JP5259585B2

JP5259585B2 - 神経系、神経変性および気分障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療のための、アファニゾメノン・フロスアクアエ（ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎＦｌｏｓＡｑｕａｅ）、調製物、その抽出物およびその精製成分

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Publication number: JP5259585B2
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Inventors: ステファーノスコグリオ、; フランコーカネストラリ、; セレナベネデッティ、; ヤニーナベネデッティ、; マリアデルガド−エステバン、
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Description

本発明は、微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎＦｌｏｓＡｑｕａｅＡｑｕａｅＲａｌｆｓｅｘＢｏｒｎ．＆Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓａｑｕａｅ）（クラマス湖産ＡＦＡ）に関する。より正確には、本発明は、神経系、神経変性および気分病態（conditions）または疾患（diseases）の予防または治療に有用なクラマス湖産ＡＦＡの抽出物およびその精製成分を提供する。

発明の背景
フェニルエチルアミン（ＰＥＡ）は、黒質線条体系のドーパミン作動性ニューロンにおいてフェニルアラニンの脱炭酸化により合成される内因性アミンであり、脳におけるカテコールアミン神経伝達の神経調節物質として作用しうる（１）。ＰＥＡの最も重要な作用は、カテコールアミン神経伝達を促進することである。ＰＥＡは、ドーパミンと同様アセチルコリンの放出を刺激することが知られる（２）。さらに、ＰＥＡは、ノルエピネフリン神経伝達（ＮＥ）（６）、およびセロトニン神経伝達さえも増大させる。

近年、ＰＥＡは、その特異的なニューロン受容体とともに、自律的神経伝達物質としてもまた働きうること、また、必要な場合は、神経伝達物質を抑制することもまた可能な、真の神経調節物質として作用することが示されている（８）。

注意および記憶の刺激；顕著な抗うつ活性を伴う気分の高揚；情動行動および性行動を含む、共感ひいては社会性の促進；空腹の抑制；薬物（substance）乱用および薬剤(drug)依存の必要性の低減といった、一連の非常に多くの効果が、このことに由来する。

ＰＥＡと感情的な気分とのつながりは、血漿または尿中のそれ自体またはその代謝物であるＰＡＡ（フェニル酢酸）により測定される、ＰＥＡレベルの著しい低下が、うつ状態の対象において見出された、研究により確認されている（９）。

パーキンソン病患者は、血漿中で直接測定されたＰＥＡレベルが著しく低いことがわかっている（１２）。これらの患者における、神経伝達、特にドーパミン作動性、の漸減は、黒質のドーパミン作動性ニューロンの進行性変性と関連する。

パーキンソン病患者において、ＰＥＡレベルのこのような減少は、ＭＡＯ−Ｂレベルの並行する上昇を伴い、このため、パーキンソン病において用いられる薬剤は、セレギリンなどのＭＡＯ−Ｂ阻害物質である（１４）。さらに、ひとたび摂取されたＰＥＡは、血液脳関門を容易に通過することができ、低用量時でさえも黒質線条体組織からのドーパミン放出を刺激することができる。これは重要な著しい特徴である。なぜなら、現在用いられる薬剤である、セレギリンは、ＭＡＯ−Ｂおよびドーパミンの再取り込みを阻害する一方で、黒質線条体組織からのその放出に対しては作用せず、したがって、さらなるドーパミン産生の一助とはならず、まさにドーパミンの産生自体が大いに脅かされる、パーキンソン病などの病変において深刻な限界があるからである。

アルツハイマー病は、ドーパミンの産生および再取り込み機構の変性、ならびに、時間経過とともにドーパミン作動性ニューロン数を減少させる、線条体領域のニューロンの進行性破壊、および結果として起こる、ドーパミン伝達の進行性破壊を伴う（１５）。

ＡＤＨＤ（注意欠陥過活動性障害）が、神経変性病変であるという事実に関する明確なデータは存在しないが、神経破壊が、小児および成人の双方において、ＡＤＨＤの主要原因であることを、いくつかの研究が示そうとしてきた（１９）。

最も重要なことは、ＡＤＨＤおよび学習障害に罹患した小児では、ＰＥＡレベルが顕著に低く（２１）、したがって、注意（ドーパミン）および鎮静（セロトニン）の神経調節（neuromodulation）において減少する、証拠があることである。ＡＤＨＤの選択薬が、ＰＥＡの、ひいては、ＡＤＨＤの病因に直接関与する２つの神経伝達物質である、ドーパミンおよびノルエピネフリンの、より高い産生を刺激することによっても作用する、ＰＥＡの合成誘導体、メチルフェニデート（２２）であるのはこのためである。

アンフェタミンの使用が空腹および、結果として、体重を制御することはよく知られている。この領域におけるその使用は、その耐性をも踏まえると、時間経過とともに潜在的に極めて重度となる傾向のある、その副作用により、常に問題となってきた。このことは、空腹および体重の制御に現在用いられる主な薬剤が、ベンラファキシンおよびブプロプリオンなどの、アンフェタミン様ドーパミン作動性抗うつ剤である事実によって確認される。これらの分子は、すべてのアンフェタミンと同様、ＰＥＡの合成誘導体である。後者（ブプロプリオン）は、ＭＡＯ−Ｂ酵素によるその分解が阻害される限りにおいて、強力な食欲抑制剤として作用する。

モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）ＡおよびＢは、ＣＮＳおよび末梢組織における神経作用性アミンおよび血管作用性アミンの分解を触媒する。特に、ＭＡＯ−Ｂは、ドーパミン作動性伝達に対するその直接および間接の関与性を踏まえると、うつ病および気分障害、パーキンソン病およびアルツハイマー病など、ドーパミンが重要な神経障害に関与する。このため、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質が、こうした神経障害の治療において用いられるのである（２６）。

1. Zhou G. et al., Platelet monoamine oxidase B and plasma β-phenylethylamine in Parkinson's disease, in J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2001; 70:229-231, 229. 2. Ispida K. et al., β-phenylethylamine stimulates striatal acetylcoline release through activation of the AMPA glutamatergic pathway, in Biol Pharm Bull 2005 Sep.; 28(9):1626-9. 6. Paterson I.A. et al., 2-phenylethylamine: a modulator of catecholamine transmission in the mammalian central nervous system?, in Journal of Neurochemistry (1990), 55:1827-1837. 8. Mauro Federici et al., Trace Amines Depress Gabab Response In Dopaminergic Neurons By Inhibiting Girk Channels, in Molecular Pharmacology Fast Forward. Published on January 11, 2005 as doi:10.1124/mol.104.007427. 9. Gusovsky F. et al., A high pressare liquid chromatography method for plasma phenylacetic acid, a putative marker for depressive disorders, in Anal Biochem, 1985 Feb. 15; 145(1):101-5. 12. Miura Y., Plasma beta-phenylethylamine in Parkinson's disease, in Kurume Med J 2000;47(4):267-72. 14. Ebadi M. et al., Neuroprotective actions of selegiline, in J Neurosci Res 2002 Feb 1;67(3):285-289. 15. Kemppainen N. et al., Different pattern of reduction of striatal dopamine reuptake sites in Alzheimer's disease and ageing, in J Neural Transm 2001;108(7):827-36. 19. Swanson J. et al., Cognitive neuroscience of attention deficit hyperactivity disorder and hyperkinetic disorder, in Curr Opin Neurobiol. 1998 Apr;8(2):263-71. 21. Kusaga A., Decreased beta-phenylethylamine in urine of children with attention deficit hyperactivity disorder and autistic disorder, in No To Hattatsu 2002 May; 34(3):243-8 21. Matsuishi T, Yamashita Y., Neurochemical and neurotransmitter studies in patients with learning disabilities, in No To Hattatsu 1999 May;31(3):245-8. 22. Kusaga A. et al., Increased urine phenylethylamine after methylphenidate treatment in children with ADHD, in Ann Neurol 2002 Sep;52(3):372-4. 26. Yamada M. et al., Clinical Pharmacology of MAO Inhibitors: Safety and Future, in Neurotoxicology 2004; 25:215-21 26. Youdim M., et al., Therapeutic Applications of Selective and Non-Selective Inhibitors of Monoamine Oxidase A and B that do not Cause Significant Tyramine Potentiation, in Neurotoxicology 2004;25:243-50.

発明の説明
本発明は、微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎＦｌｏｓＡｑｕａｅＡｑｕａｅＲａｌｆｓｅｘＢｏｒｎ．＆Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓａｑｕａｅ）（クラマス湖産ＡＦＡ）における、アルツハイマー病およびパーキンソン病、多発性硬化症、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、うつ病、記憶欠損および気分障害などの神経変性疾患を含む、各種の神経系の疾患、病態、機能不全または障害に対して、単独または組み合わせて有益な効果を及ぼす、物質の、同定に基づく。特に、クラマス湖産ＡＦＡ微細藻類は、ドーパミン作動性およびノルアドレナリン作動性活性を特徴とする神経調節物質である、フェニルエチルアミン以外に、酵素モノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯ−Ｂ）の極めて効果的な阻害物質であることがまったく驚くべきことに示された特異的分子、すなわち：ａ）特異的なＡＦＡフィトクロム；ｂ）Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）およびフィコエリスロシアニン（ＰＥＣ、その発色団であるフィコビオロビリンまたはＰＶＢを含む）により形成されるフィコビリソームを含む、ＡＦＡフィコビリタンパク質複合体（complex）（「ＡＦＡフィコシアニン」）；ｃ）マイコスポリン様アミノ酸またはＭＡＡ、を含むことがわかっている。その藻類中に含まれるＰＥＡが、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質により保護されない限り、ＭＡＯ−Ｂ酵素による取り込みと同時に迅速に破壊されるため、この知見は極めて重要である。

ＭＡＯ−Ｂの選択的阻害物質として作用する同じ分子が、強力な神経保護物質としての役割をも果たし、したがって、神経学的な健康を促進するその抽出物の能力を顕著に高める。

したがって、本発明は、クラマス湖産ＡＦＡ調製物、特に、こうした活性成分に富む抽出物、あるいは、ａ）ＡＦＡフィトクロム；ｂ）ＡＦＡもしくは他の任意の微細藻類中に存在する、Ｃ−フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体；ｃ）ＡＦＡ中に存在するかもしくは他の任意の藻類供給源に由来する、マイコスポリン様アミノ酸ポルフィラおよびシノリン；またはｄ）その混合物から選択された単離および精製成分を、それを必要とする対象に投与することにより、上述の神経系の疾患、病態、機能不全または障害を予防し、制御し、または治療する方法を提供する。

本発明に従うクラマス湖産ＡＦＡ抽出物は、以下のステップにより調製されることが好ましい：
ａ）採取直後のＡＦＡ藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥ＡＦＡ粉末である場合は、水で希釈したＡＦＡ粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する；
ｂ）ステップａ）の生成物を遠心分離し、沈殿物（細胞壁分画の大半を保持する）から上清（細胞質（cytoplasmatic）部分の大半を保持する）を分離する；
ｃ）水溶性成分を含む上清を回収する。

結果として得られる生成物が、ＰＥＡのほか、ＡＦＡフィトクロム、ＡＦＡフィコシアニン、およびＭＡＡなど他の相乗作用分子をも濃縮する抽出物（「基本抽出物」と呼ぶ）である。例えば、クラマス湖産微細藻類が２〜４ｍｇ／ｇの範囲の天然ＰＥＡ含量を有するのに対し、基本抽出物は、この濃度を、９〜１１ｍｇ／ｇの範囲のレベルにまで上昇させる（ＨＰＬＣ分析）。

抽出物を限外濾過システム、好ましくは、３０，０００ドルトン（Daltons）のカットオフ分子量を有する膜に通すことによりさらに精製することができる。限外濾過残留物（retentate）（抽出物Ａ）は、ＡＦＡフィコシアニン（分子量＝１２１，０００）およびＡＦＡフィトクロム（分子量＝４８０，０００）をともに主要な活性成分として含む。興味深いことに、ＭＡＡが、用いられるそのカットオフサイズを大きく下回る分子量を有するにもかかわらず、その残留物は、ＭＡＡの濃度も上昇させる。

ステップａ）〜ｃ）により得られる、すなわち、限外濾過を伴わない基本抽出物は、最適量のＰＥＡ、ＡＦＡフィトクロム、ＡＦＡ−ＰＣおよびＭＡＡを含むので、一般に好ましい。さらに、この基本抽出物はまた、低下した比率においてではあるが、その抗酸化および抗炎症特性に寄与する、クロロフィルおよびカロテンなどの物質をも含む。

あるいは、クラマス湖産ＡＦＡの活性成分、すなわち、複合体Ｃ−フィコシアニン／フィコエリスロシアニン（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）、ＡＦＡフィトクロム、およびＭＡＡは、さらに以下に記載の通りに、単離および精製することができ、本発明に従う方法において用いることができる。

好ましい実施形態において、クラマス湖産ＡＦＡのＣ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体、ＡＦＡフィトクロムおよびマイコスポリン様アミノ酸は、それを必要とする対象に対する同時または個別投与のための併用調製物として用いられ、さらに好ましい実施形態において、こうした併用調製物は、フェニルエチルアミンを追加の活性成分として含む。マイコスポリン様アミノ酸のうち、シノリンおよびポルフィラ３３４が、クラマス湖産ＡＦＡ微細藻類中に比較的高濃度で含まれるので、特に好ましい。

観察されたモノアミンオキシダーゼＢの阻害は、ドーパミン作動性伝達を増大させ、ＰＥＡの異化を最小化することを可能とするので、特に重要である。意義深いことに、フィトクロムおよびＡＦＡフィコシアニンがともにＭＡＯ−Ｂを可逆的および混合的な方法で阻害するのに対し、ＭＡＡによるＭＡＯ−Ｂ阻害は、競合的および可逆的であり、このため、３つの分子は全て、生理学的状態および副作用の不在下で高い有効性を確保する。

さらなる態様において、本発明は、場合によってフェニルエチルアミンを添加した、ＡＦＡ藻類中に存在するもしくは他の任意の藻類供給源に由来する、Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体、または単離したＣ−ＰＣおよびＰＥＣの単体成分；ＡＦＡフィトクロム；ＡＦＡ中に存在するもしくは他の任意の微細藻類供給源に由来する、マイコスポリン様アミノ酸ポルフィラおよびシノリン；またはその混合物から選択されることが好ましい、クラマス湖産ＡＦＡ調製物、その抽出物またはその単離成分を含む栄養補助組成物または医薬組成物を意図する。好ましい実施形態において、栄養組成物は、錠剤、カプセル、飲料の形態における栄養補助食品であり、さらに好ましい実施形態において、医薬組成物は、錠剤、カプセル、小袋、シロップ、坐薬、バイアルおよび軟膏の形態であり、上記に示した神経系または神経変性の疾患もしくは病態の予防または治療に用いられることができる。本発明に従うクラマス湖産ＡＦＡ液体抽出物は、それ自体で用いられるかまたは例えば凍結乾燥、噴霧乾燥などの手法により乾燥させることができる。その単離した活性成分は、当業者に知られる手法および以下の手順を用いて調合することができる。

その活性成分の用量は、栄養補助食品としてかまたは医薬調製物としてかの、組成物の使用目的に依存するであろう。各成分の有効量は、一般に以下の範囲に含まれるであろう。
ＰＥＡ＝０．１〜１００ｍｇ、好ましくは、５〜３０ｍｇ；
フィトクロム＝０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．８〜１０ｍｇ；
ＭＡＡ＝０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは、１０〜１００ｍｇ；
フィコシアニン＝１〜２５００ｍｇ、好ましくは、５０〜１０００ｍｇ。

ＭＡＡ試料の波長と吸光度の関係を示す図である。ＭＡＡ標準物質とＭＡＡ抽出物のクロマトグラムを示す図である。精製済みＭＡＡのＵＶスペクトルを示す図である。ＡＦＡの細胞溶解物の成分とシネコシスチス属ＰＣＣ６８０３のその成分との比較を示す図である。抽出物の分光分析を示す図である。ＰＣＢ発色団の波長を示す図である。基本抽出物の水溶性および脂溶性成分のＭＡＯ−Ｂ阻害活性を示す図である。ＡＦＡ水溶性抽出物のＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの阻害活性を示す図である。水溶性抽出物のラインウィーバー−バークプロットを示す図である。ＡＦＡ−ＰＣのＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂの阻害活性を示す図である。ＰＣのラインウィーバー−バークプロットを示す図である。ＭＡＡによる用量依存的なＭＡＯ−Ｂ阻害を示す図である。ＭＡＡのラインウィーバー−バークプロットを示す図である。ＭＡＡ濃度と傾きの関係を示す図である。、デプレニルに関してＡＦＡの３つの分子のＭＡＯ−Ｂ阻害活性を示す図である。ＡＦＡフィトクロムのＭＡＯ−Ｂ活性の用量依存的な低下を示す図である。ＡＦＡフィトクロムのラインウィーバー−バークプロットを示す図である。デプレニルおよびＡＦＡフィトクロムのＭＡＯ−Ｂ阻害活性を示す図である。アポトーシスへのグルタミン酸とＡＦＡ抽出物の添加の影響を示す図である。アポトーシスへのグルタミン酸とＡＦＡ抽出物のＭＡＡの添加の影響を示す図である。アポトーシスへのグルタミン酸とＡＦＡ抽出物のＰＣの添加の影響を示す図である。アポトーシスへのグルタミン酸とＡＦＡ抽出物のＰＣＢの添加の影響を示す図である。ＡＦＡフィトクロムのバンドを示す図である。光吸収特性を示す図である。ＡＦＡフィトクロム量のＭＤＡ形成の用量依存的減少を示す図である。

発明の詳細な説明
クラマス湖産藻類の典型的な固有のフィトクロムである「ＡＦＡフィトクロム」の同定
フィトクロムは、植物が光を検出するのに用い、可視スペクトルの赤色および遠赤色領域における光に対して感受性がある、光受容体、色素である。これらは、（日周期のリズム（rythms）を通して）開花の調節、発芽およびクロロフィルの合成を含む、植物における多数の異なる機能を果たす。ＡＦＡにおけるこの固有の種類のフィトクロムの存在が、光合成過程においてＣフィコシアニンを補うよう他のシアノバクテリアにより通常用いられる他のフィコビリタンパク質、すなわち、アロフィコシアニン、の欠如により説明しうるので、後者（クロロフィルの合成）は、ＡＦＡ藻類との関連で特に重要である。一方、クラマス湖産藻類におけるアロフィコシアニンの位置は、フィコエリスロシアニンまたはＰＥＣ（下記参照）により占められるが、特に、クラマス湖産藻類が、高い光回収能力を必要とする非熱帯環境において生育することを考えると、ＰＥＣのみでは十分ではないと思われ、したがって、ＡＦＡ藻類は、そのより高い必要性をフィトクロムで調和させていると思われる。

特異な構造を有するＡＦＡフィトクロムは、本明細書において初めて記述される。長年にわたり、異なる種類のフィトクロムが植物中に見出されており、それらは、異なるフィトクロム遺伝子（例えば、コメにおいて３種類、トウモロコシにおいて６種類）を有するだけでなく、大半の場合、顕著に異なるタンパク質成分および構造を有する。これらがすべてフィトクロムであるのは、これらがすべて、フィトクロモビリンと呼ばれる、同じビリタンパク質を、光吸収発色団として、用いるからである。この発色団は、フィコシアニンの発色団であるフィコシアノビリンと類似し、４つのピロール環（テトラピロール）の開鎖からなる単一のビリン分子であることを特徴とする。より具体的に、その正常のＰ_r状態において、このビリタンパク質は、６５０〜６７０ｎＭの最大値で吸光するのに対し、赤色光により活性化されると、７３０ｎＭの最大吸収を有するＰ_frに転換される。

発見された最初のシアノバクテリアのフィトクロムは、シネコシスチス属のそれであり、植物フィトクロムとの構造的類似性がわずかであることを示した。にもかかわらず、シネコシスチス属のビリタンパク質は、赤色／遠赤色の可逆的色素タンパク質である限りにおいて、一般にフィトクロムと考えられる（４８）。

ＡＦＡフィトクロムの精製と特性解析
ＡＦＡフィトクロムは、赤色／遠赤色スペクトルにおいて吸光するその発色団として、ビリタンパク質を有する。その構造および活性を確立するため、本発明者らは、以下のプロトコールによりフィトクロムを精製した。

・１ｇの抽出物を１０ｍｌの１Ｋリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中に懸濁させる
・その半分の体積で、１分間にわたるボルテックスを２回行う
・細胞を２％トリトンＸ１００とともに３５分間（３５’）インキュベートする
・２８０００ｒｐｍで１６〜１８時間遠心分離する
・スクロース密度段階勾配法により、上清を回収する
・スイングアウトローターを用いて、１５００００ｇで１２時間、その勾配分離物をスピンする
・ −２０℃で保存する
フィトクロムが、約１Ｍのスクロースで可視化される、強い橙色の溶解物バンドに対応するのに対し、一方、フィコビリソームは、約０．７５Ｍに位置する。２つのバンドのこの関係は、三量体ＡＦＡ−ＰＣの約４倍である、その藻類中に存在するフィトクロムの分子量についても、信頼できる指標を与える。後者（三量体ＡＦＡ−ＰＣ）が１２１Ｋｄであるので、本発明者らは、ＡＦＡフィトクロムのＭＷを約４８０Ｋｄにおいてあらかじめ確立することができる（図２２）。

その光吸収特性について調べたところ、フィトクロムは、平衡状態を形成するＰ_r（赤色光吸収）形態およびＰ_fr（遠赤色光吸収）形態にそれぞれ対応する、６７２ｎＭおよび６９４ｎＭにおいて２つのピークを伴い吸光することを示す（図２３）。

ＡＦＡ中に含まれるフィトクロムの量について、本発明者らの最初の評価は、以下の予備的な結果を与える：２ｍｇ／ｇ（または０．２％ＤＷ）。その抽出物について、基本抽出物中では濃度が約０．５％に上昇し、抽出物Ｂ中では約１％に上昇した。これらは低濃度であるが、この分子の抗酸化／抗炎症効力は極めて強いので、ごく少量でさえも極めて重要な効果をもたらすことができる。

抗酸化活性
精製済みＡＦＡフィトクロムは、極めて強力な抗酸化剤であることを示した。実際、絶対的に、今までにクラマス湖産藻類中で見出された最も強力な分子である。１００μＭで酸化作用物質ＣｕＣｌ₂とともにヒト血漿試料を２時間インキュベートすると、チオバルビツール酸との反応後５３５ｎｍにおける分光光度計により計測（ＴＢＡ試験）される、脂質過酸化の後期副生成物（a late byproduct）である、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルの上昇が生じる。ＡＦＡ藻類から抽出したＡＦＡフィトクロム量を増加させながら（２〜１６ｎＭ）１００μＭでＣｕＣｌ₂とともに３７℃で２時間、血漿をインキュベートすると、ＭＤＡレベルの極めて強力な用量依存的減少が観察される（図２４）。実際、わずか１６ｎＭのＡＦＡフィトクロムにより、対照に近いＭＤＡレベルを有する脂質過酸化のほぼ完全な阻害が得られる。意義深いことに、３．６ｎＭのＩＣ５０が、ＰＣＢについて得られるそれ(ＩＣ５０)を４５倍下回る。フィトクロムが、ＡＦＡ−ＰＣよりも高い、基本抽出物の抗酸化および神経保護効果の主要原因である。

ＭＡＡの抽出、精製および定量
本発明者らは、一般にクラマス湖産藻類として知られている、クラマス湖産の藍色植物門のアファニゾメノン・フロスアクアエにおけるＭＡＡの存在を調べた。本発明者らの知る限り、任意のアファニゾメノン属種におけるＭＡＡの存在についてはごく最近の報告（４７）が存在するのみであり、しかしながら、こうした報告が、ポルフィラを現存のＭＡＡとして同定するのみであるのに対し、本発明者らの研究は、ポルフィラおよびシノリン双方の２つのＭＡＡの存在を示す。一方、藻類に関する全般的な文献に関して、今まで報告されているシアノバクテリアの大半は、その主要ＭＡＡとしてシノリンを含むのに対して、本発明者らは、シノリンに加え、アファニゾメノン・フロスアクアエ中の主要ＭＡＡとして、ポルフィラ３３４のまれな存在を見出した。

ＭＡＡは、既に報告されているように抽出された（２９）。簡潔に言うと、４５℃の水浴中に２．５時間インキュベートすることにより、２ｍｌの２０％（ｖ／ｖ）含水メタノール（ＨＰＬＣグレード）中で２０ｍｇのＡＦＡ粉末または２０ｍｇの水性抽出物を抽出した。遠心分離（５０００ｇ；米国、パロアルト、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、ＧＳ−１５Ｒ型遠心分離機）後、上清を蒸発乾燥させ、２ｍｌの１００％メタノール中に再溶解し、２〜３分間ボルテックスし、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を蒸発させ、ＨＰＬＣでの分析用に同じ容量の０．２％酢酸中か、または、抗酸化特性の評価用に２００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に抽出物を再溶解した。試料は、ＨＰＬＣ分析、または抗酸化特性試験（下記を参照のこと）にかける前に、０．２μｍ孔径のシリンジフィルター（イタリア、ミラノ、ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）により濾過した。

クラマス湖産藻類のＭＡＡは、３３４ｎｍの最大吸収を有する。ＭＡＡのさらなる精製は、文献（３０）に従い、ＡｌｌｔｉｍａＣ１８型カラムおよびガード（イタリア、ミラノ、Ａｌｌｔｅｃｈ社製、４．６×２５０ｍｍ内径、５μｍ充填剤）を装備したＨＰＬＣシステム（日本、東京、日本分光株式会社製）を用いて行われた。検出波長は３３０ｎｍ、移動相は流量１．０ｍｌ分^-1で０．２％酢酸であった。ＭＡＡの同定は、ドイツ、エアランゲン、フリードリヒアレクサンダー大学、ＭａｎｆｒｅｄＫｌｉｓｃｈ博士のご厚意により提供された、ポルフィラ３３４、シノリンおよびパリシンを主に含む、アマノリ属種およびオバクサ属種などの標準品と吸収スペクトルおよび保持時間を比較することにより行った。試料の吸収スペクトルは、シングルビーム分光光度計（米国、パロアルト、Ｂｅｃｋｍａｎ社製、ＤＵ６４０型）の２００〜８００ｎｍにおいて測定した。生スペクトルは、コンピュータに転送し、ＭＡＡのピーク解析のために数学的に処理された。

ＭＡＡは、前述のようにＡＦＡ試料およびその水性抽出物から部分的に精製された。４５℃で２．５時間の２０％メタノールによる試料の抽出は、この手順により、少量の光合成色素（６２０ｎｍにおけるフィコシアニンなど）も抽出されたにせよ、３３４ｎｍにおいて顕著なピーク（ＭＡＡ）を生じた（図１の破線を参照のこと）。ＭＡＡ試料は、タンパク質および塩を除去するために、１００％メタノールによりさらに処理され、最終的に非極性光合成色素を除去するために、０．２％酢酸によりさらに処理された。その結果として得られる、部分的に精製されたＭＡＡは、３３４ｎｍに最大吸収を有した（図１、実線）。

３３４ｎｍにおいて吸収する化合物が、単一のＭＡＡであるか、または１以上の混合物のＭＡＡであるかを見出すため、ＨＰＬＣによってＭＡＡのさらなる解析および精製を行った。その試料のクロマトグラム（図２）は、シノリンおよびポルフィラ３３４としてそれぞれ同定された、保持時間４．２分（ピーク１）および７．６分（ピーク２）を有する２つのＭＡＡの存在を示す。ポルフィラ３３４は、シノリンが少量のみで存在する（ピーク面積比１：１５）ので、ＡＦＡにおける主要なＭＡＡであると思われる。

精製済みＭＡＡのＵＶスペクトルは、３３４ｎｍでその最大吸収が確認された（図３）。

シノリンおよびポルフィラ３３４に対する３３４ｎｍにおけるモル吸光係数が、それぞれ、４４７００および４２３００Ｍ^-1ｃｍ^-1であることを考慮し、本発明者らは、
ａ）ＡＦＡ藻類について、シノリンに対して０．４９ｍｇｇ^-1ＤＷの濃度およびポルフィラ３３４に対して７．０９ｍｇｇ^-1ＤＷの濃度；したがって、そのＭＡＡ総含量は、０．７６％藻類ＤＷに等しい；
ｂ）基本抽出物について、１７〜２１ｍｇのＭＡＡ濃度（すなわち、１．７〜２．１％ＤＷ）
を計算した。

全ＡＦＡが、ＵＶ曝露下で見出される最大濃度、すなわち、０．８４％に近い、高構成レベルのＭＡＡ（０．７６％ＤＷ）を含む（３１）ので、これらは重要なデータである。また、本発明者らは、その抽出物が、全藻類よりもさらに高い濃度を有し、最大可能濃度よりもはるかに高いレベルに達していることをも見出した。

ＭＡＡ（シノリンおよびポルフィラ３３４）は、分子量３００を有する、構造的に単純な分子である。このことは、それが最も必要とされる領域である、脳において、そのＭＡＯ−Ｂ阻害可能性を発現する能力を確かにし、これらの水溶性分子が血液脳関門を容易に通過することを可能にする。

フィコシアニン
フィコシアニンは、８〜１０％の濃度（定量については、下記を参照のこと）でその抽出物中に存在する。フィコシアニンは、特定の微細藻類ごとに特異的な特性を有するが、すべてのシアノバクテリアまたは藍藻類の、典型的な青色色素である（３２）。フィコシアニンの機能的および治療的特性について、現在まで、研究は、主に、微細藻類スピルリナの特性に焦点を合わせている。スピルリナから精製したフィコシアニンは、肝臓（３７）、呼吸器系（３８）、および脳（３９、４０）などの異なる生理系での抗酸化（３３）および抗炎症（３４、３５、３６）特性を有することを示している。スピルリナから精製したＰＣのこうした特性は、その実質的な類似性を踏まえると、一般に、他の藻類フィコシアニンにも帰属させることができる。にもかかわらず、上述の機能的および治療的特性の説明における異なる効力が生じうる、異なる微細藻類に由来する異なるフィコシアニンには種特異的な差異が存在しうる。

クラマス湖産藻類のフィコビリソームの構造決定および特異的特性
一般的に言うと、無傷のシアノバクテリア細胞において、フィコシアニン（ＰＣ）は、機能的形態（αβ）₆でフィコビリソームの内部に存在する（４１）。その細胞の破砕後、タンパク質は、分析される生体に応じて、異なる凝集状態（単量体、二量体、三量体、六量体）で見出すことができる。クラマス湖産藻類の場合、抽出物中に含まれるおよび抽出物自体から精製される両方の、ＰＣの電気泳動解析は、タンパク質が、大半の場合、総分子量１２１０００を有する、その三量体形態（αβ）₃で見出されることを示している。単量体αβは、約４００００（１８５００のサブユニットα＋２１９００のサブユニットβ）の分子量である。これとは別に、スピルリナから精製したＦＣに関する研究の大半が、タンパク質は、スピルリナにおいて約３７５００の分子量を有する単量体形態αβで見出され、したがって、ＡＦＡから精製したＰＣと比較して異なる凝集状態を示すことを示唆する。

ＡＦＡのフィコビリソームのクロマトグラフィー解析は、他のシアノバクテリア種において見られるように、ＰＣのαサブユニットが１つの補欠分子族に結合するのに対し、βサブユニットは２つの補欠分子族に結合することをも示している。その補欠分子族または発色団は、フィコシアノビリン（ＰＣＢ）と呼ばれ、タンパク質の青色およびその抗酸化力の両者の原因である（４２）。

ＡＦＡとスピルリナとの根本的な差異は、フィコビリソームの異なる構造に基づく。スピルリナに対して、クラマス湖産ＡＦＡのフィコビリソームは、色素アロフィコシアニンを含まず、スピルリナには欠如する構造的要素、すなわち、フィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）、に結合する色素ｃフィコシアニンのみを含む。ＦＥＣは、今日現在、限られた数のシアノバクテリア種中のみにおいて同定されている、光合成色素である（４３）。ＰＥＣは、ＦＣの化学的構造と極めて類似する化学的構造を有し、単量体および三量体を形成するために会合する２つのサブユニットαおよびβにより構成される。にもかかわらず、ＰＣの各単量体がＰＣＢの３分子に結合するのに対し、ＰＥＣはＰＣＢの２分子をサブユニットβに、また、フィコビオロビリン（ＰＶＢ）の１分子をαサブユニットに結合させる固有の特性を有し、これが、その色素の紫色の原因となっている。

クラマス湖産藻類のフィコビリソームが、ｃフィコシアニンおよびフィコエリスロシアニンの結合体により特異的に構成されると定義されるのはまったく初めてのことであり、クラマス湖産ＡＦＡ藻類フィコビリソームの、この異なる性質的構造が、スピルリナからＡＦＡを区別するさらに決定的な因子を追加する。

図４は、ＡＦＡの細胞溶解物の成分を、別のよく知られたシアノバクテリアである、シネコシスチス属ＰＣＣ６８０３の、成分と比較して、言われていることを確認する。両シアノバクテリアにおいても、フィコビリソームを表す青色バンドを見ることができるが、ＡＦＡ藻類におけるフィコビリソームは、より低い分子量を示し、スピルリナなど一般的な微細藻類とは異なり、ＡＦＡフィコビリソームにおいては、アロフィコシアニンではなく、フィコシアニンのみが存在することを確認する。さらに、図は、ＡＦＡ中にフィコエリスロシアニンに典型的な明るい紫色のバンド（矢印により示す）もまた存在することを示し、これにより、クラマス湖産藻類フィコビリソーム中におけるその存在を提供する。

定義を深めるため、各青色バンドは、質量分析計に接続したＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）によりさらに解析した。保持時間の差により、フィコビリソームのタンパク質を分離し、その分子量に基づきこれを同定した。得られた結果を、以下の表に示す。第１に、本発明者らは、シネコシスチス属（表１）においては、フィコシアニン（２８．２分におけるｃｐｃＡおよび２８．９分におけるｃｐｃＢ）およびアロフィコシアニン（３０．７分におけるａｐｃＡおよび３１．２分におけるａｐｃＢ）がともに存在するのに対し、ＡＦＡ（表２）においては、フィコシアニン（２８．８分におけるｃｐｃＡおよび３０．０分におけるｃｐｃＢ）のみが存在することがわかる。第２に、ＡＦＡにおいては、シネコシスチス属中には存在せず、２つのビリンが付着したフィコエリスロシアニンのベータサブユニットに対応する、分子量１９４６９のタンパク質（２５分におけるｐｅｃＢ）が同定されている。

この固有の構造が、全ＡＦＡ−ＰＣの、そのＰＣＢと比べてより強力な抗酸化および抗炎症作用を説明するのに重要な要素である。抗酸化および抗炎症特性は、これらが強力な神経保護をもたらす限りにおいて、この文脈で重要となり、全ＰＣは、神経保護の観点でもそのＰＣＢよりも強力であり、これは、フィコビリソーム中のＰＣＢ以外の他の活性成分、すなわち、その特異的なＰＶＢ発色団を有するＰＥＣが、ＡＦＡ−ＰＣにおける最も有効な健康増進主要成分である可能性が極めて高いことを明確に示唆する。精製済みＡＦＡ−ＰＣが、そのＰＣＢ発色団を有するＣ−ＰＣだけでなく、ＰＥＣおよびそのＰＶＢ発色団をも含むことは、精製の結果として得られる抽出物の分光分析を参照することにより明らかである（図５）。実際、Ｃ−ＰＣの最大吸収は、図５の分光分析においてピークの頂点を表す、６２０ｎｍである。しかし、ＰＥＣの最大吸収は、αサブユニット（フィコビオロビリンまたはＰＶＢ）について５６６ｎｍ、およびβサブユニットの２つのＰＣＢについてそれぞれ５９３ｎｍおよび６３９ｎｍであることも知られている。３つの値すべては、実際、精製済みＰＣの分光分析プロファイルを構成する釣り鐘型ピークに含まれている。ＡＦＡ藻類におけるＣ−ＰＣとＰＥＣとの間の、極めて断ち切りがたい、強い連結を考えると、これは、Ｃ−ＰＣ以外にＰＥＣも、必然的に、精製済みＰＣ抽出物の一部であるということを裏付ける。これは、同様に、ＡＦＡに由来するＰＣが、大半の研究がなされてきた、スピルリナ由来のそれ(ＰＣ)を含む、他のシアノバクテリアのＰＣとは、構造および機能の両面で顕著に異なること、および、この差異が、共通の一部分のみ、すなわちＣ−Ｐを有し、その他は有しないことにあり、Ｃ−ＰＣの特性がＡＦＡ−ＰＣのＣ−ＰＣ成分にも帰属させることができるのに対し、ＡＦＡに由来する全ＰＣの、Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体（その発色団であるＰＣＢおよびＰＶＢを含む）であることにおける、特性は、（他の任意の微細藻類中に存在する任意のＣ−ＰＣ／ＰＥＣ複合体と同様に）もっぱらこの複合体のみに帰属するという帰結を伴うことを意味する。

精製手法（図５）
ＰＣは、以下の通りに、乾燥ＡＦＡ抽出物から精製した。
・５００ｍｇの抽出物を、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４中に懸濁させる；
・４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離する；
・上清を回収し、固体の硫酸アンモニウムを５０％飽和まで添加する；
・試料を攪拌状態に保ちつつ、４℃で６０分間タンパク質を沈殿させる；
・４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する；
・無色透明の上清を廃棄し、少量の５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４中に青色の沈殿物を再懸濁させる；
・同じ緩衝液に対して、４℃で一晩透析する；
・５ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４で平衡化したヒドロキシアパタイト製カラム内に透析済みＰＣを入れる；
・イオン強度を上昇（５〜１５０ｍＭ）させているリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０で試料を溶出する；
・その分画を回収し、分光光度計により６２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を読み取る；
・Ａｂｓ₆₂₀／Ａｂｓ₂₈₀＞４（純ＰＣの指標）である分画をプールする；
・５０％飽和の硫酸アンモニウムにより、４℃で１時間ＰＣを沈殿させる；
・４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間（３０’）遠心分離する；
・上清を廃棄し、１５０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．４中にＰＣを再懸濁する；
・同じ緩衝液に対して、４℃で透析する；
・精製済みＰＣをフラスコに移し、暗所中＋４℃または−２０℃で保存する。

フィコシアニンの定量
純ＰＣのモル濃度を測定するため、本発明者らは、三量体形態（αβ）₃では７７００００Ｍ^-1ｃｍ^-1に等しい、６２０ｎｍにおけるモル吸光係数εを用いた。これは、１ＭのＰＣ溶液が、６２０ｎｍにおいて吸光値７７００００を有することを意味する。

その抽出物中のＰＣ濃度を測定するため、本発明者らは、６２０ｎｍにおける比吸光度（the coefficient of specific extinction）Ｅ^1%として７０ｌｇ^-1ｃｍ^-1を用いた。これは、１％のＰＣ（すなわち、１ｇ／１００ｍｌ）を含む溶液が、６２０ｎｍにおいて７０を吸収することを意味する。これらの計算によれば、その抽出物中の平均ＰＣ含量は、８０〜１００ｍｇ／ｇＤＷ（８〜１０％ＤＷ）に等しい。

ＰＣＢ発色団の精製（図６）
・５００ｍｇの抽出物を、５０ｍｌの蒸留済みＨ₂Ｏ中に懸濁させる。
・４℃、２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離する。
・藍色の上清を静かに移し、１％のトリクロロ酢酸によりＰＣを沈殿させる。
・攪拌しつつ、暗所中４℃で１時間インキュベートする。
・４℃、１００００ｒｐｍで３０分間（３０’）遠心分離する。
・ＰＣを含むペレットを回収し、メタノールで３回洗浄する。
・１ｍｇ／ｍｌのＨｇＣｌ₂を含む１０ｍｌのメタノール中にそのペレットを再懸濁させる。
・暗所中４２℃で２０時間インキュベートし、ＰＣからＰＣＢを放出させる。
・２５００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離し、タンパク質を除去する。
・ＰＣＢを含む上清にβメルカプトエタノール（１μｌ／ｍｌ）を添加し、ＨｇＣｌ₂を沈殿させる。
・ −２０℃で２４時間インキュベートする。
・４℃、１００００ｒｐｍで３０分間（３０’）遠心分離し、白色の沈殿物を除去する。
・上清に１０ｍｌの塩化メチレン／ブタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加する。
・２０ｍｌの蒸留済みＨ₂Ｏで洗浄し、３０００ｒｐｍで１０分間（１０’）遠心分離する。
・上層を除去し、ＰＣＢを含む下層部分を回収する。
・１５ｍｌＨ₂Ｏ中で、ＰＣＢを３回洗浄する。
・窒素下で乾燥させ、−２０℃で保存する。

クラマス湖産ＡＦＡ抽出物およびそれを構成する主要な活性のある構成要素であるフィトクロム、フィコシアニンおよびＭＡＡによるＭＡＯ−Ｂ阻害の評価
本発明者らは、特異的基質であるベンジルアミン（１ｍＭ）を用いて、基本抽出物のＭＡＯ−Ｂ阻害活性を試験した。その試験は、上記のステップａ）〜ｃ）によって取り出した（初期濃度１０ｍｇ／ｍｌ）、基本抽出物の水溶性および脂溶性成分の異なる濃度とともに、ＭＡＯ−Ｂ（２μｇ／ｍｌ）をプレインキュベートすることにより、波長２５０ｎｍ、３０℃で分光光度計により実施した。水溶性成分に富む抽出物は、水中にその水溶性抽出物を再懸濁させ、遠心分離後に上清を回収することにより調製した。親油性成分に富む可溶性抽出物は、アセトン中にその抽出物を再懸濁させ、その後、上清を乾燥させ、ペレットを、ＭＡＯ−Ｂ投与と相溶性のある溶媒である、ＤＭＳＯ中に再懸濁させることによって得られた。

図７Ａに示す通り、その水溶性分画が、ＭＡＯ−Ｂを用量依存的な方法で阻害するのに対して、その親油性分画は、酵素を阻害しない。ＡＦＡ基本抽出物の水溶性分画は、６．９μＬのＩＣ₅₀を有する、強力な選択的ＭＡＯ−Ｂ阻害物質である。そのＭＡＯ−Ｂ選択性は、４である（ＩＣ₅₀ ＭＡＯ−Ｂ／ＩＣ₅₀ ＭＡＯ−Ａ＞４．０５）（図７Ｂ）。

図８のラインウィーバー−バークプロットは、このような阻害が、可逆的で、競合に関して混合型であり、Ｖ_maxの低下およびミカエリス−メンテンによるＫ_m定数の上昇を伴うことを示す。ＡＦＡ抽出物の水溶性分画の濃度に対して傾きをプロットすると、１μＬの阻害定数Ｋ_iが得られる。基本抽出物の水溶性分画と比べると、この低いＫ_i値は、ＭＡＯ−Ｂ酵素に対する高い親和性を示す。

その抽出物の阻害が可逆的であるという事実は、この阻害が、もっともらしく副作用なしに生理活性を及ぼすことを意味する。混合型競合については、競合的でもあれば非競合的でもある、異なる機能分子を含む、抽出物の複合的な性質に起因する可能性が極めて高い。その抽出物の主要活性成分は、ＡＦＡフィトクロム（０．５％ＤＷ）、フィコシアニン（８〜１０％ＤＷ）、およびＭＡＡまたはマイコスポリン様アミノ酸（１．７〜２．１％ＤＷ）であり、本発明者らは、これらを個別に、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質として試験した。

フィコシアニンによるＭＡＯ−Ｂ阻害
その試験は、基質としてベンジルアミンを用い、ＭＡＯ−Ｂを、ＡＦＡから精製した各濃度のＰＣ（０．５〜４μＭ）とともにプレインキュベートすることにより、波長２５０ｎｍ、３０℃で分光光度計により実施した。図９に示す通り、ＡＦＡ−ＰＣは、１．４４μＭのＩＣ₅₀により、ＭＡＯ−Ｂ活性の用量依存的な低下をもたらした。ＡＦＡ−ＰＣのＭＡＯ−Ｂ選択性は、３．５より高い（ＩＣ５０ＭＡＯ−Ｂ／ＩＣ５０ＭＡＯ−Ａ＞３．５）。

図１０におけるラインウィーバー−バークプロットは、その抽出物の場合と同様に、阻害が可逆的で、ＶｍａｘおよびＫｍ双方の変更を伴う混合型（競合的および非競合的）であることを示す。

ＰＣ濃度に対して傾きをプロットすることにより、本発明者らは、この場合１．０６μＭである、阻害定数Ｋ_iの値を得る。阻害定数は、酵素に対する阻害物質の親和性を評価する。高いＫ_iが酵素に対する低親和性を示し、逆もまた同様である。この場合、低いＫ_i値は、ＭＡＯ−Ｂに対するＡＦＡ−ＰＣの高い親和性を示す。

ＭＡＡによるＭＡＯ−Ｂ阻害
ベンジルアミン基質上におけるＭＡＯ−Ｂ活性を、２０％メタノールにより基本抽出物からあらかじめ精製した、ＭＡＡ濃度の上昇（０．５〜８μＭ）との関連で評価した。図１１は、１．９８μＭのＩＣ₅₀を有する、ＭＡＡによる用量依存的なＭＡＯ−Ｂ阻害を示す。ＭＡＡのＭＡＯ−Ｂ選択性は、２より高い（ＩＣ₅₀ＭＡＯ−Ｂ／ＩＣ₅₀ＭＡＯ−Ａ＞２．０２）。

ラインウィーバー−バークプロット（図１２）は、阻害が、Ｋ_mの上昇を伴うがＶ_maxの変化は伴わず、可逆的かつ競合的であることを示す。これは、ＭＡＡが、化学構造により、酵素の活性部位に対する連結について基質と競合することを意味する。ＭＡＡ濃度に対して傾きをプロットすることにより（図１３）、本発明者らは、０．５８５μＭであり、酵素に対するとても高度の親和性を示す、阻害定数Ｋ_iの値を得る。

ＡＦＡフィトクロムによるＭＡＯ−Ｂ阻害
その試験は、基質としてベンジルアミンを用い、ＭＡＯ−Ｂを、各濃度の精製済みＡＦＡフィトクロム（８．３〜６６．４ｎＭ）とともにプレインキュベートすることにより、波長２５０ｎｍ、３０℃で分光光度計により実施した。図１５に示す通り、ＡＦＡフィトクロムは、２０．２ｎＭという低いＩＣ₅₀により、ＭＡＯ−Ｂ活性の用量依存的な低下をもたらす。

図１６におけるラインウィーバー−バークプロットは、その抽出物の場合と同様に、阻害が可逆的で、Ｖ_maxおよびＫ_m双方の変更（modification）を伴う混合型（競合的および非競合的）であることを示す。

ＡＦＡフィトクロム濃度に対して傾きをプロットすることにより、本発明者らは、この場合１０．４８ｎＭである、阻害定数Ｋ_iの値を得る。阻害定数は、酵素に対する阻害物質の親和性を評価する。高いＫ_iが酵素に対する低親和性を示し、逆もまた同様である。この場合、極めて低いＫ_i値は、ＭＡＯ−Ｂに対するＡＦＡフィトクロムの極めて高い親和性を示す。

ＭＡＡの競合的で可逆的な作用は、これらの分子をＭＡＯ−Ｂ阻害において極めて強力にする。実際、ＭＡＯ−Ｂ阻害の競合的で可逆的な特徴は、高度の有効性と生理的で副作用のない活性とを同時に確保する。この意味で、その抽出物中に含まれるＭＡＡは、その分子量および結果としての血液脳関門を容易に通過する能力にも起因して、ｉｎｖｉｖｏにおいても、ＭＡＯ−Ｂ阻害に由来する治療的効果を生じるために、決定的な成分を構成する。

ＭＡＡもさることながら、フィトクロムは、今まで知られるすべての物質で最も強力なＭＡＯ−Ｂ阻害物質であることがわかっている。ＭＡＯ−Ｂ酵素に対するその極めて高い親和性、および数ナノモルの用量におけるその有効な阻害は、この分子を、それ自体において完全な治療用作用物質とするだけでなく、１つまたは複数のＡＦＡ抽出物の高い神経学的な有効性への最も重要な寄与を提供すると思われる因子にさせる。

ＭＡＡおよびフィトクロムに関するいくつかの考察は、フィコシアニンのｉｎｖｉｖｏにおける挙動にも適用することができることを付け加えるべきであろう。本発明者らは、ＰＣが、ｉｎｖｉｖｏにおける脳に対する神経保護効果をもたらし、そのために、ＰＣが血液脳関門を通過しうることを知っている（４４）。これは、ＰＣが、ｉｎｖｉｖｏにおいて脳におけるそのＭＡＯ−Ｂ阻害活性を実現しうることを意味する。発色団の分子量は、実際、７００に過ぎず、ＭＡＡの分子量とあまりかわらない。フィコシアノビリンと構造的に類似する、フィトクロムの発色団である、フィトクロモビリンについても同じことがあてはまる。

結論として、その抽出物およびその活性成分である、ＡＦＡフィトクロム、ＡＦＡ−ＰＣおよびＭＡＡ側のＭＡＯ−Ｂの阻害活性は、以下の表に示す通り、分子および抽出物がともに、薬理学的物質以上の、最高レベルの活性に位置し、いずれの試験天然分子よりもはるかに優れているため、極めて重要である（４５）。

表が示す通り、フィコシアニンおよびＭＡＡのみが、１μＭよりもわずかに高いＩＣ５０を有し、このため、デプレニル（０．３１μＭ）のＩＣ５０に極めて近く、考察した他の分子のＩＣ５０よりも１０倍低い。一方、ＡＦＡフィトクロムは、デプレニルのＩＣ５０よりも１５倍低いＩＣ５０を有する。酵素に対する阻害物質の親和性を評価する阻害定数Ｋ_iについても同じことがあてはまる。ＡＦＡフィコシアニンは、コーヒーおよびタバコの非ハーマンアルカロイドと同様に（しかし、もちろん、これら２つの物質に関連する問題なしに）約１μＭのＫ_iを有する。一方、ＭＡＡおよびＡＦＡフィトクロムのみが、デプレニルと共に、１μＭより低いＫ_iを有し、したがって、ＭＡＯ−Ｂに対して極めて高い親和性を有する分子である。実際、ＡＦＡフィトクロムは、セレギリン／デプレニル以外で、そのＫ_iが数ナノモルのオーダーにある唯一の天然分子である。しかし、セレギリン／デプレニルとＡＦＡ抽出物の分子との間には、本質的な差異がある。前者が非可逆的な阻害物質であり、このため、潜在的な副作用を特徴とするのに対して、クラマス湖産ＡＦＡのＭＡＯ−Ｂ阻害分子は、すべてが可逆的であり、合成分子に関連する問題のない生理活性を特徴とする。

図１４は、デプレニルに関してＡＦＡの３つの分子のＭＡＯ−Ｂ阻害活性を図示する。基本抽出物（および他のＡＦＡ抽出物）中における３つの分子すべての相乗作用を考えると、基本抽出物の全体のＭＡＯ−Ｂ阻害活性は極めて高い結果となる。その中に存在するＰＥＡの高い分量をも考えると、特に重要となる事柄である。もし本発明者らが基本抽出物を、そのＰＣ含量に基づきデプレニルと比較する場合、本発明者らは、基本抽出物が、０．０５μＭという低いＰＣ用量でＩＣ５０に達し、これが、デプレニルよりも７．５倍高い（および天然物質よりも数十倍高い）効力を示すということを得る。これは、基本抽出物中に含まれるフィトクロムの効力に照らして意味を持つ。実際、７．５倍とは、ＰＣとＭＡＡの阻害効力の間の平均であり、それは、デプレニルよりやや低く、そして、１５倍高い、フィトクロムのそれ(阻害効力)である。（図１７）。これは、精製済みＡＦＡ−ＰＣと比べて、その抽出物のより高い効力が、大部分、フィトクロムに起因することをも示す。

さらに、その抽出物は、そのＭＡＯ−Ｂ阻害が可逆的で主に競合的であり、このため、デプレニルおよび他の合成物質などの不可逆的分子と潜在的に関連する副作用がない、生理的に作用する天然物質であることの利点を依然として維持する（４６）。

その抽出物のさらなる利点は、他の分子と完全に相乗的に作用する、強力なドーパミン作動性神経調節物質である、フェニルエチルアミンの高含量であり、この相乗活性を、本発明者らは以下のようにまとめることができる。

・フェニルエチルアミンまたはＰＥＡは、黒質線条体組織からのドーパミンの放出を刺激すること、およびドーパミン自体のシナプス後の再取り込みを阻害することの両方において、二重のドーパミン作動性活性を有する；
・フィトクロム、ＭＡＡおよびフィコシアニンは、減少したＭＡＯ−Ｂ活性が、ドーパミンを含む、神経アミンのより長い寿命を示唆する限りにおいて、強力なＭＡＯ−Ｂ阻害物質として、またドーパミン作動性伝達をも増大させる；
・フィトクロム、ＭＡＡおよびフィコシアニンは、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質として、また、それ自体がＭＡＯ−Ｂ酵素の脱アミノ化活性の対象である、フェニルエチルアミンの寿命および活性をも延長させ、結果として、ＰＥＡによって引き起こされる、より全般的な神経調節ならびにドーパミン作動性伝達および活性に対するさらなる支援の好循環を作り出す。
・最後に、それ自身またはその発色団の血液脳関門を越える能力と一緒に、フィコシアニンの強力な抗酸化および抗炎症活性のほかに、フィトクロムの極めて高度な抗酸化活性、およびそれほど強力ではないが顕著なＭＡＡの抗酸化活性が、いかなる酸化的損傷および炎症による損傷から、異なる活性分子およびより一般的にそれらが作り出す神経的好循環を保護する、神経保護もまた、もたらす。

神経保護
本発明者らは、グルタミン酸の神経毒性効果に対する、ＡＦＡ抽出物、特異的なＡＦＡ−ＰＣ、およびその発色団であるＰＣＢのほか、ＭＡＡの神経保護特性を調べた。

グルタミン酸は、哺乳動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であるが、ニューロンにおけるそのＮＭＤＡサブタイプ受容体の過剰刺激はＣａ²⁺の大量の細胞内蓄積を引き起こし、細胞死をもたらす。ミトコンドリア内のＣａ²⁺蓄積に加えて、ＮＭＤＡ受容体刺激後、細胞質における遊離Ｃａ²⁺の一過性の増加は、一酸化窒素（ＮＯ・）または、主に初代（primary）ニューロンにおいて、そのスーパーオキシド（Ｏ２・^-）反応生成物、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯ^-）を形成する酵素、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）のニューロンのアイソフォーム（４９）を活性化する。

ニューロンのグルタミン酸への曝露は、若干変更した方法（５０）に従い実施した。
培地を除去し、ニューロンをあらかじめ３７℃に温めて緩衝処理したハンクス液（５．２６ｍＭＫＣｌ、０．４３ｍＭＫＨ₂Ｈ₂ＰＯ₄、１３２．４ｍＭＮａＣｌ、４．０９ｍＭＮａＨＣＯ₃、０．３３ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、２０ｍＭグルコース、２ｍＭＣａＣｌ₂、および２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で１回洗浄し、あらかじめ３７℃に温めて緩衝処理したハンクス液中で、複数の濃度のＡＦＡ抽出物（１〜５０ｎＭ）、ＰＣ（１０〜１０００ｎＭ）、ＰＣＢ（１０〜１０００ｎＭ）およびＭＡＡ（１〜１０μＭ）の不在または存在下においてプレインキュベートした。３０分間のプレインキュベーション後に、Ｌグルタミン酸を濃縮液から１００μＭさらに１０μＭのグリシン、を示す最終濃度まで添加された。３７℃で１５分間ニューロンをインキュベートし、その緩衝液を吸引し、ＤＭＥＭで置換し、細胞をエフェクター不在下においてさらに２４時間３７℃でインキュベートした。

ＤＮＡに結合し、アポトーシスニューロン、すなわち、細胞核の断片化または凝縮化を示すニューロンの定量を可能とする、膜透過性蛍光染料である、ＤＡＰＩ（５０）で細胞核を染色することにより、アポトーシスを評価した。簡潔に言うと、グルタミン酸曝露後の２４時間、ニューロン培養物を温熱ＰＢＳ（３７℃）で洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳ中に４％（ｗｔ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳによる洗浄後、暗所内室温で１０分間、細胞を３μＭＤＡＰＩに曝露し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。フルオレセインフィルター（３３０〜３８０の励起、３０Ｘの倍率）を用いて、蛍光顕微鏡によりクロマチン凝縮について、細胞を記録した。総細胞核およびアポトーシス細胞核をカウントした。いずれの場合も、プロトコールデザインについて明るくない実施者により、ウェル当たり（per well）約６００〜１，０００個の細胞がカウントされた。個々の培養物に基づく測定は重複して（duplicate）実施し、結果は、表示された培養調製物数の平均（mean）ＳＥＭ値として表す。その結果の統計学的解析は、クルスカル−ワリス検定の後、最小有意差多重範囲検定により判定した。いずれの場合も、ｐ−０．０５を有意と考えた。

このグルタミン酸損傷試験により、本発明者らは、ＡＦＡ基本抽出物、ＡＦＡ−ＰＣ、そのＰＣＢ、およびＭＡＡの神経保護能を初めて示した。図１８が示す通り、培養済みニューロン細胞へのグルタミン酸の添加は、アポトーシスレベルを２２．９％±３ｎ＝４（ｐ＜０．０５）の比率まで上昇させたのに対し、
そのＡＦＡ基本抽出物の同時の添加は、グルタミン酸毒性に対する極めて高い保護をもたらし、既に１ｎＭのような低量の抽出物によって、アポトーシスレベルを対照レベル（６．３±１ｐ＞０．０５）未満に低下させた（結果は、３〜８種類の異なる細胞培養物の平均±ＳＥＭ。＃対照群と比べたとき、有意に異なる（ｐ＜０．０５）；^*グルタミン酸対照と比べたとき、有意に異なる（ｐ＜０．０５））。ＭＡＡが与える保護については、それらはまた、より高用量の１μＭで、アポトーシスレベルを対照レベル未満に低下させる（図１９）結果は、３〜８種類の異なる細胞培養物の平均±ＳＥＭ。＃対照群と比べたとき、有意に異なる（ｐ＜０．０５）；^*グルタミン酸対照と比べたとき、有意に異なる（ｐ＜０．０５））。ＡＦＡ−ＰＣおよびＰＣＢについて、本発明者らは、それらのアポトーシス阻害が極めて類似し、細胞培養物へのそれらの添加が、約１０ｎＭの用量で、アポトーシスの程度を対照未満に低下させるということがわかる（図２０および２１：結果は、３〜８種類の異なる細胞培養物の平均±ＳＥＭ。＃対照群と比べたとき、有意に異なる（ｐ＜０．０５）；^*グルタミン酸対照と比べたとき、有意に異なる（ｐ＜０．０５））。

ＡＦＡ−ＰＣによる阻害の程度は、ＰＣＢの場合とほぼ等しい。おそらくその最も活性な成分と思われるＰＣＢが、一度精製されひいてはより濃縮されると、その活性成分である全分子よりも顕著に強力であるべきことを踏まえると、これは、いささか驚くべきことである。それが実質的に同じ効力を有する事実は、全ＰＣにおいて、ＰＣＢ自体よりも実際にはさらに強力でありうる他の因子が存在することを意味する。本発明者らは、全ＰＣが、Ｃ−ＰＣおよびそのＰＣＢ発色団のほかに、ＰＣＢおよびＰＶＢ（フィコビオロビリン）をともにその発色団として含む、ＰＥＣからもなることを知る。したがって、本発明者らは、本明細書において、精製済みＰＣＢと全ＰＣとの間の効力での顕著な差異を創出する因子は、正確にＰＥＣ成分、特に、極めて強い抗酸化物質であると推定される、そのＰＶＢ発色団であるということを推定することができる。

神経保護の観点では、ＭＡＡは役割を果たすと思われるが、ＰＣおよびＰＣＢよりも顕著に低度である。しかし、最も強力な神経保護物質は、明らかに、全ＡＦＡ抽出物であり、これは、わずか１ｎＭ（ナノモル）で細胞アポトーシスを完全に阻害することができる。これは、ＰＣおよびＰＣＢの効力の１０倍である。これは、全ＡＦＡ抽出物中に存在する多数の異なる抗酸化因子の相乗作用により確かに説明しうるが、本発明者らは、上述で、ＡＦＡフィトクロムが、今までおそらく最も強力な抗酸化物質であり、わずか１６ナノモルでＭＤＡ（脂質過酸化の後期副生成物）の形成をほぼ完全に阻害しうる、ということを見たので、ＡＦＡフィトクロムが、基本抽出物のより高い効力を説明する中で重要な因子である可能性が極めて高い。こうして、本発明者らは、ＡＦＡフィトクロムが、任意のそしてすべてのフィトクロムと同様に、重要な神経保護作用物質であると結論付けることができる。

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Claims

以下のｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の成分の、神経系の疾患、病態、機能不全または障害の予防、制御または治療用の組成物の製造のための、使用。
ｉ）ＡＦＡ藻類［微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎＦｌｏｓＡｑｕａｅＡｑｕａｅＲａｌｆｓｅｘＢｏｒｎ．＆Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓａｑｕａｅ）（クラマス湖産ＡＦＡ）］の抽出物であり、以下のステップ：
ａ）採取直後のＡＦＡ藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥ＡＦＡ藻類粉末である場合は、水で希釈したＡＦＡ藻類粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する；
ｂ）ステップａ）の生成物を遠心分離し、沈殿物から上清を分離する；
ｃ）水溶性成分を含む上清を回収する
により調製される該抽出物。
ｉｉ）Ｃ−フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）、その個別の発色団であるフィコシアノビリン（ＰＣＢ）およびフィコビオロビリン（ＰＶＢ）、そのＡＦＡフィトクロムおよびマイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）から選択されるいずれか１種のＡＦＡ藻類からの単離成分。
ｉｉｉ）前記ｉｉ）に記載の、Ｃ−フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）、その個別の発色団であるフィコシアノビリン（ＰＣＢ）およびフィコビオロビリン（ＰＶＢ）、そのＡＦＡフィトクロムおよびマイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）から選択される２種以上の単離成分の混合物。
前記神経系の疾患、病態、機能不全または障害が、以下のうちの１つである：アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、うつ病、記憶欠損および気分障害、請求項１に記載の使用。
前記上清を、３０，０００ドルトンのカットオフ分子量を有する限外濾過膜を用いる限外濾過にかけることにより、ＡＦＡ藻類の抽出物がさらに精製される、請求項２に記載の使用。
前記単離成分が、シノリンおよびポルフィラ３３４から選択されるマイコスポリン様アミノ酸である、請求項１に記載の使用。
前記単離成分が、フィコシアニン／フィコエリスロシアニン複合体（Ｃ−ＰＣ／ＰＥＣ）またはその単独の部分成分（subcomponent）としてのＣ−ＰＣまたはＰＥＣである、請求項１に記載の使用。
前記単離成分が、フィトクロムである、請求項１に記載の使用。
前記単離成分の混合物が、マイコスポリン様アミノ酸、フィコシアニン、フィコエリスロシアニン、およびフィトクロムからなる、請求項１に記載の使用。
前記混合物が、フェニルエチルアミン（ＰＥＡ）をさらに含む、請求項７に記載の使用。
前記組成物がヒトへの投与に適する、請求項１に記載の使用。
前記ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の成分が、薬剤的に許容できる媒体（vehicles）または賦形剤（excipients）と共に調合される、請求項１に記載の使用。
神経保護薬の調合のための、ＡＦＡフィコシアニン(ＡＦＡ−ＰＣ)およびその発色団フィコシアノビリン（ＰＣＢ）から選択される、ＡＦＡ藻類［微細藻類アファニゾメノン・フロスアクアエ（ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎＦｌｏｓＡｑｕａｅＡｑｕａｅＲａｌｆｓｅｘＢｏｒｎ．＆Ｆｌａｈ．Ｖａｒ．ｆｌｏｓａｑｕａｅ）（クラマス湖産ＡＦＡ）］の単離成分の使用。