CN101478980B - 用于治疗神经性、神经变性和情绪障碍的水华束丝藻制剂、提取物及其纯化的组分 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于预防或治疗神经性、神经变性和情绪病症或疾病的微藻水华束丝藻(Aquae Ralfs ex Born.&Flah.Var.flos aquae)(AFA Klamath)的提取物及其纯化的组分。

Description

用于治疗神经性、神经变性和情绪障碍的水华束丝藻制剂、提取物及其纯化的组分
本申请涉及微藻类水华束丝藻(Aquae Ralfs ex Born.& Flah.Var.flosaquae)(AFA Klamath)。更准确地，本发明提供了用于神经学的、神经变性的和情绪障碍或疾病的预防或治疗的AFA Klamath提取物及其纯化组分。
发明背景
苯乙胺(PEA)是通过在黑质纹状体系统的多巴胺能神经元中苯丙氨酸脱羧合成的内源性胺，并可作为大脑中儿茶酚胺神经传递的神经调节剂(1)。PEA最重要的作用是促进儿茶酚胺类的神经传递。已知PEA刺激乙酰胆碱和多巴胺的释放(2)。此外，PEA增加去甲肾上腺素神经传递(NE)(6)和甚至5-羟色胺的神经传递。
最近还揭示，PEA还与它特异的神经元受体一起作为自发的神经递质；并且它还作为真正的神经调节剂，在需要时还能抑制神经传递。(8)
由此带来一系列效应：刺激注意力和记忆；具有显著抗抑郁活性的情绪改善；促进移情和由此的社交，包括感情的和性的行为；抑制饥饿；减少对物质滥用和药物依赖的需求。
PEA和感情性情绪之间的联系已经通过研究被确证，在抑郁个体中发现按PEA测量的或通过在血浆或尿中PEA的代谢产物PAA(苯乙酸)测量的PEA水平显著低下。(9)
在帕金森患者中可见通过血浆直接测量的PEA水平显著低下(12)。在这些患者中神经传递(尤其是多巴胺能)的进行性的减少与黑质多巴胺能神经元进行性的退化有关。
在帕金森患者中PEA水平的降低伴随有MAO-B水平的平行增加，因此用于帕金森患者的药物是MAO-B抑制剂，例如司来吉兰。(14)此外，一旦摄入的PEA能容易地通过血-脑屏障，即使是低剂量也会刺激多巴胺从黑质纹状体组织中释放。这是一个重要的区别特征，由于目前使用的药物司来吉兰抑制MAO-B和多巴胺摄取的同时，对其从黑质纹状体组织中的释放没有任何作用，因此它无助于产生更多的多巴胺，这一点在疾病诸如帕金森中是严重的限制，在该病中恰恰是多巴胺的产生受到了严重的危害。
阿尔茨海默病涉及多巴胺产生和重摄取机制的退化和纹状体区域神经元的进行性破坏，时间过长会带来多巴胺能神经元的低数量和因此多巴胺传递的低水平。(15)
尽管关于ADHD(注意缺陷多动症)是神经变性疾病这一事实没有明确的资料，一些研究已经试图证明神经元的破坏是引起孩子和成年人ADHD的主要原因。(19)
最重要的是有证据证明，患有ADHD和学习无能的儿童的PEA水平显著低下(21)，并且因此在注意力(多巴胺)和镇静状态(血清素)的神经调节作用中有减少。这就是为什么选择用于ADHD的药物是苯哌啶醋酸甲酯，一种PEA的合成衍生物，其也是通过刺激产生较多的PEA起作用(22)，并且因此产生更多的多巴胺和去甲肾上腺素，两个直接涉及到ADHD的病因的神经递质。
众所周知使用苯异丙胺控制饥饿并从而控制体重。由于它们的副作用，它们在这方面的使用一直是有争议的，所述副作用在容许量使用时也会产生，过久使用易于变得潜在的非常严重。这通过当前用于饥饿和体重控制的主要药物的事实而被证实，所述药物是苯异丙胺类多巴胺能抗抑郁药，例如文拉法辛和安非他酮。这些分子，如所有的苯异丙胺，是PEA的合成衍生物。只要其通过MAO-B酶的降解被抑制，后者作为强效的食欲抑制药。
单胺氧化酶(MAO)A和B催化CNS中和外周组织中作用于神经的和作用于血管的胺降解。MAO-B特别地与多巴胺能的传递直接和间接相关，它涉及多巴胺原发的神经性障碍，诸如抑郁症和情绪障碍、帕金森和阿尔茨海默病。由于该原因，MAO-B抑制剂被用于此类神经性障碍的治疗。(26)
发明内容
本发明基于经鉴别的、微藻类水华束丝藻(Aquae Ralfs ex Born.& Flah.Var.flos aquae)(AFA Klamath)单独或组合的物质，在多种神经性疾病、病症、机能障碍或障碍，包括神经退化性疾病诸如阿尔茨海默病和帕金森病、多发硬化症、机能亢进和注意缺陷障多动症(ADHD)、孤独症、抑郁症、记忆缺乏和情绪障碍中产生有益的效果。特别地，已经发现AFA Klamath微藻除含有以多巴胺能和去甲肾上腺素能活性为特征的神经调节物质苯乙胺外，还含有特殊的分子，它们被令人惊讶地证明是单胺氧化酶B(MAO-B)非常有效的抑制剂，即a)特定的AFA-植物色素；b)AFA-藻胆蛋白复合物，含有通过C-藻蓝蛋白(C-PC)和藻红青蛋白(PEC，包括其色基phycoviolobilin或PVB)形成的藻胆蛋白体(″AFA-藻蓝蛋白″)；C)霉孢菌素样氨基酸或MAA。这一发现非常重要，因为藻中含有PEA，除非通过MAO-B抑制剂得到保护，否则通过MAO-B酶消化会很快被破坏。
作为MAO-B选择性抑制剂的这些相同分子，还具有强大的神经保护剂的作用，因此显著增强提取物促进神经性健康的能力。
因此本发明提供用于预防、控制或治疗上述神经性疾病、病症、机能障碍或障碍的方法，通过给需要其的患者施用AFA Klamath制剂，尤其是富集了这样的活性成分的提取物，或选自下述的分离和纯化组分：a)AFA植物色素，b)c-藻蓝蛋白/藻红青蛋白(phycoerithrocyanins)复合物，如在AFA中或任何其它微藻中存在的那样；c)霉孢菌素样氨基酸紫菜聚糖和shinorine，如在AFA中存在的或来源于任何其它藻的那样；d)或其混合物。
优选地根据本发明的AFA Klamath提取物通过下述步骤制备：
a)冷冻新鲜采集的AFA藻并解冻，或如果初始材料是干燥的AFA粉末，超声处理水稀释的AFA粉末以破裂细胞；
b)将步骤a)的产品离心以从沉淀(含有大多数的细胞壁碎片)中分离上清液(含有大多数的细胞质部分)；
c)收集含有水溶性组分的上清液。
所得的产物是富集PEA和其它协同分子诸如AFA植物色素、AFA-藻蓝蛋白、和MAA。例如，而Klamath微藻PEA的天然含量为2至4mg/gr，该基本提取物将这一浓度提高至9-11mg/gr的水平(HPLC分析)。
进一步纯化该提取物是可能的，将其通过超滤系统，优选通过截留分子量30.000道尔顿的膜。该超滤保留物(提取物A)含有作为主要活性组分的AFA藻蓝蛋白(摩尔重量＝121.000)和AFA-植物色素(摩尔重量480.000)。有趣的是，尽管MAA的分子量远小于要截留的分子量，该保留物还增加了MAA的浓度。
通过步骤a)至c)、即不经过超滤获得的基本提取物通常是优选的，这是因为其含有最合适量的PEA、AFA-植物色素、AFA-PC和MAA。此外，该基本提取物还含有例如叶绿素和胡萝卜素的物质，尽管比例降低了，仍有助于它的抗氧化和抗炎性质。
或者，AFA Klamath的活性组份，即复合的c-藻蓝蛋白/藻红青蛋白(C-PC/PEC)、AFA植物色素和MAA可以按以下进一步的描述被分离和纯化，并在根据本发明的方法中使用。
在优选的实施方案中，AFA Klamath C-PC/PEC复合物、AFA的植物色素和霉孢菌素样氨基酸用作组合的制剂同时或分开给需要其的患者施用，在另一优选的实施方案中，这类的组合制剂含有苯乙胺作为附加的活性成分。在霉孢菌素样氨基酸中，特别优选shinorine和紫菜聚糖-334，因为它们在AFA Klamath微藻中含量相对较高。
所观察到的单胺氧化酶-B的抑制作用与增加多巴胺能传递和将PEA代谢最小化特别相关。重要的是，植物色素和AFA-藻蓝蛋白两者以可逆和混合的方式抑制MAO-B，然而通过MAA的MAO-B抑制是竞争的和可逆的；因此，三种分子均确保在生理条件下的高度有效性且无副作用。
另一方面，本发明涉及营养或药物组合物，其含有AFA Klamath制品、其提取物或分离的组分，其优先选自在AFA中存在的或来源于任何其它微藻的C-PC/PEC复合物或分离的C-PC和PEC单一组分；AFA植物色素；存在于AFA藻中或来源于任何其它藻的霉孢菌素样氨基酸紫菜聚糖和shinorine；或其混合物；和任选加入的苯乙胺。在优选的实施方案中，该营养组合物以片剂、胶囊、饮料的形式作为膳食补充剂；在进一步优选的实施方案中，该药物组合物为片剂、胶囊、小药囊、糖浆、栓剂、小瓶和软膏剂的形式，且可用于预防或治疗上述神经性或神经变性疾病或病症。根据本发明的AFA Klamath液体提取物可按此使用或通过诸如冷冻干燥、喷雾干燥或其类似方法干燥后使用。该分离的活性组分能使用本领域技术人员公知的技术和下述方法配制。
活性组分的剂量取决于组合物是否作为营养添加剂或作为药物制剂的预期用途。每个组分的有效量通常被包含于下述范围之内：PEA＝0.1-100mg，优选5-30mg；植物色素＝0.1-1000mg，优选0.8-10mg；MAA＝0.1-1000mg，优选10-100；藻蓝蛋白＝1-2500mg，优选50-1000mg。
发明详述
Klamath藻特有的植物色素类型″AFA-植物色素″的鉴定
植物色素是光感受器、植物用于探测光的色素并且它对可见光谱区域的红光和远红光敏感。它们在植物中具有多种不同的功能，包括控制开花(通过昼夜节律)、发芽和叶绿素的合成。后者与AFA藻特别地相关，因为在AFA中这一特定类型的植物色素的存在可通过它缺乏其它的藻胆蛋白(通常被其它的蓝细菌用来在光合作用过程中补足C-藻蓝蛋白(即别藻蓝蛋白))而得到解释。而Klamath藻中别藻蓝蛋白的位置被藻红青蛋白或PEC取代(如下所见)，有可能单独的PEC是不够的，尤其鉴于Klamath藻生活于非热带环境，需要高的光线收集效率，因此AFA藻似乎用植物色素来整合它们的较高的需求。
所述的AFA植物色素具有独特的结构，在此第一次被描述。多年以来，多种植物色素在植物中被发现，它们不仅具有不同的植物色素基因(例如在大米内为3和在玉米内为6)，但多数情况它们具有显著不同的蛋白质组分和结构。它们成为藻色素是因为它们都使用称为植物后胆色素的作为吸收光线的色基的相同胆蛋白，该色基与藻蓝蛋白的藻蓝素色基类似，以由4个吡咯环(四吡咯)的开放链组成的单个后胆色素分子为特征。更具体地，在它的Pr常态中，这个胆蛋白在最大650-670nM吸收光，而当被红光活化时，它转化成具有730nM的吸收最大值的Pfr。
被发现的第一个蓝细菌光敏色素(集胞藻的)，显示具有与植物色素相比弱的结构相似性。然而，集胞藻的胆蛋白在它为红色/远红色可逆色素蛋白的情况下而被通常认为是植物色素。(48)
AFA植物色素的纯化和鉴定
AFA-植物色素具有作为色基的胆蛋白，色基吸收红色/远红色光谱中的光线。为了确定它的结构和活性，我们通过下述试验方案纯化该植物色素：
-在10ml的pH 7.0的磷酸二氢钾缓冲液中混悬1g提取物
-用一半体积涡旋2次1分钟
-用2％Triton X 100培养细胞35′
-以28000rpm离心16-18h
-在蔗糖密度步骤梯度上收集上清液
-用甩平式转头转头在150000g离心梯度12h
-在-20℃储存
该植物色素对应于正橘黄色溶解产物带，在接近1M蔗糖处可见，而藻胆体为大约0.75M。两个带之间的关系给出了藻中存在的植物色素分子量的可靠的证明，它是AFA-PC三聚物的4倍，后者是121Kd，我们能初步确立AFA-植物色素的MW大约480Kd(图22)。
测定它的光吸收性质，该植物色素显示在672nM和694nM有两个光吸收峰，其分别对应在平衡状态中的Pr(红光吸收)和Pfr(远红光吸收)形式(附图23)。
对于AFA中含有的植物色素量，我们首次评价得出下述初步结果：2mg/gr(或0.2％DW)。对于提取物，该浓度增加至在基本提取物中约为0.5％，且在提取物B中接近1％。这些是低浓度的，而该分子抗氧化/抗炎效能非常强以至于即使非常小的量却能产生非常相关的作用。
抗氧化活性
该纯化的AFA-植物色素显示为一种非常有效的抗氧化剂。事实上，按绝对价值计算，它是到目前为止在Klamath藻中发现的最有效的分子。用100μM的氧化剂CuCl2培育人类血浆样本2小时产生增加水平的丙二醛(MDA)，其为脂质过氧化反应的后期副产品，通过与硫代巴比土酸反应后用分光光度计在535nm测量(TBA试验)。当血浆与100μM的CuCl2并伴有增加含量的从AFA藻中提取的AFA-植物色素(2-16nM)在37℃培育2小时时，可观察到MDA水平非常强的剂量依赖性减少(附图24)。事实上，在仅16nM的AFA植物色素下，获得具有接近对照的MDA水平的脂过氧化的几乎完全的抑制。显著地，3.6nM的IC50低于由PCB获得的45倍。基础提取物的抗氧化和神经保护作用主要由所述的植物色素引起，其比AFA-PC的那些更强。
MAA的提取、纯化和定量
我们测定Klamath湖的蓝藻类水华束丝藻(通常称之为Klamath藻)中MAA的存在。据我们所知，仅一份最近的报道认为MAA存在于任何种类的丝囊藻属中(47)；然而，该报道仅鉴定了作为MAA存在的紫菜聚糖，而我们的研究显示存在两种MAA，紫菜聚糖和shinorine。另一方面，有关藻的所有相关文献，目前为止被报道的多数蓝细菌含有作为它们的初级MAA的shinorine，而我们发现在水华束丝藻中除了shinorine，紫菜聚糖-334作为初级MAA极少出现。
紫菜聚糖-334
Figure G2007800234854D00071
Shinorine
Figure G2007800234854D00072
如先前报道的那样提取MAA。(29)简而言之，AFA粉末20mg或水提取物20mg在2ml的20％(v/v)甲醇(HPLC级)水溶液中水浴45℃提取2.5小时，之后离心(5000g；GS-15R离心机，Beckman，Palo Alto，USA)，将上清液蒸发至干并重新溶于2ml的100％甲醇，涡旋2-3min并在10000g离心10min。蒸发上清液并将该提取物重新溶于相同体积的0.2％的用于HPLC分析的醋酸或重新溶于200μl用于抗氧化剂性质评价的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。将样品通过0.2μm孔径大小的注射器滤器(VWR International，Milan，Italy)进行过滤，然后用于HPLC分析或抗氧化剂性质试验(见下文)。
Klamath藻的MAA具有334nm的最大吸收。根据文献(30)，使用装有AlltimaC18柱和保护柱(4.6x250mm i.d.，5μm填料，Alltech，Milan，Italy)的HPLC系统(Jasco Corporation，Tokyo，Japan)进一步纯化MAA。检测波长为330nm；流动相为0.2％醋酸，流速每分钟1.0ml。通过与标准品例如Porphyra和Pterocladiasp.(其主要含有紫菜聚糖-334、shinorine和palythine，由Dr Manfred Klisch，Friedrich-Alexander-Universitat，Erlangen，德国友情赞助)比较吸收光谱和保留时间鉴别MAA。样品的吸收光谱用单波分光光度计(DU 640，Beckman，Palo Alto，USA)在200nm至800nm之间测定。该初始谱图被传给电脑以对MAA的峰分析进行数学处理。
MAA从前述AFA样品和水提取物中部分纯化。用20％甲醇于45℃提取样品2小时导致在334nm有突起的峰(MAA)，尽管少量的光合色素(例如在620nm的藻蓝蛋白)通过该方法也被提取(见附图1，虚线)。MAA样品进一步用100％甲醇处理，以移除蛋白质和盐，并最终用0.2醋酸移除非极性光合色素。所得的部分纯化的MAA在334nm具有最大吸收(附图1，实线)。
通过HPLC进一步分析和纯化MAA，以发现是否在334nm有吸收的该化合物是MAA单体或含有不止一种MAA的混合物。该样品的色谱图(附图2)在保留时间4.2(峰1)和7.6min显示了两种MAA的存在，其被分别鉴定为shinorine和紫菜聚糖-334。紫菜聚糖-334似乎是AFA中主要的MAA，因为shinorine仅以少量存在(峰面积比1∶15)。
纯化的MAA的UV光谱证实其最大吸收在334nm(附图3)。
考虑到shinorine和紫菜聚糖-334在334nm的摩尔消光系数分别为44700和42300M-1cm-1，我们计算：
a)对于AFA藻，每克有0.49mgDW的shinorine和7.09mgDW的紫菜聚糖-334的浓度；总MAA的含量相当于0.76％的藻DW；
b)对于基本提取物，MAA的浓度为17-21mg(为1.7-2.1％DW)。
这些是重要的数据，如总AFA含有相对较高水平的MAA(0.76％DW)，几乎接近UV照射下发现的最大浓度，即0.84％。(31)我们还发现该提取物与整个藻相比具有更高的浓度，达到的水平比最大的潜在浓度还高许多。
MAA(shinorine和紫菜聚糖-334)是结构简单的分子，分子量为300。这就能让这些水溶性分子很容易通过血-脑屏障，确保其在大多数需要的区域、脑表达它们的MAO-B抑制潜能。
藻蓝蛋白
该提取物中存在的藻蓝蛋白浓度为8-10％(对于定量，见下)。藻蓝蛋白是所有蓝细菌或蓝-绿藻的典型蓝色素，尽管对于每种具体的微藻具有独特的特性。(32)对于藻蓝蛋白的功能和治疗特性，目前研究多数集中于螺旋藻属微藻中的那些。从螺旋藻属中纯化的藻蓝蛋白在不同的生理系统例如肝(37)、呼吸系统(38)和脑(39、40)中显示具有抗氧化性(33)和抗炎性(34，35，36)。考虑到它们的实质相似性，来自螺旋藻属的纯化的PC的这类的性质一般还可归因于其它藻的的藻蓝蛋白。虽然如此，源自不同微藻的不同藻蓝蛋白中存在种属特异性差别，其在上述功能和治疗特性的解释中可导致不同的效能。
Klamath藻的藻胆体的结构确定和具体特性
一般地所，在完整的蓝藻细胞中藻蓝蛋白(PC)存在于藻胆体功能形式(αβ)6中(41)。细胞破碎之后，根据有机体分析，该蛋白能在不同的聚集状态(单体、二聚物、三聚物、六聚物)中被发现。就Klamath藻而言，提取物及其提取物的纯化物含有的PC电泳分析，显示该蛋白多数存在于它的三聚体形式中(αβ)3，总分子量为121000。一个αβ单体分子量接近40000(18500亚单位α+21900亚单位β)。从螺旋藻中纯化FC的多数研究告诉我们，螺旋藻中发现的该蛋白不是单体形式αβ。而是其分子量约为37500。因此相对于从AFA中纯化的PC，显示了不同的聚集状态。
AFA的藻胆体的色谱分析也已显示，正如在其它种蓝藻中，该PC的α亚单位结合一个辅基，而该β亚单位结合两个。该辅基或色基被称为藻蓝素(PCB)且是该蛋白的蓝色和它的抗氧化作用的原因(42)。
AFA和螺旋藻属之间基本的不同之处在于藻胆体的不同结构。相对于螺旋藻属，AFA Klamath的藻胆体不含有别藻蓝蛋白色素，但仅有结合于结构组分的c-藻蓝蛋白色素，其在螺旋藻属中是没有的，即藻红青蛋白(PEC)。FEC为光合色素，至今仅在有限数量的蓝藻中被鉴定出(43)。PEC具有与FC非常相似的化学结构，由联合为单体和三聚物的两个亚单位α和β的组成。然而，每个PC单体结合PCB的3个分子，而PEC具有将PCB两个分子和亚单位β结合和1分子的phycoviolobilin(PVB)与α亚单位结合的这一独一无二的特性，这是色素呈紫色的原因。
这绝对是第一次将Klamath藻的藻胆体确定为是通过c-藻蓝蛋白和藻红青蛋白结合特定构成的，且AFA Klamath藻胆体这一不同的定性结构增加了将AFA与螺旋藻相区别的进一步的决定性因素。
附图4通过比较AFA与其它那些熟知的蓝细菌、集胞藻PCC 6803的菌体裂解组分，证实了已述内容。在蓝藻中，能看到蓝色带代表该藻胆体，但在AFA藻中该藻胆体表现为低分子量，证实与通常微藻如螺旋藻不同，AFA中藻胆体仅以藻蓝蛋白存在，而不是别藻蓝蛋白。此外，该附图显示在AFA中还存在一个淡紫色带(箭头所示)，其为藻红青蛋白所特有的，这证明在Klamath藻的藻胆体中它们的存在。
为加深定义，每个蓝色带通过联有质谱仪的HPLC(RP-HPLC-ESI-MS)进行进一步分析。由于不同的保留时间，藻胆体的蛋白被分开并根据分子量鉴别。获得的结果如下表所示。首先我们看到在集胞藻中(表1)，藻蓝蛋白(cpcA在28.2min和cpcB在28.9min)和别藻蓝蛋白(apcA在30.7min和apcB在31.2min)都存在，而在AFA中仅有藻蓝蛋白(cpcA在28.8min和cpcB在30.0min)存在。其次，AFA中蛋白经鉴定分子量为19469，而在集胞藻中不存在，其对应于连有两个后胆色素的藻红青蛋白的β亚单位(pecB在25.0min)。
表1：存在于集胞藻藻胆体中的蛋白质
  保留时间(min)   实测分子量   预期分子量     蛋白质[同源的有机体] NCBI访问号
  14.5   9322   9322     cpcD gi|16329820
  22.6   3250532388   3252030797     CpcCcpcC gi|16329821gi|16329822
  24.6   28770   27392     cpcG gi|16329710
  24.8   28885   28522     cpcG gi|16332194
  28.2   18173   17586     cpcA(藻蓝蛋白α亚单位) gi|2493297
  28.9   19313   18126     cpcB(藻蓝蛋白β亚单位) gi|2493300
    30.7   17866   17280   apcA(别藻蓝蛋白α亚单位)   gi|266765
    31.2   17816   17215   apcB(别藻蓝蛋白β亚单位)   gi|266766
表2：存在于AFA Klamath藻藻胆体中的蛋白质
保留时间(分钟) 实测分子量 预期分子量 蛋白质[同源的有机体] NCBI 访问号
15.2 9031 89258895 假拟蛋白Avar03000795[多变鱼腥藻ATCC 29413]cpcD[念珠藻 PCC7120] gi|45510540gi|131740
25.0 1946919308 1828418370 pecB：藻红青蛋白β链[念珠藻 PCC 7120]假拟蛋白Avar03000787(pecB)[多变鱼腥藻ATCC 29413] gi|548504gi|45510532
26.4 3104430124 3207832219312953130429333 cpcC[念珠藻PCC 7120]假拟蛋白Avar03000794(杆状连接基Mw32000)[多变鱼腥藻ATCC 29413]pecC[念珠藻PCC 7120]假拟蛋白Avar03000789(pecC)[多变鱼腥藻ATCC 29413]假拟蛋白Avar03000801(cpcG4)[多变鱼腥藻ATCC 29413] gi|20141679gi|45510539gi|464511gi|45510534gi|46135436
26.8 26119 28637 假拟蛋白Avar03000799(cpcG2)[多变鱼腥藻ATCC 29413] gi|45510544
27.8 10994 10986 fdxH2：植物性铁氧化还原蛋白[多变鱼腥藻] gi|1169673
28.8 17714 17457 cpcA[念珠藻PCC 7120] gi|9957319
30.0 19222 18332 cpcB[念珠藻PCC 7120] gi|38894
这一独特的结构是解释整个AFA-PC相对于它的PCB具有更强的抗氧化和抗炎作用的重要因素。在其产生强神经保护作用的范围内，抗氧化和抗炎特性变得与这一内容相关；关于神经保护整个PC较它的PCB还更为强大，其清楚表明在藻胆体中除了PCB的其它活性组分，即带有特殊的PVB色基的PEC很有可能是AFA-PC中具有最有活性的健康改善要素物质。通过观察纯化得到的提取物的光谱证明该纯化的AFA-PC事实上不仅含有带有PCB色基的C-PC，还有PEC和它的PVB色基(附图5)。事实上，C-PC的最大吸收为620nm，其在附图5谱图中表现为峰的最高点。但是PEC的最大吸收已知α-亚单位(phycoviolobilin或PVB)为566nm和两个β-亚单位的PCB分别为593nm和639nm。的确存在于钟形峰的这三个值构成PC纯化物的光谱图。鉴于在AFA藻中C-PC和PEC之间的强连接很难断开，这证明除了C-PC，PEC也是纯化的PC提取物必不可少的一部分。反过来说明从AFA中得到的PC与从其它蓝细菌，包括从研究最多的螺旋藻中得到的PC，在结构和功能上都显著不同；并且这些不同在于仅有一部分是共同的，即C-PC，而不是别的；作为结果，虽然C-PC的性质也可归结为AFA-PC的C-PC组分，但源于AFA的整个PC的性质，在它的C-PC/PEC复合物(包括它的PCB和PVB色基)中，是它(和在其它任何微藻中存在的任何C-PC/PEC复合物)专属的。
纯化方法(附图5)
PC从干燥的AFA提取物中按如下所述纯化：
-混悬500mg的提取物于50ml的100mM的pH7.4的钠磷酸盐缓冲溶液中；
-在4℃、2500rpm离心10′；
-收集上清液并加入固态硫酸铵至50％饱和量；
-在4℃沉淀蛋白质60min并持续搅拌样品；
-在4℃、10,000rpm离心30min；
-弃去澄清无色的上清液并将蓝色沉淀物再混悬于小体积的5mM、pH7.4的钠-磷酸盐缓冲溶液中；
-在4℃对这一同样的缓冲液透析过夜；
-将透析的PC上样于羟基磷灰石柱，用5mM、pH7.4的钠-磷酸盐缓冲溶液平衡；
-用离子浓度逐渐增加(从5至150mM)的pH7.0的钠-磷酸盐缓冲液洗脱该样品；
-收集组分并用分光光度计在620nm和280nm读取吸光率；
-收集Abs620/Abs280＞4(纯化PC的指数)的部分；
-在4℃用饱和度50％的硫酸铵沉淀PC1小时；
-在4℃10,000rpm离心30′；
-弃去上清液并将PC混悬于pH7.4的150mM钠-磷酸盐缓冲溶液中；
-在4℃对这一同样的缓冲液透析；
-将纯化的PC移至烧瓶内并于暗处+4℃或-20℃保存。
藻蓝蛋白的定量
为了测定纯PC的摩尔浓度，我们使用在620nm的摩尔消光系数ε，对于(αβ)3三聚物形式其等于770000M-1cm-1。这意味着1M的PC溶液在620nm具有770000的吸收值。
我们用在620nm的为70|g-1cm-1比消光系数E1％测定PC在提取物中的浓度。这意味着含有1％(即为1g/100ml)的PC溶液在620nm吸收为70。基于这些计算结果，提取物中PC的平均含量等于80-100mg/g DW(8-10％DW)。
PCB色基的纯化(附图6)
·将500mg提取物混悬于50ml蒸馏水中。
·在4℃2500rpm离心10′。
·轻轻倒出深兰色上清液并用1％三氯乙酸沉淀PC。
·搅拌下在暗处于4℃培养1小时。
·在4℃10000rpm离心30′。
·收集含有PC的片状沉淀物并用甲醇洗涤3次。
·将该片状沉淀物再混悬于含有1mg/mlHgCl2的甲醇中。
·在暗处于42℃培养20h以从PC中释放PCB。
·2500rpm离心10′除法蛋白质。
·将含有PCB的上清液中加入β-巯基乙醇(1μl/ml)以沉淀HgCl2。
·在-20℃培养24h。
·在4℃10000rpm离心30′除去白色沉淀。
·在上清液中加入10ml二氯甲烷/丁醇(2∶1，v/v)。
·用20ml蒸馏水洗涤并3000rpm离心10′。
·除去上层，收集含有PCB的下层部分。
·洗涤在15ml水中的PCB三次。
·氮下干燥并储存于-20℃。
通过AFA KLAMATH提取物及其组成的活性物质植物色素、藻蓝蛋白和MAA评价MAO-B的抑制作用
我们使用特殊的底物苄胺(1mM)试验了基本提取物的MAO-B抑制活性。该试验用分光光度计在30℃波长250nm测定，通过由上述步骤a)至c)制备的基本提取物不同浓度的水溶液和脂溶性组分预培养MAO-B(2μg/ml)(初始浓度10mg/ml)。用水再混悬水提取物并离心后收集上清液制备水溶性组分富集的提取物。将提取物再混悬于丙酮中得到脂溶性成分富集的可溶性提取物；然后将上清液干燥，并将该片状沉淀物再混悬于适合MAO-B的剂量的溶剂DMSO中。
如附图7A所示，水溶性组分以剂量依赖性方式抑制MAO-B，而脂溶性组分不抑制该酶。AFA基本提取物水溶性组分是强效的选择性MAO-B抑制剂，IC50为6.9μl。它的MAO-B选择性为4(IC50MAO-B/IC50MAO-A＞4.05)(附图7B)。
附图8的Lineweaver-Burk图显示该抑制与竞争的关系是可逆的和混合性的，伴随Vmax减少和Michaelis-Menten的Km常数的增加。以AFA提取物水溶性部分的浓度对斜率作图求得1μL抑制常数Ki。对照基本提取物的水溶性成分，低Ki值表明对MAO-B酶高亲和力。
提取物的抑制作用是可逆的这一事实，意味着它仿真地实现生理活性却避免了副作用。至于混合竞争，很有可能是由于提取物的混合性，其包含不同功能的分子，一些是竞争性的而一些是非竞争性的。该提取物主要活性成分是这些我们逐一试验作为MAO-B抑制剂的AFA-植物色素(0.5％DW)、藻蓝蛋白(8-10％DW)和MAA或霉孢菌素样氨基酸(1.7-2.1％DW)。
藻蓝蛋白对MAO-B的抑制作用
该试验用分光光度计在30℃波长250nm处测量，用苄胺作为底物，用从AFA中得到的纯化PC的多种浓度(0.5-4μM)预培养MAO-B。如附图9所示，AFA-PC导致MAO-B活性的剂量依赖性减少，IC50为1.44μM。AFA-PC的MAO-B选择性大于3.5(IC50MAO-B/IC50MAO-A＞3.5)。
附图10的Lineweaver-Burk图显示，对于该提取物，抑制作用是可逆的并为混合性(竞争和非竞争)，具有变化的Vmax和Km。
通过将斜率对PC浓度作图我们得到抑制常数Ki值，此处为1.06μM。该抑制常数衡量对酶的抑制剂的亲和力：高的Ki值说明对酶的亲和力低并反之亦然。在该实例中，低Ki值显示AFAPC对MAO-B的高亲和力。
MAA对MAO-B的抑制作用
苄胺底物的MAO-B活性，被评价与从基本提取物中用20％甲醇先前纯化的MAA浓度增加(0.5-8μM)有关。附图11显示MAA对MAO-B抑制的剂量依赖性，IC50为1.98μM。MAA的MAO-B选择性大于2(IC50MAO-B/IC50MAO-A＞2.02)。
Lineweaver-Burk图(附图12)显示该抑制是可逆的和竞争性的，伴随Km增加，但Vmax没有改变。这显示MAA，由于它的化学结构，与底物竞争与酶的活性位点结合。将斜率对MAA的浓度作图(附图13)，我们得到抑制常数Ki值为0.585μM，证明了对酶具有非常高的亲和力。
AFA植物色素对MAO-B的抑制作用
通过分光光度计在30℃波长250nm处测量，用苄胺作为底物，用纯化的AFA植物色素的多种浓度(8.3-66.4nM)预培养MAO-B。如附图15所示，AFA植物色素导致MAO-B活性的剂量依赖性减少，IC50低至20.2nM。
附图16的Lineweaver-Burk图显示，对于该提取物，抑制作用是混合性(竞争性和非竞争性的)可逆的具有可变的Vmax和Km。
将斜率对AFA植物色素浓度作图我们得到抑制常数Ki值，此处为10.48nM。该抑制常数衡量对酶的抑制剂的亲和力：高的Ki值说明对酶的亲和力低并反之亦然。在该实例中，非常低的Ki值显示AFA植物色素对MAO-B具有非常高的亲和力。
MAA的竞争性和可逆的作用使得这些分子对MAO-B的抑制非常强效。事实上，对MAO-B抑制的竞争和可逆特性同时保证了高效、生理学的和没有副作用的活性。在这个意义上，包含于提取物中的MAA，也是由于它们的分子量和由此容易穿过血-脑屏障的能力，而构成了一个决定性的组分，甚至在体内，也以便产生衍生于MAO-B抑制的疗效。
甚至不仅是MAA，植物色素被证实为是至今已知物质中最强大的MAO B抑制剂。对MAO-B酶有非常高的亲和力，且它在纳摩尔剂量的有效抑制，使得该分子不仅本身是完美的治疗剂，并且这一因素似乎为AFA提取物(们)的高度的神经学有效性提供了最重要的贡献。
另外一些关于MAA和植物色素的考虑也适用于藻蓝蛋白的体内行为。我们知道PC在体内对脑产生神经保护作用，因此它们能穿过血-脑屏障。(44)这说明它们也能在体内脑部实现它们对MAO-B的抑制活性。色基的分子量实际上仅700，并不大于MAA的分子量。对于植物色素的色基、结构类似于藻蓝素的植物后胆色素同样如此。
总之，就提取物的部分和它的活性组分、AFA植物色素、AFA-PC和MAA而言，MAO-B的抑制活性是十分相关的，无论是分子还是提取物都具有高活性水平、活性水平相当于或高于药理学物质，并显著优于任何被测试的天然分子，如下表所示(45)：
表3 来自已知合成和天然抑制剂的MAO-B抑制的比较动力学参数(IC50和Ki)。
Figure G2007800234854D00161
Figure G2007800234854D00171
如表所示，仅有藻蓝蛋白和MAA的IC50略微高于1μM，这非常接近于得普尼林(0.31μM)，且10倍量仍低于考虑的其它分子的IC50。另一方面，AFA植物色素15倍量的IC50仍低于得普尼林。对评价酶抑制剂亲和力的抑制常数Ki同样如此。AFA-藻蓝蛋白的Ki在1μM附近，类似咖啡和烟草中的非哈尔满生物碱(但是当然没有与这两个物质相伴的任何问题)。另一方面，MAA、AFA植物色素和得普尼林均为具有小于1的Ki的仅有的分子，所以对MAO-B有非常高的亲和力。事实上，AFA植物色素是除了司来吉兰/得普尼林仅有的天然分子，它的Ki为纳摩尔数量级。然而，在司来吉兰/得普尼林和AFA提取物分子之间存在本质的区别：前者为不可逆的抑制剂，因此由潜在的副作用表征；而AFAKlamath的MAOB抑制分子均为可逆的，由生理性活性表征，不存在与合成的分子相伴的问题。
附图14图解显示了与得普尼林相关的AFA的三种分子的MAO-B抑制活性。给出了基本提取物(和其它的AFA提取物)中三种分子的协同作用，总体上基本提取物的MAO-B抑制活性结果非常高。一些物质是显著相关的，也是由于其中存在的高含量的PEA。如果我们以它们的PC含量为基础比较基本提取物和得普尼林，我们得到基本提取物达到IC50的PC剂量低至0.05μM，这表明它的效能是得普尼林的7.5倍(且是天然物质的10倍之多)。重要的是鉴于基本提取物中含有的植物色素的效能：事实上7.5倍是PC和MAA抑制效能的平均值，其略低于得普尼林，且该植物色素的比15倍还多(附图17)。这也表明了关于纯化的AFA-PC的提取物的较高效能最主要是由于植物色素。
此外，该提取物仍保持天然物质生理学作用的优点，它们的MAO-B抑制作用是可逆的且主要是竞争性的，这就没有与不可逆分子例如得普尼林和其它合成物质伴随的潜在副作用。(46)
该提取物进一步的优点是它高含量的苯乙胺，苯乙胺是一种强大的多巴胺能神经调节剂，其与其它分子产生总的协同作用，该协同作用我们可概括如下：
-苯乙胺或PEA在刺激黑质纹状体组织中多巴胺的释放和抑制多巴胺本身的突触后再摄取都具有双重的多巴胺能活性；
-植物色素、MAA和藻蓝蛋白作为强大的MAO-B抑制剂，在减少MAO-B活性的范围内还增加多巴胺能性传递，这意味着神经胺寿命更长，包括多巴胺。
-植物色素、MAA和藻蓝蛋白作为MAO-B抑制剂，还延长了苯乙胺的寿命和活性，这是它本身MAO-B酶的脱氨活性的目的所在，并由此建立了良性循环，进一步支持多巴胺能性传递及活性和通过PEA产生更广泛的神经调节。
-最后，藻蓝蛋白强大的抗氧化和抗炎活性，和它们或它们色基的能穿过血-脑屏障的能力一起；和植物色素非常高的抗氧化性和MAA稍逊的却仍显著的抗氧化活性，产生了神经保护作用，保护了不同的活性分子并建立了更广泛的神经学上的良性循环，以远离任何氧化和炎性损伤。
神经保护
我们已经试验了AFA提取物、特别的AFA-PC和它的色基PCB以及MAA对谷氨酸的神经毒性作用的神经保护特性。
谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，但是在神经元它的NMDA亚型受体的过度刺激会触发Ca2+的大量细胞内积聚，导致细胞死亡。此外NMDA受体刺激后线粒体内Ca2+聚集，暂时增加细胞溶质中游离的Ca2+活化了氧化氮合酶的(NOS)神经元同种型(49)，氧化氮合酶是形成氧化氮(NO)(主要存在于初级神经元)或它的过氧化物(O2-)反应产物过氧化亚硝酸盐(ONOO-)。
经略微改良的方法暴露神经元于谷氨酸(50)：撤离培养基，用37℃预热的缓冲的Hanks’溶液(5.26mM KCl，0.43mM KH2H2PO4，132.4mM NaCl，4.09mMNaHCO3，0.33mM Na2HPO4，20mM葡萄糖，2mM CaCl2，和20mM HEPES，pH7.4)冲洗神经元一次，随后在不含有或含有AFA提取物(1-50nM)、PC(10-1000nM)、PCB(10-1000nM)和MAA(1-10μM)浓度的37℃预热的缓冲的Hanks’溶液中预培养，预培养30分钟后，将100μM浓溶液的L-谷氨酸加入到100μM加10μM的甘氨酸终溶液中，神经元于37℃培养15分钟，随后吸走缓冲液，用DMEM培养基取代，使细胞在无效应物存在的情况下37℃培养24小时。
通过DAPI的细胞核染色法评估细胞的程序性死亡(50)，可透过膜的荧光染料与DNA的结合，可以定量凋亡的神经元，即神经元显示碎裂和稠核。简述之，接触谷氨酸24小时，用热的PBS(37℃)冲洗神经元的培养基，并且用含有4％(wt/vol)多聚甲醛的PBS室温下固定30分钟。用PBS冲洗后，将细胞于黑暗中室温下接触3μM的DAPI10分钟，随后再用PBS缓冲液冲洗两次。使用萤光过滤器(330-380激发；30X放大)，通过荧光显微术根据染色质凝聚对细胞进行打分，计数总数和凋亡的细胞核。在所有的情况下，通过计数员盲法的实验设计，大约按每孔600-1,000个细胞进行计数，单独培养的测量一式两份进行，培养制品的数量的结果以S.E.M值的平均数表示，结果的统计分析通过Kruskal-Wallis检验接着通过最小显著差异多范围检测法进行确定，在所有情况下，p-0.05被认为是显著的。
通过谷氨酸损伤实验，我们第一时间得出了AFA基本提取物、AFA-PC、它的PCB和MAA的神经保护能力，如图18所示，谷氨酸的加入使得被培养的神经元细胞程序性细亡增加到22.9％±3n＝4(p＜0.05)的水平；而AFA基本提取物的同时加入则产生了非常高的抗谷氨酸毒性的保护作用，其降低了细胞程序性死亡的水平，低于对照水平(6.3％±1 p＞0.05)只使用了相当于1nM数量的提取物(结果为3至8种不同细胞培养物的平均数±SEM，#与对照组比较具有显著差异(p＜0.05)；＊与谷氨酸组比较具显著差异(p＜0.05)。至于MAA所提供的保护作用，它们也降低了细胞程序性死亡的水平，低于对照水平使用了更高的剂量1μM(图19)，结果为3至8种不同细胞培养物的平均数±SEM，#与对照组比较具有显著差异(p＜0.05)；＊与谷氨酸对照比较具显著差异(p＜0.05))。关于AFA-PC和PCB，我们发现它们抑制细胞程序性死亡的作用是非常相似的：它们的加入降低了细胞程序性死亡的程度低于对照水平，使用大约10nM的剂量(图20和21-结果是3至8种不同细胞培养物的平均数±SEM，#与对照组比较具有显著差异(p＜0.05)；＊与谷氨酸对照比较具有显著差异(p＜0.05))。
AFA-PC与PCB的抑制程度大致相当，这多少有点让人惊讶，因为PCB被认为是最主要的活性成分，如果进行纯化或进一步浓缩，应比作为活性组分的整个分子具有更强的活性，实际上它具有同样的效能的事实意味着整个PC中存在着其他可能实际上比PCB自己更强效的其他因子。我们知道整个PC分子，除了C-PC和它的PCB色基，还由PEC组成，它含有PCB和PVB(phycoviolobilin)作为它的色基，因此，我们可以推测产生纯化后的PCB与整个PC分子之间的效能显著差异的因素，明显是因为PEC组分，特别是它的PVB色基，它被认为是非常强的抗氧化剂。
神经保护的方面，MAA似乎起着显著弱于PC和PCB的作用，但是最强的神经保护剂明显是整个AFA提取物，它能够在仅仅1nM(纳摩尔)就完全抑制细胞的程序性死亡，10倍于PC和PCB的效能。这当然可解释为整个AFA提取物中的许多不同的抗氧化因子的协同作用，而我们如上可知AFA植物色素可能是迄今为止最强的抗氧化剂，仅仅16纳摩尔几乎完全地抑制MDA(后期脂质过氧化副产物)的形成，很可能AFA植物色素在解释基本提取物的更高效能时是一个更重要的因素。我们可如此断定：AFA植物色素如其他任何所有的植物色素都是重要的神经保护剂。
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25.PEA是一脂溶性分子，易受热破坏，这意味着高温干燥法较冷冻干燥法，具有较低含量的PEA。发现利用偏流窗
Figure G2007800234854D00231
方法干燥的藻中PEA含量最高，基本提取物是通过这种藻而实现的。
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Claims (5)

1.微藻水华束丝藻(Aquae Ralfs ex Born.& Flah.Var.flos aquae)(AFAKlamath)的提取物用于制备预防、控制或治疗神经性疾病、病症、机能障碍或障碍的组合物的用途，其中所述的提取物通过下列的步骤进行制备：
a)冷冻新鲜采集的AFA藻并解冻，或如果初始材料是干燥的AFA粉末，超声处理水稀释的AFA粉末以破裂细胞；
b)离心步骤a)的产品，从沉淀中分离上清液；
c)收集含有水溶性组分的上清液，
其中所述的神经性疾病、病症、机能障碍或障碍为下述之一：阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、注意缺陷多动症(ADHD)、自闭症、抑郁症、记忆缺失和情绪障碍。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的提取物含有微藻水华束丝藻(AquaeRalfs ex Born.& Flah.Var.flos aquae)(AFA Klamath)的下列成分：C-藻蓝蛋白/藻红青蛋白复合物(C-PC/PEC)、它们的独立色基藻青素(PCB)和phycoviolobilin(PVB)、AFA植物色素、霉孢菌素样氨基酸(MAA)和苯乙胺(PEA)。
3.根据权利要求1的用途，其中所述的AFA Klamath提取物是通过将所述的上清液使用截留分子量为30,000道尔顿的超滤膜进行超滤而进一步纯化的。
4.根据权利要求1的用途，其中所述的组合物适合人类施用。
5.根据权利要求1的用途，其中所述的提取物用药学上可接受的载体或赋形剂进行配制。
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