RU2323722C2 - Фармацевтическая композиция для фотодинамической терапии и способ лечения онкологического заболевания с ее использованием - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Изобретение касается фармацевтической композиции, предназначенной для фотодинамической терапии злокачественных опухолей, содержащей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из производных фуллерена С₆₀, выбранных из группы, включающей соединение, в котором молекула фуллерена С₆₀ ковалентно связана с одной молекулой аминокислоты или дипептида, или его фармацевтически приемлемое производное, или комплекс соединения с биосовместимыми синтетическими полимерами или биополимерами и тетрапирролами, или конъюгат соединения с аминосоединением. Заявленная композиция на основе указанных соединений обладает низкой токсичностью и высокой селективностью накопления в тканях опухоли, а также позволяет использовать для проведения фотодинамической терапии спектр излучения до 1 мкм, что в свою очередь позволяет расширить область применения фотодинамической терапии вследствие более глубокого проникновения света с такой длиной волны в глубь тканей. Настоящее изобретение также относится к способу фотодинамической терапии злокачественных опухолей, в котором в качестве фотосенсибилизатора применяется фармацевтическая композиция данного изобретения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 12 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и связано с получением и применением новых фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных опухолей. ФДТ представляет собой метод локальной активации светом накопившегося в опухоли ФС, что в присутствии кислорода тканей приводит к развитию фотохимических реакций, разрушающих опухолевые клетки. В качестве ФС данное изобретение предлагает использовать аминокислотные и пептидные производные фуллерена С₆₀ и их комплексы с биосовместимыми полимерами и тетрапирролами, такими как хлорин e₆ и их металлокомплексы. Указанные соединения после накопления в клетках и фотооблучения превращают молекулярный кислород в синглетный, генерируют свободные радикалы, а также запускают биологические процессы, угнетающие жизнедеятельность опухолевых клеток.

Уровень техники

Известно, что при введении в организм ФС они селективно накапливаются в клетках опухоли, и последующее облучение их светом низкоэнергетического лазера с соответствующей длиной волны приводит к генерации свободных радикалов и синглетного кислорода, разрушающих опухоль. ФС можно вводить внутривенно, перрорально или апплицировать внешне на опухолевую ткань. После избирательного накопления ФС в опухолевых клетках их облучают светом в видимом диапазоне, что в присутствии кислорода вызывает их деструкцию. Механизм действия ФДТ представляется следующим образом: молекула ФС, поглотив квант света, переходит в возбужденное триплетное состояние и вступает в фотохимические реакции двух типов. При первом типе реакций происходит взаимодействие непосредственно с молекулами биологического субстрата, что в конечном итоге приводит к образованию свободных радикалов. Во втором типе реакций происходит взаимодействие возбужденного ФС с молекулой кислорода с образованием синглетного кислорода, который является цитотоксическим для живых клеток из-за сильного окислительного эффекта. Физико-химические свойства ФС должны обеспечивать достаточно высокую селективность накопления их в опухолевой ткани, низкую токсичность для нормальных клеток и высокую фототоксичность для злокачественных клеток, связанную с высоким квантовым выходом синглетного кислорода, а также обладать хорошей химической стабильностью и способностью к выведению из организма (Wyss P. History of Photomedicine // Wyss P., Tadir Y., Tromberg B.J., Haller U. (eds): Photomedicine in Gynecology and Reproduction. - Basel: Karger, 2000, p.4-11; http://www.magicray. ru/RU/article/modem.html). Применяемые в настоящее время ФС являются производными фталоцианинов или природных тетрапирролов (гематопорфирин, бактериохлорин); все они водорастворимы при рН>7 и имеют характерные полосы поглощения в области 400-650 нм. На данный момент наибольшее распространение получили коммерческие препараты: «Фотодитазин» (бактериохлорин е₆), «Фотогем» (гематопорфирин), «Фотосенс» (фталоцианин), «Аласенс» (5-аминолевулиновая кислота - предшественник протопорфирина IX), «Photofrin II» (гематопорфирин) (Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва 16-18 марта 2005 г, с.1-36; Исторические аспекты развития фотодинамической терапии. http://www.magicray.ru/RU/lecture/html). Одно из ограничений современной ФДТ - небольшая глубина проникновения света сквозь биологическую ткань из-за использования относительно коротковолновой части спектра, 600-650 нм.

Альтернативный класс перспективных ФС, но еще не применяемых в медицине - соединения на основе фуллеренов. Фуллерены - недавно открытая новая аллотропная молекулярная форма углерода. Они представляют собой сферические полиэдрические молекулы диаметром около 1 нм, содержащие 60 и более углеродных атомов. Сферический фуллерен с 60 атомами углерода (С₆₀) является наиболее дешевым и производится в настоящее время в многотоннажных количествах. Ввиду высокой гидрофобности фуллерен обычно модифицируют, вводя в ядро гидрофильные группы, что придает ему растворимость или диспергируемость в водных средах (Сидоров Л.Н., Юровская М.А. и др. Фуллерены. М.: Издательство «Экзамен», 2005, 688 с.)

Фуллерен и его производные являются электроотрицательными соединениями («электронная губка»). Поэтому при взаимодействии ядра фуллерена с молекулой, обладающей электрон-донорной активностью (нуклеофилом), происходит образование аддукта с переносом заряда. Такие аддукты обладают ценным фотоактивным свойством - фотооблучение индуцирует эффективный внутримолекулярный транспорт электрона от донорной молекулы в ядро фуллерена, что приводит к резкому изменению оптических свойств аддукта. В физиологических условиях такие изменения приводят к генерации активных форм кислорода (Mizuseki_H., Igarashi N., Belosludov R.V., Farajian A.A., Kawazoe Y. Theoretical Study of Chlorin-Fullerene Supramolecular Complexes for Photovoltaic Devices Jpn. J. Appl. Phys., 2003, 42/4B, 2503-2505).

Многие эксперименты демонстрируют, что фуллерен С₆₀ является эффективным ФС, конвертируя кислород в синглетное состояние (Yamakoshi Y., Sueyoshi S., Miyata N. Biological activity of photoexcited fullerene. Kokuritsu lyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku. 1999, 117, 50-60; Arbogast J.W., Foote C.S. J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 8886-8891). Наличие у производных фуллерена слабой полосы поглощения в области 700 нм делает возможным использование С₆₀ соединений для ФТД благодаря эффективному проникновению света с такой длиной волны через биологические ткани. Производные С₆₀ аккумулируются в опухолевой ткани за счет их повышенной проницаемости и относительной незрелости лимфатической системы. Кроме того, эти соединения агрегируют в водной среде за счет ассоциации гидрофобных ядер С60, а увеличение молекулярной массы способствует более интенсивному поглощению их клетками опухоли. Соединения С₆₀ также способны продуцировать свободные радикалы, особенно при недостатке кислорода (Elisa M.M., Gabriela A.M. et al. Porphirin-fullerene C60 dyads with high ability to form photoinduced charge-separated state as novel sensitizers for photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., 2005, 81/4, 891-897; Cardullo F., Isaacs I., Diederich F., Gisselbecht J.-P., Boudon C., Gronn M., Chem. Commun., 1996, 797-799). Локальное фотооблучение мышей с привитой фибромой, предварительно обработанных производными фуллерена, приводило к некрозу опухоли без повреждения здоровой ткани (Tabata Y., Murakami Y, Ikada Y. Photodynamic effect of polyethylene glycol-modified fullerene on tumor," Jpn. J. Cancer Res., 1997. 88, 1108-1116; Tabata Y., Murakami Y, Ikada Y. Antitumor effect of poly(ethylene glycol)-modified fullerene. Fullerene Sci. Technol, 1997, 5, 989-1007). Конъюгат фуллерена С₆₀ с полиэтиленгликолем (ПЭГ) вызывал активный некроз привитой опухоли у мышей в дозе 0,4 мг/кг веса, причем здоровая ткань, окружающая опухоль, никак не затрагивалась. Раковые клетки селективно накапливали С₆₀-ПЭГ после его внутривенного введения, по сравнению с нормальной кожей и мышцами коэффициент селективности для опухоли составлял 2,5 и 17 соответственно (Tabata Y., Ikada Y. Biological function of fullerene. Pure Appl. Chem., 1999, 71(11), 2047-2059). В опытах in vitro с опухолевыми клетками линии HeLa S3 цитотоксическая активность фуллероциклопентана проявлялась только при облучении светом (Schwenninger R., Muller T., Krautler B.J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 9317).

Исследования по токсичности и фармакокинетике фуллеренов, содержащих гидрофильные адденды, показали, что эти вещества выводятся из организма и обладают низкой острой токсичностью (Wilson L.J., Cagle D.W., Thrash T.P., Kennel S.J., Mirzadeh S., Alford J.M., Ehrhardt G.J. Metallofullerene drug design. Coordination Chem. Rev., 1999, 190-192, 199-207; Nelson M.A., Domann F.E., Bowden G.Т., Hooser S.В., Fernando Q., Carter D.E. Effects of acute and subchronic exposure of topically applied fullerene extracts on the mouse skin. Toxicol. Ind. Health, 1993, 9, 623-630), т.е. в дозах, обычно применяемых для ФДТ, они безопасны. Так, немодифицированный фуллерен С₆₀ не оказывает действия на жизнеспособность и скорость пролиферации фибробластов и кератиноцитов (W.A.Scrivens, Tour J.M., Creek K.E., Pirisi L. Synthesis of ¹⁴C-labeled C60, its suspension in water, and its uptake by human keratinocytes // J. Am. Chem. Soc. 1994. 116. P.4517-4518). Эти данные хорошо коррелируют с результатами опытов по цитотоксичности С₆₀ на животных моделях и культурах дендритных человеческих клеток (Rancan F., Rosan S., Boehm F., Cantrell A., Brellreich M., Schoenberger H., Hirsch A., Moussa F. Cytotoxicity and photocytotoxicity of a dendritic C(60) mono-adduct and a malonic acid C(60) tris-adduct on Jurkat cells. J. Photochem. Photobiol. В., 2002, 67, 157-162; Lin A.M., Fang S.-F., Lin S.-Z., Chou C.-K., Luh T.-Y., Hoa L.-T. Local carboxyfullerene protects cortical infarction in rat brain. Neurosci. Res., 2002, 43, 317-321).

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к медицине и направлено на разработку новых фармацевтических композиций для фотодинамической терапии опухолевых заболеваний введением ФС на основе водорастворимых аминокислотных и дипептидных производных фуллерена С₆₀ и их нековалентных комплексов или ковалентных конъюгатов и способов фотодинамической терапии опухолевых заболеваний, предусматривающих введение фармацевтических композиций данного изобретения.

Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции для фотодинамической терапии злокачественных опухолей, содержащей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из производных фуллерена С₆₀, выбранного из группы, включающей:

а) соединение, в котором молекула фуллерена С₆₀ ковалентно связана с одной молекулой аминокислоты, или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемое производное;

б) соединение, в котором молекула фуллерена С₆₀ ковалентно связана с одной молекулой дипептида, или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемое производное;

в) нековалентный комплекс соединения, охарактеризованного выше в подпунктах а) или б), или или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемого производного с фотосенсибилизатором из класса тетрапирролов, или фотосенсибилизатором из ряда хлорина-е₆ или металлокомплекса хлорина-е₆, или синтетическим полимером, или биополимером;

и

г) конъюгат соединения, охарактеризованного выше в подпунктах а) или б), с аминосоединением;

и фармацевтически приемлемый наполнитель или растворитель.

В одном из предпочтительных воплощений фармацевтической композиции аминокислотой, ковалентно связанной с молекулой фуллерена С₆₀, является L- или D-аминокислота, выбранная из группы, включающей (трехбуквенный международный код): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, γ-аминомасляную кислоту (Aba), ε-аминокапроновую кислоту (Аср), цитруллин, орнитин.

В еще одном воплощении композиции дипептидом, ковалентно свзязанным с фуллереном С₆₀, является дипептид, состоящий из комбинации двух L- или D-аминокислот, независимо выбранных из группы, включающей (трехбуквенный международный код): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, γ-аминомасляную кислоту (Aba), ε-аминокапроновую кислоту (Аср), цитруллин, орнитин.

В своем следующем аспекте изобретение касается способа фотодинамической терапии онкологического заболевания у человека, отличающегося тем, что пациенту, нуждающемуся в лечении, вводят в качестве фотосенсибилизатора фармацевтическую композицию, относящуюся к первому аспекту изобретения.

В одном из воплощений способа данного изобретения онкологическое заболевание выбирают из группы, включающей карциномы, саркомы, лимфомы, лейкемии, бластомы.

В еще одном предпочтительном воплощении способа фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, внутрибрюшинно, местно, перорально, внутривенно, интратуморально, интраназально.

В следующем предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят суточной дозе, составляющей от 0.5 до 50 мг/кг веса.

Эффект лечения достигается путем фотоактивации накопившегося в опухоли ФС, для чего используют лазерное и светодиодное излучение в диапазоне 640-680 нм. Комбинация аминокислотного или дипептидного производного фуллерена с гидрофильным электронным донором, каким являются тетрапиррольные соединения, позволяет расширить спектр облучения до 1 мкм (ближний ИК-диапазон) и тем самым увеличить глубину проникновения света в ткань. Тетрапирролы и, в частности, хлорин-е₆ - хорошие электронные доноры, имеющие развитую подвижную конъюгированную π-электронную систему с высокой степенью селективности накопления в злокачественных клетках. Поэтому эти соединения представляют собой хороших партнеров для получения комплексов с фуллереном. Например, такая пара в физиологической среде при облучении проявляет фотодинамический эффект в отношении гепатоцитов, продуцируя синглетный кислород в присутствии кислорода или свободные радикалы при недостатке кислорода (Elisa M.M., Gabriela A.M., Silber R.V., Durantini J.J., Edgardo N. Porphyrin-fullerene C60 Dyads with High Ability to Form Photoinduced Charge-separated state as novel sensitizers for photodynamic therapy. Photochem. Photobiol, 2005, 81, 891-897).

Преимуществом и новым подходом является взаимное дополнение в поглощении фотоизлучения: у бактериохлорина (хлорина-е₆), спектр поглощения которого представлен на фиг.1 - 635 нм и 420 нм, а у производных фуллерена - до 1 мкм с захватом ближнего ИК диапазона (фиг.2), что повышает фотохимическую активность ФДТ. Фотооблучение в ближнем ИК диапазоне обеспечивает проникновение света на большую глубину, что позволяет лечение более широкого спектра онкологических заболеваний, например опухолей внутренних органов.

Другое преимущество состоит в том, что фуллерены представляют собой углеродные гидрофобные кластеры, что, с одной стороны, способствует их повышенному сродству к мембранам клеток (Andreev I.M. Romanova V.S. Petruklina A.O., S.M.Andreev. Amino acid derivatives of fullerene С₆₀ behave as lipophilic ions penetrating through biomembranes. Physics of the Solid State, 2002, 44(4), 683-685; Kotelnikova R.A., Bogdanov G.N., Frog E.C., Kotelnikov A.I., Romanova V.S., Andreev S.M., Kushch A.A., Fedorova N.E., Medzhidova A.A., G.G.Miller. Nanobionics of pharmacologically active derivatives of fullerene С₆₀. J. Nanoparticle Res., 2003, 5, 561-566), а с другой - стимулирует поглощение таких соединений клетками опухоли, поскольку из-за агрегации увеличивается их молекулярная масса (Seymour L.W. Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1992, 9, 135-187; Андреев С.M., Петрухина А.О., Романова В.С., Бабахин А.А., Петров Р.В. Иммуногенные и аллергенные свойства конъюгатов фуллерена с аминокислотами и белком. Докл. РАН, 2000, 370, 261-264). Большая масса также способствует более длительному удерживанию вещества в клетках опухоли.

Комплексование биосовместимых полимеров и заряженных тетрапиррольных соединений с аминокислотными и пептидными производными фуллерена резко увеличивают растворимость последних, позволяя не ограничивать дозы вводимого фармакологически активного соединения.

Другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из прилагаемых фигур, подробного описания и формулы изобретения.

Перечень фигур

Для более ясного понимания заявленного изобретения, а также для демонстрации его особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание изобретения со ссылками на фигуры чертежей, на которых

Фиг.1 демонстрирует спектр поглощения хлорина е₆ (ось абсцисс: нм).

Фиг.2 демонстрирует спектр поглощения С₆₀-Aba.

Фиг.3 демонстрирует спектр поглощения комплекса С₆₀-Arg-Arg с хлорином е₆.

Фиг.4 демонстрирует спектр поглощения комплекса С₆₀-Aba с поливинилпирролидоном.

Фиг.5 демонстрирует ИК-спектр поглощения С₆₀-Aba-Phe-NH₂.

Фиг.6 показывает фотоактивацию лазерным и светодиодным излучением.

Фиг.7 показывает осмолярную гибель опухолевых клеток после ФДТ.

Фиг.8 показывает адгезию и гибель клеток в асците после ФДТ.

Фиг.9 показывает мембранно-контактные взаимодействия иммунокомпетентных клеток в асците.

Фиг.10 демонстрирует эмбриокарциному, перевитую внутримышечно.

Фиг.11 демонстрирует некроз опухоли на 5-е сутки после облучения.

Фиг.12 демонстрирует некроз опухоли через 2 недели после облучения.

Осуществление изобретения

Спектр водорастворимых производных фуллерена, применяемых в рамках данного изобретения, но не ограничивающийся только этими производными, включает аддукты С₆₀ с аминокислотами L- или D-ряда или дипептидами, образованными аминокислотами L- или D-ряда. Предпочтительными для целей настоящего изобретения являются такие аминокислотные производные фуллерена С₆₀, в которых аминокислотой, ковалентно связанной с молекулой фуллерена, является L- или D-аминокислота, выбранная из группы, включающей (трехбуквенный международный код): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, γ-аминомасляную кислоту (Aba), ε-аминокапроновую кислоту (Аср), цитруллин, орнитин. Предпочтительными для целей настоящего изобретения являются такие дипептидные производные фуллерена С₆₀, в которых дипептидом, ковалентно связанным с фуллереном, является дипептид, состоящий из комбинации двух L- или D-аминокислот, независимо выбранных из группы, включающей (трехбуквенный международный код): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, γ-аминомасляную кислоту (Aba), ε-аминокапроновую кислоту (Аср), цитруллин, орнитин.

Карбоксильная группа аминокислоты или дипептида, связанных с молекулой фуллерена, может быть свободной, а также находиться в виде фармацевтически приемлемлой соли или в виде физиологически приемлемых производных, таких как амид, сложный эфир, алкиламид, ариламид, или гидроксиалкил(арил)амид. В объем изобретения также включаются и другие физиологически приемлемые производные аминокислотных или дипептидных производных фуллерена, в частности такие, в которых модифицированы другие функциональные группы, имеющиеся в составе аминокислот, в частности гидроксильные, гуанидиновые, амино, тиоловые. Способы модификаций таких функциональных групп хорошо известны специалистам в данной области. Подразумевается, что при введении таких физиологически приемлемых производных будет происходить регенерирование активного ингредиента in vivo.

Под фармацевтически приемлемой солью понимают такую соль, которая приемлема с фармацевтической точки зрения и которая обладает желаемой фармакологической активностью исходного вещества. В контексте данного изобретения фармацевтически приемлемые соли могут быть образованы по свободной С-концевой карбоксильной группе аминокислоты или пептида. Такие соли включают основно-аддитивные соли, образуемые неорганическими или органическими основаниями. К числу фармацевтически приемлемых в указанном выше смысле неорганических оснований относятся, в частности, гидроксид аммония, гидроксиды щелочных металлов, таких как калий, натрий, литий и т.д., гидроксиды щелочноземельных металлов, таких как кальций магний и т.д., гидроокись алюминия и тому подобное; к числу органических оснований относятся, например, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, N-метилглюкамин и тому подобное.

В том случае, когда в состав аминокислотного или пептидного производного фуллерена входит аминокислота, имеющая дополнительные способные к образованию солей функциональные группы помимо α-аминогруппы и карбоксильной группы, как, например, еще одну карбоксильную группу (Asp, Glu), или аминогруппу (Lys), или гуанидиновую группу (Arg), или имидазольную группу (His), в дополнение к основно-аддитивным солям могут быть получены кислотно-аддитивные соли, образуемые неорганическими или органическими кислотами. К числу фармацевтически приемлемых в указанном выше смысле неорганических кислот относятся, в частности, соляная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная кислоты и тому подобное; к числу органических кислот относятся, например, уксусная, пропионовая, пировиноградная, молочная, лимонная, коричная, янтарная, малоновая, малеиновая, фумаровая, бензойная, этансульфоновая, метансульфоновая, глюконовая, триметилуксусная, салициловая, стеариновая, муконовая и тому подобное. Исчерпывающая информация о фармацевтически приемлемых солях может быть найдена во всеобъемлющем руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company - 1990, которое включается в настоящее описание во всей своей полноте путем отсылки.

Указанные соединения получают известными способами путем прямого присоединения аминокислот или дипептидов к фуллереновому ядру (Парнес 3.Н., Романова В.С., Андреев С.М., Петрухина А.О., Вольпин М.Е. «Адъюванты». Патент на изобретение №2129436, 1997; Романова В.С., Цыряпкин В.А., Ляховецкий Ю.А., Парнес 3.П., Вольпин М.Е. Изв. РАН, сер. Хим., 1994, 1151). Следует отметить, что данный класс соединений физиологичен, поскольку для их получения используют нетоксичные аминокислоты, дипептиды и другие биосовместимые соединения, и их низкая токсичность была подтверждена рядом биологических тестов (Андреев С.М., Петрухина А.О., Романова В.С., Бабахин А.А., Петров Р.В. Иммуногенные и аллергенные свойства конъюгатов фуллерена с аминокислотами и белком. Докл. РАН, 2000, 370, 261-264; Миллер Г.Г., Романова В.С., Покидышева и др. Ингибирование репродукции ВИЧ с помощью аминокислотных и дипептидных производных фуллерена С60. Антибиотики и химиотерапия, 2004, 49 (12), 3-12; Меджидова М.Г., Абдуллаева М.В., Федорова Н.Е., Романова В.С., Кущ А.А. Противовирусная активность аминокислотных производных фуллерена при цитомегаловирусной инфекции in vitro. Антибиотики и химиотерапия, 2004, 49(8-9), 13-20). Показано, что достаточной терапевтической дозой препарата для получения ФДТ-эффекта в опухолях и минимального сброса излишков введенного препарата через печень в кишечник является 7-15 мг/кг веса, что на порядок ниже вводимых субтоксических и токсических доз.

Получение нековалентных комплексов аминокислотных и дипептидных производных фуллерена С₆₀ с тетрапиррольными соединениями, синтетическими полимерами и биополимерами осуществляют путем смешивания растворов комплексируемых компонентов в подходящей среде (вода, физраствор, раствор Хенкса и т.п.) при рН, позволяющих переводить С₆₀-производные в растворимую форму, и выдерживания полученной смеси определенное время при температурах от около 0 до около 30°С. Выделение целевого продукта проводят диализом или хроматографически с последующей лиофилизацией полученного диализата или нужной фракции. Поскольку производные фуллерена являются карбоксилсодержащими соединениями, их ковалентное конъюгирование осуществляется путем конденсации с аминосодержащими биодеградируемыми соединениями, например, такими как пептиды и белки (желатин, альбумины). Для получения комплексов применяют биосовместимые полимеры из разряда кровезаменителей, такие как, например, низкомолекулярные синтетические поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиглюкин, декстран, полиэтиленгликоль, гидроксиэтилкрахмал, полиметилметакрилаты, природные - желатиноль, а также другие нетоксичные полимеры медицинского назначения.

Получение ковалентных комплексов аминокислотных производных С₆₀ с аминосодержащими соединениями проводят с использованием подходящих конденсирующих агентов, например трифторацетоксисукцинимида (Андреев С.М., Сидорова М.В., Ракова О.А., Цветков Д.Е., Фонина Л.А. Синтез N-оксисукцинимидных эфиров органических кислот и карбоксилсодержащих полимеров с использованием N-трифторацетоксисукцинимида. Биоорг. Химия, 1987, 13(5), 696-700) или карбодиимидов, например дициклогексилкарбодиимида (Sheehan J.С., Hess G.P.J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 1067).

Спектрофотометрический анализ фуллереновых комплексов, содержащих хлорин е₆, свидетельствует о сохранении полос поглощения (фиг.3), характерных для этого соединения. При этом тушения флуоресценции хлорина е₆ не происходит.

Анализ острой токсичности производных фуллерена показал, что в дозах ниже 70 мг/кг эти соединения малотоксичны. Следует отметить, что для фотоактивных соединений (гематопорфирины, хлорины) существует индивидуальная чувствительность к препаратам, даже в одинаковой по весу, полу и возрасту сингенной системе животных при проведении фотодинамической терапии опухолей. При этом фотохимический эффект на злокачественные клетки после облучения лазером может варьировать в значительных пределах. Вероятно, соединения фуллерена также не являются исключением в этом ряду фотосенсибилизаторов. Наши опыты по изучению действия аминокислотных производных фуллерена на эритроциты человека и мыши показали, что даже в высоких концентрациях (400 мМ) эти соединения не вызывают ни гемолиза, ни агглютинации, клетки в процессе инкубации не претерпевают морфологических изменений. Парентеральное введение мышам сравнительно высоких доз С₆₀-Ser (80 мг/кг) не оказывало никакого влияния на поведение и жизнеспособность мышей в течение 6 месяцев, свидетельствуя о низкой токсичности аминокислотных производных фуллерена (Андреев С.М., Петрухина А.О., Романова В.С., Бабахин А.А., Петров Р.В. Иммуногенные и аллергенные свойства конъюгатов фуллерена с аминокислотами и белком. Докл. РАН, 2000, 370, 261-264).

Таким образом, фармацевтическая композиция настоящего изобретения является сочетанием малотоксичных компонентов: ковалентного аддукта фуллерен-аминокислота/дипептид, биосовместимых полимеров и тетрапиррольных соединений (например хлорин е₆ или его металлокомплексы).

Композиции настоящего изобретения, пригодные для применения в фотодинамической терапии у человека, могут быть приготовлены в соответствии с известными специалисту в данной области способами, в частности путем смешивания с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Под «фармацевтически приемлемым» в контексте настоящего описания понимается такой эксципиент, например носитель, растворитель или любая иная целевая добавка, которые не вызывают нежелательных побочных эффектов у индивида, которому они вводятся, и не препятствуют осуществлению целевой биологической функции при введении ФС в организм индивида. Такие фармацевтически и физиологически приемлемые средства хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company - 1990; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press - 2000). К таким эксципиентам могут относиться буферы, диспергаторы, консерванты, стабилизаторы, носители, наполнители, растворители и т.д.

В частности, к фармацевтически приемлемым эксципиентам относятся фармацевтически приемлемые соли, способствующие поддержанию рН, изотоничности, а также придающие другие полезные свойства фармацевтической композиции. К таким солям относятся, например, неорганические соли натрия, калия, лития, аммония, а также органические соли первичных, вторичных или третичных аминов, аминокислот. Могут быть получены и использованы в целях данного изобретения также различные органические соли, такие как соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, виноградной кислоты, малеиновой кислоты и других приемлемых кислот.

Для поддержания осмотического давления фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать такие регулирующие тоничность агенты, как сахароза, глюкоза, хлорид натрия, а также многоатомные сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит или маннит.

Для поддержания физиологических значений рН фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать физиологически приемлемые буферные агенты, как, например, Hepes, фосфатный, цитратный, сукцинатный, тартратный, фумаратный, глюконатный, оксалатный, лактатный, ацетатный или гистидиновый буферы, а также их комбинации.

В том случае, когда фармацевтическая композиция настоящего изобретения предназначена для местного введения, она может представлять собой мазь, линимент, эмульсию, суспензию, лосьон и т.д. В качестве их основы могут использоваться известные специалисту в данной области вещества, например масла или жиры, которые могут быть как синтетического, так и животного или растительного происхождения, как, например, вазелин, петролатум, ланолин, соевое, кукурузное, подсолнечное, кокосовое масла, свиной жир, глицерин, жирные кислоты, многоатомные спирты и их эфиры с жирными кислотами, усилители трансдермального транспорта, и другие подобные фармацевтически приемлемые компоненты.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит эффективное количество активного начала - фотосенсибилизатора. В контексте данной заявки под «эффективным количеством» понимается такое количество ФС настоящего изобретения, которое является достаточным для оказания желаемого эффекта в отношении состояния, в связи с которым они вводятся индивиду. Точное количество будет зависеть от конкретных обстоятельств и может быть оценено специалистом в данной области с использованием известных методик. Обычно количество должно быть такое, чтобы оказывать желаемое терапевтическое действие (некроз, угнетение) в отношении злокачественной опухоли у человека, которому оно вводится. Специалисту будет понятно, что эффективное количество будет inter alia зависеть от типа опухоли, режима введения, состава композиции, вводится ли композиция сама по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, общего состояния здоровья индивида, реактивности его организма. Обычно композиции настоящего изобретения будут вводиться в дозах, находящихся в интервале от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 50 мг.

Поскольку фармацевтические композиции настоящего изобретения могут вводиться внутримышечно, внутрибрюшинно, местно, перорально, внутривенно, интратуморально, интраназально, специалисту в данной области понятно, что композиции должны находиться преимущественно в стерильной форме. Для обеспечения стерильности могут использоваться различные известные в данной области способы, такие как фильтрование через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм. Для предотвращения бактериального заражения в состав фармацевтических композиций могут также входить (но необязательно) консерванты, например тимеросал, фенол.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, однако должно быть понятно, что примеры приводятся исключительно для целей более ясного понимания сущности заявленного изобретения и не предназначены для его ограничения.

Примеры

Пример 1. Получение комплекса С60-Arg-Arg с хлорином е₆.

Смолу Dowex 1Х2 (Cl-форма) переводили в ОН-форму промывкой 2М раствором NaOH и затем водой до нейтральной реакции. Раствор 52 мг С60-Arg-Arg в 2 мл воды обрабатывали ОН-формой Dowex 1Х2 в течение 15 мин и затем фильтрат смешивали с водным раствором 7 мг хлорина е6 (2 мл) и 10 мкл конц. NH₄OH. Полученный раствор выдерживали 1 час, подвергали диафильтрации на мембране Amicon PM30 и лиофилизовывали. Выход коричневого порошка 46 мг. Спектр поглощения полученного комплекса представлен на фиг.3.

Пример 2. Получение комплекса С₆₀-Aba с поливинилпирролидоном.

Растворили 48,3 мг Na-соли С60-Aba в 7 мл воды, добавили 3 мл раствора поливинилпирролидона (202 мг, MW~10000). Раствор доводили до рН 8, выдерживали 40 часов, подвергали диафильтрации на мембране Amicon PM30 и оставшийся раствор лиофилизовывали. Выход светло-коричневого порошка 190 мг. Спектр полученного комплекса представлен на фиг.4.

Пример 3. Получение конъюгата амида фенилаланина (Phe-NH₂) с С₆₀-Aba.

Смешивали 30 мг N-оксисукцинимида и 100 мкл трифторуксусного ангидрида, выдерживали 20 мин и раствор упаривали до образования белых кристаллов трифторацетоксисукцинимида (ТФАС). Отдельно 50 мг С₆₀-Aba растворяли в 1 мл пиридина и раствор добавляли к кристаллам ТФАС, выдерживали смесь 20 мин и затем добавляли 5 мкл дистиллированной воды. В реакционную смесь вносили 5 мг Phe-NH₂, и полученный раствор выдерживали 30 мин. Продукт реакции осаждали этилацетатом, затем растворяли в 2 мл ДМФА, добавляли смолу с обращенной фазой RP-18, выдерживали 30 мин. Смолу удаляли фильтрацией, фильтрат концентрировали в вакууме и остаток разбавляли этилацетатом. Полученный осадок промывали этилацетатом, серным эфиром, фильтровали и высушивали. Выход кремового порошка 43 мг. Для доказательства химической связи между С₆₀-Aba и амидом фенилаланина проводили аминокислотный анализ полученного продукта после его гидролиза 6N HCl 2 часа при 160°С. Тонкослойная хроматография гидролизата (система пропанол:аммиак=3:1, проявление нингидрином) показывала наличие двух аминокислот, Aba и Phe. ИК-спектр также показывает наличие сильных полос поглощения NH и С=O групп (1676, 1440, 1385, 3200-3400 см^-1) (фиг.5).

Пример 4. Получение конъюгата C₆₀-Acp с желатинолем (10 кДа).

Смесь кристаллического ТФАС, приготовленного из 5 мг (43 мкмоля) N-оксисукцинимида и 5 мкл трифторуксусного ангидрида, и 10 мг (11,8 мкмоля) C₆₀-Acp растворяли в 500 мкл смеси ДМФ/пиридин (1:1), выдерживали 30 минут при комнатной температуре и добавляли 5 мкл дистиллированной воды. Затем полученный раствор смешивали с раствором 30 мг медицинского желатиноля в 1 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с рН 8,0. Реакционную смесь интенсивно перемешивали 4 часа при комнатной температуре, после чего ее разбавляли до 8 мл дистиллированной водой и диализовывали против воды, используя диализную мембрану Servapore (Serva). Полученный светло-коричневый мутный раствор ценрифугировали при 2000 об/мин и супернатант лиофильно высушивали. Выход С₆₀-Аср-желатина в виде окрашенного порошка 26,5 мг, УФ-спектр: λ_max=268 НМ.

Пример 5. Исследования острой токсичности.

Для определения параметров острой токсичности препарат С₆₀-Aba вводили в виде стерилизованного раствора в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 внутрибрюшинно однократно в дозах от 30 до 120 мг/кг веса с шагом 30 мг/кг веса. Падеж животных, соответствующий средним параметрам ЛД, наблюдался при концентрациях выше 70-80 мг/кг веса. У некоторых животных сразу после введения препарата наблюдались признаки острой токсичности, выражающиеся в адинамии, взъерошенности шерсти и отсутствии защитного рефлекса. Эти реакции наблюдались в течение 3-5 часов, после чего животные возвращались в нормальный режим. Дальнейшее наблюдение за выжившими животными продолжалось в течение 1-го месяца.

Часть животных из контрольной и опытной группы с токсическими проявлениями были использованы для гистологического исследования через 1 неделю после введения препарата (взяты печень, почка, селезенка, легкие, головной мозг, костный мозг). Выраженных цитотоксических реакций в вышеперечисленных органах, способных привести к гибели опытных животных, не отмечено.

Пример 6. Фотодинамическая терапия.

Оценку фотодинамической активности фармацевтических композиций проводили на мышах-гибридах F₁(CBA+С₅₇|В₆), самках весом 20-21 грамм с перевитой внутрибрюшинно эмбриокарциномой (асцитный и солидный рост). На 5-е сутки роста опухоли вводили внутрибрюшинно композицию из комплекса С₆₀-Arg-Arg и цинкового комплекса хлорина-е6 в суммарной дозе 30 мг/кг веса. Спустя 2-4 часа после введения композиции животных облучали лазерным излучением (662 нм и 890 нм) в суммарной дозе 100 Дж/см² (фиг.6). Забор асцитного материала для цитологических исследований производили через 1, 24 и 48 часов после облучения. Результаты эксперимента оценивали по продолжительности жизни в группах и характеру морфологических изменений в опухолевых клетках (см. фиг.7-9). При цитологическом исследовании мазков в опытной группе отмечено значительное увеличение количества иммунокомпетентных клеток, гистиоцитарных элементов и перитонеальных макрофагов. Наблюдаются явления адгезии иммунокомпетентных и опухолевых клеток с последующими процессами осмоса, приводящими к гибели опухолевых клеток. Эти иммунные реакции можно расценивать как неспецифическую противоопухолевую активность иммунокомпетентных клеток, спровоцированную фотохимическими процессами в опухолевой ткани (образование синглетного кислорода и запуск реакций перекисного окисления липидов). Следует отметить полиморфизм иммунных клеток и их мембранное взаимодействие между разными типами клеток.

Пример 7. Фотодинамическая терапия.

Эксперименты по ФДТ проведены на мышах-самках линии Balb/c весом 21-22 г. Моделью опухолевого роста служила эмбриокарцинома, метастазирующая лимфогенно (штамм РОНЦ им. Блохина РАМН).

При изучении фотодинамической реакции на солидных внутримышечных опухолях с внутрибрюшинным введением С₆₀-Arg-Arg в физиологическом 0,9% растворе NaCl в дозе 10 мг/кг и цинкового комплекса хлорина-е6 в дозе 5 мг/кг веса, с последующим облучением лазерным излучением в видимом 615-680 нм и инфракрасном диапазоне до 1 мкм, развитие истинной фотохимической реакции в опухолевой ткани наблюдалось не сразу в первые часы после облучения. Цвет опухолевого узла изменялся от серого до серо-синего, что свидетельствовало об отсутствии термической реакции при воздействии лазерного излучения. Формирование фотохимического струпа происходило в течение последующих 3-5 суток. Глубина некроза в опухолевом узле при однократном ФДТ-воздействии достигала 7-9 мм, что глубже, чем при ФДТ с использованием хлоринов. Динамика развития некроза в опухоли на макроскопическом уровне продемонстрирована на фиг.10-12.

Таким образом, хотя выше были подробно раскрыты отдельные наиболее предпочтительные воплощения изобретения, специалист в данной области сможет сделать многочисленные дополнения и изменения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Claims (7)

1. Фармацевтическая композиция для фотодинамической терапии злокачественных опухолей, содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из производных фуллерена С₆₀, выбранного из группы, включающей

а) соединение, в котором молекула фуллерена С₆₀ ковалентно связана с одной молекулой аминокислоты, или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемое производное; б) соединение, в котором молекула фуллерена С₆₀ ковалентно связана с одной молекулой дипептида, или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемое производное; в) нековалентный комплекс соединения, охарактеризованного выше в подпунктах а) или б), или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически приемлемого производного с фотосенсибилизатором из класса тетрапирролов, или фотосенсибилизатором из ряда хлорина-е₆, или металлокомплекса хлорина-е₆, или синтетическим полимером, или биополимером; г) конъюгат соединения, охарактеризованного выше в подпунктах а) или б), с аминосоединением; и фармацевтически приемлемый наполнитель или растворитель.

2. Композиция по п.1, в которой аминокислотой, ковалентно связанной с фуллереном С₆₀, является L- или D-аминокислота, выбранная из группы, включающей (трехбуквенный международный код): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, γ-аминомасляную кислоту (Aba), ε-аминокапроновую кислоту (Аср), цитруллин, орнитин.

3. Композиция по п.1, в которой дипептидом, ковалентно свзязанным с фуллереном С₆₀, является дипептид, состоящий из комбинации двух L- или D-аминокислот, независимо выбранных из группы, включающей (трехбуквенный международный код): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, γ-аминомасляную кислоту (Aba), ε-аминокапроновую кислоту (Аср), цитруллин, орнитин.

4. Способ фотодинамической терапии онкологического заболевания у человека, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в лечении, вводят в качестве фотосенсибилизатора фармацевтическую композицию по любому из пп.1-3.

5. Способ по п.4, в котором онкологическое заболевание выбирают из группы, включающей карциномы, саркомы, лимфомы, лейкемии, бластомы.

6. Способ по п.4, в котором фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, внутрибрюшинно, местно, перорально, внутривенно, интратуморально, интраназально.

7. Способ по п.4, в котором фармацевтическую композицию вводят в суточной дозе, составляющей от 0,5 до 50 мг/кг веса.

Images