PT2046354E - Preparação de alfanizomenon flos aquae, extractos e componentes purificados da mesma para o tratamento de distúrbios neurológicos, neurodegenerativos e de humor - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO " PREPARAÇÃO DE ALFANIZOMENON FLOS AQUAE, EXTRACTOS E COMPONENTES PURIFICADOS DA MESMA PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEUROLÓGICOS, NEURODEGENERATIVOS E DE HUMOR" A presente invenção refere-se à microalga Aphanizomenon Fios Aquae Aquae Ralfs ex Born. & Flah. Var. fios aquae (AFA Klamath). Mais exactamente, a invenção proporciona extractos de AFA Klamath úteis para a prevenção ou tratamento de especifico condições ou doenças neurológicas, neurodegenerativas e de humor.

Antecedentes da invenção A feniletilamina (PEA) é uma amina endógena sintetizada por meio de descarboxilação de fenilalanina em neurónios dopaminérgicos do sistema nigroestriatal, e pode agir como um neuromodulador de neurotransmissão de catecolamina no cérebro (1). A mais importante acção de PEA é promover a neurotransmissão de catecolaminas. É conhecido que PEA estimula a libertação de acetilcolina bem como dopamina (2) . Além disso, a PEA aumenta a neurotransmissão de norepinefrina (NE) (6) e inclusive a neurotransmissão de serotonina.

Recentemente foi mostrado que PEA pode também trabalhar como um neurotransmissor autónomo, com seus receptores neuronais específicos; e que age como um verdadeiro neuromodulador, sendo também capaz de deprimir a neurotransmissão se for necessário. (8) A partir disto deriva uma completa série de efeitos: estimulação de atenção e memória; melhora do humor, com significativa actividade anti-depressiva; promoção de empatia e assim sociabilidade, incluído comportamento emocional e sexual; inibição da fome; redução da necessidade de abuso de substâncias e dependência de drogas. 2 A ligação entre PEA e humor emocional foi confirmada por meio de estudos por meio dos quais níveis de PEA de maneira significativa menores, medidos como tal ou através de seu metabolito PAA (ácido fenilacético) no plasma ou urina, foram encontrados em indivíduos deprimidos. (9)

Foi visto que pacientes com Parkinson têm níveis de PEA significativamente menores, como medidos directamente no plasma (12). A redução progressiva da neurotransmissão, particularmente dopaminérgica, nestes pacientes, está relacionada com a degeneração progressiva dos neurónios dopaminérgicos da substância negra.

Esta redução nos níveis de PEA é acompanhada de um aumento paralelo em níveis de MAO-B em pacientes parkinsonianos, por essa razão, os fármacos utilizados em Parkinson são inibidores de MAO-B, tais como selegilina. (14) Além disso, uma vez ingerida, a PEA pode facilmente passar através da barreira hematoencefálica e estimular a libertação de dopamina a partir do tecido nigroestriatal, mesmo em baixas dosagens. Este é um importante carácter distintivo, porque o fármaco actualmente utilizado, selegilina, embora iniba MAO-B e a recaptação de dopamina, não tem qualquer acção sobre a sua libertação do tecido nigroestriatal pelo que não ajuda a produzir mais dopamina, o que constitui um limitação grave numa patologia tal como Parkinson, onde a geração de dopamina está enormemente comprometida. A doença de Alzheimer envolve uma degeneração do mecanismo de produção e recaptação de dopamina e a destruição progressiva dos neurónios da área estriatal, o que, ao longo do tempo, leva a um baixo número de neurónios dopaminérgicos e consequentemente de transmissão de dopamina. (15)

Embora não existam dados claros sobre o facto de a TDAH (Transtorno do Défice de Atenção e Hiperactividade) é uma patologia neurodegenerativa, alguns estudos têm tentado 3 provar que a destruição neuronal é uma causa principal de TDAH, tanto em crianças como em adultos. (19)

Mais importante é existirem evidências de que as crianças afectadas por TDAH e incapacidades de aprendizagem têm níveis de PEA significativamente menores (21) e, desse modo, uma redução na neuromodulação de atenção (dopamina) e sedação (serotonina). Este é o motivo por que o fármaco de escolha para TDAH é metilfenidato, um derivado sintético de PEA, que também age pelo estímulo de uma maior produção de PEA (22) e, assim, de dopamina e norepinefrina, dois neurotransmissores directamente envolvidos na etiologia do TDAH. É bem conhecido a utilização de anfetaminas para controlar a fome e, consequentemente, o peso. A sua utilização nesta área tem sido sempre controversa devido aos seus efeitos secundários que, dada também sua tolerância, tendem a tornar-se potencialmente muito graves ao longo do tempo. Isto é confirmado pelo facto de os principais fármacos actualmente utilizados para o controlo da fome e do peso serem anti-depressivos dopaminérgicos similares a anfetamina, tais como venlafaxina e bupropriona. Estas moléculas, como todas as anfetaminas, são derivados sintéticos de PEA. Esta última age como um supressor potente do apetite à medida que sua degradação por enzimas MAO-B é prevenida. A monoaminoxidase (MAO) A e B catalisa a degradação de aminas neuroactivas e vasoactivas no SNC e em tecidos periféricos. A MAO-B, em particular, dada a sua relevância directa e indirecta para a transmissão dopaminérgica, está envolvida em distúrbios neurológicos onde a dopamina é essencial, tais como a depressão e os distúrbios de humor, as doenças de Parkinson e Alzheimer. Por esta razão, os inibidores de MAO-B são utilizados no tratamento destes distúrbios neurológicos. (26)

Descrição da invenção 4 A invenção baseia-se na identificação, na microalga Aphanizomenon Fios Aquae Aquae Ralfs ex Born. & Flah. Var. fios aquae (AFA Klamath) , de substâncias que, em combinação, exercem efeitos benéficos sobre várias doenças, condições, disfunções ou distúrbios neurológicos, incluindo doenças neurodegenerativas, nomeadamente doenças de Parkinson e Alzheimer, esclerose múltipla, transtorno do défice de atenção e hiperactividade (TDAH), autismo, depressão, défice de memória e distúrbios de humor. Em particular, descobriu-se que a microalga AFA Klamath contém, além de feniletilamina, que é um neuromodulador caracterizado por actividade dopaminérgica e noradrenérgica, moléculas específicas que de forma completamente surpreendente provaram ser inibidores muito eficazes da enzima monoaminoxidase B (MAO-B), a saber: a) o fitocromo de AFA específico; b) o complexo de ficobiliproteína de AFA que contém um ficobilissoma formado por C-ficocianina (C-PC) e ficoeritrocianina (PEC, incluindo seu cromóforo ficoviolobilina ou PVB) ("ficocianinas de AFA"); c) aminoácidos similares a micosporina ou MAAs. Esta descoberta é muito importante, uma vez que a PEA contida nas algas, a não ser que seja protegida por inibidores de MAO-B, seria rapidamente destruída após ingestão pela enzima MAO-B.

As mesmas moléculas que agem como inibidores selectivos de MAO-B, também realizam um poderoso papel neuroprotector, assim potenciando significativamente a habilidade do extracto de promover a saúde neurológica.

Consequentemente, a invenção proporciona uma utilização para o fabrico de uma composição para prevenir, controlar ou tratar as doenças, as condições, as disfunções ou os distúrbios neurológicos mencionados anteriormente de um extracto de AFA Klamath enriquecido em tais componentes activos, que é preparado através das seguintes etapas: 5 a) congelar a alga AFA recentemente colhida e descongelá-la ou, se o material de partida é pó de AFA seco, sonicar o pó de AFA diluido em água para romper as células; b) centrifugar o produto da etapa a) para separar o sobrenadante (retendo a maioria da porção citoplasmática) do precipitado (retendo a maioria da fracção de parede celular); c) colher o sobrenadante que contém os componentes solúveis em água. 0 produto resultante é um extracto (indicado como "Extracto básico") que concentra PEA, bem como outras moléculas sinérgicas, tais como o fitocromo de AFA, as ficocianinas de AFA e os MAAs. Por exemplo, ao passo que a microalga Klamath tem um conteúdo natural de PEA que varia desde 2 até 4 mg/g, o extracto básico aumenta esta concentração a um nivel que varia desde 9 a 11 mg/g (análise por meio de HPLC). É possivel purificar adicionalmente o extracto pela passagem do mesmo através de um sistema de ultra-filtração, preferentemente através de uma membrana com um corte de peso molecular de 30.000 Daltons. O retentato da ultra-filtração (Extracto A) contém como componentes activos principais as ficocianinas de AFA (peso mol. = 121.000) e o fitocromo de AFA (peso mol. 480.000). De maneira interessante, mesmo quando os MAAs têm um peso molecular bem abaixo do tamanho de corte utilizado, o retentato também aumenta a concentração de MAAs. O extracto básico obtido pelas etapas a) a c), isto é, sem ultra-filtração, é geralmente preferida já que contém as quantidades mais apropriadas de PEA, fitocromo de AFA, AFA-PC e MAAs. Além disso, este extracto básico também inclui substâncias tais como clorofila e carotenos, mesmo que numa proporção reduzida, contribuindo para as suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. 6 A inibição observada de monoaminoxidase-B é particularmente relevante uma vez que permite aumentar a transmissão dopaminérgica e minimizar o catabolismo de PEA. De maneira significativa, tanto fitocromo como AFA-ficocianina inibem MAO- B de uma forma reversível e misturada, ao passo que inibição de MAO-B pelos MAAs é competitiva e reversível; portanto, todas as três moléculas asseguram eficácia alta em condições fisiológicas e na ausência de efeitos secundários.

Num aspecto adicional, a invenção é dirigida a um nutracêutico ou composição farmacêutica que contém um extracto de AFA Klamath para utilização como foi descrito anteriormente. Numa forma de realização preferida, as composições nutricionais são suplementos dietéticos na forma de comprimidos, cápsulas, bebidas; numa forma de realização preferida adicional, as composições farmacêuticas são na forma de comprimidos, cápsulas, saquetas, xaropes, supositórios, viais e pomadas para utilização para a prevenção ou tratamento de condições ou doenças neurodegenerativas ou neurológicas indicadas anteriormente. Os extractos líquidos de AFA Klamath para utilização de acordo com a invenção podem ser utilizados tal qual ou podem ser secos através de metodologias tais como liofilização, secagem por atomização ou similares. A dose de ingrediente activo dependerá da utilização pretendida das composições, se como suplemento nutricional ou como uma preparação farmacêutica. A quantidade eficaz de cada componente será geralmente compreendida nos seguintes intervalos: PEA = 0,1 - 100 mg, preferentemente 5-30 mg; fitocromo = 0, 1 - 1000 pg, preferentemente 0,8 - 10 mg; MAAs = 0, 1 - 1000 pg, preferentemente 10 - 100; ficocianinas = 1 - 2500 mg, preferentemente 50 - 1000 mg. Descrição detalhada da invenção

Identificação de "fitocromo de AFA", um fitocromo único típico de algas Klamath 7

Fitocromos são fotorreceptores, pigmentos que as plantas utilizam para detectar luz e que são sensíveis à luz na região do vermelho e vermelho longínquo do espectro visível. Realizam muitas funções diferentes em plantas, incluindo a regulação da floração (através de ritmos circadianos), germinação e a síntese de clorofila. 0 último é particularmente relevante em relação a algas AFA, porque a presença deste tipo único de fitocromo em AFA pode ser explicada pela sua carência da outra ficobiliproteína comummente utilizada por outras cianobactérias para complementar a C-ficocianina no processo de fotossíntese, a saber alo-ficocianina. Enquanto o lugar de alo-ficocianina em algas Klamath é tomado por ficoeritrocianina ou PEC (veja-se a seguir), é provável que PEC em separado não seja suficiente, especialmente na consideração de que algas Klamath vivem num ambiente não tropical que necessita uma eficiência alta de colheita de luz, e assim algas AFA parecem integrar suas necessidades mais altas com o fitocromo. 0 fitocromo de AFA, que tem uma estrutura peculiar, é descrito no presente documento pela primeira vez. Ao longo dos anos, diferentes tipos de fitocromos têm sido encontrados em plantas, que não somente têm diferentes genes de fitocromo (3 em arroz e 6 em milho, por exemplo), mas na maioria dos casos têm de maneira significativa diferentes componentes de proteína e estrutura. 0 que os torna todos ficocromos é que todos utilizam a mesma biliproteína, chamada fitocromobilina, como um cromóforo que absorve luz, Este cromóforo é similar ao cromóforo ficocianobilina da ficocianina, e é caracterizado por uma única molécula bilina que consiste numa cadeia aberta de quatro anéis pirrole (tetrapirroles). Mais especificamente, em seu estado normal Pr esta biliproteína absorve luz num máximo de 650-670 nM, ao passo que quando activada pela luz 8 vermelha é transformada em Pfr com uma absorvância máxima de 730 nM. O primeiro fitocromo cianobacteriano a ser descoberto, esse de Synechocystis, mostrou ter uma similaridade estrutural fraca com fitocromos de planta. Não obstante, a biliproteina de Synechocystis é geralmente considerada um fitocromo à medida que é uma cromoproteína de vermelho/vermelho longínquo reversível. (48)

Purificação e caracterização de fitocromo de AFA O fitocromo de AFA tem um biliproteina como seu cromóforo que absorve luz no espectro vermelho/vermelho longínquo. Para estabelecer sua estrutura e actividades os inventores purificaram o fitocromo com os seguinte protocolo:

Suspender 1 g de extracto em 10 ml de 1 tampão fosfato de K, pH 7,0

Submeter a vórtex duas vezes durante 1 min com metade do seu volume

Incubar as células durante 35' com 2 % de Triton X 100

Centrifugar em 28000 rpm durante 16-18 h

Colher sobrenadante num gradiente escalonado de densidade de sacarose

Girar o gradiente utilizando rotores oscilantes em 150000 g durante 12 h

Armazenar a -20 °C O fitocromo corresponde à banda de lisado de uma cor laranja intenso, que é visível em aproximadamente 1 M de sacarose, enquanto o ficobilissoma pára em aproximadamente 0,75 M. Esta relação das duas bandas também dá uma indicação fiável com relação ao peso molecular do fitocromo presente nas algas, que é aproximadamente 4 vezes aquele da AFA-PC trimérica: o último sendo 121 Kd, os inventores podem estabelecer de maneira preliminar o MW de fitocromo de AFA em aproximadamente 480 Kd (Figura 22) 9

Testado para suas propriedades de absorção de luz, o fitocromo mostra que absorve luz com dois picos em 672 nM e 694 nM, que corresponde respectivamente às formas Pr (absorção de luz vermelha) e Pfr (absorção de vermelha longínqua) num estado de equilíbrio (Figura 23).

Como à quantidade de fitocromo contida em AFA, a primeiro avaliação dos inventores dá o seguinte resultado preliminar: 2 mg/g (ou 0,2 % DW). Como para os extractos, a concentração aumenta a aproximadamente 0,5 % no extracto básico, e aproximadamente 1 % no extracto B. Estas são baixas concentrações, ainda a potência antioxidante/anti-inflamatória deste molécula é tão forte que mesmo uma quantidade muito pequena podem produzir efeitos muito relevantes.

Actividade antioxidante O fitocromo de AFA purificado mostrou que é um antioxidante muito poderoso. De facto, em termos absolutos, a molécula mais poderosa até o momento encontrada em algas Klamath. A incubação durante 2 h de amostras de plasma humano com agente oxidante CuCl2 em 100 μΜ gera níveis aumentados de malondialdeído (MDA), um subproduto tardio de peroxidação de lípidos que é medido através de espectrof otómetro em 535 nm após uma reacção com ácido tiobarbitúrico (teste TBA). Quando o plasma é incubado durante 2 h a 37 °C com CuCl2 100 μΜ junto com quantidades crescentes de fitocromo de AFA (2-16 nM) extraído de algas AFA, uma redução dependente da dose muito forte dos Níveis de MDA é observada (Figura 24) . De facto, uma inibição quase completa de lipoperoxidação é obtida com níveis de MDA próximos ao controlo, com somente 16 nM de fitocromo de AFA. De maneira significativa, o CI50 de 3,6 nM é 45 vezes inferior a aquele obtida para o PCB. O fitocromo é o principal responsável pelos efeitos antioxidante e 10 neuroprotector do extracto básico, que são superiores a aqueles de AFA-PC.

Extracção, purificação e quantificação de MAAs Os inventores testaram a presença de MAAs na cianófita

Aphanizomenon flos-aquae de Klamath Lake, geralmente conhecido como algas Klamath. No conhecimento dos inventores, existe somente um relatório muito sobre a ocorrência de MAAs em qualquer espécie de Aphanizomenon (47); no entanto, tal relatório somente identifica porphyra como a MAAs presente, ao passo que a investigação dos inventores mostra a presença de dois MAAs, tanto porphyra como shinorine. Por outro lado, em relação à literatura global sobre algas, ao passo que a maioria das cianobactérias observadas até o momento contêm shinorine como seus MAAs primários, os inventores encontraram uma rara ocorrência de porphyra-334 como o MAA primário em Aphanizomenon flos-aquae além de shinorine.

MAAs foram extraídos como anteriormente observado. (29) De maneira breve, 2 0 mg de pó de AFA ou 2 0 mg. de extracto aquoso são extraídos em 2 ml de 20 % (v/v) de metanol aquoso (HPLC grade) por incubação num banho de água em 45 °C durante 2,5 h. Após a centrifugação (5000 g; Centrífuga GS-15R, Beckman, Paio Alto, USA), o sobrenadante foi evaporado até a secura e re-dissolvido em 2 ml de metanol a 100 %, submetido a vórtex durante 2-3 min e centrifugado em 10000 g durante 10 min. O sobrenadante foi 11 evaporado e o extracto re-dissolvido no mesmo volume de ácido acético a 0,2 % para a análise em HPLC ou em 200 μΐ de tampão fosfato (PBS) para a avaliação de propriedades antioxidante. As amostras foram filtradas através de filtros de seringa de tamanho de poro de 0,2 μπι (VWR International, Milão, Itália) antes de ser submetidas a análise por meio de HPLC, ou ao teste de propriedades antioxidante (veja-se a seguir).

Os MAAs de algas Klamath têm uma absorção máxima de 334 nm. a purificação adicional de MAAs foi feita utilizando um sistema HPLC (Jasco Corporation, Tóquio, Japão) equipado com um coluna Alltima C18 e guarda (4,6 x 250 mm de i.d., 5 μπι de empacotamento, Alltech, Milão,

Itália), de acordo com a literatura (30). O comprimento de onda para detecção foi de 330 nm; a fase móvel foi de 0,2 % de ácido acético num taxa de fluxo de 1,0 ml min-1. a identificação de MAAs foi feita pela comparação dos espectros de absorção e tempos de retenções com padrões tais como Porphyra e Pterocladia sp, principalmente que contém porphyra-334, shinorine e palythine, gentilmente proporcionadas pelo Dr Manfred Klisch, Friedrich-Alexander-Universitat, Erlangen, Alemanha. Os espectros de absorção de amostras foram medidos desde 200 até 800 nm num espectrofotómetro de feixe único (DU 640, Beckman, Paio Alto, USA). Os espectros brutos foram transferidos a um computador e tratados matematicamente para as análises de pico de MAAs.

Os MAAs foram parcialmente purificados a partir de amostra de AFA e a partir do extracto aquoso como foi descrito anteriormente. A extracção de amostras com 20 % de metanol em 45 °C durante 2,5 h resultou num pico proeminente em 334 nm (MAAs); mesmo se pequenas quantidades de pigmentos fotossintéticos (tal como ficocianina em 620 nm) foram também extraídos com este procedimento (veja-se a Figura 1, linha tracejada). Amostras de MAA foram tratadas 12 adicionalmente com 100 % de metanol com a finalidade de retirar as proteínas e sais e finalmente com 0,2 % de ácido acético para retirar pigmentos fotossintéticos não polares. Os MAAs resultantes parcialmente purificada tinham uma absorção máxima em 334 nm (Figura 1, linha contínua). A análise e purificação adicional de MAAs foi feita por meio de HPLC com uma vista para encontrar se os compostos que absorvem em 33 4 nm foi um MAA único ou uma mistura de mais de um MAAs. 0 cromatograma da amostra (Figura 2) mostra a presença de dois MAAs com tempos de retenção de 4,2 (pico 1) e 7,6 min (pico 2) que foram identificados como shinorine e porphyra-334, respectivamente. Porphyra-334 parece ser o principal MAA em AFA uma vez que shinorine estava presente somente em pequenas quantidades (razão da área de pico 1:15).

Os espectros de UV dos MAAs purificados confirmaram sua absorção máximo em 334 nm (Figura 3).

Levando em consideração que os coeficientes de extinção molar em 334 nm para shinorine e porphyra-334 são de 44700 e 42300 M”1 cm-1, respectivamente, os inventores calcularam: um) for algas AFA, concentrações de 0,49 mg g-1 DW para shinorine e 7,09 mg g-1 DW para porphyra-33 4; o conteúdo total de MAAs sendo assim igual a 0,76 % DW de alga; b) Para o extracto básico, concentrações de 17-21 mg de MAAs (que é 1,7-2,1 % DW).

Estes são dados significativos, já que a AFA completa contém altos níveis de MAAs constitutivos (0,76 % DW) , próximos a concentração máxima encontrada sob exposição a UV, isto é, 0,84 %. (31) Também, os inventores encontraram que o extracto tem uma concentração maior que as algas completas, alcançando níveis que são muito maiores que a concentração potencial máxima. MAAs (shinorine e porphyra-334) são moléculas estruturalmente simples, com um peso molecular de 300. Isto 13 permite que estas moléculas solúveis em água facilmente atravessem a barreira hematoencefálica, confirmando sua habilidade para expressar seu potencial inibitório de MAO-B na área onde é principalmente necessário, o cérebro. Ficocianinas

As ficocianinas estão presentes no extracto numa concentração de 8-10 % (para a quantificação, veja-se a seguir). As ficocianinas são os pigmentos azuis típicos de todas as cianobactérias ou algas azuis-verdes, embora com características peculiares para cada microalga específica. (32) Como para as propriedades funcionais e terapêuticas das ficocianinas, a investigação tem principalmente focalizou até o momento naquelas da microalga Spirulina. As ficocianinas purificadas a partir de Spirulina têm mostrado possuir propriedades antioxidante (33) e anti-inflamatória (34, 35, 36) em sistemas fisiológicos diferentes tais como fígado (37), sistema respiratório (38) e cérebro (39, 40). Tais propriedades da PC purificada a partir de Spirulina podem em geral ser atribuídas também às ficocianinas de outras algas, dada sua similaridade substancial. Não obstante, podem existir diferenças específicas de espécie nas diferentes ficocianinas de diferentes microalgas que podem levar a uma potência diferente na explicação das propriedades funcionais e terapêuticas descritas anteriormente.

Estrutural determinação e características específicas dos ficobilissomas de algas Klamath.

Falando Geralmente, nas ficocianinas (PC) de células cianobacterianas intactas estão presentes no interior do ficobilissoma na forma funcional (αβ)β (41). Em seguida à quebra da célula, a proteína pode ser encontrada em diferentes estados de agregação (monómeros, dímeros, trímeros, hexámeros) de acordo com o organismo analisado. No caso de algas Klamath, a análise electroforética da PC, ambos, como contida no extracto e como purificadas do 14 próprio extracto, tem mostrado que a proteína é encontrada para a maior parte em usa forma trimérica (αβ)3, com um peso molecular total de 121000. Um monómero αβ pesa aproximadamente 40000 (18500 subunidades oí + 21900 subunidades β) . A maioria dos estudos na FC purificada de Spirulina mostra ao invés disso que a proteína é encontrada em Spirulina na forma monomérica αβ com um peso molecular de aproximadamente 37500, assim que mostram um estado de agregação diferente em relação à PC purificada de AFA. A análise cromatográfica dos ficobilossomas de AFA mostrou também, como em outras espécies de cianobactérias, a subunidade α de PC liga-se a um grupo prostético, enquanto a subunidade β liga-se a dois. O grupo prostético ou cromóforo é chamado ficocianobilina (PCB) e é responsável tanto pela cor azul da proteína e como por seu poder antioxidante (42).

Uma diferença fundamental entre AFA e Spirulina baseia-se na estrutura diferente do ficobilissoma. Como oposição a Spirulina, o ficobilissoma de AFA Klamath não contêm o pigmento alo-ficocianina, mas somente o pigmento c-ficocianina ligado a um componente estrutural que está ausente em Spirulina, a saber ficoeritrocianina (PEC). A FEC é um pigmento fotossintético que actualmente foi identificado somente num número limitado de espécies de cianobactérias [43] . A PEC tem uma estrutura química muito similar a aquela de FC, sendo composta pelas duas subunidades α e β que associam-se para formar monómeros e trimeros. Não obstante, enquanto cada monómero de PC liga-se a 3 moléculas de PCB, PEC possui a característica única de ligar duas moléculas de PCB à subunidade β e uma molécula de ficoviolobilina (PVB) à subunidade a, que é responsável pela cor púrpura do pigmento.

Isto absolutamente é a primeira vez que o ficobilissoma de algas Klamath é definido como 15 peculiarmente constituído pela união de c-ficocianina e ficoeritrocianina, e esta estrutura qualitativa diferente do ficobilissoma de AFA de algas Klamath adiciona um factor decisivo adicional que distingue AFA de Spirulina. A figura 4 confirma o que foi dito, comparando os componentes do lisado celular de AFA com aqueles de outras cianobactéria bem conhecida, Synechocystis PCC 6803. Em ambas a cianobactérias é possível ver a banda azul que representa o ficobilissoma, mas em algas AFA o ficobilissoma apresenta uma massa molecular menor, confirmando que, como ao contrário das microalgas comuns tal como Spirulina, no ficobilissoma de AFA somente ficocianinas, mas não alo-ficocianinas, estão presentes. Além disso, a Figura mostra que em AFA está também presente uma banda de luz púrpura (mostrada pela seta) que é típica de ficoceritrocianinas, assim provando sua presença no ficobilissoma de algas Klamath.

Para aprofundar a definição, cada banda azul foi adicionalmente analisada através de HPLC ligada à espectrómetro massa (RP-HPLC-ESI-MS) . Graças aos diferentes tempos de retenção, as proteínas do ficobilissoma foram separadas e identificadas com base em sua massa molecular. Os resultados obtidos são mostradas nos seguintes quadros. Em primeiro lugar os inventores viram que enquanto em Synechocystis (Quadro 1) tanto a ficocianina (cpcA em 28,2 min e cpcB em 28,9 min) como a aloficocianina (apcA em 30,7 min e apcB em 31,2 min), em AFA (Quadro 2) somente ficocianina (cpcA em 28,8 min e cpcB em 30,0 min) está presente. Em segundo lugar, em AFA uma proteína com massa molecular de 19469 foi identificada que não está presente em Synechocystis e que corresponde à subunidade beta da ficoeritrocianina com duas bilinas unidas (pecB um 25,0 min) . QUADRO 1: proteínas presentes no ficobilissoma de Synechocystis. 16

Tempo de retenção (min) Massa molecular medida Massa molecular esperada Proteína [organismo homólogo] Número de acesso NCBI 14, 5 9322 9322 cpcD gi 6329820 22, 6 32505 32520 CpcC gi 6329821 32388 30797 cpcC gi 6329822 24, 6 28770 27392 cpcG gi 16329710 24, 8 28885 28522 cpcG gipl6332194 28, 2 18173 17586 cpcA (sub α de gi 2493297 ficocianina) 28, 9 19313 18126 cpcB (sub β de gi 2493300 ficocianina) 30, 7 17866 17280 apcA (sub α de gi | 266 76 5 aloficocianina) 31, 2 17816 17215 apcB (sub β de gi | 266766 aloficocianina) QUADRO 2: proteínas presentes no ficobilissoma de AFA algas Klamath

Tempo de retenção (min) Massa molecular medida Massa molecular esperada Proteína [organismo homólogo] Número de acesso NCBI 15, 2 9031 8925 8895 proteína hipotética Avar03000795 [Anabaena variabilis ATCC 29413] cpcD [Nostoc sp. PCC 7120] gi 45510540 gi 131740 25, 0 19469 19308 18284 pecB: cadeia beta de ficoeritrocianina gi 548504 18370 [Nostoc sp. PCC 7120] proteína hipotética Avar03000787 (pecB) gi 45510532 17 [Anabaena variabilis ATCC 29413] 26, 4 31044 30124 32078 32219 31295 31304 29333 cpcC [Nostoc sp. PCC 7120] proteína hipotética Avar03000794 (rod ligante Mw 32000) [Anabaena variabilis ATCC 29413] pecC [Nostoc sp. PCC 7120] proteína hipotética Avar03000789 (pecC) [Anabaena variabilis ATCC 29413] proteína hipotética Avar03000801 (cpcG4) [Anabaena variabilis ATCC 29413] gi 20141679 gi 45510539 gi 464511 gi 145510534 gi 46135436 26, 8 26119 28637 proteína hipotética Avar03000799 (cpcG2) [Anabaena variabilis ATCC 29413] gi 45510544 27, 8 10994 10986 fdxH2: ferredoxina vegetativa [Anabaena variabilis] gi 1169673 28, 8 17714 17457 cpcA [Nostoc sp. PCC 7120] gi 9957319 30, 0 19222 18332 cpcB [Nostoc sp. PCC 7120] gi |38 89 4

Esta estrutura única é um elemento importante para explicar a acção antioxidante e anti-inflamatória mais forte da PC de AFA completa com relação ao seu PCB. As 18 propriedades antioxidante e anti-inflamatória tornam-se relevantes neste contexto à medida que geram uma forte neuroprotecção; a PC completa é mais poderosa que seu PCB também em termos de neuroprotecção, o que claramente indica que o outro componente activo além de PCB no ficobilissoma, a saber PEC com seu cromóforo PVB especifico, é muito provavelmente o mais principio activo de melhora da saúde em AFA-PC. Que a PC AFA purificada de facto contém não somente a C-PC com seu cromóforo PCB, mas também PEC e seu cromóforo PVB é evidente olhando a espectrometria do extracto resultante da purificação (Figura 5). De facto, a absorção máxima de C-PC é 620 nm, que na espectrometria da Figura 5 reapresenta a parte superior do pico. Mas a absorção máxima de PEC é conhecida que é 566 nm para a subunidade oí (ficoviolobilina ou PVB) e respectivamente 593 nm e 639 nm para as duas PCBs da subunidade β. Todos os três valores estão de facto incluídos no pico em forma de sino que constitui o perfil espectrométrico da PC purificada. Em consideração da forte união, muito difícil de quebrar, entre C-PC e PEC em algas AFA, isto confirma que além da C-PC, também a PEC é necessariamente parte do extracto de PC purificada. Isto por sua vez significa que a PC de AFA é de maneira significativa diferente, tanto estruturalmente como funcionalmente, das PCs de outras cianobactérias, incluindo aquela de Spirulina, em que a maioria dos estudos têm sido feita; e que esta diferença consiste em que tem somente uma parte em comum, a saber C-PC, mas não as outras; com a consequência que, enquanto as propriedades de C-PC também podem ser atribuídas ao componente C-PC da AFA-PC, as propriedades da PC completa de AFA, nisso a ser um complexo de C-PC/PEC (incluindo seus cromóforos PCB e PVB), são exclusivamente atribuíveis a isso (bem como a qualquer complexo de C-PC/PEC presente em quaisquer outras microalgas).

Metodologias de purificação (Figura 5) 19 PC foi purificada do extracto de AFA seco como segue: suspender 500 mg de extracto em 50 ml de 100 mM de tampão fosfato de Na pH 7,4; centrífuga em 2500 rpm durante 10' a 4 °C; colher o sobrenadante e adicionar sulfato de amónio sólido a um 50 % de saturação; precipitar as proteínas durante 60 min a 4 °C enquanto mantém a amostra em agitação; centrifugar em 10.000 rpm durante 30 min a 4 °C; descartar o sobrenadante incolor transparente e ressuspender o precipitado azul num volume pequeno de 5 mM de tampão fosfato de Na pH 7,4; - submeter a diálise durante a noite a 4 °C contra o mesmo tampão; colocar a PC dialisada numa coluna hidroxiapatita equilibrada com 5 mM de tampão fosfato de Na pH 7,4; eluir a amostra com tampão fosfato de Na pH 7,0 de força iónica crescente (desde 5 até 150 mM); colher as fracções e ler a absorvância em 620 nm e 280 nm com o espectrofotómetro; agrupar as fracções em que AbS62o/AbS28o > 4 (índice de PC pura); precipitar a PC com sulfato de amónio em 50 % de saturação durante 1 hora em 4o; centrifugar em 10.000 rpm durante 30' a 4 °C; descartar o sobrenadante e suspender de novo a PC num 150 mM de tampão fosfato de Na pH 7,4; submeter a diálise contra o mesmo tampão a 4 °C; transferir a PC purificada num frasco e armazenar em escuridão a +4 °C ou -20 °C.

Quantificação de ficocianina

Para medir a concentração molar de PC pura os inventores utilizaram seu coeficiente de extinção molar e em 620 nm, que para a forma trimérica (αβ)3 é igual a 20 770000 lyT1 cm-1. Isto significa que uma solução de 1 M de PC em 620 nm tem um valor de absorção de 770000.

Para medir a concentração de PC no extracto os inventores utilizaram o coeficiente de extinção especifico E1 % em 620 nm de 70 1 g-1 cm-1. Isto significa que uma solução que contém 1 % de PC (que é 1 g/100 ml) em 620 nm absorve 70. Com base neste cálculos, o conteúdo médio de PC no extracto é igual a 80-100 mg/g DW (8-10 % DW). Purificação do cromóforo de PCB (Figura 6) • Suspender 500 mg de extracto em 50 ml de H20 destilada. • Centrifugar em 2500 rpm durante 10' a 4 °C. • Decantar o sobrenadante azul-escuro e precipitar a PC com ácido tricloroacético em 1 %. • Incubar durante 1 h na escuridão a 4 °C, enquanto agita. • Centrifugar em 10000 rpm durante 30' a 4 °C. • Colher o precipitado que contém PC e lavar 3 vezes com metanol. • 0 re-suspender o precipitado em 10 ml de metanol que contém 1 mg/ml de HgCl2. • Incubar durante 20 h em 42 °C em escuridão para libertar a PCB da PC. • Centrifugar em 2500 rpm durante 10' para retirar as proteínas. • Adicionar ao sobrenadante que contém PCB β- mercaptoetanol (1 μΐ/ml) para precipitar o HgCl2. • Incubar a -20 °C durante 24 h. • Centrifugar em 10000 rpm durante 30' a 4 °C para retirar o precipitado branco. • Adicionar ao sobrenadante 10 ml de cloreto de metileno/butanol (2:1, v/v). • Lavar com 20 ml de H20 e destilada centrifugar em 3000 rpm durante 10'. 21 • retirar a fase superior, colher a parte inferior que contém PCB. • Lavar a PCB em 15 ml H20 3 vezes. • Secar sob azoto e armazenar a -20 °C. AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DE MAO-B POR EXTRACTO DE AFA KLAMATH E POR SEUS PRINCÍPIOS ACTIVOS CONSTITUTIVOS FITOCROMO, FICOCIANINA E MAAs

Os inventores testaram a actividade inibidora de MAO-B do extracto básico utilizando o substrato especifico benzilamina (1 mM) . 0 teste foi realizado por um espectrofotómetro a 30 °C com um comprimento de onda de 250 nm, por pré-incubar MAO-B (2 pg/ml) com diferentes concentrações dos componentes hidrossolúveis e lipossolúveis do extracto básico, como produzido pelas etapas a) a c) descritas anteriormente (concentração inicial de 10 mg/ml). O extracto enriquecido com componente hidrossolúvel foi preparados por re-suspensão do extracto aquoso em água e colheita do sobrenadante após a centrifugação. O extracto solúvel enriquecido com componente lipofílico foi obtido por re-suspensão do extracto em acetona; depois disso o sobrenadante foi seco, e o precipitado foi ressuspenso em DMSO, um solvente compatível com a dosagem de MAO-B.

Como é mostrado na Figura 7A, a fracção solúvel em água inibe MAO-B de uma maneira dependente de dose, enquanto a fracção lipofílica não inibe a enzima. A fracção solúvel em água do extracto básico de AFA é um inibidor de MAO-B potente e selectivo, com um CI50 de 6,9 pL. Sua selectividade para MAO-B é 4 (CI50 MAO-B/ CI5o MAO-A > 4,05) (Figura 7B). A representação gráfica de Lineweaver-Burk na Figura 8 mostra que tal inibição é reversível e de um tipo misto em relação a competição, com uma diminuição no Vmax e aumento da constante Km de Michaelis-Menten. A representação gráfica do declive vs. a concentração da fracção 22 hidrossolúvel do extracto de AFA, uma constante de inibição Kh de 1 pL é obtida. Em comparação com a fracção hidrosolúvel do extracto básico, este valor de K baixo indica uma alta afinidade para a enzima MAO-B. 0 facto de que a inibição do extracto seja reversível significa que realiza uma actividade fisiológica plausível isento de efeitos secundários. Como para a competição mista, é muito provável devido à natureza complexa do extracto, incluindo diferentes moléculas funcionais, alguma competitiva e outra não competitiva. Os componentes activos principais do extracto são o fitocromo de AFA (0,5 % DW) ; ficocianinas (8-10 % DW); e os MAAs ou aminoácidos similares a micosporina (1,7-2,1 % DW) , que os inventores testaram individualmente como inibidores de MAO-B.

Inibição de MAO-B por ficocianinas O teste foi feito através de um espectrofotómetro a 30 °C com um comprimento de onda de 250 nm, utilizando benzilamina como um substrato, por pré-incubação de MAO-B com várias concentrações de PC purificada de AFA (0,5-4 μΜ). Como é mostrado na Figura 9, AFA-PC causa uma diminuição dependente da dose de actividade de MAO-B, com um CI5o de 1,44 μΜ. A selectividade para MAO-B de AFA-PC é superior a 3,5 (CI50MAO-B/CI50MAO-A > 3,5). A representação gráfica de Lineweaver-Burk na Figura 10 mostra que, como com o extracto, a inibição é reversível e de um tipo misto (competitiva e não competitiva) com modificação de tanto Vmax como Km.

Pela representação gráfica do declive vs. a concentração de PC os inventores obtêm o valor da constante de inibição Ki, que no presente documento é de 1,06 μΜ. A constante de inibição mede a afinidade do inibidor para a enzima: um K alto indica uma baixa afinidade para a enzima e vice-versa. Neste exemplo, o valor de K baixo indica uma alta afinidade de AFA PC em direcção a MAO-B.

Inibição de MAO-B pelos MAAs 23 A actividade de MAO-B num substrato benzilamina foi avaliada em relação a concentrações crescentes de MAAs (0,5-8 μΜ) , anteriormente purificadas do Extracto básico com 20 % de metanol. A Figura 11 mostra a inibição dependente da dose de MAO-B pelos MAAs, com um CI50 de 1,98 μΜ. A select ividade para MAO-B de MAAs é superior a 2 (CI50MAO- B/CI50MAO-A >2,02). A representação gráfica de Lineweaver-Burk (Figura 12) mostra que a inibição é tanto reversível como competitiva, com um aumento de Km, mas nenhuma variação do Vmax. Isto significa que MAAs, graças a sua estrutura química, compete com o substrato para a união ao local activo da enzima. Pela representação gráfica do declive vs. a concentração de MAAs (Figura 13) os inventores obtêm o valor da constante de inibição K; que é de 0,585 μΜ, que demonstra um grau de afinidade muito alto para a enzima.

Inibição de MAO-B pelo fitocromo de AFA 0 teste foi feita através de um espectrofotómetro a 30 °C com um comprimento de onda de 250 nm, utilizando benzilamina como um substrato, por pré-incubação de MAO-B com várias concentrações de fitocromo de AFA purificado (8,3 - 66,4 nM). Como é mostrado na Figura 15, o fitocromo de AFA causa uma diminuição dependente da dose de actividade de MAO-B, com um CI50 tão baixo como 20,2 nM. A representação gráfica de Lineweaver-Burk na Figura 16 mostra que, como com o extracto, a inibição é reversível de um tipo misto (competitiva e não competitiva) com modificação de tanto Vmax como Km.

Pela representação gráfica do declive vs. a concentração fitocromo de AFA os inventores obtêm o valor da constante de inibição K; que no presente documento é de 10,48 nM. A constante de inibição mede a afinidade do inibidor para a enzima: uma K alta; indica uma afinidade baixa para a enzima e vice-versa. Neste exemplo, o valor de 24 K extremamente baixo; indica uma afinidade muito alta de fitocromo de AFA para MAO-B. A acção competitiva e reversível dos MAAs torna estas moléculas muito potente na inibição de MAO- B. De facto, o carácter competitiva e reversível da inibição de MAO-B assegura ao mesmo tempo eficácia alta e uma actividade livre de efeitos secundários e fisiológica. Neste sentido, os MAAs contidos no extracto, também devido a seu peso molecular e consequente habilidade de facilmente atravessar a barreira hematoencefálica, constitui um componente decisivo, inclusive in vivo, com a finalidade de gerar os efeitos terapêuticos derivados de inibição de MAO-B.

Ainda mais do que MAAs, o fitocromo tem provado ser o mais poderoso inibidor de MAO B de todas as substâncias conhecidas até o momento. Sua afinidade muito alta para a enzima MAO-B, e sua inibição eficaz em dosagens de poucos nanomolares, torna esta molécula não somente um perfeito agente terapêutico por si própria, mas o factor que parece proporcionar a mais importante contribuição para a alta eficácia neurológica do(s) extracto(s) de AFA.

Deve ser adicionada que alguma das considerações em relação aos MAAs e fitocromo também podem ser aplicadas ao comportamento in vivo de ficocianinas. Os inventores sabem que a PC gera efeitos neuroprotectores no cérebro in vivo, e de modo que são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica. (44) Isto significa que são também capazes de realizar in vivo sua actividade inibidora de MAO- B no cérebro. 0 peso molecular do cromóforo é de facto somente 700, que não é muito mais do que o peso molecular dos MAAs. O mesmo é verdadeiro para o cromóforo do fitocromo, o fitocromobilina, estruturalmente similar a ficocianobilina.

Em conclusão, a actividade de inibição de MAO-B na parte do extracto e seus componentes activos, fitocromo de AFA, AFA-PC e MAAs, é extremamente relevante, já que tanto 25 as moléculas como o extracto os colocam no mais alto nível de actividade, igual ou superior as substâncias farmacológicas, e muito superior a qualquer molécula natural testada, como é mostrado no seguinte quadro (45):

Quadro 3: Parâmetros cinéticos comparativos (CI5o e Ki) de inibição de MAO B de inibidores conhecidos sintéticos e naturais.

Inibidores de MAO-B CI5 0 Κι tipo de inibição Deprenilo 0,31 μΜ 0,002 μΜ Irreversível Epicatequina 58,9 μΜ 21 μΜ Mista Catequina 88,6 μΜ 74 μΜ Mista alcaloide não Harman 6,47 μΜ 1,12 μΜ Mista Piperina 91,3 μΜ 79,9 μΜ Competitiva Paeonol 42,5 μΜ 38,2 μΜ Competitiva Emodina 35,4 μΜ 15,1 μΜ Mista ficocianina de AFA 1. 4 4 μΜ 1. 06 μΜ Mista MAAs de AFA 1,98 μΜ 0,585 μΜ Competitiva fitocromo de AFA, 0. 0 2 μΜ 0,010 μΜ Mista Como é mostrado pelo quadro, somente ficocianinas e MA As têm um CI50 ligeiramente superiores a 1 μΜ, assim muito próximo a aquele de Deprenilo (0,31 μΜ) , e dezenas de vezes mais baixa que o CI50 das outras moléculas consideradas, o fitocromo de AFA, por outro lado, tem um CI50 15 vezes mais baixo que aquele de Deprenilo. O mesmo é verdadeiro para a constante de inibição K que mede a afinidade do inibidor para a enzima. As ficocianinas de AFA têm um K de ao redor de 1 μΜ, como os alcaloides não Harman de café e tabaco (mas obviamente sem qualquer dos problemas associados a aquelas duas substâncias). Por outro lado, MA As e o fitocromo de AFA são as únicas moléculas, junto com Deprenilo, a ter um K mais baixo que 1 μΜ, e assim uma afinidade muito alta para o MAO-B. De facto, o fitocromo de AFA é á única molécula natural, além de selegilina/ Deprenilo, cujo K é da ordem de alguns nanomolares. E ainda, existe uma diferença essencial entre selegilina/ 26

Deprenilo e as moléculas do extracto de AFA: o primeiro é um inibidor irreversível, assim caracterizado por efeitos secundários potenciais; ao passo que as moléculas que inibem MAO B de AFA Klamath são todas reversíveis, caracterizado por um actividade fisiológica isenta dos problemas associados a moléculas sintéticas. a Figura 14 mostra graficamente a actividade inibidora de MAO-B das três moléculas de AFA em relação a Deprenilo. Dado a sinergia de todas as três moléculas no Extracto básico (e outros extractos AFA), a actividade inibidora global de MAO-B do Extracto básico resulta muito alta. algo que se torna particularmente relevante considerando também a alta quantidade de PEA presente no mesmo. Se os inventores comparam o extracto básico com deprenilo na base de seu conteúdo PC, os inventores obtêm, que o Extracto básico alcança o CI50 numa dosagem de PC tão baixa como 0,05 μΜ, que indicaria uma potência 7,5 vezes superior a Deprenilo (e dezenas de vezes superior às substâncias naturais). Isto faz sentido à luz da potência do fitocromo contida no Extracto básico: de facto 7,5 vezes é uma média entre a potência inibidora de PC e MAAs, que é ligeiramente mais baixa que Deprenilo, e que do fitocromo, que é 15 vezes maior (Figura 17). Isto também mostra que a potência mais alta do extracto em relação a AFA-PC purificada é pela maior parte devido ao fitocromo.

Além disso, o extracto ainda mantém a vantagem de ser um substância natural que age de maneira fisiológica, cuja inibição de MAO-B é reversível e principalmente competitiva, assim isenta dos efeitos secundários potencialmente associados a moléculas irreversíveis tais como Deprenilo e outros substâncias sintéticas. (46) A vantagem adicional do extracto é seu conteúdo alto de feniletilamina, um poderoso neuromodulador dopaminérgico que trabalha em sinergia total com as outras moléculas, um actividade sinérgica que os inventores podem resumir assim: 27 A feniletilamina ou PEA tem duas vezes actividade dopaminérgica, ambos como estimula a libertação de dopamina do tecido nigroestriatal , e como inibe a recaptação pós-sináptica da própria dopamina; - Fitocromo, MAAs e ficocianinas, como poderosos inibidores de MAO-B, também aumentam a transmissão dopaminérgica à medida que uma actividade reduzida de MAO-B implica num vida mais longa de neuroaminas, incluindo dopamina; - Fitocromo, MAAs e ficocianinas, como inibidores de MAO-B, também prolongam a vida e a actividade de f enilet ilamina, que é por si o objecto da actividade de desaminação da enzima MAO-B, com a consequente criação de um circulo vicioso de suporte adicional a transmissão dopaminérgica e actividade e à neuromodulação mais geral produzida por PEA. - Finalmente, a poderosa a actividade antioxidante e anti-inflamatória de ficocianinas, junto com seus ou sua habilidade de cromóforo de atravessar a barreira hematoencefálica; bem como a actividade antioxidante extremamente alta do fitocromo e a menos forte ainda significativa actividade antioxidante de MAAs, gera uma neuroprotecção que protege as diferentes moléculas activas e mais geralmente o ciclo vicioso neurológico que criam, de qualquer dano oxidativo e inflamatório.

NEUROPROTECÇÃO

Os inventores testaram as propriedades neuroprotectoras do extracto de AFA, a AFA-PC especifica e seu cromóforo PCB, bem como MAA contra o efeito neurotóxico de glutamato. 0 glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central de mamíferos, mas a super-estimulação de seu receptor de subtipo NMDA em neurónios desencadeia um acúmulo intracelular massivo de Ca2+, levando a morte celular. Além disso acúmulo de Ca2+ 28 intramitocondrial, após a estimulação de receptor de NMDA, o aumento transitório em livre Ca2+ citosólico activa a isoforma neuronal de óxido nitrico sintase (NOS) (49), uma enzima que forma óxido nitrico (NO) ou, principalmente em neurónios primários, seu produto de reacção superóxido (02~ ) , peroxinitrito (0N00-) . A exposição de neurónios a glutamato foi realizada de acordo com um método ligeiramente modificado (50) : meio de cultura foi retirado e neurónios foram lavados uma vez com solução de Hanks tamponada pré-aquecida a 37 °C (5,26 mM de KC1, 0,43 mM de KH2H2P04, 132,4 mM de NaCl, 4,09 mM de NaHC03, 0,33 mM de Na2HP04, 20 mM glucose, 2 mM de CaCl2, e 20 mM de HEPES, pH 7,4) e pré-incubados na ausência ou presença de diversas concentrações de extracto de AFA (1-50 nM) , PC (10-1000 nM) , PCB (10-1000 nM) e MAA (1-10 μΜ) em solução de Hanks tamponada pré-aquecida a 37 °C. Após 30 min de pré-incubação, L-glutamato foi adicionado a partir de soluções concentradas à concentração final indicada de 100 μΜ mais 10 μΜ de glicina. Os neurónios foram incubados a 37 °C durante 15 min, o tampão foi aspirado, substituído com DMEM e as células foram incubadas a 37 °C durante 24 h adicionais na ausência de efectores. A apoptose foi avaliada pela coloração dos núcleos de células com DAPI (50), um corante fluorescente permeável a membrana que liga-se a ADN e permite a quantificação de neurónios apoptóticos, isto é, neurónios mostrando núcleos fragmentados ou condensados. De maneira breve, 24 h após a exposição a glutamato, as culturas de neurónios foram lavadas com PBS aquecido (37 °C) e fixas com 4 % (p/vol) de paraformaldeido em PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Após serem lavadas com PBS, as células foram expostas a 3 μΜ de DAPI durante 10 min a temperatura ambiente na escuridão e foram então lavadas duas vezes com PBS. As células foram classificadas condensação de cromatina por meio de microscopia de fluorescência, 29 utilizando um filtro de fluoresceina (330-380 excitação; 30X de aumento). Os núcleos totais e apoptóticos foram contados. Em todos os casos, aproximadamente 600-1.000 células foram contadas por poço por um operador que desconhecia o desenho do protocolo. Medidas de culturas individuais foram realizadas em duplicata e os resultados são expressos como a média S.E.M. Os valores para o número de preparações de cultura indicado. A análise estatística dos resultados foi determinada por meio de teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de intervalo múltiplo de diferença menos significativa. Em todos os casos, p-0,05 foi considerado significativo.

Através deste teste de dano de glutamato os inventores mostraram pela primeira vez a habilidade neuroprotectora de Extracto básico de AFA, AFA-PC, seu PCB e MAAs. Como é mostrado pela Figura 18, a adição de glutamato as células neuronais cultivadas aumentou o nível de Apoptose a uma percentagem de 22,9 % ± 3 n = 4 (p< 0,05); enquanto a adição simultânea do Extracto básico de AFA gerou uma protecção muito alta contra toxicidade de glutamato, diminuindo o nível de Apoptose abaixo do nível controlo de (6,3 % ± 1 p> 0,05) já com uma quantidade de extracto tão baixa como 1 nM (os resultados são médias ± SEM desde 3 até 8 culturas celulares diferentes. # diferentes de maneira significativa quando comparado com grupo controlo (p<0,05); * diferentes de maneira significativa quando comparado com o controlo de glutamato (p<0,05). Como para a protecção proporcionada pelos MAAs, também diminuem o nível de Apoptose abaixo do nível de controlo, com a dosagem mais alta de 1 μΜ (Figura 19) os resultados são médias ± SEM desde 3 até 8 culturas celulares diferentes. # diferentes de maneira significativa quando comparado com grupo controlo (p<0,05); * diferentes de maneira significativa quando comparado com o controlo de glutamato (p<0,05).). Em relação a AFA-PC e PCB, os inventores viram que sua 30 inibição de Apoptose é muito similar: sua adição à cultura celular diminui o grau de Apoptose abaixo do controlo com uma dosagem de aproximadamente 10 nM (Figuras 20 e 21- os resultados são médias ± SEM desde 3 até 8 culturas celulares diferentes. # diferentes de maneira significativa quando comparado com grupo controlo (p<0,05); * diferentes de maneira significativa quando comparado com o controlo de glutamato (p<0,05)). O grau de inibição de AFA-PC é aproximadamente igual a esse de PCB. Isto é algo surpreendente, dado que o PCB, supostamente seu principio mais activo, uma vez purificada e assim mais concentrada, deve ser mais forte de maneira significativa que a molécula completa do qual é o componente activo. 0 facto de que tem praticamente a mesma potência significa que na PC completa existem outros factores que podem realmente ser ainda mais potentes que a própria PCB. Os inventores sabem que a PC completa está constituída, além de C-PC e seu PCB cromóforo, de PEC, que inclui como seu cromóforos tanto PCB como PVB (ficoviolobilina). Portanto, os inventores podem no presente documento assumir que o factor que cria uma diferença significativa em potência entre a PCB purificada e a PC completa é exactamente o componente PEC, particularmente seu cromóforo PVB, que é presumido que é um antioxidante muito forte.

Em termos de neuroprotecção, MAAs parecem desempenhar um papel, mas de maneira significativa inferior a PC e PCB. No entanto, o neuroprotector mais poderoso é claramente o extracto de AFA completa, que é capaz de inibir completamente a Apoptose celular em somente 1 nM (nanomolar) . Este é 10 vezes a potência de PC e PCB. Isto podem certamente ser explicado com a sinergia de muitos factores antioxidantes presente diferentes no extracto de AFA completa; ainda, uma vez que os inventores viram acima que o fitocromo de AFA é possivelmente o mais poderoso 31

antioxidante até agora, sendo capaz de quase completamente inibir formação MDA (um subproduto tardio de peroxidação de lipido) com somente 16 nanomolares, é muito provável que fitocromo de AFA seja o factor mais importante em explicar a maior potência do Extracto básico. Os inventores podem assim concluir que fitocromo de AFA, bem como quaisquer e todos fitocromos, são importante agentes neuroprotectores. BIBLIOGRAFIA 1. Zhou G. et al., Platelet monoamine oxidase B and plasma β-phenylethylamine in Parkinson's disease, in J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2001; 70:229-231, 229. 2. Ispida K. et al., β-phenylethylamine stimulates striatal acetylcoline release through activation of the AMPA glutamatergic pathway, in Biol Pharm Bul/ 2005 Sep.; 28(9): 1626-9. 3. Barroso N., Rodriguez M., Action of β-phenylethylamine and related amines on nigrostriatal dopamine neurotransmission, in European Journal of Pharmacology, 297 (1996), 195-203, 200. 4. Dyck L. E., Release of monoamines from striatal slices by phenelzine and β-phenylethylamine, in Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 1983, 7:797-800;

Philips S.R., Robson A.M., In vivo release of endogenous dopamine from rat caudate nucleus by phenylethylamine, in Neuropharmacology 1983, 22:1297-1301; Raitieri m., et al.,

Effect of sympathomimetic amines on the synaptosomal transport of noradrenaline, dopamine and 5-hydroxytryptamine, in Eur J Pharmacol 1977, 41:133-143. 5. Janssen P.A.J, et al., Does phenylethylamine act as an endogenous amphetamine in some patients?, in International Journal of Neuropsychopharmacology 1999, 2: 229-240, 232. 6. Paterson I.A. et al., 2-phenylethylamine: a modulator of catecholamine transmission in the mammalian central nervous system?, in Journal of Neurochemistry (1990), 55:1827-1837. 32 7. Sabelli H.C., Javaid I.J., Phenylethylamine Modulation of Affect: Therapeutic and Diagnostic Implications, in Journal of Neuropsychiatry (1995), 7(1):6-14, 7. 8. Mauro Federici et al., Trace Amines Depress Gabab Response In Dopaminergic Neurons By Inhibiting Girk Channels, in Molecular Pharmacology Fast Forward. Published on January 11, 2005 as doi:10.1124/mol. 104.007427. 9. Gusovsky F. et al., A high pressare liquid chromatography method for plasma phenylacetic acid, a putative marker for depressive disorders, in Anal Biochem, 1985 Feb. 15; 145(1):101-5. In this study, the depressed patients had a PAA levei in the plasma of 327.64 +/- 45.44 ng/ml, against the 536.18 +/- 54.99 ng/ml. of the control group. In another study, in the urine of the depressed patients was found and average PAA of 66 +/- 23 mg/die, against the 104 +/- 23 mg/die of non depressed patients. See Sabelli HC. et al., Urinary phenylacetic acid in panic disorder with and without depression, in Acta Psychiatr Scand 1990 Jul;82(l): 14-6. 10. Szabo A. et al., Phenylethylamine, a possible link to the antidepressant effects of exercise?, in Br J Sports Med Out de 2001; 35(5):342-3. 11. Sabelli H et al., Sustained antidepressant effect of PEA replacement, in J Neuropsychiatry Clin Neurosci, 8(2): 168-71. 12. Miura Y., Plasma beta-phenylethylamine in Parkinson's disease, in Kurume Med J 2000;47(4):267-72. 13. Ibid., 14. Ebadi M. et al., Neuroprotective actions of selegiline, in J Neurosci Res 2002 Feb 1;67(3) : 285-289. 15. Kemppainen N. et al., Different pattern of reduction of striatal dopamine reuptake sites in Alzheimer's disease and ageing, in J Neural Transm 2001;108(7):827-36. 16. Knoll J., (-)Deprenyl (Selegiline): past, present and future, in Neurobiology (Bp) 2000;8(2):179-99. 33 17. Knoll J., The pharmacological basis of the beneficiai effects of (-)deprenyl (selegiline) in Parkinson's and Alzheimer^s diseases, in J Neural Transm Suppl 1993;40:69-91. 18. Rimbau V., et al., Protective effects of C-phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus, in Neurosci Lett 1999 Dec 3;276(2):75-8. In this study phycocyanins have been used from the microalga Spirulina. The phycocyanins from Klamath algae are different and endowed with a higher antioxidant activity. See Benedetti S., Scoglio S., Canestrari F., et al. , Antioxydant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon Fios Aquae, in Life Sciences, 75 (2004): 2353-2362. 19. Swanson J. et al. , Cognitive neuroscience of attention déficit hyperactivity disorder and hyperkinetic disorder, in Curr Opin Neurobiol. 1998 Apr;8(2):263-71 20. Citazione solo di Benedetti et al. LifeScience; o menzione del parallelo brevetto? Attendere l'anno provisional in attesa di effettuare studi sulla neuroprotezione? 21. Kusaga A., Decreased beta-phenylethylamine in urine of children with attention déficit hyperactivity disorder and autistic disorder, in No To Hattatsu 2002 May; 34(3):243-8; Matsuishi T, Yamashita Y., Neurochemical and neurotransmitter studies in patients with learning disabilities, in No To Hattatsu 1999 May;31 (3):245-8. 22. Kusaga A. et al., Increased urine phenylethylamine after methylphenidate treatment in children with ADHD, in Ann Neurol 2002 Sep;52(3):372-4. 23. Jain AK, . Et al., Bupropion SR vs. placebo for weight loss in obese patients with depressive symptoms, in Obes Res. 2002 Oct;10(10):1049-56. 24. Rudolph et al., A randomized, placebo-controlled, dose-response trial of venlafaxine hydrochloride in the 34 treatment of major depression, in J Clin Psychiatry (1998); 59(3):116-22. 25. PEA is a lipid-soluble molecule quite subject to be damaged by heat. This means that drying methods using high temperatures, such a freeze drying, usually have lower concentration of PEA. The highest content of PEA is found in the algae dried with the Refractance Window® method. It is from this type of algae that the Basic Extract is realized. 26. Yamada M. et al., Clinicai Pharmacology of MAO Inhibitors: Safety and Future, in Neurotoxicology 2004; 25: 215-21; Youdim M., et al., Therapeutic Applications of Selective and Non-Selective Inhibitors of Monoamine Oxidase A and B that do not Cause Significant Tyramine Potentiation, in Neurotoxicology 2004;25:243-50. 27. Groniger A et al., Photoprotective compounds in cyanobacteria, phytoplankton and macroalgae-a database, in J Photochem Photobiol B. Nov de 2000;58 ( 2-3):115-22. 28. Suh HJ et al., Mycosporine glycine protects biological systems against photodynamic damage by quenching singlet oxygen with a high efficiency, in Photochem Photobiol. 2003 Aug;78(2):109-13. 29. Groniger A et al., Photoprotective compounds in cyanobacteria, phytoplankton and macroalgae-a database, in J Photochem Photobiol B. 2000 Nov;58(2-3):115-22. 30. Sinha RP et al. , Induction of mycosporine-like amino acids (MAAs) in cyanobacteria by solar ultraviolet-B radiation, in J Photochem Photobiol B. Jul de 2001; 60(2— 3) : 129-35. 31. Garcia-Pichel F et al. , Occurrence of UV-Absorbing, Mycosporine-Like Compounds among Cyanobacterial

Isolates and an Estimate of Their Screening Capacity, in Appl Environ Microbiol. 1993 Jan;59(1):163-169. 32. Glazer A.N., Phycobiliproteins, in Methods Enzymol, 1988, 167: 291-303. 35 33. Bhat V.B., et al., C-phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro, in Biochem Biophys Res Commun., 2000; 275(1):20-25; Romay, C. et al.,

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões .

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Zhou G. et al. Platelet monoamine oxidase B and plasma β-phenylethylamine in Parkinson's disease,. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2001, vol. 70, 229-231 [0079] • Ispida K. et al. β-phenylethylamine stimulates striatal acetylcoline release through activation of the AMPA glutamatergic pathway. Biol Pharm Bul, Setembro de 2005, vol. 28 (9), 1626-9 [0079] • Barroso N. ; Rodriguez M. Action of β-phenylethylamine and related amines on nigrostriatal dopamine neurotransmission. European Journal of Pharmacology, 1996, vol. 297, 195-203 [0079] • Dyck L. E. Release of monoamines from striatal slices by phenelzine and β-phenylethylamine. Prog

Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 1983, vol. 7, 797-800 [0079] • Philips S.R. ; Robson A.M. In vivo release of endogenous dopamine from rat caudate nucleus by phenylethylamine. Neuropharmacology, 1983, vol. 22, 1297-1301 [0079] • Raitieri m. et al. Effect of sympathomimetic amines on the synaptosomal transport of noradrenaline, dopamine and 5-hydroxytryptamine. Eur J Pharmacol, 1977, vol. 41, 133- 143 [0079] • Janssen P.A.J et al. Does phenylethylamine act as an endogenous amphetamine in some patients?. International 39

Journal of Neuropsychopharmacology, 1999, vol. 2, 229-240 [0079] • Paterson I.A. et al. 2-phenylethylamine: a modulator of catecholamine transmission in the mammalian central nervous system?. Journal of Neurochemistry, 1990, vol. 55, 1827- 1837 [0079] • Sabelli H.C. ; Javaid I.J. Phenylethylamine Modulation of Affect: Therapeutic and Diagnostic Implications. Journal of Neuropsychiatry, 1995, vol. 7 (1), 6-14 [0079] • Mauro Federici et al. Trace Amines Depress Gabab Response In Dopaminergic Neurons By Inhibiting Girk Channels. Molecular Pharmacology, 11 de Janeiro de 2005 [0079] • Gusovsky F. et al. A high pressare liquid chromatography method for plasma phenylacetic acid, a putative marker for depressive disorders. Anal Biochem, 15 de fevereiro de 1985, vol. 145 (1), 101-5 [0079] • Sabelli HC. et al. Urinary phenylacetic acid in panic disorder with and without depression. Acta Psychiatr Scand, July 1990, vol. 82 (1), 14-6 [0079] • Szabo A. et al. Phenylethylamine, a possible link to the antidepressant effects of exercise?. Br J Sports Med, October 2001, vol. 35 (5), 342-3 [0079]

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Antioxydant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon Fios Aquae. Life Sciences, 2004, vol. 75, 2353-2362 [0079] • Swanson J. et al. Cognitive neuroscience of attention déficit hyperactivity disorder and hyperkinetic disorder. Curr Opin Neurobiol., April 1998, vol. 8 (2), 263-71 [0079] • Benedetti et al. o menzione del parallelo brevetto? Attendere 1'anno provisional in attesa di effettuare studi sulla neuroprotezione?. LifeScience [0079] • Kusaga A. Decreased beta-phenylethylamine in urine of children with attention déficit hyperactivity disorder and autistic disorder. No To Hattatsu, Maio de 2002, vol. 34 (3), 243-8 [0079] • Matsuishi T ; Yamashita Y. Neurochemical and neurotransmitter studies in patients with learning disabilities. No To Hattatsu, May 1999, vol. 31 (3), 245-8 [0079] • Kusaga A. et al. Increased urine phenylethylamine after methylphenidate treatment in children with ADHD. Ann Neurol, Setembro 2002, vol. 52 (3), 372-4 [0079] • Jain AK et al. Bupropion SR vs. placebo for weight loss in obese patients with depressive symptoms. Obes Res., October 2002, vol. 10 (10), 1049-56 [0079] • Rudolph et al. A randomized, placebo-controlled, dose-response trial of venlafaxine hydrochloride in the 41 treatment of major depression. J Clin Psychiatry, 1998, vol. 59 (3), 116-22 [0079] • Yamada M. et al. Clinicai Pharmacology of MAO Inhibitors:

Safety and Future. Neurotoxicology, 2004, vol. 25, 215-21 [0079] • Youdim M. et al. Therapeutic Applications of Selective and Non-Selective Inhibitors of Monoamine Oxidase A and B that do not Cause Significant Tyramine Potentiation. Neurotoxicology, 2004, vol. 25, 243-50 [0079] • Groniger A et al. Photoprotective compounds in cyanobacteria, phytoplankton and macroalgae-a database. J Photochem Photobiol B, November 2000, vol. 58 (2-3), 115-22 [0079] • Suh HJ et al. Mycosporine glycine protects biological systems against photodynamic damage by quenching singlet oxygen with a high efficiency. Photochem Photobiol., August 2003, vol. 78 (2), 109-13 [0079]

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Photochem Photobiol B, [0079] July 2001, vol. 60 (2-3), 129-35 • Garcia-Pichel F et al. Occurrence of UV-Absorbing,

Mycosporine-Like Compounds among Cyanobacterial Isolates and an Estimate of Their Screening Capacity. Appl Environ Microbiol., Janeiro de 1993, vol. 59 (1), 163-169 [0079] • Glazer A.N. Phycobiliproteins. Methods Enzymol, 1988, vol. 167, 291-303 [0079] • Bhat V.B. et al. C-phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro. Biochem Biophys

Res Commun., 2000, vol. 275 (1), 20-25 [0079] • Romay, C. et al. Antioxidant and antinflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae. Inflamm Res, January 1998, vol. 47 (1), 36-41 [0079] • Reddy C.M. et al. Selective Inhibition of cyclooxygenase- 42 2 by C-phycocyanin. Biochem Biophys Res Commun., 2000, vol. 277 (3), 599-603 [0079] • Gonzales R. et al. Anti-inflammatory activity of phycocyanin extract in acetic acid induced colitis in rats. Pharmacol Res, 1999, vol. 39 (1), 55-9 [0079] • Vadiraja BB. et al. Hepatoprotective effect of C- phycocyanin: protection for carbon tetrachloride and R-(+)-pulegone-mediated hepatotoxicty in rats. Biochem Biophys Res Commun, 1998, vol. 249 (2), 428-31 [0079] • Romay C. et al. Phycocyanin extract reduces leukotriene B4 leveis in arachidonic induced mouse-ear infl ammation test. J Pharm Pharmacol., 1999, vol. 51 (5), 641-42 [0079] • Rimbau V. et al. Protective effects of C-phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus. Neurosci Lett, 1999, vol. 276 (2), 75-8 [0079] • Rimbau V. et al. C-phycocyanin protects cerebellar granule cells from low potassium/serum deprivation-induced apoptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2001, vol. 364 (2), 96-104 [0079] • Glazer A.N. Phycobilisomes. Methods Enzymol, 1988, vol. 167, 304-312 [0079] • Hirata T. et al. Antioxidant avtivities ofphycocyanobilin prepared from Spirulina platensis. J Appl Phycol, 2000, vol. 12, 435-439 [0079] • Fuglistaller P. et al. Isolation and characterization of phycoerythrocyanin and chromatic adptation of the thermophilic cyanobacterium Mastigocladus laminosus. Arch Microbiol, 1981, vol. 129, 268-274 [0079] • Magyar K. et al. Pharmacological aspects of (-)-deprenyl. Curr Med Chem, August 2004, vol. 11 (15), 2017-31 [0079] • Hou et al. Monoamine oxidase B (MAO-B) inhibition by active principies from Uncaria rhyncophylla. Journal of Ethnopharmacology, 2005, vol. 100, 216-220 [0079] • Herraiz T; Chaparro C. Human monoamine oxidase is inhibited by tobacco smoke: β-carboline alkaloids act as 43 potent and revesible inhibitors. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, vol. 326, 378- 386 [0079] • Kong LD et al. Inihibition MAO-A and B by some plant-derived alkaloids, phenols and anthraquinones. Journal of Ethnopharmacology, 2004, vol. 91, 351-355 [0079] • Yoshida S. et al. Fluorinated phenylcyclopropylamines. Part 3: Inhibition of monoamine oxidase A and B. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2004, vol. 12, 2645-2652 [0079] • Torres A. et al. Porphyra-334, a potential natural source for UVA protective sunscreens. Photochem. Photobiol. Sei., 2006, vol. 5, 432-435 [0079] • Hughes J ; Lamparter T. Prokaryotes and Phytochrome. The Connection to Chromophores and Signaling. Plant Physiology, December 1999, vol. 121, 1059-1068 [0079] • Garthwaite et al. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain. Nature, 24 November 1988, vol. 336 (6197), 385-8 [0079] • Delgado-Esteban M. et al. D-Glucose prevents glutathione oxidation and mitochondrial damage after glutamate receptor stimulation in rat cortical primary neurone. J Neurochem, October 2000, vol. 75 (4), 1618-24 [0079]

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de um extracto da microalga Aphanizomenon Fios Aquae Aquae Ralfs ex Born. & Flah. Var. fios aquae (AFA Klamath), em que o extracto é preparado pelas seguintes etapas: um) congelar a alga AFA recentemente colhida e descongelá-la ou, se o material de partida for pó de AFA seco, sonicar o pó de AFA diluído em água para romper as células; b) centrifugar o produto da etapa a) para separar o sobrenadante do precipitado; c) colher o sobrenadante que contém os componentes solúveis em água, para o fabrico de uma composição para prevenir, controlar ou tratar um dos seguintes distúrbios, doenças, condições ou disfunções neurológicos: doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose múltipla, transtornos do défice de atenção e hiperactividade (TDAH), autismo, depressão, défice de memória e distúrbios de humor.

2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o dito extracto contém os seguintes componentes da microalga Aphanizomenon Fios Aquae Aquae Ralfs ex Born. & Flah. Var. fios aquae (AFA Klamath): complexo de C-Ficocianina/ficoeritrocianinas (C-PC/PEC), seus cromóforos separados ficocianobilina (PCB) e ficoviolobilina (PVB), o fitocromo de AFA, aminoácidos similares a micosporina (MAAs) e feniletilamina (PEA).

3. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o extracto de AFA Klamath é purificado adicionalmente por se submeter o dito sobrenadante a ultra-filtração utilizando uma membrana de ultra-filtração com corte de peso molecular de 30.000 Daltons. 2

4. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em dita composição é adequada para administração em humanos.

5. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em dito extracto é formulado com veículos ou excip: farmaceuticamente aceitáveis. que a seres que o entes