KR20150011568A - 효소 민감성 폴리아미노산과 접합된 광응답제 또는 소광제 및 광역학 치료를 위한 소수성 약물 봉입 나노입자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효소에 의해 특이적으로 분해되는 폴리 아미노산 광응답제 접합체 및 폴리아미노산 소광제 접합체를 포함하는 광화학적 내재화를 위한 소수성 약물 봉입 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 소수성 약물 봉입 나노입자는 효소에 의해 폴리아미노산의 결합이 분해되어 소수성의 성질이 감소됨으로써 나노입자의 붕괴와 연계될 수 있으며, 그로 인해 나노입자의 내부에 봉인된 약물의 방출이 유도되고 또한, 나노 입자를 구성하는 광응답제는 소광제로부터의 영향이 감소하여 광응답 효율의 증가와 단일항산소등의 활성산소종의 반응에 의해 세포질로의 내재화를 유도할 수 있으므로, 약물의 세포질 내재화율을 극대화시켜 광화학적 내재화를 위한 약물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 효소에 의해 특이적으로 분해되는 폴리아미노산 광응답제 접합체 및/또는 폴리아미노산 소광제 접합체 및 이를 포함하는 광화학적 내재화를 위한 소수성 약물 봉입 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
광화학요법 또는 광역학요법(photodynamic therapy: PDT)은 다양한 이상 또는 장애를 치료하기 위한 기술이다. PDT는 피부 또는 다른 상피 기관 또는 점막의 장애, 특히 암 또는 전-암성 병변을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 비-암성 상태, 예를 들어, 여드름 및 노인성 황반 변성의 치료에서의 용도를 발견하여 임상에 적용하여 사용되고 있다. PDT는 신체의 병에 걸린 부위에 광응답제를 적용시킨 후, 광응답제를 활성화시키기 위해서 이 부위를 광에 노출시키는 것을 포함한다. 광응답제의 활성화는 광응답제를 병에 걸린 세포의 증식 잠재력을 없애거나 그렇지 않으면 감소시키는 세포독성 형태로 전환시킨다.
광역학치료에 사용하기 위한 다양한 광응답제가 공지되어 있다. 포르피린 유도체는 암세포 선택적으로 축적되는데, 이는 포르피린 수송을 담당하는 저밀도지방단백질 (low density lipoprotein, LDL)에 대한 수용체가 암세포에 많이 발현되어 있기 때문이라 설명된다. 그러나 대부분의 광응답제는 난용성이며, 인체 잔류시간이 길어 나타나는 광독성으로 인해 인체에서 부작용이 나타난다. 또한, 광응답제를 이용한 치료방법은 적절한 빛 (광자)의 조사가 필수적이나, 병변 부위로의 빛 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용이 불가능한 단점이 있다.
임상적 사용에 대해 공지된 광응답제들은 5-아미노레불린산(5-ALA), 5-ALA 메틸 에스테르, 5-ALA 헥실 에스테르, 베르테포르핀, 소랄렌 및 포르피머를 포함한다. 5-ALA(Levulan) 및 5-ALA 메틸 에스테르(Metvix)는 다양한 피부 상태의 치료에 사용되며; 5-ALA 헥실 에스테르(Hexvix)는 방광암의 진단에 사용되며; 베르테포르핀(Visudyne)은 눈에서의 황반 변성의 치료에 사용되며; 포르피머(Photofrin)는 폐암의 치료 및 폐쇄성 식도암의 일시적 치료에 사용된다.
광화학적 내재화(Photochemical Internaliztion; PCI)는, 세포의 세포질액(cytosol) 내로, 광 및 광응답제의 사용없이는 막-불투과성인 약물을 도입하기 위한 광 및 광응답제의 사용을 포함하지만 세포 파괴 또는 세포 사멸을 반드시 초래하지는 않는 약물 전달 방법이다. 이 방법에서 내재화되거나 이송될 분자는 광응답제와 조합하여 세포에 적용된다. 세포를 적합한 파장의 광에 노출하는 것은 광응답제를 활성화시키고, 이어서 세포내구획 막을 파괴시키고 상기 분자의 세포질액 내로의 후속적인 방출을 야기한다. PDT에서, 이것은 직접적으로 질환에 영향을 끼치는 세포-독성 물질을 형성하는 광응답제에 대한 광의 효과이다. 이와는 대조적으로, PCI에서, 광응답제와 광 사이의 상호작용은 약물의 세포내 흡수가 개선되도록 세포에 영향을 끼치는데 이용된다. 두 기작 모두 일중항(singlet) 산소종을 수반하는 경로를 통한다. 일중항 산소는 세포막에 있는 분자를 포함하여 다양한 생물분자를 산화시킬 수 있는 산소의 높은 반응성 형태이다. PDT에서는 직접-작용 치료제가 통상적으로 사용되지 않는 반면, PCI에서는 직접-작용 약물(또는 이의 프로드럭)이 항상 광응답제와 함께 사용된다. "직접-작용"인 것으로 간주될 수 있는 약물은 (치료적이든 예방적이든) 고유한 생물학적 활성을 갖는다. 이러한 약물은, 생체 내에서 목적하는 표적 부위에 존재하는 경우, 활성화되기 위해 광을 필요로 하지 않는다. PCI에서 사용될 수 있는 광응답제는 PDT에서도 사용될 수 있으나, 모든 PDT-활성 광응답제가 PCI에 사용될 수 있는 것은 아니다.
PCI에 사용하기 위한 많은 상이한 광응답제가 제시되어 있다. 예를 들어, 프탈로시아닌, 디-설폰화된 알루미늄 프탈로시아닌(AlPcS2 및 AlPcS2a), 설폰화된 테트라페닐포르피린(TPPS2a, TPPS4, TPPS1 및 TPPS20), 나일 블루, 클로린(chlorin) 및 클로린 유도체(박테리오클로린 및 케토클로린 포함), 우로포르피린 I, 필로에리트린, 천연 및 합성 포르피린(헤마토포르피린 및 벤조포르피린 포함), 메틸렌 블루, 양이온성 염료, 테트라사이클린, 나프탈로시아닌, 텍사피린, 페오포르비드, 푸르푸린, 로다민, 플루오레세인, 리소좀자극(lysosomotropic) 약 염기, 및 포르피센을 포함한다.
따라서 광역학 치료법의 세포에 대한 영향과 유전자, 항암제, 단백질 약물 등의 약물 치료를 단독으로 수행하는 것이 아닌 상기 두 치료 방법을 융합하여 그 치료 효과를 높일 수 있는 방법이 연구되고 있다. 하지만 기존의 방법은 유전자, 항암제 혹은 단백질 약물이 광응답제와 동시에 목적 부위에 전달하는 것이 아닌 광응답제를 선 주입한 후 약물을 주입하게 되고 일정 시간 지난 뒤 광자를 조사하는 방법을 사용하고 있다. 이러한 방법은 각 약물을 여러 차례 걸쳐 주입해야 하며, 병변 부위로 만의 전달이 불가능하며, 광응답제와 치료용 약물이 일체형이 아니므로 두 약물이 세포 내 동일한 부분에 위치하지 않을 수 있으며, 주입된 광응답제로부터 발생할 수 있는 광독성 또한 수반된다는 단점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명의 목적은 소수성 블록을 구성하는 폴리아미노산 및 친수성 블록을 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 공중합체에 있어서, 상기 폴리아미노산은 효소 작용에 의해 소수성기가 제거되어 친수성으로 전환되는 것을 특징으로 하는, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-광응답제 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-소광제 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-광응답제 접합체 및/또는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-소광제 접합체 및 소수성 약물을 포함하는, 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 광역학 치료용 나노 입자를 세포에 처리한 후, 500~800nm의 파장의 광자를 200J/cm2 이하로 조사하는 단계를 포함하는, 광역학 치료용 나노 입자의 세포 내재화 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 광역학 치료용 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 암 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 소수성 블록을 구성하는 폴리아미노산 및 친수성 블록을 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 공중합체에 있어서, 상기 폴리아미노산은 효소 작용에 의해 소수성기가 제거되어 친수성으로 전환되는 것을 특징으로 하는, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리아미노산은 아스파틱산 또는 글루타믹산의 곁사슬의 카르복시기가 벤질 알콜기와 에스터 결합으로 결합되어 있는 형태의 벤질 아스파틱산 또는 벤질 글루타믹산 중에서 1종 또는 2종을 개환 중합한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300내지 50,000일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중합은 폴리아미노산을 10 내지 200의 중합비율로 중합시킨 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 광응답제가 접합된, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-광응답제 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 블랙홀 소광제(blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광제(blackberry quencher, BBQ)중에서 선택된 1종 이상의 소광제가 접합된, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-소광제 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-광응답제 접합체 및/또는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-소광제 접합체 및 소수성 약물을 포함하는, 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 약물은 파클리탁셀 또는 독소루비신일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 입자는 10 내지 200nm 의 입자 크기를 가지며, 제타포션셀은 음전하를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리아미노산은 에스테라제 효소 처리에 의해 특이적으로 분해되며 이로 인해 나노 입자의 붕괴와 내부 봉입 약물의 방출이 유도되고, 효소 처리에 의해 분해되는 폴리아미노산 기반의 고분자 1몰과 결합할 수 있는 광응답제 또는 소광제는 0.5~1몰일 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) 폴리아미노산 기반의 효소 민감성 양친매성 고분자를 중합하는 단계;(b) 상기 (a) 단계에서 중합된 효소 민감성 양친매성 고분자에 광응답제를 첨가하여 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체를 합성하는 단계;(c) 상기 (a) 단계에서 중합된 효소 민감성 양친매성 고분자에 소광제를 첨가하여 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체를 합성하는 단계; 및 (d) 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체와 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체 및 소수성 약물을 용매에 혼합하여 나노 입자를 제조하는 단계를 포함하는, 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide:DMSO) 및 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide;DMF)인 것을 특징으로 하는 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(nitrosourea) 중에서 선택된 1종 이상을 투석을 통해 봉입시킨 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 약물은 상기 나노입자의 총 중량을 기준으로 0.001~10중량%로 함유된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계에서 나노 입자를 제조하는 단계는 자가 응집법(self-assembly method), 초음파(ultrasonic) 및 균질기(homogenizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로 수행하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 광역학 치료용 나노 입자를 세포에 처리한 후, 500~800nm의 파장의 광자를 200J/cm2 이하로 조사하는 단계를 포함하는, 광역학 치료용 나노 입자의 세포 내재화 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 광역학 치료용 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 암 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 편평상피세포함, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담남앙으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 효소에 의해 특이적으로 분해되는 폴리아미노산 광응답제 접합체 및 폴리아미노산 소광제 접합체를 포함하는 광화학적 내재화를 위한 소수성 약물 봉입 나노 입자의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 소수성 약물 봉입 나노입자는 효소에 의해 폴리아미노산의 결합이 분해되어 소수성의 성질이 감소됨으로써 나노입자의 붕괴와 연계될 수 있으며, 그로 인해 나노입자의 내부에 봉인된 약물의 방출이 유도되고 또한, 나노 입자를 구성하는 광응답제는 소광제로부터의 영향이 감소하여 광응답 효율의 증가와 단일항산소등의 활성산소종의 반응에 의해 세포질로의 내재화를 유도할 수 있으므로, 약물의 세포질 내재화율을 극대화시켜 광화학적 내재화를 위한 약물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 mPEG-pBLA, mPEG-pBLA-Ce6, mPEG-pBLA-BHQ3의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 2는 mPEG-pBLA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 mPEG-pBLA-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 mPEG-pBLA-BHQ3의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5a는 효소 민감성 양친매성 고분자 소광제 접합체의 효소 민감성 양친매성 고분자 광응답제 접합체에 대한 혼합비율에 따른 소광효율 및 근적외선 형광영상을 나타낸 것이다.
도 5b는 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 수상에서의 입자 분포도 및 전계방출형 주사현미경 영상을 나타낸 것이다.
도 5c는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 형광 강도 변화 및 근적외선 형광 영상을 나타낸 것이다.
도 5d는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 일항산소 발생능을 나타낸 것이다.
도 5e는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 소수성 약물의 약물 방출 특성을 나타낸 것이다.
도 6a는 HeLa 세포에서의 광원조사에 따른 나일레드를 봉입한 효소민감성 나노입자로부터 방출된 나일레드의 세포질 내재화율 변화에 대한 공촛점 현미경 사진 및 그에 대한 히스토그램 그래프를 나타낸 것이다.
도 6b는 HCT-8 세포에서의 광원조사에 따른 나일레드를 봉입한 효소민감성 나노입자로부터 방출된 나일레드의 세포질 내재화율 변화에 대한 공촛점 현미경 사진 및 그에 대한 히스토그램 그래프를 나타낸 것이다.
도 7a는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 용혈율을 나타낸 것이다.
도 7b는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 지질 산화 정도를 나타낸 것이다.
도 8a는 HeLa 세포에서의 광원조사에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8b는 HCT-8 세포에서의 광원조사에 따른 세포 생존율을 나타내는 것이다.
도 9a는 HeLa 세포에서의 광원조사 후에 세포 생존율에 대한 Live/Dead assay결과이다.
도 9b HCT-8 세포에서의 광원조사 후에 세포 생존율에 대한 Live/Dead assay결과이다.
도 10은 동물 종양 모델에서의 항종양 효과에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 mPEG-pBLA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 mPEG-pBLA-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 mPEG-pBLA-BHQ3의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5a는 효소 민감성 양친매성 고분자 소광제 접합체의 효소 민감성 양친매성 고분자 광응답제 접합체에 대한 혼합비율에 따른 소광효율 및 근적외선 형광영상을 나타낸 것이다.
도 5b는 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 수상에서의 입자 분포도 및 전계방출형 주사현미경 영상을 나타낸 것이다.
도 5c는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 형광 강도 변화 및 근적외선 형광 영상을 나타낸 것이다.
도 5d는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 일항산소 발생능을 나타낸 것이다.
도 5e는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 소수성 약물의 약물 방출 특성을 나타낸 것이다.
도 6a는 HeLa 세포에서의 광원조사에 따른 나일레드를 봉입한 효소민감성 나노입자로부터 방출된 나일레드의 세포질 내재화율 변화에 대한 공촛점 현미경 사진 및 그에 대한 히스토그램 그래프를 나타낸 것이다.
도 6b는 HCT-8 세포에서의 광원조사에 따른 나일레드를 봉입한 효소민감성 나노입자로부터 방출된 나일레드의 세포질 내재화율 변화에 대한 공촛점 현미경 사진 및 그에 대한 히스토그램 그래프를 나타낸 것이다.
도 7a는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 용혈율을 나타낸 것이다.
도 7b는 에스터라아제 처리에 따른 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 지질 산화 정도를 나타낸 것이다.
도 8a는 HeLa 세포에서의 광원조사에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8b는 HCT-8 세포에서의 광원조사에 따른 세포 생존율을 나타내는 것이다.
도 9a는 HeLa 세포에서의 광원조사 후에 세포 생존율에 대한 Live/Dead assay결과이다.
도 9b HCT-8 세포에서의 광원조사 후에 세포 생존율에 대한 Live/Dead assay결과이다.
도 10은 동물 종양 모델에서의 항종양 효과에 대한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 폴리 아미노산 기반의 효소 민감성 양친매성 고분자 광응답제 접합체 및 소광제 접합체를 포함하는 소수성 약물 봉입 나노 입자에 관한 것이다. 폴리아미노산과 광응답제 및 소광제를 합성하여 항암치료효과를 지닌 소수성 약물을 내부에 봉입한 나노입자를 제조함으로써 광원 조사시 단일항산소등의 활성산소종의 반응에 의해 세포소기관에서 세로질로의 내재화가 유도된다는 발견에 근거한 것이다.
용어 “세포소기관”이란 인체에 여러 가지 기관이 존재하는 것처럼 진핵세포의 내부에 존재하며 세포의 여러 가지 기능을 분업으로 하고 있는 구조단위를 뜻한다. 세포소기관에는 막구조를 하는 막성 소기관과 리보솜, 미소관, 방추체, 핵소체와 같이 막구조가 없는 비막성 소기관이 존재하는데 좁은 뜻의 세포소기관은 막성소기관을 말한다. 막성소기관에는 2중막으로 둘러싸인 핵, 미토콘드리아와 단일막으로 둘러싸인 소포체, 골지체, 분비과립, 분비소포, 리소솜, 파고솜, 퍼옥시솜 등이 있다.
용어 “세포질”이란 원형질에서 핵을 제외한 나머지 부분을 일컫는 말이며, 전형적이라고 생각되는 세포에서는 세포질의 가장 겉층은 세포막으로 분화하고, 그 내부는 광학현미경적으로는 외질과 내질로 구성된다. 세포질에는 각종 세포소기관이나 과립이 존재하며, 각각 특유한 기능을 하고 있다.
본 발명은 효소 민감성과 소수성 블록을 구성하는 폴리아미노산과 친수성 블록을 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 블록 공중합체에 관한 것이다. 특히, 폴리아미노산과 폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체는 양친매성의 특징을 갖는다. 효소 민감성 폴리아미노산 블록은 효소의 작용에 의해 폴리아미노산으로부터 소수성기가 제거됨으로서 친수성으로 전환될 수 있는 특징을 지닌다.
본 발명의 일실시예에서 상기 친수성 블록을 구성하는 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 분자량이 300내지 50,000이며, 상기 화학식 1과 같이 말단에 1차 아민기를 가지고 있다. 상기 폴리에틸렌 글리콜은 한쪽 말단이 메톡시기로 치환된 메톡시 폴리에틸렌글리콜로서 분자량은 5,000인 것을 사용하였다.
또한, 폴리에틸렌글리콜은 HO-(CH2CH2O)n-H로 표현되는 구조식을 가지며, 반복 연결되는 에틸렌 옥사이드((CH2CH2O)-)를 가지는 구조적 특성으로 인해 강한 친수성을 나타내며, 또한 이러한 특성이 단백질 또는 화합물과 결합하는 경우에 생체친화성을 부여하게 되는 특징을 가진다.
본 발명의 일실시예에서 상기 폴리아미노산은 아스파틱산 또는 글루타믹산의 곁사슬의 카르복시기가 벤질 알콜기와 에스터 결합으로 결합되어 있는 형태의 벤질 아스파틱산 또는 벤질 글루타믹산을 개환중합(고리모양 화합물의 고리가 열려 선 모양의 중합체가 되는 중합반응이다. 분자내 결합이 분자간 결합으로 변하여 중합체가 된다.)하여 사용하였다(상기 화학식 2 참조). 본 발명에서 상기 폴리아미노산의 아미노산의 중합도는 10내지 200이다.
본 발명에서 사용되는 폴리아미노산은 폴리에틸렌글리콜의 분자량 및 중합 비율에 의해 유연하게 중합정도의 조절이 가능하며, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리아미노산의 중합비율은 40인 것으로 선택하였다.
본 발명에서 효소 민감성 양친매성 고분자는 효소에 의해 본 발명의 일실시예에 따른 폴리 벤질 아스파틱산의 벤질기와 아스파틱산의 결합이 분해되어 친수성의 아스파틱산 고유의 특성이 회복된다. 그로 인해 나노 입자의 붕괴와 나노 입자 내부에 봉입된 소수성 약물의 방출이 유도되고 광응답제의 광응답 효율의 증가하게 되고, 광원이 조사되었을 때 단일항산소(singlet oxyge, 1O2)등의 활성산소종의 반응에 의해 세포소기관에서 세포질로의 내재화를 유도할 수가 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(nitrosourea) 중 1종 이상인 것을 특징으로 하나 이에 제한되지는 않으며 바람직하게는 파클리탁셀 또는 독소루비신을 사용할 수 있다.
또한 본 발명에서 사용하는 광응답제는 특정 파장의 조사에 따라 체내에서 단일항산소 또는 자유라디컬을 생성할 수 있는 것으로, 상기 폴리아미노산과 아마이드결합 또는 에스터결합을 형성할 수 있는 카르복실기(COOH)를 가지고 있는 화합물이면 특별히 종류를 한정하지 않는다.
예를 들어, 상기 광응답제로 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 클로린계 화합물이 좋다.
이에 클로린계 화합물이 종양조직에 대한 선택성을 가지며 빛이 없는 상태에서 독성이 낮고 체내에서 빠르게 배출되며 저렴한 가격의 원료 물질로부터 대량으로 제조가 가능하다는 점에서, 본 발명에서 사용할 수 있는 광응답제로 적합하다.
이러한 클로린계 화합물의 종류로는 포토디타진, 라다클로린(radachlorin), 2-(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide-α(HPPH), 또는 클로린 e6 등이 있으며, 본 발명의 구체적 실시예에서는 클로린 e6를 사용하였다.
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 소광제로는 블랙홀 소광제(blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광제(blackberry quencher, BBQ)를 사용할 수 있으며 바람직하게는 블랙홀 소광제(blackhole quencher, BHQ)를 사용할 수 있다.
상기의 소광제는 광응답제의 특이적 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 제공하는 광화학적 내재화를 위한 소수성 약물 봉입 나노 입자는 암세포 내의 엔도좀(endosome) 및 리소좀(lisosome)내에서 특이적으로 분해되는 양친매성 고분자에 광응답제와 소광제를 결합시키고, 상기 광응답제 또는 소광제가 결합된 효소 민감성 양친매성 고분자들을 자가 응집법을 이용하여 나노입자를 형성하여 약물의 세포질 내재화 효율을 증가시켰다.
보다 자세하게는 (a)폴리 아미노산 기반의 효소 민감성 양친매성 고분자를 중합하는 단계; (b)상기 중합된 효소 민감성 양친매성 고분자에 광응답제를 첨가하여 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체를 합성하는 단계; (c)상기 중합된 효소 민감성 양친매성 고분자에 소광제를 첨가하여 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체를 합성하는 단계; 및 (d)상기 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체와 상기 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체 및 소수성 약물을 용매에 혼합하여 나노 입자를 제조하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계에서, 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체는 폴리아미노산의 말단 아민기와 광응답제의 카르복실기가 아마이드 결합을 통해 결합되어 합성되어 있다.
또한, 상기 (b) 단계에서, 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체는 폴리아미노산의 곁사슬의 카르복실기와 알콜기를 포함하고 있는 광응답제가 에스터 결합을 통해 결합되어 합성되어 있다.
본 발명의 상기 (d) 단계의 상기 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체와 상기 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체 및 소수성 약물을 용매에 혼합하여 나노 입자를 제조하는 단계는 유기용매 하에서 충분히 용해될 수 있도록 적당량의 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 유기용매의 사용량이 너무 적을 경우, 고분자가 서로 엉겨 붙는 현상이 일어날 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide:DMSO), 포름아마이드(Formamide) 및 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide:DMF)이며, 바람직하게는 DMSO가 좋다.
또한, 본 발명의 상기 (d) 단계에서 나노 입자를 제조하는 단계는 자가 응집법(self-assembly method), 초음파(ultrasonic) 및 균질기(homogenizer)를 사용하는 방법이 있으며, 바람직하게는 자가 응집법(self-assembly method)을 사용할 수 있다.
상기 (d) 단계에서 제조된 나노 입자의 크기는 50내지 500nm이며, 바람직하게는 50내지 100nm일 수 있다.
본 발명에서 상기 (d) 단계의 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체와 효소 민감성 폴리아미노산-소광제 접합체의 총 무게에 대하여 소수성 약물의 무게는 0 내지 10%인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계의 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체와 효소 민감성 폴리아미노산-소광제 접합체의 반응 비는 효소 민감성 폴리아미노산-광응답제 접합체 1몰에 대하여 효소 민감성 폴리아미노산-소광제 접합체는 0.25내지 1.5의 몰비이며 바람직하게는 1:1의 몰비로 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 소수성 약물 봉입 나노입자에서 상기 광응답제와 소광제의 거리는 20nm이내일 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 특징을 가진 소수성 약물 봉입 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 환자의 세포의 세포질액 내로 약물 분자를 도입하는 광화학적 내재화(photochemical internalization)용 제제를 위한 조성물을 제공한다.
상기 환자의 세포의 세포질액 내료 약물 분자를 도입하는 방법은 (a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 소수성 약물 봉입 나노 입자를 세포에 처리하는 단계; (b)상기 나노입자가 세포내로 유입되는 단계; 및 (c)상기 세포에 광원을 조사하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 광원을 조사하는 단계는 500내지 800nm 파장의 광자를 200J/cm2 이하로 조사하는 것을 특징으로 하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 상기와 같은 특징을 가진 소수성 약물 봉입 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 항암의 진단 및 치료를 위한 광역학 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 소수성 약물 봉입 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 약제학적 조성물의 유효성분인 소수성 약물 봉입 나노입자의 일일 투여량은 약 5 내지 1,000㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 10 내지 500㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암 질환 치료 또는 진단에 효과적이다. 본 발명의 조성물을 사용하여 치료 또는 진단할 수 있는 암은 뇌종양, 양성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두 개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종 및 피부암 등일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 암 관련 치료 또는 진단용 의약의 제조를 위한 소수성 약물 봉입 나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 소수성 약물 봉입 나노입자를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 암 관련질환의 치료 또는 진단용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 표유동물에서 소수성 약물 봉입 나노 입자를 투여하는 것을 포함하는 암 관련 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 폴리아미노산-광응답제 접합체 및 pH 감응성 폴리아미노산-광응답제 접합체의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏당 약 5 내지 1,000㎎/㎏, 가장 바람직하게는 10 내지 500㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 소수성 약물 봉입 나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1>
효소 민감성 및
양친매성
특징을 갖는 고분자의 합성
벤질아스파틱산 (L-aspartate-benzyl ester : BLA) 3g과 트리포스젠(triphosgene) 3g을 테트라하이드로퓨란 (tetrahydrofuran : THF) 50mL에 녹였다. 이후, 60℃에서 4시간 반응시켰고, 상기 반응시킨 용액을 여과하여 미반응물과 불순물을 제거하였다. 상기 여과한 용액을 헥산 (hexane) 900mL에 침전시킨 뒤, 침전물은 진공건조장치를 이용하여 건조시켜 환형의 벤질아스파틱산(BLA-NCA)을 수득하였다. 상기 합성된 환형의 벤질아스파틱산 2.87g을 디메틸포름아마이드 (N,N-dimethylformamide : DMF) 20mL에 녹여 환형의 벤질아스파틱산 용액을 만들었다. 이후 메톡시 폴리에틸렌글리콜아민(mPEG-amine) 1.15g을 메틸클로라이드 (methyl chloride) 50mL에 녹여 폴리에틸렌글리콜 용액을 만들었고, 제조된 폴리에틸렌글리콜 용액에 상기 환형의 벤질아스파틱산 용액을 천천히 넣어준 후, 상온에서 48시간동안 반응시켰다. 이 반응물을 2번에 거쳐 여과한 후, 회전식감압증발기를 이용하여 60℃에서 30분간 메틸클로라이드를 제거한 뒤, 디메틸포름아마이드를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 효소 민감성 및 양친매성 고분자 (mPEG-pBLA)를 수득하였다. 또한 상기 효소 민감성 ? 양친매성 고분자 (mPEG-pBLA)를 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)분석을 통해 화학적 결합 여부를 재확인하였다(도 2 참조).
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실시예
2>
효소 민감성 및
양친매성
고분자와
광응답제의
접합체(
mPEG
-
pBLA
-
Ce6
, p-
Ce6
) 합성
상기 실시예 1을 통해 합성된 효소 민감성 양친매성 고분자 (mPEG-pBLA) 0.2g 과 클로린e6 (chlorin e6, Ce6) 0.01g 및 N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(DCC ; 1.2 Ce6 in moles)를 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide : DMSO) 5ml에 녹이고, N-하이드록시석시닐이미드(HOSu ; 1.2 Ce6 in moles)를 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide : DMSO) 5mL에 녹인 후 이들은 각각 3시간 동안 교반하였다. 상기 두 용액을 섞은 후에 상온에서 24시간 반응시켰고, 두 용액이 반응하여 생긴 비수용성의 디사이클로헥실우레아를 제거하기 위해 필터링을 한 후 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 효소 민감성 양친매성 고분자와 광응답제가 접합된 접합체(mPEG-pBLA-Ce6)를 수득하였다. 또한 상기 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체(mPEG-pBLA-Ce6)를 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)분석을 통해 화학적 결합 여부를 재확인하였다(도 3 참조)
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실시예
3>
효소 민감성 및 양친매성 고분자와 소광제의 접합체 ( mPEG - pBLA - BHQ3 , P- BHQ3 ) 합성
상기 실시예 1을 통해 합성된 효소 민감성 양친매성 고분자 (mPEG-pBLA) 0.2g, 블랙홀 소광체 (blackhole quencher, BHQ3) 11mg과 N-N'-다이사이클로헥실카르보디이미드(DCC ; 1.2 BHQ3 in moles)를 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide : DMSO) 5ml에 녹이고, N-하이드록시석시닐이미드(HOSu ; 1.2 BHQ3 in moles)를 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide : DMSO) 5mL에 각각 녹인 후 3시간 동안 교반하였다. 상기 두 용액을 섞은 후에 상온에서 24시간 반응시켰고, 두 용액이 반응하여 생긴 비수용성의 디사이클로헥실우레아를 제거하기 위해 필터링을 한 후 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체(mPEG-pBLA-BHQ3, P-BHQ3)를 수득하였다. 또한 상기 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체(mPEG-pBLA-BHQ3, P-BHQ3)를 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)분석을 통해 화학적 결합 여부를 재확인하였다(도 4 참조).
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실시예
4>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 제조
상기 실시예 2와 실시예 3을 통해 제조한 P-Ce6과 P-BHQ3 및 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX) 0.1mg을 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide : DMSO) 6mL에 녹였다. 이때, 상기 P-Ce6과 P-BHQ3의 혼합은 소광제/광응답제의 몰 비율을 달리하여 혼합시켰는데, 소광제/광응답제의 몰비율이 0, 0.25, 0.5 및 1이 각각 되도록 혼합하였다(몰비율이 1인 경우, P-Ce6 5.0mg과 P-BHQ3 5.0mg을 혼합하여 사용함).
이후 이 용액을 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 1,000)을 이용하여 12시간 동안 1차 증류수 5L를 이용하여 투석하였고, 최종 회수된 용액은 0.45㎛ 규격의 필터로 침전물을 제거 한 후 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자(PTX@EPN)를 수득하였다.
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실험예
1>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 물리 화학적 특성 분석
상기 실시예 4에서 제조된 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자(PTX@EPN)의 물리/화학적 특성을 분석하기 위해 실시예 4의 방법으로 P-Ce6과 P-BHQ3의 비를 달리(1:0, 1:0.25, 1:0.5, 1:1의 몰비)하여 소광제에 의한 광응답제의 소광 효율을 확인한 결과, 소광제의 비가 증가할수록 소광효율도 증가함을 확인하였다(도 5a 참조). 이에 본 발명자들은 하기 실험을 P-Ce6과 P-BHQ3의 비율을 1:1로 고정하여 제조된 것을 사용하였으며, 상기 비율에서의 입자 분포(n=3)와 입자 형태를 관찰하였다(도 5b 참조). 나노입자의 입자크기와 제타포텐셜을 측정하기 위하여 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK)를 이용하여 분석한 결과, 입자크기는 약 125 nm 정도로 일정하였으며, 제타포텐셜은 음이온성 고분자 소광제의 질량비가 증가할수록 약 -12mV 정도의 음전하를 띄는 것을 확인하였다. 입자 형태는 전계방출형 주사전자현미경 (FE-SEM; S-4700; Hitachi, Japan, scale bar=500㎛)을 이용한 결과 구형의 균일한 형태의 나노입자를 확인 할 수 있었다.
<
실험예
2>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 효소 특이적 특성 분석
상기 실시예 4에서 제조된 나노입자(PTX@EPN)의 효소 특이적 특성을 분석하기 위하여 상기 제조된 나노입자를 대상으로 효소인 에스터라아제의 농도(0, 10 or 20 Unit/mL)를 달리하여 12 시간 처리한 후, 형광 플레이트 리더 (Tecan Genios, Durham, NC, USA)를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 그리고 상기의 용액을 12-bit CCD 카메라 (Image Station 4000 MM; Kodak, New Haven, CT, USA)를 이용하여 형광 사진을 촬영하였다. 이를 토대로 효소(에스터라아제)를 처리한 나노입자에서 처리하지 않은 나노입자보다 훨씬 높은 광응답제의 형광이 검출되는 것을 확인하였다(도 5c 참조). 또한, 에스터라아제 처리에 의한 나노입자의 일항산소 생성능을 시약 (Singlet oxygen sensor green, SOSG, Molecular Probe Inc. Eugene, OR, USA)을 이용하여 광원을 조사한 후 일항산소를 측정하였다.
그 결과, 도 5d와 같이 에스터라아제를 처리한 경우, 그렇지 않은 나노입자와 비교하여 더 많은 일항산소가 발생된 것을 확인하였다. 도 5e는 나노입자에 에스터라아제 처리에 의한 내부에 봉입된 파클릭탁셀의 방출 특성을 확인한 것이다. 나노입자용액 (포스페이트-시트레이트 버퍼, pH 5.5)에 에스터라아제를 처리한 후 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 1,000)에 넣고 0.1% Tween 80의 포스페이트-시트레이트 버퍼(pH 5.5)상에서 파클릭탁셀을 방출 특성을 확인하였다. 따라서 에스터라아제에 의해 나노입자로부터 약물의 방출이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.
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실험예
3>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 약물의 세포질 내재화 유도 특성 분석
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 약물의 세포질 내재화 유도 특성 분석을 분석하기 위해서 나일레드(소수성 세포비투과성 형광물질, nile red, NR)를 파클릭탁셀을 대신하여 사용(NR@EPN)하였다. HeLa 세포와 HCT-8 세포를 35 mm 멸균 세포 배양 접시에 5 x 104cells의 세포를 분주한 후 12시간 동안 37 oC 배양기에서 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후, 0.05 μg/mL 의 Ce6 (HeLa) 와 0.40 μg/mL 의 Ce6 (HCT-8) 농도의 효소 민감성 나일레드 봉입 나노입자 (NR@EPN)를 4 시간 동안 처리하였다. 배양액을 제거한 뒤, DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척을 하고 0.6 J/cm2의 광원을 조사하였다. 배양기에서 1시간 배양한 뒤, 4 % 파라포름알데하이드용액과 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 세포를 고정시키고 핵을 염색하였다. 세포의 리소좀은 Lysotracker Green DND-26 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포는 공촛점 현미경 (LSM 710 Meta; Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
도 6은 (a)HeLa 세포와 (b)HCT-8 세포에서의 광원(laser) 조사에 따른 나일레드(NR)를 봉입한 효소민감성 나노입자(NR@EPN)의로부터 방출된 나일레드의 세포질 내재화율 변화에 따른 공초점 현미경 사진 및 그에 대한 히스토그램 그래프(scale bar=10㎛)의 결과를 나타내는 것으로, 광원의 조사 유무에 따라 나이레드의 적색형광이 리소좀의 녹색형광과 넓은 범위에 걸쳐 퍼져 있는 것을 확인함으로서 리소좀의 세포질 내재화가 증가됨을 확인하였다.
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실험예
4>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 용혈 및 지질 산화 유도 특성 분석
나노입자의 용혈 및 지질 산화 유도 특성을 분석하기 위해서 도 7a와 같이 적혈구의 용혈율(n=3, ＊p＜0.005)을 확인하였다. 나노입자 (Ce6 0.05 μg/mL)를 포스페이트-시트레이트 (pH 5.5)에서 에스터라아제 (0 또는 10 Unit/mL)와 함께 37 oC에서 4시간 동안 배양한 후, 적혈구와 섞어주고 광원 (0 또는 0.6 J/cm2)을 조사하여 용혈로 인해 적혈구 외부로 배출된 헤모글로빈을 측정하였다. 음성대조군은 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, pH7.2-7)만을 처리한 것을 사용하였으며, 양성대조군은 1 % Triton X-100 용액을 사용하였다. 그 결과, 광응답제의 활성화로 인해 적혈구의 용혈현상이 촉진됨을 확인하였다.
도 7b는 나노입자에 포함되어 있는 광응답제로부터 유도되는 지질 산화능에 대한 분석 결과로서, 지질 산화능(n=3, ＊p＜0.005) 평가는 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS, Item No. 10009055, Cayman Chemical Co., MI, USA) assay를 통해서 확인하였다. 자세하게는, HCT-8 세포를 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)에 2 x 107 cells/mL의 농도로 모은 후, 초음파 (Ultrasonic Processor, VCX-500/750, CT, USA)를 이용하여 1 분간 세포를 깨준 뒤, 티오바르비툴산(thiobarbituric acid; TBA) 반응액과 나노입자를 처리하고 광원 (0 또는 0.6 J/cm2)을 조사한다. 이 용액을 1 시간동안 100 oC의 끓는 물에서 배양하였다. 이 후 10 분간 얼음에 넣어주고 30 분간 상온에서 보존한 뒤, 532 nm 파장에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(microplate reader, Bio-Tek, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 광원이 조사되었을 때, 광응답제의 활성으로부터 지질의 산화가 유도되어, 지질의 산화로부터 생성되는 부산물 중 하나인, 말론디알데히드(Malondialdehyde ;MDA)의 양이 약 3 배 정도 많은 양이 생성된 것을 확인하였다.
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실험예
5>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 세포 독성 분석 (1)
상기 실시예 4에서 제조된 나노입자의 항암효과를 확인하기 위해서 Hela 세포 (1 x 104 cells/well)와 HCT-8 세포 (1 x 104 cells/well)의 100 ㎕의 배양액을 96-well 세포 배양 접시에 각각 분주한 뒤 12 시간동안 37 oC 배양기에서 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 실험군 1) 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)과 실험군 2) 약물이 봉입되지 않은 나노입자 (empty@EPN), 실험군 3) 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)이 봉입된 나노입자 (PTX@EPN)를 처리하고 4 시간 동안 배양하였다. 처리된 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)의 농도는 0.12 μg/mL (HeLa 세포)와 1.00 μg/mL (HCT-8 세포)이 처리되었으며, Ce6의 농도는 0.05 μg/mL (HeLa 세포)와 0.40 μg/mL (HCT-8 세포)이 처리되었다. 배양액을 제거한 뒤, 광원 (0 또는 0.6 J/cm2)을 조사하고 24 시간 배양하였다. 최종적으로 세포 생존율(n=3, ＊p＜0.001)은 MTT(3-<4,5-dimethylthiazol-2-yl>-2,5-diphenyl tetrazolium) 분석법에 의해 분석하였다. 그 결과, 도 8과 같이 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)과 empty@EPN은 세포 독성을 거의 보이지 않았지만, PTX@EPN은 어느 정도의 독성을 보였으며, 특히, 광원이 조사된 실험군의 경우는 월등한 세포 독성을 확인하였다.
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실험예
6>
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 세포 독성 분석 (2)
상기 실시예 4에서 제조된 나노입자의 항암효과를 확인하기 위해서 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Molecular Probes Invitrogen, USA)를 사용하였다. 자세하게는 HeLa 세포와 HCT-8 세포를 35 mm 멸균 세포 배양 접시에 5 x 105와 1 x 106의 세포를 분주한 후 12 시간 동안 37 oC 배양기에서 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)과 empty@EPN, PTX@EPN (PTX 0.12 μg/mL과 Ce6 0.05 μg/mL)를 처리하고 4 시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척한 뒤, 새로운 배양액으로 4 시간 동안 37oC 배양기에서 5% CO2 조건에서 배양하였다. LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit로 염색하여 형광 현미경 (Zeiss, Germany)으로 촬영하였다. 그 결과, 도 9와 같이 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)과 empty@EPN은 세포 독성을 거의 보이지 않았지만, PTX@EPN은 어느 정도의 독성을 보였으며 특히, 광원이 조사된 실험군의 경우는 월등한 세포 독성을 확인하였다.
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실험예
7>
동물 모델에서의 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 항종양 효과 분석
효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자의 항종양 효과를 분석하기 위해 CT-26 세포를 6주령 BALB/c 마우스에 피하주사를 통하여 동물모델을 준비하였다. 접종된 세포의 수는 1 x 105으로 100 ㎕의 세럼이 포함되지 않은 배양액상에서 접종하였다. 종양의 크기는 장축 x 단축 x 단축 x 0.5 (단위=mm3)로 계산되었다.
상기의 동물모델을 대상으로 나노입자의 항종양 효과를 확인하기 위해서 무작위로 마우스를 4 개의 실험군(실험군 1 PBS, 실험군 2 PTX, 실험군 3 광원을 조사하지 않은 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자, 실험군 4 광원을 조사한 효소 민감성 소수성 약물 봉입 나노입자)으로 나누고 실험을 진행하였다. 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, pH7.2-7)와 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX), PTX@EPN은 각각 0 과 5 일에 정맥주사를 통해 투여되었으며, 그 농도는 1.5 mg/kg의 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX)과 0.5 mg/kg Ce6이다. 광원의 조사는 투여 24 시간 뒤에 조사하였으며, 조사된 광원의 양은 100 J/cm2이다. 광학 사진은 디지털카메라로 촬영하였다.
그 결과, 도 10a와 도 10b에 제시된 바와 같이 항종향 효과는 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, pH7.2-7)와 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX), 광원을 조사하지 않은 PTX@EPN 실험군과 비교하여 PTX@EPN을 투여하고 광원이 조사된 실험군에서 뚜렷한 효과를 보이는 것을 확인하였다.
또한, 조직학적 분석을 위해 헤마토신-에오신(H&E) 염색을 하였다. 마우스로부터 추출한 종양조직을 24 시간동안 4 % 파라포름알데히드로 고정한 후에 탈파라핀 과정을 거쳤다. 그 후, 조직을 5 ㎛의 두께로 분할한 뒤에 헤마토신과 에오신으로 염색하였다.
면역조직화학적 분석은 TUNEL 분석법(TdT-mediated dUTP nick end labeling)으로 수행하였다. 상기 면역조직화학적 분선은 마우스로부터 추출한 종양조직을 24 시간동안 4 % 파라포름알데히드로 고정한 후에 조직을 5 μm의 두께로 동결 절편하여 분할하였다. 이 조직을 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, pH7.2-7)로 두 번 세척하고, 0.2 % Triton X-100 용액으로 10 분간 상온에 두었다. 그 후, 조직을 TUNEL assay kit (Promega Corp., WI, USA)로 염색하였다. 형광 사진은 공촛점 현미경 (LSM 710 Meta; Zeiss, Germany)으로 촬영하였다.
그 결과, 도 10c에 제시된 바와 같이 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, pH7.2-7)와 파클리탁셀 (paclitaxel, PTX), 광원을 조사하지 않은 PTX@EPN 실험군과 비교하여 PTX@EPN을 투여하고 광원이 조사된 실험군에서 높은 세포자멸수준과 항종양 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 효소 민감성 광응답제 유도체 및 소광체 유도체를 포함하는 광역학 치료용 소수성 약물 봉입 나노 입자는 세포내 효소에 의해 활성이 증가하고 입자내에 봉입된 약물의 방출이 유도됨으로써 약물의 세포질액 내로의 유입을 향상시키고 약물의 세포질 내재화율을 높여 약효를 극대화 할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (18)
- 소수성 블록을 구성하는 폴리아미노산 및 친수성 블록을 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 공중합체에 있어서, 상기 폴리아미노산은 효소 작용에 의해 소수성기가 제거되어 친수성으로 전환되는 것을 특징으로 하는, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리아미노산은 아스파틱산 또는 글루타믹산의 곁사슬의 카르복시기가 벤질 알콜기와 에스터 결합으로 결합되어 있는 형태의 벤질 아스파틱산 또는 벤질 글루타믹산 중에서 1종 또는 2종을 개환 중합한 것을 특징으로 하는 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체. - 제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300내지 50,000인 것을 특징으로 하는 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체. - 제2항에 있어서,
상기 중합은 폴리아미노산을 10 내지 200의 중합비율로 중합시킨 것을 특징으로 하는 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체. - 제1항의 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 광응답제가 접합된, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-광응답제 접합체.
- 제1항의 폴리아미노산 및 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 블랙홀 소광제(blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광제(blackberry quencher, BBQ)중에서 선택된 1종 이상의 소광제가 접합된, 효소 민감성 및 양친매성 특징을 갖는 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-소광제 접합체.
- 제5항의 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-광응답제 접합체 및/또는 제6항의 폴리에틸렌글리콜-폴리아미노산-소광제 접합체 및 소수성 약물을 포함하는, 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자.
- 제7항에 있어서,
상기 소수성 약물은 파클리탁셀 또는 독소루비신인 것으로 특징으로 하는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자. - 제7항에 있어서,
상기 나노 입자는 10 내지 200nm 의 입자 크기를 가지며, 제타포션셀은 음전하를 갖는 것을 특징으로 하는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자. - 제7항에 있어서,
상기 폴리아미노산은 에스테라제 효소 처리에 의해 특이적으로 분해되며 이로 인해 나노 입자의 붕괴와 내부 봉입 약물의 방출이 유도되고, 효소 처리에 의해 분해되는 폴리아미노산 기반의 고분자 1몰과 결합할 수 있는 광응답제 또는 소광제는 0.5~1몰인 것을 특징으로 하는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자. - (a) 폴리아미노산 기반의 효소 민감성 양친매성 고분자를 중합하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 중합된 효소 민감성 양친매성 고분자에 광응답제를 첨가하여 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체를 합성하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계에서 중합된 효소 민감성 양친매성 고분자에 소광제를 첨가하여 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체를 합성하는 단계; 및
(d) 효소 민감성 양친매성 고분자-광응답제 접합체와 효소 민감성 양친매성 고분자-소광제 접합체 및 소수성 약물을 용매에 혼합하여 나노 입자를 제조하는 단계를 포함하는,
소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 용매는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide:DMSO) 및 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide;DMF)인 것을 특징으로 하는 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 소수성 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(nitrosourea) 중에서 선택된 1종 이상을 투석을 통해 봉입시키는 것을 특징으로 하는 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 소수성 약물은 상기 나노입자의 총 중량을 기준으로 0.001~10중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 나노 입자를 제조하는 단계는 자가 응집법(self-awwembly method), 초음파(ultrasonic) 및 균질기(homogenizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로 수행하는 것을 특징으로 하는 소수성 약물의 가용화 활성 및 광화학적 내재화 활성을 갖는 효소 민감성 소수성 약물이 봉입된 광역학 치료용 나노 입자의 제조방법. - 제11항의 방법으로 제조된 광역학 치료용 나노 입자를 세포에 처리한 후, 500~800nm의 파장의 광자를 200J/cm2 이하로 조사하는 단계를 포함하는, 광역학 치료용 나노 입자의 세포 내재화 방법.
- 제11항의 방법으로 제조된 광역학 치료용 나노 입자를 유효성분으로 포함하는 암 치료를 위한 광역학 치료용 약학적 조성물.
- 제17항에 있어서,
상기 암은 편평상피세포함, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담남앙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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