BRPI0720822B1

BRPI0720822B1 - Cepa de e. coli recombinante que possui produtividade de l-triptofano e processo para a produção de l-triptofano

Info

Publication number: BRPI0720822B1
Application number: BRPI0720822-7A
Authority: BR
Inventors: Jae-Yeong Ju; Hyang Choi; Eun-Sung Koh; Ji-Sun LEE; So Young Kim; Chang-Hyun JIN; Young-hoon Park; Jin-ho Lee
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2024-02-27
Also published as: US8569066B2; US8945907B2; EP2115121B1; CN101622338B; PL2115121T3; US20120276639A1; ES2606705T3; US20100028956A1; KR100792095B1; EP2115121A1; CN101622338A; EP3059310A1; EP2115121A4; WO2008082179A1; EP3059311A1; BRPI0720822A2

Abstract

CEPA DE E. COL/ RECOMBINANTE CJ600 (KCCM 10812P) QUE POSSUI PRODUTIVIDADE DE L-TRIPTOFANO E PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DA REFERIDA CEPA E PARA A PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO. A presente invenção refere-se a um micro-organismo que possui produtividade de L-triptofano e a um processo para a produção de Ltriptofano utilizando o mesmo. Mais precisamente, a presente invenção refere- se à cepa de E. coli recombinante CJ600 (KCCM 10812P) que possui produtividade de triptofano produzida partindo da forma mutante (KFCC 10066) de E. coli que possui produtividade de L-fenilalanina, em que a auxotrofia em relação ao triptofano é liberada, a biossíntese de L-fenilalanina é bloqueada, mas a produtividade de triptofano é aumentada através do reforço do gene envolvido na biossíntese de triptofano e um processo de produção de L-triptofano utilizando a mesma.

Description

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um micro-organismo que possui produtividade de L-triptofano a um processo para a produção de L-triptofano utilizando o mesmo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma E. coli recombinante que possui produtividade de triptofano produzida por engenharia genética através da perda de sua auxotrofia em relação ao triptofano, do bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina e da intensificação do gene envolvido na biossíntese de triptofano partindo da E. coli KFCC 10066 mutante que possui produtividade de L-fenilalanina e um processo para a produção de L-triptofano utilizando a mesma.

Antecedentes da Técnica

O L-triptofano é um dos aminoácidos fundamentais, que foi utilizado como um aditivo alimentar ou uma matéria-prima para medicamentos incluindo injeções e alimentos saudáveis, graças ao seu efeito hipnótico ou seu efeito tranquilizante. O L-triptofano foi produzido através de síntese química, reação enzimática e fermentação por microorganismos. Para a síntese química, é necessária uma reação à alta temperatura e à alta pressão e tanto o tipo D quanto o tipo L são incluídos no produto de reação, o que torna o processo de purificação difícil. A reação enzimática possui problemas de alto preço de indol e serina utilizados como substratos e de instabilidade da enzima, como mostrado na descrição de patente de Mitsui Toatsu (Publicação de Patente Coreana No 90-005773). Portanto, a produção de L-triptofano dependia enormemente da fermentação direta utilizando um micro-organismo. A produção de L- triptofano de acordo com a fermentação convencional por micro-organismos era principalmente realizada em auxotrófico e mutante com mutação de região controle de vários micro-organismos incluindo E. coli e Corynebacteri- um. Com o avanço surpreendente de técnicas do DNA recombinante desde 1980, a via do metabolismo e seu mecanismo de regulação foram divulgados. Desde então, os pesquisadores tiveram sucesso no desenvolvimento de cepas recombinantes excelentes utilizando técnicas de manipulação gê- nica, que trouxeram aumento notável na produção.

Algumas das Patentes Coreanas em relação à produção de trip- tofano através da fermentação direta utilizando um micro-organismo descrevem respectivamente a produção de triptofano através da utilização de cepas mutantes que possuem resistência ou auxotrofia ao análogo de triptofano (Publicações de Patentes Coreanas N— 87-1813, 90-8251 e 92-7405) e a produção de triptofano através da utilização de cepas recombinantes (Publicações de Patentes Coreanas N— 90-5772 e 91-5672). No caso de utilizar uma cepa resistente ao análogo de triptofano, era o objetivo principal superar a inibição de realimentação de enzimas na biossíntese de triptofano. No caso de utilizar uma cepa recombinante, a clonagem de genes envolvidos na biossíntese de triptofano era um objetivo principal. E, os processo anteriores conquistaram um enorme sucesso na verdade. Entretanto, muito embora o processo convencional para a produção de L-triptofano utilizando a E. coli mutante convencional possua uma vantagem de produzir L-triptofano através do uso de meio de cultura barato, este possui uma desvantagem de baixa produtividade de L-triptofano. Os presentes inventores consideraram que a produção de L-triptofano através da fermentação por E. coli CJ285 (KCCM-10534, PCT/KR2004/003030) que foi desenvolvida e mantida pela companhia dos presentes inventores também possui um problema de baixa produtividade. Assim, os presentes inventores consideraram que o desen-volvimento de uma cepa mutante excelente como uma cepa matriz era importante para maximizar a produtividade de L-triptofano através de técnicas do DNA recombinante. Por outro lado, a cepa que produz L-fenilalanina (KFCC 10066, Publicação de Patente Coreana N- 1985-0001232) foi desenvolvida e mantida pela companhia dos presentes inventores uma vez que o aminoácido a- romático (L-triptofano, L-fenilalanina e L-tirosina) pode ser sintetizado na via de metabolismo comum. Assim, os presentes inventores consideraram que a manipulação apropriada da cepa anterior através de técnicas de engenharia genética poderia aumentar a produtividade de L-triptofano. Os presentes inventores, portanto, utilizaram a cepa que produz L-fenilalanina (KFCC 10066, Publicação de Patente Coreana N° 1985-0001232) como uma cepa matriz para uma cepa de E. coli recombinante que produz L-triptofano com alto rendimento através da perda da auxotrofia em relação ao triptofano, do bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina e da intensificação do gene envolvido na biossíntese de triptofano.

Divulgação da Invenção Problema Técnico

A presente invenção fornece uma cepa produtora de triptofano desenvolvida partindo da cepa de E. coli matriz (KFCC 10066) que produz L- fenilalanina através da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB no cromossomo e através da mutação dos genes aroG e trpE genes no cromossomo com a finalidade de liberar a auxotrofia em relação ao triptofano, bloquear a biossíntese de L-fenilalanina, mas induzir a produção de triptofano.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer um processo para a produção de L-triptofano a uma alta concentração através do cultivo da cepa de E. coli recombinante anterior no meio de fermentação contendo glicose através da fermentação direta.

Solução Técnica

Os objetivos anteriores e outros objetivos da presente invenção podem ser conseguidos através das modalidades a seguir da presente invenção.

A presente invenção é descrita em detalhes posteriormente aqui.

O processo para a produção de L-triptofano da presente invenção compreende as etapas a seguir: liberação da auxotrofia em relação ao triptofano da cepa de E. coli mutante (KFCC 10066) que possui produtividade de L-fenilalanina no cromossomo; bloqueio da biossíntese de L- fenilalanina, que é a inativação do gene pheA envolvido na biossíntese de L- fenilalanina, do gene trpR envolvido na regulação da biossíntese de triptofano, do gene mtr envolvido na reentrada intracelular do triptofano produzido e do gene tnaAB envolvido na degradação do triptofano produzido; intensificação do gene envolvido na biossíntese de triptofano, que é a mutação do gene aroG que codifica a enzima para a síntese de 3-desoxiarabinose- heptulossonato-7-fosfato (DAHP) no cromossomo e trpE envolvido na biossíntese de triptofano para a liberação da inibição da realimentação; e confirmação da produção de L-triptofano partindo da cepa de E. coli recombinante obtida anteriormente no meio de fermentação contendo glicose através da fermentação direta.

A etapa de liberação da auxotrofia em relação ao triptofano inclui o processo de restauração do gene do operon de triptofano no cromossomo de uma cepa que produz L-fenilalanina que possui auxotrofia em relação ao triptofano para a forma de uma cepa do tipo selvagem. O gene do operon de triptofano compreende a forma de trpEDCBA e é composto de genes necessários para a conversão de corismato em triptofano, sugerindo que este é necessário para a cepa que produz triptofano. Assim, o gene do operon de triptofano foi selecionado como um gene-alvo que deve ser restaurado.

A etapa de bloqueio da biossíntese de L-fenilalanina nesta invenção inclui o processo de inativação de genes envolvidos na biossíntese de L-fenilalanina. Aqui, "inativação" indica a deleção de genes pheA, trpR, mtr e tnaAB ativos intracelulares ou a mutação de genes pheA, trpR, mtr e tnaAB de forma a reduzir os níveis das proteínas codificadas por estes genes.

O gene pheA (NCBI gene ID: 16130520) (SEQ. ID. NO: 33) é o gene que codifica a proteína necessária para a biossíntese de L-fenilalanina em E. coli e compete com a via de biossíntese de triptofano no corismato. Portanto, este foi selecionado como um gene-alvo para ser inativado para a produção de uma cepa que produz triptofano.

O gene trpR (NCBI gene ID: 16132210) (SEQ. ID. NO: 34) é o gene que codifica a proteína TrpR necessária para a regulação da biossínte- * se do operon de triptofano (trpEDCBA) em E. coli, que se liga ao triptofano endógeno que será funcional como um repressor através da ligação do promotor do operon de triptofano. Assim, a inativação desta proteína resulta na superexpressão do mRNA do operon de triptofano, indicando o aumento da 5 concentração de triptofano. Portanto, este foi selecionado como um gene- alvo para ser inativado. O gene mtr (NCBI gene ID: 16131053) (SEQ. ID. NO: 35) é o gene que codifica a proteína necessária para o influxo de triptofano proveniente do exterior das células. Assim, este gene deve ser deletado da cepa 10 que produz triptofano, o que torna o gene um alvo para ser inativado. O gene tnaAB (NCBI gene ID: 90111643, 16131577) (SEQ. ID. NO: 36 e NO: 37) é composto de tnaA que codifica a proteína necessária para a degradação do triptofano intracelular e tnaB que codifica a proteína envolvida no influxo de triptofano extracelular. Acredita-se que este gene não 15 é necessário para a cultura que produz L-triptofano. Assim, este foi selecionado como um gene-alvo para ser inativado.

O micro-organismo da presente invenção é preparado através da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB que existem no cromossomo de um micro-organismo que possui produtividade de L-triptofano. Para 20 inativar tais genes, a mutação é induzida através da utilização de um raio tal como UV ou um reagente químico. E dos mutantes, é selecionada uma cepa que possui genes inativados que codificam pheA, trpR, mtr e tnaAB. A inativação pode ser realizada através de técnicas do DNA recombinante. Por exemplo, a inativação pode ser conseguida através da inserção da sequên- 25 cia de nucleotídeos ou do vetor que contém a sequência de nucleotídeos que possui homologia com os genes que codificam pheA, trpR, mtr e tnaAB em um micro-organismo-alvo para induzir a recombinação homóloga. A se-quência de nucleotídeos ou o vetor anterior pode incluir um marcador de seleção dominante.

Nesta invenção, os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB inativados ou seus fragmentos de DNA contêm sequência de polinucleotídeos que possuem homologia de sequência com os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB do hos- pedeiro, mas estas sequências de polinucleotídeos possuem mutação tal como truncamento, deleção, substituição, inserção e inversão de forma a serem incapazes de expressar as proteínas codificadas pelos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB. A inserção dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB inativados ou seus fragmentos de DNA em uma célula hospedeira pode ser conseguida através de transformação, conjugação, transdução ou eletroporação, mas nem sempre limitada à mesma.

Quando os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB inativados ou seus fragmentos de DNA são introduzidos em uma célula hospedeira através de transformação, a inativação é induzida através da mistura das sequências de polinucleotídeos com a cultura da cepa. Neste momento, a cepa pode ser transformada porque é naturalmente competente para a inserção do DNA, mas é preferido tornar a cepa competente para a inserção do DNA através do processo apropriado antecipadamente (ver LeBlanc e outros, Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi e outros, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996). Através da recombinação homóloga, a cópia do cromossomo do tipo selvagem da sequência é inativada através da deleção de uma ptécnica dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB do DNA genômico ou da inserção de um fragmento de DNA estranho.

A etapa de intensificação do gene envolvido na biossíntese de triptofano da presente invenção inclui o processo de mutação do gene envolvido na biossíntese de triptofano. Aqui, "mutação" indica que a atividade dos genes aroG e trpE que codificam proteínas é modificada para liberar a inibição de realimentação.

O aroG (NCBI gene ID: 16128722) (SEQ. ID. NO: 38) é o gene que codifica a proteína necessária para a síntese de 7P-2-des-hidro-3- desóxi-D-arabinoheptose que é o ponto de partida da via de biossíntese de aminoácidos aromáticos (triptofano, L-fenilalanina, tirosina). Foi considerado que este gene é necessariamente mutado para aumentar a produtividade de triptofano.

O trpE (NCBI gene ID: 16129225) (SEQ. ID. NO: 39) é o gene que codifica a proteína envolvida na síntese de antranilato. Entre os genes que constituem o operon de triptofano, este gene é inibido pelo triptofano. Assim, foi considerado que este gene era necessariamente mutado para prevenir a inibição.

A presente invenção fornece ainda um processo para a produção de L-triptofano a alta concentração com alto rendimento através do cultivo da cepa de E. coli recombinante preparada anteriormente no meio de fermentação contendo glicose através da fermentação direta.

Melhor Modo de Realizar a Invenção

As modalidades práticas e atualmente preferidas da presente invenção são ilustrativas como mostrado nos Exemplos a seguir.

Entretanto, será reconhecido que os peritos na técnica, conside-rando esta divulgação, podem realizar modificações e melhorias dentro do espírito e do âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Construção de uma cepa que perdeu a propriedade de auxotro-fia em relação ao triptofano

Neste exemplo, o gene do operon de triptofano que existe no cromossomo da cepa auxotrófica em relação ao triptofano que produz L- fenilalanina foi restaurado para o tipo selvagem. Para fazer isso, foi utilizado o lisado de células da E. coli do tipo sel-vagem infectada com o fago P1. Precisamente, uma alça de platina de E. coli foi inoculada em meio LB líquido (Luria-Bertani, deferido como LB posteriormente aqui; bacto triptone 10 g/L, extrato de levedura bacto extract 5 g/L, cloreto de sódio 10 g/L), seguida pelo cultivo a 37°C durante a noite. As células cultivadas foram recuperadas e ressuspensas em meio líquido LB-GMC (0,2% de glicose, 1 mM de sulfato de magnésio (MgSO4), 0,05 mM de cloreto de cálcio (CaCI2)), seguido pela infecção com 2 μL de fago P1. Após a cultura a 37°C durante 30 minutos, o produto da cultura foi lavado duas vezes com 0,1 M de citrato de Na para eliminar o restante do fago P1. As células foram ressuspensas em 0,1 mL de citrato de Na, que foram espalhadas sobre meio mínimo sólido M9 suplementado com 20 mg/L de tirosina. A colônia obtida foi confirmada como sendo capaz de crescer em um meio isento de triptofano, sugerindo que as cepas perderam a propriedade de auxotrofia em relação ao triptofano. A cepa construída foi chamada de "CJ001 (Trp+)".

Exemplo 2: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene pheA inativado

Neste exemplo, o gene pheA de E. coli foi inativado através de recombinação homóloga. Para inativar o gene pheA, foi utilizada a inativação em uma etapa, que é um processo que utiliza a lambda Red recombinase desenvolvida por Datsenko KA e outros (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5). Para confirmar a inserção no gene, o gene resistente ao cloranfenicol de pKD3 foi utilizado como um marcador. A reação em cadeia da polimerase (referida como PCR posteriormente aqui) foi utilizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 1 e o primer 2 mostrados na Tabela 1 que compreendem uma ptécni- ca do gene pheA e uma ptécnica da sequência do gene resistente ao cloranfenicol de pKD3, resultando na amplificação de um fragmento do gene de aproximadamente 1100 bb [Sambrook e outros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit (BIONEER, Coreia). E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 1 Para a obtenção do fragmento de DNA a 5’ do gene pheA de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 3 e 4 mostrados na tabela 2, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi-madamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C 5 durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 2 Para a obtenção do fragmento de DNA a 3’ do gene pheA de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 5 e 6 mostrados na tabela 3, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 3

Aqui, 18 pares das sequências de nucleotídeos do primer 1 e do primer 4 eram complementares e 20 pares das sequências de nucleotídeos do primer 2 e do primer 5 eram complementares. Assim, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 1 e 2, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 3 e 4 e o fragmento obtido através da PCR utili- zando os primers 5 e 6 poderiam ser ligados na forma de um fragmento. Os produtos da PCR foram amplificados através de cinco ciclos da PCR sem primers. O primer 3 e o primer 6 foram adicionados aos mesmos, seguidos por 25 ciclos da PCR. Como um resultado, um fragmento gênico de aproxi- madamente 1600 bp foi amplificado.

A E. coli CJ001 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi preparada na forma de uma cepa competente, seguida pela indução do fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR, as cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB suplementado com 30 mg/L de cloranfenicol. A cepa obtida foi confirmada como possuindo pheA inativado pelo fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR utilizando o primer 3 e o primer 6. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ100 (Trp+Δ pheA)".

Exemplo 3: Construção de um micro-organismo recombinante que produz L- triptofano com o gene trpR inativado

Neste exemplo, o gene trpR de E. coli foi inativado através de recombinação homóloga.

A PCR foi realizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 7 e o primer 8 mostrados na Tabela 4 que compreendem uma ptécnica do gene trpR e uma ptécnica da sequência do gene resistente ao cloranfenicol de pKD3, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 1100 bp. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 4 Para a obtenção do fragmento de DNA a 5’ do gene trpR de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 9 e 10 mostrados « na Tabela 5, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi-madamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C 5 durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 5 Para a obtenção do fragmento de DNA a 3’ do gene trpR de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 11 e 12 mostrados na Tabela 6, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 250 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 20 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 6

Aqui, 20 pares das sequências de nucleotídeos do primer 7 e do primer 10 eram complementares e 20 pares das sequências de nucleotídeos do primer 8 e do primer 11 eram complementares. Assim, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 7 e 8, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 9 e 10 e o fragmento obtido através da PCR utili- zando os primers 11 e 12 poderiam ser ligados na forma de um fragmento. Os produtos da PCR foram amplificados através de cinco ciclos da PCR sem primers. O primer 9 e o primer 12 foram adicionados aos mesmos, seguidos por 25 ciclos da PCR. Como um resultado, um fragmento gênico de aproximadamente 1600 bp foi amplificado.

A E. coli CJ100 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi gerada na forma de uma cepa competente, se-guida pela indução utilizando o fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR. As cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo cloranfenicol.

A cepa obtida foi confirmada como possuindo trpR inativado pelo fragmento gênico de tamanho de 1600 bp obtido através da PCR utilizando o primer 9 e o primer 12. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ200 (Trp+ ΔpheAΔtrpR)”.

Exemplo 4: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene mtr inativado

Neste exemplo, o gene mtr de E. coli foi inativado através de recombinação homóloga.

A PCR foi realizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 13 e o primer 14 mostrados na Tabela 7 que compreendem uma ptécnica do gene mtr e uma ptécnica da sequência do gene resistente ao cloranfenicol de pKD3, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 1100 bp. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 7 Para a obtenção do fragmento de DNA a 5’ do gene mtr de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 15 e 16 mostrados na Tabela 8, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi- madamente 500 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletrofo- 5 rese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 8 Para a obtenção do fragmento de DNA a 3’ do gene mtr de E. coli, a PCR foi realizada através da utilização do cromossomo da E. coli 10 W3110 do tipo selvagem como um molde com os primers 17 e 18 mostrados na Tabela 9, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproxi-madamente 500 bp. A solução de reação utilizada aqui era o PCR HL premix kit e a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C 15 durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 9

Aqui, 20 pares das sequências de nucleotídeos do primer 13 e 20 do primer 16 eram complementares e 20 pares das sequências de nucleotídeos do primer 14 e do primer 17 eram complementares. Assim, o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 13 e 14, o fragmento obtido a- través da PCR utilizando os primers 15 e 16 e o fragmento obtido através da PCR utilizando os primers 17 e 18 poderiam ser ligados na forma de um 25 fragmento. Os produtos da PCR foram amplificados através de cinco ciclos da PCR sem primers. O primer 15 e o primer 18 foram adicionados aos mesmos, seguidos por 25 ciclos da PCR. Como um resultado, foi amplificado um fragmento gênico de aproximadamente 2100 bp. A E. coli CJ200 transformada com pKD46 através do processo 30 de Datsenko KA e outros foi preparada na forma de uma cepa competente, seguida pela indução utilizando o fragmento gênico de tamanho de 2100 bp obtido através da PCR. As cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo cloranfenicol.

A cepa obtida foi confirmada como possuindo mtr inativado pelo fragmento gênico de tamanho de 2100 bp obtido através da PCR utilizando o primer 15 e o primer 18. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ300 (Trp+ ΔpheAΔtrpRΔmtr)".

Exemplo 5: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene tnaAB inativado

Neste exemplo, o gene tnaAB de E. coli foi inativado através de recombinação homóloga.

A PCR foi realizada através da utilização de pKD3 como um molde com o primer 19 e o primer 20 que compreendem uma ptécnica do gene tnaAB e uma ptécnica da sequência do gene resistente ao cloranfenicol de pKD3 mostrados na Tabela 10, resultando na amplificação de um fragmento gênico de aproximadamente 1100 bp. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 1 minuto (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 10

A E. coli CJ300 transformada com pKD46 através do processo de Datsenko KA e outros foi preparada na forma de uma cepa competente, seguida pela indução utilizando o fragmento gênico de tamanho de 1100 bp obtido através da PCR. As cepas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo cloranfenicol. A cepa foi confirmada como possuindo tnaAB inati- » vado pelo fragmento gênico de tamanho de 1900 bp obtido através da PCR utilizando o primer 21 e o primer 22. A cepa recombinante resultante foi chamada de "CJ400 (Trp+ ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABy'. Tabela 11

Exemplo 6: Construção do vetor pSKH que induz mutação qênica específica Neste exemplo, foi construído o vetor que é capaz de induzir mutação gênica específica no cromossomo de E. coli.

Para fazer isso, o gene sacB de Bacillus subtilis foi inserido no 10 vetor pKCG119 utilizado na Publicação de Patente Coreana Ns 10-2006- 0079297. Para selecionar as cepas mutadas sem a inserção de um gene estranho, foi utilizado o gene sacB. O gene sacB (1,9 kb) foi amplificado através da PCR utilizando o cromossomo de Bacillus subtilis do tipo selvagem (Marburg 168) como um 15 molde com os primers 23 e 24 (Molecular organization of intrinsic restriction and modification genes BsuM of Bacillus subtilis Marburg, Ohshima H, Mat- suoka S, Asai K, Sadaie Y. J Bacteriol. 2002 Jan;184(2):381-9). A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento 20 a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 2 minutos (30 ciclos). Tabela 12 O produto da PCR foi digerido com Xbal e BamHI, que seguiu 25 para um gel de agarose a 0,8%. Como um resultado, foi obtido um fragmento de DNA de tamanho de 1,9 kb. O fragmento obtido foi ligado no vetor pKCG119 digerido com Xba I e BamH (NEB Ligation kit). A E. co//Top 10 foi transformada com a mistura de ligação. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo canamicina (50 mg/L) e cultivadas 30 a 37°C durante a noite.

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 ml_ de meio líquido LB contendo canamicina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização de plasmid miniprep kit. A sequência de nucleotídeos do sacB inserido foi identificada através do se- quenciamento do DNA. O vetor construído foi chamado de "pSKH".

Exemplo 7: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene aroG mutado

Neste exemplo, o gene aroG de E. coli foi mutado. O DNA cromossômico foi extraído de uma cepa que produz triptofano através da utilização do Genomic-tip system (QIAGEN). A PCR foi realizada utilizando o DNA cromossômico como um molde com os primers 25 e 26 mostrados na Tabela 13, resultando na amplificação do fragmento de DNA de 660 bp contendo o ORF do gene aroG. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 13

O fragmento do gene aroG obtido através da PCR anterior foi ligado ao vetor pCR2.1-TOPO através da utilização do TA cloning kit (Invi- trogen). A E. coli Top 10 foi transformada com a mistura de ligação. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo ampici- lina (100 mg/L) e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "TOPO2.1 -aroG". colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit (QIAGEN) e o tamanho do TOPQ2.1-aroG foi medido. Para gerar a forma mutante do gene aroG, foi realizada a mutação direcionada ao sítio (Quik- « Change Site-Directed Mutagenesis Kit, STRAT AGENE) utilizando o vetor TOPO2.1 -aroG como um molde com os primers 27 e 28 mostrados na Tabela 14. As condições de reação eram como a seguir; desnaturação a 95°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 1 minuto e alongamento a 5 68°C durante 6 min e 30 segundos (18 ciclos). As células de E. coli TOP10 foram transformadas com 12 μL de cada solução de reação, que foram es-palhados sobre meio sólido LB contendo ampicilina, seguido pela cultura a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "TOPO2.1 -maroG". Tabela 14

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit. A sequência de nucleotídeos do gene aroG mutado foi identificada através 15 do sequenciamento do DNA. O TOPO2.1 -maroG contendo o gene aroG mutado foi digerido com BamHI e Sail, que seguiu para um gel de agarose a 0,8%. Como um resultado, foi obtido um fragmento de DNA de tamanho de 660 bp. O fragmento obtido foi ligado ao vetor pSKH digerido com BamH I e Sal I. As células E. coli Top 10 foram transformadas com a mistura de liga- ção. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo canamicina e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "pSKH-maroG".

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo canamicina e cultivada durante a noite. O 25 DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit (QIAGEN) e o tamanho do pSKH-maroG foi medido. A origem de replicação do plasmídeo foi eliminada através da digestão com Nhel e então ligado. O fragmento de DNA foi introduzido em CJ400 que foi preparada como uma célula competente. A CJ400 foi espalhada sobre meio sólido LB contendo canamicina a 37°C durante a noite. A PCR foi realizada utilizando a colônia gerada com os primers 25 e 26 e como um resultado uma banda de 4,4 kb foi confirmada. Partindo do resultado, foi confirmado que o vetor pSKH contendo o gene aroG mutado foi introduzido de forma bem sucedida no DNA cromossômico. Para eliminar o vetor exceto a ptécnica do gene aroG mutado do DNA cromossômico, a cepa foi cultivada em meio LB+10% de sacarose durante 16 horas e espalhada sobre uma placa de meio LB. As colônias geradas foram cultivadas sobre meio sólido contendo canamicina e sobre o meio sólido isento de canamicina. Foram selecionadas as colônias que cresciam no meio isento de antibiótico, seguido pelo sequenciamento do DNA. Então, a cepa mutante com a substituição do aminoácido 150 do gene aroG por leucina foi finalmente selecionada. A cepa mutante foi chamada de "CJ500 (Trp+ ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB aroG m)".

Exemplo 8: Construção de uma cepa recombinante que produz L-triptofano com o gene trpE mutado

Neste exemplo, o gene trpE de E. coli foi mutado. O DNA cromossômico foi extraído de uma cepa que produz triptofano através da utilização do Genomic-tip system (QIAGEN). A PCR foi realizada utilizando o DNA cromossômico como um molde com os primers 29 e 30 mostrados na Tabela 15, resultando na amplificação do fragmento de DNA de 600 bp contendo uma ptécnica do ORF do gene trpE. A solução de reação utilizada neste exemplo era o PCR HL premix kit. E a PCR foi realizada como a seguir; desnaturação a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 30 segundos, alongamento a 72°C durante 30 segundos (30 ciclos). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%. A banda-alvo foi obtida por eluição. Tabela 15

O fragmento do gene trpE obtido através da PCR anterior foi ligado ao vetor pCR2.1-TOPO através da utilização do TA cloning kit (Invitro- gen). A E. coli Top 10 foi transformada com a mistura de ligação. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo ampicilina e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "TO- < P02.1-trpE”.

A coIonia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit 5 (QIAGEN) e o tamanho do TOPO2.1-trpE foi medido. Para gerar a forma mutante do gene trpE, foi realizada a mutação direcionada ao sítio utilizando o vetor TOPO2.1-trpE como um molde com os primers 31 e 32 mostrados na Tabela 16. As condições de reação eram como a seguir; desnaturação a 95°C durante 30 segundos, anelamento a 55°C durante 1 minuto e alonga- mento a 68°C durante 6 minutos e 30 segundos (18 ciclos). As células E. coli TOP10 foram transformadas com 12 μL de cada solução de reação, que foram espalhados sobre meio sólido LB contendo ampicilina, seguido pela cultura a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "TOPO2.1- mtrpE'. Tabela 16

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo ampicilina e cultivada durante a noite. O DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit.

A sequência de nucleotídeos do trpE mutado foi identificada através do se- quenciamento do DNA. O plasmídeo TOPO2.1-mtrpE contendo o gene trpE mutado foi digerido com BamHI e Sail, que seguiu para um gel de agarose a 0,8%. Como um resultado, foi obtido um fragmento de DNA de tamanho de 660 bp. O fragmento obtido foi ligado ao vetor pSKH digerido com BamH I e Sal l. As células E. coli Top 10 foram transformadas com a mistura de ligação. As células transformadas foram espalhadas sobre meio sólido LB contendo canamicina e cultivadas a 37°C durante a noite. O vetor construído foi chamado de "pSKH-mtrpE”.

A colônia foi obtida com um palito de dente, que foi inoculada em 3 mL de meio líquido LB contendo canamicina e cultivada durante a noite. O

DNA plasmideal foi recuperado através da utilização do plasmid miniprep kit (QIAGEN) e o tamanho do pSKH-mtrpE foi medido. A origem de replicação do plasmideo foi eliminada através da digestão com Nhel e então ligado. O fragmento de DNA foi introduzido em CJ500, que foi espalhada sobre meio sólido LB contendo canamicina a 37°C durante a noite. A PCR foi realizada utilizando a colônia gerada com os primers 29 e 30 e como um resultado foi confirmada uma banda de 4,4 kb. Partindo do resultado, foi confirmado que o vetor pSKH contendo o gene trpE mutado foi introduzido de forma bem sucedida no DNA cromossômico. Para eliminar o vetor exceto a ptécnica do gene trpE mutado do DNA cromossômico, a cepa foi cultivada em meio LB+10% de sacarose durante 16 horas, seguido pela distribuição em placa de meio LB. As colônias geradas foram cultivadas sobre meio sólido contendo canamicina e sobre o meio sólido isento de canamicina. Foram selecionadas as colônias que cresciam no meio isento de antibiótico, seguido pelo sequenciamento do DNA. Então, a cepa mutante com a substituição do 212 aminoácido do gene trpE por alanina foi finalmente selecionada. A cepa mu-tante foi chamada de "CJ600 (Trp+ ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB aroG m trpE m)" e depositada no KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) da KFCC (Korean Federation of Culture Collection), a International Depository Authority localizada em 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seoul, Coreia, em 8 de dezembro de 2006 (N2 de Acesso: KCCM 10812P).

Exemplo 9: Comparação da produtividade de triptofano do micro-orqanismo construído através de recombinação genética

Neste exemplo, as colônias das cepas recombinantes construídas no Exemplo 1 - Exemplo 6, CJ001, CJ100, CJ200, CJ300, CJ400, CJ500 e CJ600 (KCCM 10812P) foram espalhadas sobre meio sólido LB cada uma através de uma alça de platina e cultivadas durante a noite. As cepas em crescimento foram inoculadas em meio para titulação em frascos possuindo a composição que é mostrada na Tabela 17 cada uma através de uma alça de platina. Após a inoculação, as cepas foram cultivadas a 37°C, 200 rpm durante 48 horas. Os níveis de triptofano e L-fenilalanina obtidos partindo da cultura anterior e os níveis de triptofano e L-fenilalanina obtidos partindo da cultura de E. coli KFCC 10066 mutante que produz L-fenilalanina < foram comparados. A densidade óptica (DO) e os níveis de L-triptofano e L- fenilalanina foram representados através do valor médio obtido dos três fras-cos. Tabela 17 Como um resultado, como mostrado na Tabela 18, o L-triptofano não era produzido na E. coli KFCC 10066 mutante que produz L-fenilalanina, enquanto 6,5 g/L de L-triptofano eram produzidos na E. coli CJ600 (KCCM 10812P) desenvolvida na presente invenção. Tabela 18

Aplicabilidade Industrial

Os presentes inventores desenvolveram a cepa de E. coli re-combinante CJ600 que produz triptofano a alta concentração partindo da E. coli que produz L-fenilalanina sem a produção de L-fenilalanina durante um curto espaço de tempo através da liberação da auxotrofia em relação ao trip-tofano e da mutação ou da inativação de genes. Particularmente, a cepa re-combinante de E. coli CJ600 (KCCM 10812P) foi preparada partindo da E. coli KFCC 10066 mutante que possui produtividade de L-fenilalanina através 5 da liberação da auxotrofia em relação ao triptofano, da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB e da mutação dos genes aroG e trpE no cromossomo. O L-triptofano foi produzido a alta concentração através da cultura da cepa recombinante anterior, indicando que a produtividade de L-triptofano era maior. Os peritos na técnica considerarão que os conceitos e as moda lidades específicas na descrição anterior podem ser facilmente utilizados como uma base para a modificação ou para o planejamento de outras moda-lidades para a realização das mesmas finalidades da presente invenção. Os peritos na técnica também considerarão que tais modalidades equivalentes não divergem do espírito e do âmbito da invenção como apresentado nas reivindicações em anexo.

Claims

1. Cepa de E. coli recombinante que possui produtividade de L- triptofano, caracterizada pelo fato de que é a cepa CJ600 (KCCM 10812P), em que a referida cepa é preparada a partir da E. coli mutante (KFCC 5 10066), que possui produtividade de L-fenilalanina, através da liberação da auxotrofia em relação ao triptofano, da inativação dos genes pheA, trpR, mtr e tnaAB e da mutação dos genes aroG e trpE no cromossomo.

2. Processo para a produção de L-triptofano, caracterizado pelo fato de que é através da utilização da CJ600 (KCCM 10812P).