CN115068606A - 一种肿瘤靶向纳米制剂、制备方法及在抗肿瘤药物制备中的应用 - Google Patents

一种肿瘤靶向纳米制剂、制备方法及在抗肿瘤药物制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤靶向纳米制剂、制备方法及在抗肿瘤药物制备中的应用。光动力疗法及生物膜仿生纳米载体在抗肿瘤药物开发领域具有显著的应用优势，本发明提供了一种肿瘤靶向纳米制剂，具体涉及一种血小板膜包覆、共载多西他赛和二氢卟吩e6的三代聚赖氨酸树状大分子纳米制剂。所述纳米制剂具有酸响应释放效果、肿瘤细胞摄取量更高，对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性。

Description

一种肿瘤靶向纳米制剂、制备方法及在抗肿瘤药物制备中的 应用
技术领域
本发明属于肿瘤靶向纳米制剂技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向纳米制剂、所述纳米制剂的制备方法、包含所述肿瘤纳米制剂的药物组合物及其在抗肿瘤药物制备中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
癌症是影响人类生命健康的主要疾病之一，在世界范围内，癌症负担逐年增加。癌症治疗的主要方式有手术治疗、化疗、放疗，但是这些治疗方法仍存在缺陷，如治疗不彻底，毒副作用大，特异性差等。20世纪80年代，纳米科学技术作为崛起的新科技，被应用于精确靶向的纳米药物递送系统的构建，为了提高药效，化学疗法与其他疗法的结合应用成为目前对于药物剂型开发和递送领域主要的研究热点。
光动力疗法(PDT)是用光敏药物和激光活化治疗肿瘤疾病的一种新方法。用特定波长照射肿瘤部位，能使选择性聚集在肿瘤组织的光敏药物活化，引发光化学反应破坏肿瘤。新一代光动力疗法(PDT)中的光敏药物如二氢卟吩e6(Ce6)会将能量传递给周围的氧，生成活性很强的活性氧(ROS)。活性氧能与附近的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性进而杀伤肿瘤细胞。与传统肿瘤疗法相比，PDT的优势在于：(1)能够精确进行有效的治疗，且副作用很小。(2)PDT能够损伤与肿瘤相关的脉管系统,致使肿瘤缺血性死亡。(3)PDT还能够激活机体的抗肿瘤免疫反应，如增加肿瘤组织内的细胞毒性T细胞，产生细胞因子等。综上，PDT是一种损伤小，且易操作的抗肿瘤疗法。
身体识别和清除外来物质的精细调节能力、特异性靶向机制是影响纳米药物进入靶部位的两大因素。近年来，生物膜仿生纳米载体引起了学者的广泛关注。通过血小板膜的包覆，其表面的CD47蛋白向巨噬细胞发送“不要吃我”的信号，以逃避RES的清除；通过血小板膜表面的P-选择素靶向肿瘤细胞高表达的CD44受体，实现主动靶向，从而使更多药物蓄积于肿瘤组织，提高抗肿瘤疗效。
由于肿瘤微环境的高间质液压力，即使药物到达肿瘤部位，也很难深入到深层的瘤重细胞。为了解决这一问题，粒径收缩的纳米给药系统逐渐进入人们的视野。科学家们利用肿瘤微环境区别于正常组织的生理环境，制备了一系列环境响应型的粒径收缩的纳米递药系统。在注射进入血液后，较大的粒径可以满足在血液中的长循环，而进入肿瘤组织后，在一定的刺激下，粒径减小，可到达肿瘤组织深处，发挥治疗效果。
发明内容
本发明设计提供了一种适用于疏水性抗肿瘤药物的递送系统，采用三代聚赖氨酸树状大分子作为载体，并采用血小板膜进行包覆实现药物溶解性的提升。另外，上述生物膜包覆作用还能够提升药物载体的主动靶向性。进一步的，本发明在上述药物载体中还添加了光敏剂，配合光动力作用实现血小板膜的破裂，提升对肿瘤细胞的破坏作用。
因此，本发明主要目的在于提供一种肿瘤靶向纳米制剂，所述肿瘤靶向纳米制剂采用三代聚赖氨酸树枝状大分子包载疏水性抗肿瘤药物及光敏剂作为核心，表面进行血小板膜包覆。
其中，三代聚赖氨酸树状大分子(DGL-G3)是良好的纳米载体，它具有良好的生物相容性、水溶性、无免疫原性、生物可降解性、众多的末端氨基便于修饰、粒径小、便于深层渗透等优点。因此，选用三代聚赖氨酸树状大分子作为载体，负载疏水性药物，并通过血小板膜包覆，以期提高药物溶解性，主动靶向作用，粒径可变以深层渗透肿瘤组织，提高抗肿瘤疗效。
所述光敏剂采用二氢卟吩e6(Ce6)，是一种提取自叶绿素的单体四吡咯化合物，具有无毒、肿瘤组织高选择性及非肿瘤组织清除率高的优点。二氢卟吩e6作为常用光敏剂用于光动力治疗，基于其疏水特性，通过物理负载的方式，将Ce6载入DGL-G3疏水性的空腔内。
多西他赛(DTX)是从欧洲红豆杉的枝条中提取的前体半合成衍生物，是一种紫杉类的广谱抗癌药物。其作用机制是通过抑制微管解聚，将细胞阻滞在对化疗敏感的G2/M期，从而达到抗肿瘤作用，适用于多种肿瘤治疗。本发明验证的一种实施方式中，采用血小板膜包覆共载DTX和Ce6的纳米制剂，采用水溶性的DGL-G3作为载体，其众多的末端氨基与羧基化DTX共价连接，得到载DTX的纳米制剂，同时，将Ce6通过物理吸附载入DGL-G3的疏水性空腔中，该技术方案取得了以下有益效果：
(1)本发明选用DGL-G3作为载体材料，具有良好的生物相容性和可降解性。载药时，制备工艺简单，制备条件温和，载药量大。血小板膜包覆，使纳米制剂具有靶向作用。综上，血小板膜包覆共载DTX和Ce6的纳米制剂是一种优良抗癌药物靶向纳米载体。
(2)本发明制备的载药纳米纳米制剂粒径适宜，形态圆整且呈现均匀的球形，具有适宜的载药量和包封率，且稳定性好。
(3)本发明制备的纳米制剂，通过血小板膜包覆赋予载体材料潜在的CD44高表达肿瘤靶向的特性，设计思路合理、操作易行。
(4)本发明制备的血小板膜包覆纳米制剂，在到达肿瘤部位时，可通过近红外光照射，使血小板膜破裂，从而有效释放粒径小、带正电的Ce6/DGL-DTX纳米制剂，粒径小且带正电的纳米制剂易于进入并渗透进入肿瘤深处。此外，Ce6在进入细胞内部经近红外光刺激可促进细胞产生活性氧，导致肿瘤细胞凋亡；在肿瘤细胞内的酸性环境中酯键断裂，释放出多西他赛，通过影响细胞有丝分裂过程，导致肿瘤细胞凋亡。该纳米制剂设计思路合理、操作易行。
(5)本发明制备的载药纳米胶束克服了难溶性药物水溶性差的缺陷，大大改善了难溶性抗肿瘤药物的溶解度，同时将DTX引入到载体之上，提高了药物含量。
(6)本发明制备的载药纳米制剂同时将难溶性的抗肿瘤药物包载、连接于胶束制剂中，能够有效的提高肿瘤致凋亡的能力，提供药物治疗效果。综上，本发明以DGL-G3为载体材料，其末端氨基与羧基化多西他赛连接，并载入二氢卟吩e6，通过血小板膜包覆，制成CD44受体靶向，ROS/酸响应的的纳米载体材料。本发明的血小板膜包覆纳米载体，具有良好的生物相容性以及生物可降解性。制备的肿瘤靶向载药纳米制剂外观圆整且稳定性好，载药量高，能增强药物靶向浓集，增强肿瘤杀伤的治疗效果，并降低非特异性毒副作用，具有良好的应有前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为DTX-COOH的1HNMR谱图；
图2为DTX-COOH的MS谱图；
图3为DGL-DTX的1HNMR谱图；
图4为DGL-DTX的FT-IR谱图；
图5为PM，PM@Ce6/DGL-DTX，Ce6/DGL-DTX，DGL-DTX的UV-Vis谱图；
图6为Ce6/DGL-DTX，PM@Ce6/DGL-DTX和PM的Western blot图；
图7为Ce6/DGL-DTX，PM@Ce6/DGL-DTX的透射电镜图；
图8为Ce6/DGL-DTX，PM@Ce6/DGL-DTX的粒径图；
图9为Ce6/DGL-DTX，PM@Ce6/DGL-DTX，PM的电位图；
图10为Ce6/DGL-DTX，PM@Ce6/DGL-DTX的粒径稳定性图；
其中，图10(a)为CDD纳米制剂在五天内纳米粒粒径变化；
图10(b)为PCDD纳米制剂在五天内纳米粒粒径变化；
图11为PM@Ce6/DGL-DTX的溶血实验结果图；
图12为PM@Ce6/DGL-DTX在pH 7.4和pH 5.0的释放介质中的释药曲线图
图13为活死细胞染色结果；
图14为B16F10细胞的凋亡流式结果图；
图15为B16F10细胞摄取结果图；
图16为B16F10细胞摄取阻断结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明第一方面，提供一种肿瘤靶向纳米制剂，所述纳米制剂的核心为共载多西他赛(DTX)和二氢卟吩e6(Ce6)的聚赖氨酸树枝状大分子纳米粒，所述纳米粒表面包覆血小板膜。
常见的纳米载体多为外源性物质，易引起免疫排斥反应，往往导致药物无法顺利递送至肿瘤部位，甚至引起毒性反应，因而本发明选择血小板膜包覆聚赖氨酸树状大分子核心，可延长药物体内循环时间；同时血小板膜表面的P-选择素蛋白靶向肿瘤细胞高表达的CD44受体，实现药物的精确递送，增加肿瘤部位药物蓄积；再者，通过血小板膜包覆，实现纳米载体的粒径可变。在血液循环过程中，较大的粒径及血小板膜包覆便于长循环，而到达肿瘤部位后，通过近红外光照射，光敏剂产生活性氧促使血小板膜破裂，释放出粒径小、带正电的纳米制剂，发挥化疗-光动力协同治疗作用，实现纳米制剂的肿瘤靶向释放。
优选的，聚赖氨酸树枝状大分子为三代聚赖氨酸树状大分子(GDL-G3)，本发明优选GDL-G3的粒径为5～8nm，分子量为18000～25000Da。
优选的，所述多西他赛和二氢卟吩e6通过物理吸附、包载或共价键连接的方式与聚赖氨酸树状大分子连接；进一步优选的方案中，所述二氢卟吩e6通过物理吸附负载在聚赖氨酸树状大分子中，所述多西他赛羧基化后与聚赖氨酸树状大分子末端的氨基连接。
本发明第二方面，提供第一方面所述肿瘤靶向纳米载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：向多西他赛中加入丁二酸酐进行羧基化修饰，将羧基化的多西他赛(DTX-COOH)与DGL-G3进行酰胺化反应得到DGL-DTX；向DGL-DTX的溶液中加入二氢卟吩e6溶液，搅拌后得到所述产物Ce6/DGL-DTX；将Ce6/DGL-DTX加入血小板膜溶液中超声并挤压得到所述肿瘤靶向纳米制剂。
优选的，所述多西他赛的羧基化修饰，具体步骤如下：将多西他赛、丁二酸酐、DMAP溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下搅拌；反应20～26h后除去溶剂得到白色固体，加入有机相溶解洗涤干燥后去除有机相得到DTX-COOH。
进一步的，所述多西他赛、丁二酸酐、DMAP的质量比为20:1～5:1～3。
优选的，所述DGL-DTX合成的具体步骤如下：向DTX-COOH溶液中加入EDC·HCl得到混合溶液，向混合溶液中逐滴加入NHS溶液搅拌对DTX-COOH进行活化；将活化的DTX-COOH滴加到DGL-G3溶液中，室温搅拌反应并进行透析得到所述白色产物DGL-DTX。
进一步的，DTX-COOH:EDC·HCl:NHS的比例为0.8～1.2:2～4:2～4。
进一步的，所述透析的截留分子量为3300～3700Da.
进一步的，所述透析依次采用DMF和水进行透析，透析时间共计4～6天。
优选的，Ce6/DGL-DTX制备的具体步骤如下：
将Ce6加入DMF溶解得Ce6溶液，搅拌作用下将Ce6溶液逐滴加入DGL-DTX水溶液中，所述DGL-DTX:Ce6的投料比为3～5:1；室温搅拌反应5～7h进行对水透析得到所述Ce6/DGL-DTX。
优选的，所述超声条件如下：140～160W超声4～7min。
优选的，所述挤压通过薄膜挤压的方式进行，所述薄膜为400nm、200nm的聚碳酸酯膜。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括第一方面所述肿瘤靶向纳米制剂。
优选的，所述药物组合物中，所述肿瘤靶向纳米制剂应当是有效剂量的，所述有效剂量依据药物组合物的使用目的、使用方式可通过本领域常规手段确定。
优选的，所述药物组合物为液体制剂，进一步的，为注射剂。
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的辅料。
本发明第四方面，提供第一方面所述肿瘤靶向纳米制剂、第三方面所述药物组合物在抗肿瘤药物制备中的应用。
上述应用中，所述抗肿瘤药物优选为疏水性抗肿瘤药物。
本发明第五方面，提供一种肿瘤治疗方法，所述治疗方法包括向有治疗需求的患者施用第一方面所述肿瘤靶向纳米制剂。
优选的，所述施用方式为静脉注射或通过介入手段等使所述肿瘤靶向纳米制剂能够作用于患处。
优选的，所述治疗方法中，还包括采用近红外光源对患处进行照射。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1、DGL-DTX的合成
(1)DTX-COOH的合成：称取DTX 100mg，丁二酸酐15mg，DMAP 7.5mg，溶于10mL无水二氯甲烷中，氮气保护下搅拌，反应24小时后，旋转蒸发除去二氯甲烷，用10mL乙酸乙酯溶解旋蒸后的白色固体，分别用1％HCl和饱和NaCl溶液洗涤3次，收集有机相，加无水硫酸镁静置过夜除去残余水分，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到白色粉末状产物DTX-COOH。
(2)DGL-DTX(DD)的合成：称取100mg DTX-COOH，溶于10mL的DMF中。按照DTX-COOH:EDC·HCl:NHS＝1:3:3的比例加入64mg EDC·HCl，室温搅拌1.5h，将38mg NHS溶于2mL DMF中，逐滴加入到上述混合溶液中，室温搅拌1.5h活化DTX-COOH的羧基。称取DGL-G3100 mg溶于20mL NHS中，将已活化的DTX-COOH滴加到DGL-G3溶液中，室温搅拌24h，然后将最终产物溶液转移至透析袋(截留分子量3500Da)中，DMF透析3天，水透析2天以除去未反应的DTX-COOH，EDC·HCl和NHS。透析结束后冻干即得白色产物DGL-DTX，其合成方法如下式所示：
Figure BDA0003657237310000071
DTX-COOH的1H-NMR和MS谱图见图1、图2，相较于DTX，DTX-COOH的1H-NMR图中出现了7.0-8.0ppm处DTX苯环上的特征峰，在2.5-3.0ppm处出现了丁二酸酐亚甲基的吸收峰，而且在12.2ppm处出现了羧基氢的特征峰，MS图中最高峰显示DTX-COOH的分子离子峰[M-H]-＝906.7。综合以上结果，表明了DTX-COOH的成功合成。DGL-DTX的1H-NMR和FT-IR谱图见图3、图4，DGL-G3在1到1.8ppm之间的峰为三个赖氨酸单位的-CH2-，在2.9ppm处为-CH2-NH2的特征峰，而接近4.2ppm处的峰代表赖氨酸结构中手性碳上的H。而DGL-DTX的1H-NMR谱显示出7.5ppm-8.5ppm DTX苯环氢的特征峰。如图2-7为DTX、DGL-G3和DGL-DTX的红外光谱图。DGL-G3为赖氨酸多聚物，含有大量的酰胺键与氨基。三种特征峰分别为3540cm-1、1720cm-1和1585cm-1，这分别对应的是DGL中的N-H的伸缩振动峰即DGL-G3赖氨酸的侧链氨基、C＝O伸缩振动峰，即酰胺Ⅰ带和N-H的弯曲振动，即酰胺Ⅱ带，由此证明该化合物为DGL-G3。经过DTX-COOH的修饰后，相较于DGL-G3的谱图，有2个新峰出现分别是3070cm-1、2935cm-1，3070cm-1为苯环上C-H的特征峰，2935cm-1为DTX苯环上＝C-H的特征峰，且图中酰胺Ⅰ带1650cm-1和酰胺Ⅱ带1542cm-1峰变强，说明由DTX-COOH的羧基和DGL-G3的氨基形成了酰胺键(CO-NH2)。综上所述，DGL-G3与DTX-COOH发生了酰胺反应，成功合成了DGL-DTX。
2、载Ce6的DGL-DTX纳米制剂(Ce6/DGL-DTX)的合成
首先进行DD和Ce6的处方筛选。称取4mg DGL-DTX(DD)于50mL圆底烧瓶，加4mL水溶解，水浴超声使其分散均匀，得1mg/mL的DD溶液。称取1mg Ce6，加入1mL DMF溶解，得1mg/mLCe6溶液。设定DD和Ce6投料比为1:1,2:1,3:1,4:1,和5:1，搅拌下将Ce6溶液逐滴加入DD水溶液中，室温搅拌6h，水透析24h，冻干即得产物Ce6/DGL-DTX(CDD)。HPLC测得DTX在CDD纳米制剂的载药量为15.58％；紫外测得Ce6在CDD纳米制剂的包封率为67.2％，载药量为13.44％。如图5，通过紫外可见光谱法证明了Ce6的负载。
3、血小板膜包覆Ce6/DGL-DTX纳米制剂的合成
首先进行血小板膜的提取，具体步骤如下：
(1)采用梯度离心后冻融的方法从全血中提取血小板膜(PM)。全血1050rpm离心20min，分离出富含血小板的血浆上清液至新的5mL EP管中；将得到的血浆上清液1050rpm离心20min，除去剩余的红细胞沉淀，将上清液转移至新的5mL EP管中；向5mL EP管中加入含有1mM EDTA和2μM前列腺素E1的磷酸盐缓冲液抑制血小板活化，3000rpm离心20min，弃去上清液，保留细胞沉淀；收集所得细胞沉淀，用磷酸缓冲盐溶液(含有1mM EDTA和蛋白酶抑制剂)重悬细胞沉淀，即得血小板溶液；将该溶液在-80℃条件下冻存20min，放于室温至完全溶解，反复冻融7次，6650rpm离心3min，弃去上清液，得到细胞膜沉淀；用含蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液反复洗涤沉淀3次，得到血小板膜，放置于-20℃冰箱备用。
(2)将CDD(CDD的量为0.4mg)加入上述从1mL血中提取的血小板膜溶液中，150W40kHz超声5min，分别通过400nm，200nm的聚碳酸酯膜在脂质体挤压器上往复20次，即得PM@Ce6/DGL-DTX(PCDD)纳米制剂。如图5，通过紫外-可见光谱证明纳米制剂中血小板膜的存在；如图6，通过Western blot证明纳米制剂上存在血小板膜的主要蛋白如P-选择素、CD41、CD47；如图7，通过透射电镜看出所制备纳米制剂呈球形，形状规整，表面附着血小板膜；如图8，CDD纳米制剂的粒径为79.38±0.7697nm，而血小板膜包覆后，粒径明显增大，为252.9±4.937nm，证明了该纳米制剂的粒径可变；如图9，CDD纳米制剂电位为+14.9mV，而血小板膜包覆后，电位转为负，为-20.8mV，与血小板膜电位(-24.4mV)相近；如图10，CDD纳米制剂在五天内纳米粒粒径变化明显，而PCDD纳米制剂5天内粒径无明显改变，证明了PCDD纳米制剂良好的稳定性；如图11，溶血结果显示出PCDD纳米制剂良好的安全性，可用于静脉注射。
实施例2：血小板膜包覆Ce6/DGL-DTX纳米制剂的体外释放实验
本实施例中，采用pH 5.0含5％Tween 80的PBS模拟肿瘤细胞内的酸性环境，采用反向动态透析法测定药物的释放度：取2mL PCDD纳米粒溶液置于3500Da的透析袋内。分别向离心管中加入上述两种释放介质30mL,将装有纳米粒溶液的透析袋浸入其中后，置于37℃、100rpm条件下孵育。在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、60、72、96小时从所有介质中取1mL用以测定DTX的含量，同时补充等量预热的新鲜介质。所得的样品过0.22μm滤膜，进样量20μL进行HPLC检测，计算累积释放百分率。如图12所示，PCDD纳米制剂在pH7.4的释放介质中释药缓慢，而在pH 5.0的释放介质中释药迅速，证明了酸响应的药物释放。
实施例3：血小板膜包覆Ce6/DGL-DTX纳米制剂的活死细胞染色实验
利用活死细胞染色试剂盒来观察活死细胞的数量。将B16F10细胞计数后，以1×105细胞/孔的密度接种于12孔板中，孵育24h使其充分贴壁。小心吸弃培养基，用PBS洗涤3次，向每孔加入1mL空白培养基或含药培养基孵育12h后，用660nm(100mW/cm2照射5min,然后继续孵育至24h。先收集细胞上清，1000rpm离心3min。贴壁的细胞用胰蛋白酶消化液消化，离心收集(1000rpm,3min)。去除上清后，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2-3次，去除胰蛋白酶消化液，然后用1×Assay Buffer工作液重悬细胞。按照试剂盒说明书上的步骤取100μL的Calcein-AM/PI染色工作液加入到200μL的细胞悬液中，混匀，37℃孵育15min，最后用荧光显微镜拍照。如图13所示为用不同方法处理B16F10细胞24h的活死细胞染色结果。对照组几乎没有细胞死亡，而游离DTX存在较少的细胞死亡，而PCDD纳米粒细胞死亡更多，这可能是因为血小板膜包覆可增加DTX的摄取；Ce6无光照条件下，几乎无细胞死亡，而在光照的情况下，细胞死亡较多；PCDD纳米粒，可导致最多的细胞死亡，说明光敏剂及化疗药物共同存在条件下，可导致较高的细胞毒性，能收集到的活细胞数目较少。
实施例4：血小板膜包覆Ce6/DGL-DTX纳米制剂的细胞凋亡实验
将B16F10细胞接种于12孔板中，密度是1×105细胞/孔(含有1mL细胞培养基)，孵育过夜。吸弃培养基，用PBS洗涤2次，向每孔加入1mL空白培养基或含药培养基继续孵育12h后，用660nm的近红外光(100mW/cm2)照射5min，然后继续孵育至24h。收集上清和细胞，转移到离心管中1000g离心5min。收集细胞后加入冷PBS重悬清洗，离心收集细胞，重复2次。在细胞沉淀中加入1×binding buffer工作液，重悬细胞，得到细胞浓度为1×l06细胞/mL。吸取上述细胞100μL至1.5mL的离心管中，再根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的染色要求，加入5μL的Annex in V-FITC和10μL PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。染色孵育后，再加入400μL的1×Binding buffer工作液，混匀后转移至流式管中，使用流式细胞仪于1h内检测完毕。
细胞凋亡结果如图14所示，其中Q1、Q2、Q3、Q4分别代表坏死、晚凋、早凋和活细胞比例。Ce6未加光照组的细胞凋亡率为11.85％，与对照组的细胞凋亡率(5.7％)相差不大，说明在没有光照的情况下，光敏剂Ce6对细胞无较强杀伤作用。而Ce6激光照射组，细胞凋亡率明显增大(为29.08％)，说明近红外激光照射，细胞可产生ROS，具有肿瘤细胞杀伤作用。游离的DTX处理后的细胞凋亡率为17.67％,而PCDD NPs的凋亡率增加到36.84％,这可能是因为血小板膜包覆增加了细胞对药物的摄取，导致细胞内的药物浓度增加，使化疗药DTX发挥抗肿瘤效果。此外，经过光照处理后，发现纳米粒凋亡率增加到62.16％,体现了化疗与光动治疗联合应用的优越性。
实施例5：血小板膜包覆Ce6/DGL-DTX纳米制剂的细胞摄取及阻断实验
将B16F10细胞计后，以1×105个/孔的密度(含有1mL的细胞培养基)接种到12孔板中，孵育24h使其充分贴壁。每孔加入1mL Ce6或PM@Ce6/DGL-DTX(PCDD)纳米粒，将细胞放回胞培养箱分别继续孵育1、2、4h后，除去培养基，用冷PBS洗涤3次。用移液枪小心地将PBS除去，然后每孔加入0.5mL 4％多聚甲醛固定液，室温避光固定30min。然后将固定液除去，用冷的PBS漂洗，每次3min,洗3次。接着向每孔中加入300μL DAPI染色液，避光染色10min后，PBS漂洗。最后加入0.5mL的PBS缓冲液浸润细胞并在荧光显微镜下观察细胞摄取情况。
为了评估P-选择素对摄取的影响，进行了摄取阻断实验。首先，将B16F10细胞与P-选择素(20μg/mL)预孵育1h，将细胞与PCDD纳米粒孵育4h，进行共聚焦显微镜成像分析。
细胞摄取结果如图15所示，Ce6和PCDD纳米制剂的摄取均显示出时间依赖性，且在相同时间点，PCDD的摄取多于Ce6。阻断实验结果如图16所示，P-选择素预孵育PCDD纳米制剂的红色荧光远远弱于P-选择素未预孵育PCDD组的荧光。这是因为PCDD纳米制剂中血小板膜上的P-选择素靶向黑色素瘤细胞表面高表达的CD44受体，使药物更多的进入细胞，证明血小板膜的包覆，使PCDD纳米粒具有P-选择素主动靶向能力，可增加B16F10细胞对药物的摄取，增加肿瘤药物蓄积。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂的核心为共载多西他赛和二氢卟吩e6的聚赖氨酸树枝状大分子纳米粒，所述纳米粒表面包覆血小板膜。
2.如权利要求1所述肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于，所述聚赖氨酸树枝状大分子为GDL-G3，所述GDL-G3的粒径为5～8nm，分子量为18000～25000Da。
3.如权利要求1所述肿瘤靶向纳米制剂，其特征在于，所述多西他赛和二氢卟吩e6通过物理吸附、包载或共价键连接的方式与聚赖氨酸树状大分子连接；
优选的，所述二氢卟吩e6通过物理吸附负载在聚赖氨酸树状大分子中，所述多西他赛羧基化后与聚赖氨酸树状大分子末端的氨基连接。
4.权利要求1-3任一项所述肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：向多西他赛中加入丁二酸酐进行羧基化修饰，将羧基化的多西他赛与DGL-G3进行酰胺化反应得到DGL-DTX；向DGL-DTX的溶液中加入二氢卟吩e6溶液，搅拌后得到所述产物Ce6/DGL-DTX；将Ce6/DGL-DTX加入血小板膜溶液中超声并挤压得到所述肿瘤靶向纳米制剂。
5.如权利要求4所述肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述多西他赛的羧基化修饰，具体步骤如下：将多西他赛、丁二酸酐、DMAP溶于无水二氯甲烷中，氮气保护下搅拌；反应20～26h后除去溶剂得到白色固体，加入有机相溶解洗涤干燥后去除有机相得到DTX-COOH；
进一步的，所述多西他赛、丁二酸酐、DMAP的质量比为20:1～5:1～3。
6.如权利要求4所述肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，所述DGL-DTX合成的具体步骤如下：向DTX-COOH溶液中加入EDC·HCl得到混合溶液，向混合溶液中逐滴加入NHS溶液搅拌对DTX-COOH进行活化；将活化的DTX-COOH滴加到DGL-G3溶液中，室温搅拌反应并进行透析得到所述白色产物DGL-DTX；
优选的，DTX-COOH:EDC·HCl:NHS的比例为0.8～1.2:2～4:2～4；
优选的，所述透析的截留分子量为3300～3700Da；
优选的，所述透析依次采用DMF和水进行透析，透析时间共计4～6天。
7.如权利要求4所述肿瘤靶向纳米载体的制备方法，其特征在于，Ce6/DGL-DTX制备的具体步骤如下：
将Ce6加入DMF溶解得Ce6溶液，搅拌作用下将Ce6溶液逐滴加入DGL-DTX水溶液中，所述DGL-DTX:Ce6的投料比为3～5:1；室温搅拌反应5～7h进行对水透析得到所述Ce6/DGL-DTX；
或，所述超声条件如下：140～160W超声4～7min；
或，所述挤压通过薄膜挤压的方式进行，所述薄膜为400nm、200nm的聚碳酸酯膜。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求1-3任一项所述肿瘤靶向纳米制剂；
优选的，所述药物组合物中，所述肿瘤靶向纳米制剂是有效剂量的；
优选的，所述药物组合物为液体制剂，进一步的，为注射剂；
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的辅料。
9.权利要求1-3任一项所述肿瘤靶向纳米制剂、权利要求8所述药物组合物在抗肿瘤药物制备中的应用；
所述应用中，所述抗肿瘤药物优选为疏水性抗肿瘤药物。
10.一种肿瘤治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括向有治疗需求的患者施用权利要求1-3任一项所述肿瘤靶向纳米制剂；
优选的，所述施用方式为静脉注射或通过介入手段使所述肿瘤靶向纳米制剂作用于患处；
优选的，所述治疗方法中，还包括采用近红外光源对患处进行照射。
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