CN106727751A - 红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用 - Google Patents
红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用;红甜菜含有的硝基化合物均可溶于水;且能够在人体内有效的转化为一氧化氮;食用一氧化氮补充剂能绕过线粒体乙醛脱氢酶产生一氧化氮,经唾液腺硝酸还原酶产生过渡产物亚硝酸基团,亚硝酸基团进入血液循环系统并且在内皮的低氧区域转化成一氧化氮,该组硝基化合物有明显增进心血管健康的效果,具有乙醛脱氢酶基因带有R671多聚态(G/A)的中国人饮用红甜菜汁能够有效地降低高血压和有效改善血管内皮功能;一氧化氮是具有多种功能的活性分子,除了增进心血管健康,还有助于抗炎,改善供氧,增加血流及增强运动耐力。因此,红甜菜产品具有广泛和实际的开发应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及保健药物应用技术领域,更具体地,涉及红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用。
背景技术
自1980年发现NO是人体的信号分子,人们对其进行了深入和广泛的研究。NO起着信使分子的作用。当内皮要向肌肉发出信号以促进血液流通时,它就会产生一些NO分子,这些分子很小,很容易地穿过细胞膜,血管周围的平滑肌细胞接收信号后舒张,引起血管舒张。经过长期的科学探索和研究,药学开发及医学临床应用证明,NO是直接有效的诱导血管舒张的活性分子,具有改善心脑血管的作用,除此之外,NO作为NANC神经元递质,在泌尿生殖系统中起着重要作用;NO在胃肠神经介导胃肠平滑肌松弛中起着重要的中介作用;NO在杀伤入侵的细菌、真菌等微生物和肿瘤细胞、有机异物及在炎症损伤方面起着十分重要的作用,可见NO在心、脑血管调节、神经、免疫调节等方面都有着十分关键的生理学作用,受到人们普遍的重视。
NO的生物半衰期极短,正常生理状态下机体可以产生适当水平的NO以维持各系统的机能。但许多慢性疾病如高血压,粥样动脉硬化等可造成血管内皮细胞损伤,使体内NO产生减少,此时补充外源性NO是一种必要的治疗措施,因此出现了NO供体的概念。NO供体是一类能在体内释放出NO的前体药物,是指不需经一氧化氮合成酶(NOS)催化自行或与其他物质作用产生NO的物质。鉴于其存在的应用价值,越来越多的NO供体被开发和应用于各种相关疾病的治疗。现有技术存在很多药物性NO供体化合物,如硝酸甘油已经成为必备的心脏病急救用药。随着社会经济和人类健康意识的进步,提供应用可以转化为一氧化氮的植物补充剂为预防和治疗疾病开拓了一种全新的思路。临床应用上给这种思路寄予了很大的希望,但同时也有高标准和要求。首先,要有与现有药物相比同等甚至更好的疗效。其次,应该减少副作用。再次,应有较低的成本。如果作为非药物补充剂,还应该具备方便食用,稳定,容易与其他食物或饮料配制,口感好,无怪味,不含酒精或其它有机溶剂等特点。最重要的特点应该是该非药物补充剂有相对高的含量,能通过消化道进入人体内转化为一氧化氮达到稳定、持久地预防和治疗疾病的效果。
在经过食品营养研究以及对传统医药的分析,人们发现很多植物的根茎有硝基化合物。可是绝大多数因为含量不高而不具有更进一步的开发价值。而且其所含的硝基化合物是否能够被通过消化道进入人体内转化为一氧化氮也是未知。因此,找到一种含有相对较高硝基化合物含量的植物并能确证其体内效果将为提供可以转化为一氧化氮的食用补充剂的思路打开新篇章。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷,提供红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用。
发明人发现以及证实:1、红甜菜是一种含有丰富的硝基化合物的植物,红甜菜根硝基化合物含量高于目前文献所报道过的其他植物;2、红甜菜含有的硝基化合物均可溶于水;3、红甜菜所含有的硝基化合物能够在人体内有效的转化为一氧化氮;食用一氧化氮补充剂(如红甜菜相关活性制剂)能绕过线粒体乙醛脱氢酶产生一氧化氮,其过程是经唾液腺硝酸还原酶(nitrate reductase)产生过渡产物亚硝酸基团(Nitrite),亚硝酸基团进入血液循环系统并且在内皮的低氧区域转化成一氧化氮;4、红甜菜中能够转化为一氧化氮的硝基化合物为无色的多分子复合物。
红甜莱中提取的硝基化合物是一种无机和有机的复合物,含有多种成分,并非单一分子。在消化道吸收入血液后,在唾液腺浓缩并转化为亚硝酸根并在胃或血液中转化为一氧化氮。并不是所有的一氧化氮供体都可以转化为一氧化氮。发明人对红甜菜进行提取分离可转化为一氧化氮的硝基化合物成分,发现红甜菜所含有的硝基化合物非单一成分但均易溶于水。
因此本发明还保护红甜菜中无色硝基化合物作为一氧化氮补充剂的应用。
一氧化氮是一种具有强生物活性但非常不稳定的小分子,其在人体内的半衰期只有几微秒。一氧化氮的最重要的生理效应是快速诱导平滑肌舒张。因此,一氧化氮成为心脏冠脉栓塞类疾病和恶性高血压的急救用药。常用的心脏疾病的急救药有单硝酸异山梨酯(isosorbide mononitrate)和三硝酸甘油(glyceryl trinitrate),这类药物是一氧化氮供体,使其发生药效,必须快速产生一氧化氮。但是,硝酸甘油转化为一氧化氮需要通过人体内的线粒体乙醛脱氢酶(mtALDH2)催化反应。乙醛脱氢酶也是人体内降解酒精的重要酶之一。在亚洲人群(包括中国人,日本人,朝鲜人等)中,有大量的人(超过 25% 的中国人们和40%的日本人)的乙醛脱氢酶基因带有R671(E487L)多聚态。具有高活性乙醛脱氢酶基因多聚态为G,而低活性多聚态为A。在中国人群中,有纯合体(即G/G 或A/A),也有杂合体(即G/A)。多聚态(A/A)导致乙醛脱氢酶活性丧失,多聚态 (G/A) 导致乙醛脱氢酶活性部分丧失。这类人饮用酒精饮料通常在短时间内会出现局部或全身发红,严重时会出现所谓的酒精中毒。但是,该类人群(G/A或A/A)真正面对的健康风险是对硝酸甘油治疗无效或产生抗药性,在出现心脏冠脉栓塞时出现应用硝酸甘油无效而错过救治的最佳时机(Sydow K et,al. Central role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase and reactive oxygenspecies in nitroglycerin tolerance and cross-tolerance. J Clin Invest. 2004;113(3):482-9.),对于该类人群,如果能提供不依赖乙醛脱氢酶而产生一氧化氮的硝基化合物将具有不可估量的增进心血管健康的价值。
由于红甜菜含有的硝基化合物经过消化系统,能绕过线粒体乙醛脱氢酶产生一氧化氮,其过程是经唾液腺硝酸还原酶(nitrate reductase)产生过渡产物亚硝酸基团(Nitrite),亚硝酸基团进入血液循环系统并且在内皮的低氧区域转化成一氧化氮。
因此,红甜菜可以给乙醛脱氢酶基因多聚态G/G人群、G/A人群和A/A人群提供一氧化氮,特别是G/A人群和A/A人群,即本发明提供红甜菜中无色硝基化合物作为乙醛脱氢酶基因多聚态G/A人群和A/A人群的一氧化氮补充剂的应用,其红甜菜产生的一氧化氮含量与红甜菜汁的饮用量成正比。
因此,具有乙醛脱氢酶基因带有R671多聚态(G/A或A/A)的亚洲人群通过食用不依赖乙醛脱氢酶的一氧化氮补充剂能够补充体内的一氧化氮以促进心血管健康。
即本发明还提供红甜菜中无色硝基化合物在制备降低和预防高血压的制剂中的应用。
本发明还提供红甜菜中无色硝基化合物在制备预防或/和治疗心脑血管疾病的制剂中的应用。
优选地,所述无色硝基化合物的制备方法为:将红甜菜制成浆,过滤除去不溶的纤维,分离去除有色成分,即得。
现有技术中能够去除可溶性硝基化合物的有色成分的方法均可用于本发明,这里,为了更明确,这里举例分离去除有色成分的方法为活性炭吸附法:将相当于三分之一红甜菜汁体积的活性炭装入过滤柱中。反复冲洗以去除悬浮的微小颗粒。缓缓加入红甜菜汁,让其自然滤过。收集滤过液入烧杯中。对滤过液中的色素等成份进行标定。即获得脱色红甜菜汁。
发明人通过研究也发现红甜菜根中能够转化为一氧化氮的无色硝基化合物含量最高,因此,优选地,上述应用中,所述红甜菜选自红甜菜根。
红甜菜经过打碎或压制成浆或汁后,过滤除去不溶的纤维,含有可转化为一氧化氮的硝基化合物成分在滤后的浆中。进一步分离去除有色成分可以得到无潜在副作用的食用一氧化氮补充剂;深度加工可以制备成为果汁,汽水类, 胶囊,以及食品,营养品和补品添加剂等相关产品作为食用一氧化氮补充剂。
因此本发明还提供一种制备一氧化氮补充剂的方法,是将红甜菜打碎压制成浆,过滤除去不溶的纤维,分离去除有色成分,即得。
现有技术中能够去除可溶性硝基化合物的有色成分的方法均可用于本发明,这里,为了更明确,这里举例分离去除有色成分的方法为活性炭吸附法:将相当于三分之一红甜菜汁体积的活性炭装入柱子中。反复冲洗以去除悬浮的微小颗粒。缓缓加入红甜菜汁,让其自然滤过。收集滤过液入烧杯中。对滤过液中的色素等成份进行标定。即获得脱色红甜菜汁。并对其相关功能作进一步鉴定。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了红甜菜(Beta vulgaris,也俗称 beetroot)作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用;红甜菜含有的硝基化合物均可溶于水;且能够在人体内有效的转化为一氧化氮;食用一氧化氮补充剂(如红甜菜相关活性制剂)能绕过线粒体乙醛脱氢酶产生一氧化氮,其过程是经唾液腺硝酸还原酶(nitrate reductase)产生过渡产物亚硝酸基团(Nitrite),亚硝酸基团进入血液循环系统并且在内皮的低氧区域转化成一氧化氮,红甜菜所含有的硝基化合物有明显增进心血管健康的效果,具有乙醛脱氢酶基因带有R671多聚态(G/A)的中国人饮用红甜菜汁能够有效地降低高血压和有效改善血管内皮功能;一氧化氮是具有多种功能的活性分子,除了增进心血管健康,还有助于抗炎,改善供氧,增加血流及增强运动耐力。因此,红甜菜产品有进一步开发的价值。
附图说明
图1为红甜菜植物示意图。
图2为红甜菜与西洋参所含的可转化为一氧化氮的硝基化合物总量;以硝基(NO3-)为换算单位(毫克/千克湿重),图中的结果为三次测量的平均值。
图3为晾干的红甜菜根与西洋参所含的硝基化合物总量;以硝基(NO3-)为换算单位(毫克/千克湿重),图中的结果为三次测量的平均值。
图4为红甜菜所含的硝基化合物的成分分析;图4A为10%的聚丙烯酰胺凝胶进行高分辨电泳分析红甜菜汁,能分辨多种有色成分,包括紫,深紫,橙,和黄色成分,其中深紫为主要有色成分;图4B为分析红甜菜汁电泳后的聚丙烯酰胺凝胶以及电泳液中所含的硝基化合物量;通过与上样总量计算得出各个的回收率。
图5为红甜菜所含的硝基化合物的成分琼脂糖凝胶电泳分析;用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析红甜菜汁能分辨多种有色成分,包括紫,深紫,橙,和黄色成分,其中深紫为主要有色成分;测定红甜菜汁电泳后的凝胶所含的硝基化合物量[可转化为一氧化氮的成分含量以硝基(NO3-)为换算单位(微摩尔)]。
图6为患高血压的志愿者饮用红甜菜汁后的血压监测;患高血压的志愿者停用降压药48小时后,饮用了相当于含有300毫克硝基化合物[以硝基(NO3-)为换算单位]的红甜菜汁,对其血压进行二十四小时的监测。
图7为患高血压的志愿者饮用红甜菜汁后的尿液中硝基化合物排泄监测;患高血压的志愿者停用降压药48小时后,饮用了相当于300毫克硝基化合物[以硝基(NO3-)为换算单位]的红甜菜汁,对其尿液中含硝基化合物进行监测[以硝基(NO3-)的浓度为换算单位(毫摩尔)]。
图8为患高血压的志愿者饮用脱色红甜菜汁后的血压监测,图8A为红甜菜汁经活性碳脱色后,对其480纳米和540纳米光吸收值用荧光分光光度读盘机记录光吸收值;图8B为高血压的志愿者,饮用了相当于含有300毫克硝基化合物[以硝基(NO3-)为换算单位]的脱色红甜菜汁,对其收缩压和舒张压进行十二小时的监测。
图9为药用有机一氧化氮供体和红甜菜食用一氧化氮补充剂降血压原理的简单图解。线粒体乙醛脱氢酶是药用一氧化氮供体产生药效必要的催化酶。然而,食用一氧化氮补充剂产生一氧化氮的过程不依赖线粒体乙醛脱氢酶;产生的一氧化氮直接舒张血管或通过诱导产生鸟嘌呤核糖苷-3,5-环磷酸酯(cGMP)进而舒张平滑肌,从而降低血压。
图10为带有线粒体乙醛脱氢酶基因多聚态G/G和G/A的志愿者在饮用红甜菜汁后的血压变化;有轻度高血压中国人志愿者线粒体乙醛脱氢酶基因经过全自动测序,图10A和10B显示多聚态G/G和G/A的原始测序波谱,其中,黑色波谱线代表G,绿色波谱线代表A;R671(E487L)多聚态在红框内;图10C和10D显示饮用了相当于300毫克硝基化合物[以硝基(NO3-)为换算单位]的红甜菜汁后的最大血压变化。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。若无特别说明,实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术,试剂或材料均为通过商业途径得到。
一氧化氮供体硝基化合物的含量通过化学还原和化学荧光的方法用一氧化氮检测仪(NOA280)来测定(具体参考Shi JD,et, al. Nitric oxide,2013,34:27-37,PMID:23669183),用溶于95℃,0.5M盐酸的氯化钒还原总的氮氧化合物;由于该系统的强还原力,所有高于+2价的氮氧化合物包括硝酸基团、亚硝酸基团及S-亚硝酸基团都被还原并释放一氧化氮。所以该系统测定的是总的硝基化合物的量。用不同浓度的硝酸钠作为标准品作标准曲线。测量标本的最终信号面积和标准品产生的信号面积进行计算来获得总硝基化合物的含量。
实施例1 红甜菜硝基化合物的分离
红甜菜为当年五月种植,九月收获,生长约四个月的中等大小(如图1,每个湿重大约200~300克)。通过定量测定新鲜红甜菜,发现红甜菜根,茎,叶中都有高含量的可转化为一氧化氮的硝基化合物(图2,以硝基NO3-为换算单位),其中,根部含量最高,且明显高于产于美国威斯康辛州的新鲜花旗参(俗称西洋参)(图2);将红甜菜晾干后,发现红甜菜根所含有的可转化为一氧化氮的硝基化合物含量更高(图3)。
红甜菜中硝基化合物的分离过程:晾干或新鲜红甜菜用塑球颗粒在20,000g,2分钟打碎,加入纯水,离心10,000g,2分钟,溶水上清即为富含硝基化合物的红甜菜汁。
通过用水和多种有机溶剂对红甜菜可转化为一氧化氮的硝基化合物成分进行抽提,大约大于99%的转化为一氧化氮的硝基化合物易溶于水。当用甲醇或乙醇抽提时,仅约20~30%的成分为可溶于100%的甲醇或乙醇。当用丙酮或氯仿抽提时,可溶性小于1%。
在对分别由200毫克新鲜红甜菜根,茎,叶,打碎的粗制物进行五次纯水洗涤后,剩余成分不再含有硝基化合物成分,硝基化合物溶于洗涤的水中(回收率>99%)。
应用10%的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide)对溶于水的成分进行高分辨电泳分析,结果:红甜菜中含有多种有色成分,包括紫,深紫,橙,和黄色成份,其中深紫为主要有色成分(图4)。同样,通过应用2%琼脂糖凝胶电泳也能分辨红甜菜中含有多种有色成分,包括淡黄,深紫和红色成分,其中深紫为主要有色成分(图5)。在琼脂凝胶上,电荷从负极游向正极。分子量小,带电荷多的分子游向最靠近正极的位置。在图5可以清楚看出回收的硝基化合物从样品第6到第13靠近正极,它们没有颜色。有颜色靠近负极的样品2含有红色素的样品硝基化合物含量很低。因此可以得出结论,可转化为一氧化氮的硝基化合物为无色而且带有多电荷,电泳在凝胶的较前沿。与之相比,所有有色成分均带较少电荷,电泳在胶的后半部。因此,可转化为一氧化氮的硝基化合物与有色成分无太大关联。同时,上述结果也能证明红甜菜素 (甜菜红素(betacyanin)和甜菜黄素(betaxanthin))并非能够转化为一氧化氮的有效成分。
在国际上,红甜菜产品是作为一种抗氧化剂,其通用标准为深紫色的红甜菜素(betanin)的含量。很明显,红甜菜素不是可以转化为一氧化氮的硝基化合物, 不能作通过食用红甜菜补充一氧化氮的应用的有效价值的参考,含一氧化氮供体的硝基化合物总量是直接的有效的指标。
实施例2 应用分离得到的硝基化合物降低高血压
给志愿高血压患者饮用红甜菜汁大约1~2小时后,志愿者血压开始稳步下降,心率没有明显变化(图6),而该效益能持续较长时间。根据对志愿者的监测,饮用含300毫克一氧化氮供体的红甜菜汁。血圧在1个小时就开始下降。6~9小时血压达到最大降幅。这种降压效果可以持续12小时左右。这与一氧化氮供体在体内代谢是一致的。
一氧化氮供体在6~9小时体内吸收也达到高峰(图7)。为了达到较好的降压效果,每天两次饮用(每12小时)是一种比较好的方法。根据该结果,发明人推断该效益应该是由红甜菜的硝基化合物在肠胃中由肠道微生物代谢吸收而造成的缓慢释放一氧化氮引起的血管平滑肌舒张的结果。
在饮用红甜菜汁的实验时,还对志愿者的尿液进行了监测,发现尿液会呈现粉红色。这种现象反应红甜菜中的有色成分会被人体吸收但不能被代谢,需要经过尿液排出体外。
实施例3 应用分离得到的脱色红甜菜汁(无色硝基化合物)研究对血压的影响
由于发明人通过一系列实验已经证明红甜菜的硝基化合物为无色的多分子复合物,进一步观察脱色红甜菜汁对血压的影响。红甜菜汁有两个吸收光谱,分别是黄绿色的480纳米和紫红色的540纳米。经过活性炭脱色,至少95%的色素已经去除(图8A)。测定一氧化氮供体含量并给予高血压自愿者300毫克。观察12小时内血压变化。同样脱色红甜菜汁降低血压的作用与应用红甜菜汁类似(图8B)。这组数据充分说明红甜菜中具有降压效果的一氧化氮供体为多成分的无色硝基化合物。
实施例4 应用分离得到的硝基化合物降低乙醛脱氢酶活性缺乏人群的高血压
经过对有轻度高血压中国人志愿者的线粒体乙醛脱氢酶基因测序,我们发现有线粒体乙醛脱氢酶基因多聚态G/G和G/A(图10)。带有线粒体乙醛脱氢酶基因多聚态G/G的人,体内酶活性正常。在两个基因都表达的情况下,带有多聚态G/A的人体内酶活性约为正常人的一半。根据多聚态G/A的志愿者在饮少许酒后有强烈的对酒精过敏反应,可以推断该G/A志愿者的线粒体乙醛脱氢酶酶活性较低。 对比多聚态G/G志愿者与多聚态G/A志愿者饮用红甜菜汁后的血压变化(受试期间,均未服用降压药),红甜菜汁有相同的降低血压的效果(图10)。该结果证实红甜菜中的硝基化合物转化一氧化氮供体的过程不依赖线粒体乙醛脱氢酶,即红甜菜中的硝基化合物可作为乙醛脱氢酶活性缺乏人群的一氧化氮补充剂。
还有一点值得关注:直接摄入大量硝酸盐和亚硝酸盐均属是有毒害的;然而,红甜菜的食用已经有上千年的历史,发明人长期饮用红甜菜汁,都未发现任何副作用。这足以说明红甜菜能缓慢释放能转化为一氧化氮的硝基化合物,而这类化合物能够在人体内迅速转化,几乎没有积累,所以不构成有害效果。正因这样的缓慢释放,红甜菜降低高血压的效果才能持久。这也是食用植物源一氧化氮补充剂与有机硝基化药物如三硝酸甘油的不同之处。
Claims (9)
1.红甜菜作为食用植物源一氧化氮补充剂的应用。
2.红甜菜中无色硝基化合物作为一氧化氮补充剂的应用。
3.红甜菜中无色硝基化合物作为乙醛脱氢酶基因多聚态G/A人群和A/A人群的一氧化氮补充剂的应用。
4.红甜菜中无色硝基化合物在制备降低和预防高血压的制剂中的应用。
5.红甜菜中无色硝基化合物在制备预防或/和治疗心脑血管疾病的制剂中的应用。
6.根据权利要求1至5任一项所述的应用,其特征在于,所述无色硝基化合物的制备方法为:将红甜菜制成浆,过滤除去不溶的纤维,分离去除有色成分,即得。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述分离去除有色成分的方法为活性炭吸附法。
8.根据权利要求1至5任一项所述的应用,其特征在于,所述红甜菜选自红甜菜根。
9.一种制备一氧化氮补充剂的方法,其特征在于,将红甜菜打碎压制成浆,过滤除去不溶的纤维,分离去除有色成分,即得。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170531 |
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