetor que contém a seqüência de nucleotídeos que possui homologia com os genes que codificam pheA, trpR, mtr e tnaAB em um micro-organismo-alvo para induzir a recombinação homóloga. A se- qüência de nucleotídeos ou o vetor anterior pode incluir um marcador de se- leção dominante.

Nesta invenção, os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB inativados ou

seus fragmentos de DNA contêm seqüência de polinucleotídeos que possu- em homologia de seqüência com os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB do hos- pedeiro, mas estas seqüências de polinucleotídeos possuem mutação tal como truncamento, deleção, substituição, inserção e inversão de forma a serem incapazes de expressar as proteínas codificadas pelos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB. A inserção dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB inativados 5 ou seus fragmentos de DNA em uma célula hospedeira pode ser conseguida através de transformação, conjugação, transdução ou eletroporação, mas nem sempre limitada à mesma.

Quando os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB inativados ou seus fragmentos de DNA são introduzidos em uma célula hospedeira através de 10 transformação, a inativação é induzida através da mistura das seqüências de polinucleotídeos com a cultura da cepa. Neste momento, a cepa pode ser transformada porque é naturalmente competente para a inserção do DNA, mas é preferido tornar a cepa competente para a inserção do DNA através do processo apropriado antecipadamente (ver LeBIanc e outros, Plasmid 28, 15 130-145, 1992; Pozzi e outros, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996). Através da recombinação homóloga, a cópia do cromossomo do tipo selvagem da seqüência é inativada através da deleção de uma ptécnica dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB do DNA genômico ou da inserção de um fragmento de DNA estranho.

A etapa de intensificação do gene envolvido na biossíntese de

triptofano da presente invenção inclui o processo de mutação do gene en- volvido na biossíntese de triptofano. Aqui, "mutação" indica que a atividade dos genes aroG e trpE que codificam proteínas é modificada para liberar a inibição de realimentação.

O aroG (NCBI gene ID: 16128722) (SEQ. ID. NO: 38) é o gene

que codifica a proteína necessária para a síntese de 7P-2-des-hidro-3- desóxi-D-arabinoheptose que é o ponto de partida da via de biossíntese de aminoácidos aromáticos (triptofano, L-fenilalanina, tirosina). Foi considerado que este gene é necessariamente mutado para aumentar a produtividade de triptofano.

O trpE (NCBI gene ID: 16129225) (SEQ. ID. NO: 39) é o gene que codifica a proteína envolvida na síntese de antranilato. Entre os genes que constituem o operon de triptofano, este gene é inibido pelo triptofano. Assim, foi considerado que este gene era necessariamente mutado para prevenir a inibição.

A presente invenção fornece ainda um processo para a produ- 5 ção de L-triptofano a alta concentração com alto rendimento através do culti- vo da cepa de E. coli recombinante preparada anteriormente no meio de fermentação contendo glicose através da fermentação direta.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

As modalidades práticas e atualmente preferidas da presente invenção são ilustrativas como mostrado nos Exemplos a seguir.

Entretanto, será reconhecido que os peritos na técnica, conside- rando esta divulgação, podem realizar modificações e melhorias dentro do espírito e do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Construção de uma cepa que perdeu a propriedade de auxotro- fia em relação ao triptofano

Neste exemplo, o gene do operon de triptofano que existe no cromossomo da cepa auxotrófica em relação ao triptofano que produz L- fenilalanina foi restaurado para o tipo selvagem.

Para fazer isso, foi utilizado o Iisado de células da E. coli do tipo sel- vagem infectada com o fago P1. Precisamente, uma alça de platina de E. coli foi inoculada em meio LB líquido (Luria-Bertani, deferido como LB poste- riormente aqui; bacto triptone 10 g/L, extrato de levedura bacto extract 5 g/L, cloreto de sódio 10 g/L), seguida pelo cultivo a 37°C durante a noite. As célu- las cultivadas foram recuperadas e ressuspensas em meio líquido LB-GMC (0,2% de glicose, 1 mM de sulfato de magnésio (MgSO4), 0,05 mM de clore- to de cálcio (CaCI2)), seguido pela infecção com 2 pL de fago P1. Após a cultura a 37°C durante 30 minutos, o produto da cultura foi lavado duas ve- zes com 0,1 M de citrato de Na para eliminar o restante do fago P1. As célu- las foram ressuspensas em 0,1 mL de citrato de Na, que foram espalhadas sobre meio mínimo sólido M9 suplementado com 20 mg/L de tirosina. A co- lônia obtida foi confirmada como sendo capaz de crescer em um meio isento de triptofano, sugerindo que as cepas perderam a propriedade de auxotrofia em relação ao triptofano. A cepa construída foi chamada de "CJ001 (Trp+)". Exemplo 2: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene pheA inativado

Neste exemplo, o gene pheA de E. coli foi inativado através de

5 recombinação homóloga.

Para inativaro gene pheA, foi utilizada a inativação em uma eta- pa, que é um processo que utiliza a lambda Red recombinase desenvolvida por Datsenko KA e outros (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc 10 Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5). Para confirmar a inserção no gene, o gene resistente ao cloranfenicol de pKD3 foi utilizado como um mar- cador. A reação em cadeia da polimerase (referida como PCR posteriormen- te aqui) foi utilizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 1 e o primer 2 mostrados na Tabela 1 que compreendem uma ptécni- 15 ca do gene pheA e uma ptécnica da seqüência do gene resistente ao cloran- fenicol de pKD3, resultando na amplificação de um fragmento do gene de aproximadamente 1100 bb [Sambrook e outros, Molecular Cloning, a Labo- ratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit (BIONEER, Coreia). E a 20 PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 1

Iniciador 1 5’- aggcaacactatgacatcgtgtaggctggagctgcttc -3’ (SEQ. ID. NO: 1) Iniciador 2 5’- ggtcgccattaacaacgtggcatatgaatatcctccttag -3’ (SEQ. ID. NO: 2) Para a obtenção do fragmento de DNA a 5’ do gene pheA de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 3 e 4 mostrados na tabela 2, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 2

Iniciador 3 5'-tattgagtgtatcgccaac-3’ (SEQ. ID. NO: 3) Iniciador 4 5’- cgatgtcatagtgttgcc -3’ (SEQ. ID. NO; 4) Para a obtenção do fragmento de DNA a 3’ do gene pheA de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 5 e 6 mostrados na tabela 3, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 3

Iniciador 5 5’- ccacgttgttaatggcgacc -3’ (SEQ. ID. NO: 5) Iniciador 6 5'- ttcattgaacgggtgatttc -3’ (SEQ. ID. NO: 6) Aqui, 18 pares das seqüências de nucleotídeos do primer 1 e do primer 4 eram complementares e 20 pares das seqüências de nucleotídeos do primer 2 e do primer 5 eram complementares. Assim, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 1 e 2, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 3 e 4 e o fragmento obtido através da PCR utili- zando os primers 5 e 6 poderiam ser ligados na forma de um fragmento. Os produtos da PCR foram amplificados através de cinco ciclos da PCR sem primers. O primer 3 e o primer 6 foram adicionados aos mesmos, seguidos por 25 ciclos da PCR. Como um resultado, um fragmento gênico de aproxi- madamente 1600 bp foi amplificado.

A E. coli CJ001 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi preparada na forma de uma cepa competente, seguida pela indução do fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido 5 através da PCR, as cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB suple- mentado com 30 mg/L de cloranfenicol. A cepa obtida foi confirmada como possuindo pheA inativado pelo fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR utilizando o primer 3 e o primer 6. A cepa recombi- nante resultante foi chamada de "CJ100 (Trp+A pheA)".

Exemplo 3: Construção de um micro-orqanismo recombinante que produz L- triptofano com o gene trpR inativado

Neste exemplo, o gene trpR de E. coli foi inativado através de recombinação homóloga.

A PCR foi realizada através da utilização de pKD3 como um 15 molde com o primer 7 e o primer 8 mostrados na Tabela 4 que compreen- dem uma ptécnica do gene trpR e uma ptécnica da seqüência do gene resis- tente ao cloranfenicol de pKD3, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 1100 bp. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; des- 20 naturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 se- gundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 4

Iniciador 5'- 7 tccgcacgtttatgatatgctatcgtactctttagcgagtacaaccgggggtgtaggctggagct gcttc-3’ (SEQ. ID. NO: 7) Iniciador 5’- 8 gccacgicttatcaggcctacaaaatcaatcgcttttcagcaacacctctcatatgaatatcctc cttag-3’ (SEQ. ID. NO: 8) Para a obtenção do fragmento de DNA a 5’ do gene trpR de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 9 e 10 mostrados na Tabela 5, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 5

Iniciador 9 5’- gcgccgggcgtatcgacgca -3’ (SEQ. ID. NO: 9) Iniciador 10 5'- gcatatcataaacgtgcgga -3' (SEQ. ID. NO: 10) Para a obtenção do fragmento de DNA a 3’ do gene trpR de E. 10 coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 11 e 12 mostrados na Tabela 6, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 15 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 6

Inieiador 11 5’- tgtaggcctgataagacgtg -3’ (SEQ. ID. NO: 11) Inieiador 12 5’- aaggggcgatcggcgtgttt -3’ (SEQ. ID. NO: 12) Aqui, 20 pares das seqüências de nucleotídeos do primer 7 e do

primer 10 eram complementares e 20 pares das seqüências de nucleotídeos do primer 8 e do primer 11 eram complementares. Assim, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 7 e 8, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 9 e 10 e o fragmento obtido através da PCR utili- 25 zando os primers 11 e 12 poderiam ser ligados na forma de um fragmento. Os produtos da PCR foram amplificados através de cinco ciclos da PCR sem primers. O primer 9 e o primer 12 foram adicionados aos mesmos, seguidos por 25 ciclos da PCR. Como um resultado, um fragmento gênico de aproxi- madamente 1600 bp foi amplificado.

A E. coli CJ100 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi gerada na forma de uma cepa competente, se- guida pela indução utilizando o fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR. As cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo cloranfenicol.

A cepa obtida foi confirmada como possuindo trpR inativado pelo

fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR utilizando o primer 9 e o primer 12. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ200 (Trp+ ÂpheAÂtrpR)".

Exemplo 4: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene mtr inativado

Neste exemplo, o gene mtr de E. coli foi inativado através de recombinação homóloga.

A PCR foi realizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 13 e o primer 14 mostrados na Tabela 7 que compreen- 15 dem uma ptécnica do gene mtr e uma ptécnica da seqüência do gene resis- tente ao cloranfenicol de pKD3, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 1100 bp. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; des- naturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 se- 20 gundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 7

Iniciador 13 5’- atggcaacactaaccaccacccaaacgtcaccgtcgctgcttggcggcgtgtgtaggctg gagctgcttc -3’ (SEQ. ID. NO: 13) Iniciador 14 5'- ttactgatacaccggcagtaaattaaagctcgataaaatatgcaccagtgcatatgaatatc ctccttag -3’ (SEQ. ID. NO: 14) Para a obtenção do fragmento de DNA a 5’ do gene mtr de E.

coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 15 e 16 mostrados na Tabela 8, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 500 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 8

Iniciador 15 5’- gcagccgttacattggtaac -3' (SEQ. ID. NO: 15) Iniciador 16 5’- gtggtggttagtgttgccat -3’ (SEQ. ID. NO: 16) Para a obtenção do fragmento de DNA a 3’ do gene mtr de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli 10 W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 17 e 18 mostrados na Tabela 9, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 500 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C 15 durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 9

Inieiador 15 5’- tactgccggtgtatcagtaa -3’ (SEQ. ID. NO: 17) Inieiador 15 5’-tcaaaccgtcagcacggctg -3’(SEQ. ID. NO: 18) Aqui, 20 pares das seqüências de nucleotídeos do primer 13 e 20 do primer 16 eram complementares e 20 pares das seqüências de nucleotí- deos do primer 14 e do primer 17 eram complementares. Assim, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 13 e 14, o fragmento obtido a- través da PCR utilizando os primers 15 e 16 e o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 17 e 18 poderiam ser ligados na forma de um 25 fragmento. Os produtos da PCR foram amplificados através de cinco ciclos da PCR sem primers. O primer 15 e o primer 18 foram adicionados aos mesmos, seguidos por 25 ciclos da PCR. Como um resultado, foi amplificado um fragmento gênico de aproximadamente 2100 bp.

A E. coli CJ200 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi preparada na forma de uma cepa competente, seguida pela indução utilizando o fragmento gênico de tamanho de 2100 bp obtido através da PCR. As cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo cloranfenicol.

A cepa obtida foi confirmada como possuindo mtr inativado pelo fragmento gênico de tamanho de 2100 bp obtido através da PCR utilizando o primer 15 e o primer 18. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ300 (Trp+ ApheAAtrpRAmtr)".

Exemplo 5: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene tnaAB inativado Neste exemplo, o gene tnaAB de E. coli foi inativado através de

recombinação homóloga.

A PCR foi realizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 19 e o primer 20 que compreendem uma ptécnica do gene tnaAB e uma ptécnica da seqüência do gene resistente ao cloranfeni- 15 col de pKD3 mostrados na Tabela 10, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 1100 bp. A solução de reação utili- zada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C du- rante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O pro- 20 duto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A ban- da-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 10

Iniciador 19 5’- atgaaggattatgtaatggaaaactttaaacatctccctgaaccgttccggtgtaggctg gagctgcttc-3’ (SEQ. ID. NO: 19) Iniciador 20 5’- ttagccaaatttaggtaacacgttaaagacgttgccgaaccagcacaaaacatatgaa tatcctccttag -3' (SEQ. ID. NO: 20) A E. coli CJ300 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi preparada na forma de uma cepa competente, seguida pela indução utilizando o fragmento gênico de tamanho de 1100 bp obtido através da PCR. As cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo cloranfenicol. A cepa foi confirmada como possuindo tnaAB inati- vado pelo fragmento gênico de tamanho de 1900 bp obtido através da PCR utilizando o primer 21 e o primer 22. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ400 (Trp+ ApheAAtrpRAmtrAtnaAB)".

Tabela 11

Iniciador 21 5’-ttaagcgaaatcaccggggaa -3’ (SEQ. ID. NO: 21) Iniciador 22 5’- atgtccgagcactggcgc -3’ (SEQ. ID. NO: 22) Exemplo 6: Construção do vetor pSKH que induz mutação gênica específica Neste exemplo, foi construído o vetor que é capaz de induzir mu- tação gênica específica no cromossomo de E. coli.

Para fazer isso, o gene sacB de Bacillus subtilis foi inserido no vetor pKCG119 utilizado na Publicação de Patente Coreana Ns 10-2006- 0079297. Para selecionar as cepas mutadas sem a inserção de um gene estranho, foi utilizado o gene sacB.

O gene sacB (1,9 kb) foi amplificado através da PCR utilizando o cromossomo de Bacillus subtilis do tipo selvagem (Marburg 168) como um 15 molde com os primers 23 e 24 (Molecular organization of intrinsic restriction and modification genes BsuM of Bacillus subtilis Marburg, Ohshima H, Mat- suoka S, Asai K, Sadaie Y. J Bacteriol. 2002 Jan;184(2):381-9). A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi reali- zada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento 20 a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 2 minutos (30 ciclos).

Tabela 12

Inieiador 23 5’-tgctctagagatcctttttaacccatcacatat -3’ (SEQ. ID. NO: 23) Inieiador 24 5’- cgcggatcctcgtgatggcaggttgggcgtcgc -3' (SEQ. ID. NO: 24) O produto da PCR foi digerido com Xbal e BamHI, que seguiu 25 para um gel de agarose a 0,8%. Como um resultado, foi obtido um fragmen- to de DNA de tamanho de 1,9 kb. O fragmento obtido foi ligado no vetor pKCG119 digerido com Xba I e BamH (NEB Ligation kit). A E. coli Top 10 foi transformada com a mistura de ligação. As células transformadas foram es- palhadas sobre meio sólido LB contendo canamicina (50 mg/L) e cultivadas 30 a 37°C durante a noite. A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo canamicina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização de plasmid miniprep kit. A seqüência de nucleotídeos do sacB inserido foi identificada através do se- 5 quenciamento do DNA. O vetor construído foi chamado de "pSKH".

Exemplo 7: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene aroG mutado

Neste exemplo, o gene aroG de E. coli foi mutado.

O DNA cromossômico foi extraído de uma cepa que produz trip- 10 tofano através da utilização do Genomic-tip system (QIAGEN). A PCR foi realizada utilizando o DNA cromossômico como um molde com os primers 25 e 26 mostrados na Tabela 13, resultando na amplificação do fragmento de DNA de 660 bp contendo o ORF do gene aroG. A solução de reação utili- zada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a 15 seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C du- rante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 13

Iniciador 25 5’- cgcggatccgaaaagcgatccataagatat -3’ (SEQ. ID. NO: 25) Iniciador 26 5’- cgcgtcgactgctggcaggcctgctttgtt -3’ (SEQ. ID. NO: 26) 20

O fragmento do gene aroG obtido através da PCR anterior foi ligado ao vetor pCR2.1-TOPO através da utilização do TA cloning kit (Invi- trogen). A E. coli Top 10 foi transformada com a mistura de ligação. As célu- las transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo ampici- 25 Iina (100 mg/L) e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "JOPOlA-aroG".

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit (QIAGEN) e o tamanho do T0PO2.1-aroG foi medido. Para gerar a forma mutante do gene aroG, foi realizada a mutação direcionada ao sítio (Quik- Change Site-Directed Mutagenesis Kit1 STRAT AGENE) utilizando o vetor T0P02.1 -aroG como um molde com os primers 27 e 28 mostrados na Tabe- la 14. As condições de reação eram como a seguir; desnaturação a 95°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 1 minuto e alongamento a 68°C durante 6 min e 30 segundos (18 ciclos). As células de E. coli TOPIO foram transformadas com 12 μΙ_ de cada solução de reação, que foram es- palhados sobre meio sólido LB contendo ampicilina, seguido pela cultura a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "T0P02.1-ma/OG".

Tabela 14

Iniciador 27 5’-cgatatgatcaccctacaatatctcgctga -3’ (SEQ. ID. NO: 27) Iniciador 28 5’-tcagcgagatattgtagggtgatcatatcg-3' (SEQ. ID. NO: 28) 10

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit. A seqüência de nucleotídeos do gene aroG mutado foi identificada através 15 do sequenciamento do DNA. O T0P02.1-maroG contendo o gene aroG mu- tado foi digerido com BamHI e Sall, que seguiu para um gel de agarose a

0,8%. Como um resultado, foi obtido um fragmento de DNA de tamanho de 660 bp. O fragmento obtido foi ligado ao vetor pSKH digerido com BamH I e Sal I. As células E. coli Top 10 foram transformadas com a mistura de Iiga- 20 ção. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB con- tendo canamicina e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "pSKH-maroG".

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo canamicina e cultivada durante a noite. O 25 DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit (QIAGEN) e o tamanho do pSKH-maroG foi medido. A origem de replicação do plasmídeo foi eliminada através da digestão com Nhel e então ligado. O fragmento de DNA foi introduzido em CJ400 que foi preparada como uma célula competente. A CJ400 foi espalhada sobre meio sólido LB contendo 30 canamicina a 37°C durante a noite. A PCR foi realizada utilizando a colônia gerada com os primers 25 e 26 e como um resultado uma banda de 4,4 kb foi confirmada. Partindo do resultado, foi confirmado que o vetor pSKH con- tendo o gene aroG mutado foi introduzido de forma bem sucedida no DNA cromossômico. Para eliminar o vetor exceto a ptécnica do gene aroG muta- do do DNA cromossômico, a cepa foi cultivada em meio LB+10% de sacaro- 5 se durante 16 horas e espalhada sobre uma placa de meio LB. As colônias geradas foram cultivadas sobre meio sólido contendo canamicina e sobre o meio sólido isento de canamicina. Foram selecionadas as colônias que cres- ciam no meio isento de antibiótico, seguido pelo sequenciamento do DNA. Então, a cepa mutante com a substituição do aminoácido 150 do gene aroG 10 por Ieucina foi finalmente selecionada. A cepa mutante foi chamada de "CJ500 (Trp+ ApheAAtrpRAmtrAtnaAB aroG m)".

Exemplo 8: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene trpE mutado

Neste exemplo, o gene trpE de E. coli foi mutado.

O DNA cromossômico foi extraído de uma cepa que produz triptofano atra- vés da utilização do Genomic-tip system (QIAGEN). A PCR foi realizada uti- lizando o DNA cromossômico como um molde com os primers 29 e 30 mos- trados na Tabela 15, resultando na amplificação do fragmento de DNA de 600 bp contendo uma ptécnica do ORF do gene trpE. A solução de reação 20 utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada co- mo a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição.

Tabela 15

Iniciador 29 5'- cgcggatccaccgtggaaatttccacgccg -3’ (SEQ. ID. NO: 29) Iniciador 30 5’- cgcgtcgactttccgctgacagttgcggta -3’ (SEQ. ID. NO: 30) O fragmento do gene trpE obtido através da PCR anterior foi li- gado ao vetor pCR2.1-TOPO através da utilização do TA cloning kit (Invitro- gen). A E. coli Top 10 foi transformada com a mistura de ligação. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo ampicilina e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "TO- Ρ02.1-trpE".

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit 5 (QIAGEN) e o tamanho do T0P02.1 -trpE foi medido. Para gerar a forma mutante do gene trpE, foi realizada a mutação direcionada ao sítio utilizando o vetor T0P02.1 -trpE como um molde com os primers 31 e 32 mostrados na Tabela 16. As condições de reação eram como a seguir; desnaturação a QSilC durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 1 minuto e alonga- 10 mento a 68°C durante 6 minutos e 30 segundos (18 ciclos). As células E. coli TOPIO foram transformadas com 12 pL de cada solução de reação, que fo- ram espalhados sobre meio sólido LB contendo ampicilina, seguido pela cul- tura a 37°C durante a noite. Q vetor construído foi chamado de "T0P02.1- m trpE'.

Tabela 16

Iniciador 31 5 - gcttatcgcgacaatgccaccgcgctttttcac -3’ (SEQ. ID. NO: 31) Iniciador 32 5’- gtgaaaaagcgcggtggcattgtcgcgataagc-3’ (SEQ. ID. NO: 32) A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit. 20 A seqüência de nucleotídeos do trpE mutado foi identificada através do se- quenciamento do DNA. O plasmídeo T0P02.1-mfrp£ contendo o gene trpE mutado foi digerido com BamHt e Sall, que seguiu para um gel de agarose a

0,8%. Como um resultado, foi obtido um fragmento de DNA de tamanho de 660 bp. O fragmento obtido foi ligado ao vetor pSKH digerido com BamH I e 25 Sal I. As células E. coli Top 10 foram transformadas com a mistura de liga- ção. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB con- tendo canamicina e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "pSKH-mfrpP.

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo canamicina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit (QIAGEN) e o tamanho do pSKH-mtrpE foi medido. A origem de replicação do plasmídeo foi eliminada através da digestão com Nhel e então ligado. O fragmento de DNA foi introduzido em CJ500, que foi espalhada sobre meio sólido LB contendo canamicina a 37°C durante a noite. A PCR foi realizada utilizando a colônia gerada com os primers 29 e 30 e como um resultado foi confirmada uma banda de 4,4 kb. Partindo do resultado, foi confirmado que o vetor pSKH contendo o gene trpE mutado foi introduzido de forma bem sucedida no DNA cromossômico. Para eliminar o vetor exceto a ptécnica do gene trpE mutado do DNA cromossômico, a cepa foi cultivada em meio LB+10% de sacarose durante 16 horas, seguido pela distribuição em placa de meio LB. As colônias geradas foram cultivadas sobre meio sólido conten- do canamicina e sobre o meio sólido isento de canamicina. Foram selecio- nadas as colônias que cresciam no meio isento de antibiótico, seguido pelo sequenciamento do DNA. Então, a cepa mutante com a substituição do 21e aminoácido do gene trpE por alanina foi finalmente selecionada. A cepa mu- tante foi chamada de "CJ600 (Trp+ ApheAAtrpRAmtrAtnaAB aroG m trpE m)" e depositada no KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) da KFCC (Korean Federation of Culture Collection), a International Depository Autho- rity localizada em 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seoul, Co- reia, em 8 de dezembro de 2006 (Ns de Acesso: KCCM 10812P).

Exemplo 9: Comparação da produtividade de triptofano do micro-orqanismo construído através de recombinacão genética

Neste exemplo, as colônias das cepas recombinantes construí- das no Exemplo 1 - Exemplo 6, CJ001, CJ100, CJ200, CJ300, CJ400, 25 CJ500 e CJ600 (KCCM 10812P) foram espalhadas sobre meio sólido LB cada uma através de uma alça de platina e cultivadas durante a noite. As cepas em crescimento foram inoculadas em meio para titulação em frascos possuindo a composição que é mostrada na Tabela 17 cada uma através de uma alça de platina. Após a inoculação, as cepas foram cultivadas a 37°C, 30 200 rpm durante 48 horas. Os níveis de triptofano e L-fenilalanina obtidos partindo da cultura anterior e os níveis de triptofano e L-fenilalanina obtidos partindo da cultura de E. coli KFCC 10066 mutante que produz L-fenilalanina foram comparados. A densidade óptica (DO) e os níveis de L-triptofano e L- fenilalanina foram representados através do valor médio obtido dos três fras- cos.

Tabela 17

Composição Concentração Glicose 2,5 Extrato de levedura 2,5 (NH4)2SO4^H2O 20 MgSO4 1 Citrato de Na 5 NaCI 1 L-tirosina 0,1 L-fenilalanina 0,15 CaCO3 40 KH2PO4 2 Como um resultado, como mostrado na Tabela 18, o L-triptofano

não era produzido na E. coli KFCC 10066 mutante que produz L-fenilalanina, enquanto 6,5 g/L de L-triptofano eram produzidos na E. coli CJ600 (KCCM 10812P) desenvolvida na presente invenção.

Tabela 18

Nome da cepa DO da célula (562 L-triptofano (g/L) L-fenilalanina nm) (g/L) KFCC 10066 15,2 0,0 9,1 CJ001 17,6 0,0 3,5 CJ100 16,1 0,1 0 CJ200 16,3 0,3 0 CJ300 16,8 0,3 0 CJ400 16,4 0,3 0 CJ500 16,3 0,4 0 CJ600 13,5 6,5 0 Aplicabilidadelndustrial

Os presentes inventores desenvolveram a cepa de E. coli re- combinante CJ600 que produz triptofano a alta concentração partindo da E. coli que produz L-fenilalanina sem a produção de L-fenilalanina durante um curto espaço de tempo através da liberação da auxotrofia em relação ao trip- tofano e da mutação ou da inativação de genes. Particularmente, a cepa re- combinante de E. coli CJ600 (KCCM 10812P) foi preparada partindo da E. coli KFCC 10066 mutante que possui produtividade de L-fenilalanina através 5 da liberação da auxotrofia em relação ao triptofano, da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB e da mutação dos genes aroG e trpE no cromosso- mo. O L-triptofano foi produzido a alta concentração através da cultura da cepa recombinante anterior, indicando que a produtividade de L-triptofano era maior.

Os peritos na técnica considerarão que os conceitos e as moda-

lidades específicas na descrição anterior podem ser facilmente utilizados como uma base para a modificação ou para o planejamento de outras moda- lidades para a realização das mesmas finalidades da presente invenção. Os peritos na técnica também considerarão que tais modalidades equivalentes 15 não divergem do espírito e do âmbito da invenção como apresentado nas reivindicações em anexo. TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO- ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

DESTINATARIO: | RECIBO NO CASO DE DEPOSITO

ORIGINAL, emitido por força da regra

500 5-GA NAMDAEMUN-RO CHUNG-KU, SEOUL REPUBLIC OF KOREA

7.1 pela AUTORIDADE INTERNA- CIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

IDENTIFICAÇAO DO MICRO-ORGANISMO

Referência de identificação fornecida Número de acesso fornecido pela pelo DEPOSITANTE: AUTORIDADE INTERNACIONAL DE

Escherichia coli Cj600 DEPÓSITO:

KCCM10812P

II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇAO TAXONOMICA PROPOSTA

O micro-organismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

□ uma descrição científica

□ designação taxonômica proposta

(marca com um X quando aplicável)

RECIBO E ACEITAÇAO

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o micro-organismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 08 de dezembro de 2006. (data do depósito original)1

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO

O micro-organismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade In- ternacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requeri- mento para conversão)__

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPOSITO

Nome: Korean Culture Center of Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o Microorganisms poder de representação da Autoridade

Internacional de Depósito ou de oficial(is) Endereço: 361-221, Yurim B/D responsável(is):

Honflie-Idong1

Seodaemun-gu

SEOUL120-091 Data: 08 de dezembro de 2006

Republic of Korea

nQuando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Au- toridade Internacional de depósito foi obtido. Onde um depósito feito fora do tra- tado de Budapeste, após a aquisição do estado de autoridade de depósito inter- nacional é convertido em um depósito sob o Tratato de Budapeste, tal dado é o dado sobre o qual o micro-organismo foi recebido pela autoridade de patente in- ternacional

Claims

1. Cepa de E. coli recombinante CJ600 (KCCM 10812P) que possui produtividade de L-triptofano, caracterizada pelo fato de que é prepa- rada a partir da E. coli mutante (KFCC 10066), que possui produtividade de L- fenilalanina, através da liberação da auxotrofia em relação ao triptofano, da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB e da mutação dos genes aroG e trpE no cromossomo.

2. Processo para a produção da cepa de E. coli que possui pro- dutividade de L-triptofano, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de liberação da auxotrofia em relação ao triptofano no cromossomo através da manipulação gênica; bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina através da inativação dos genes pheA, trpR, mtre tnaAB; e da intensificação do genes envolvidos na biossíntese do L-triptofano através da mutação dos genes aroG e trpE.

3. Processo para a produção de L-triptofano, caracterizado pelo fato de que é através da utilização da E. coli recombinante preparada atra- vés do processo como definido na reivindicação 2.