KR20160139817A

KR20160139817A - 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법, 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20160139817A
Application number: KR1020150075373A
Authority: KR
Inventors: 김진하; 조광명; 정순천; 정유경
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2016-12-07
Also published as: KR102581464B1; US10059926B2; US20160348079A1

Abstract

락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법, 락테이트 데히드로게나제 변이체 및 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법, 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법{Method for screeninig a lactate dehydrogenase mutant, lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide, vector, microorganism including the mutant, and method for preparing a lactate using the microorganism}

락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법, 락테이트 데히드로게나제 변이체 및 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.

또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.

현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.

따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도 락테이트 데히드로게나제 변이체, 및 이를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 야생형 락테이트 데히드로게나제의 활성보다 증가된 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

일 양상은 락테이트 데히드로게나제 변이체를 제공한다.

일 양상은 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 양상은 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다.

일 양상은 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 미생물을 제공한다.

일 양상은 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다. 여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 상기 서열 동일성은 예를 들면, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형 (예, 유전자의 카피수의 증가), 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)을 포함한다.

"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.

용어 "유전자(gene)"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의한 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.

"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.

용어 “모균주(parent strain)” 또는 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.

상기 모균주 또는 모세포는 해당 유전적 변형(subject genetic modification)을 위해 사용된 것일 수 있다. 상기 모세포는 상기 유전적 변형을 제외하고는 해당 세포(subject cell)와 동일하기 때문에, 상기 유전적 변형에 대한 기준 세포(reference cell)일 수 있다. 상기 “유전적 변형(genetic modification)”은 세포의 유전물질의 구성 또는 구조가 인위적으로 변경된 것을 의미한다. 상기 모세포는 해당 유전적 변형, 예를 들면 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다.

용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 유전적 변형은 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 것일 수 있다.

용어 "파괴 (disruption)"는 언급된 유전자 (referenced gene)의 발현이 감소되도록 하는 유전적 변형을 나타낸다. 상기 파괴는 언급된 유전자의 발현이 없도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "불활성화 (inactivation)"이라고 한다.) 또는 유전자의 발현은 있으나 감소된 수준으로 발현되도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "감쇄 (attenuation)"이라고 한다.)을 포함한다. 상기 불활성화는 유전자의 기능적 산물 (functional product)이 발현되지 않는 것뿐만 아니라 발현은 되지만 기능적 산물이 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 감쇄는 유전자의 기능적 산물의 발현양 감소를 포함한다. 즉, 상기 감쇄는 유전자의 순 발현량은 증가하였더라도 기능적 산물의 발현량이 감소되는 것을 포함한다. 여기서 유전자의 기능적 산물이란 모세포 또는 야생형 세포에서 상기 유전자의 산물 (예, 효소)이 갖는 생화학적 또는 생리적 기능 (예, 효소 활성)을 보유하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 파괴는 유전자의 기능적 파괴 (functional disruption)를 포함한다. 상기 유전적 변형은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형, 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)을 포함한다.

상기 유전자의 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전적 변형은 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커를 사용하여 선별함으로써 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)의 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명에서 사용된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

본 명세서에 사용된 용어 "외인성 (exogenous)"은 언급된 분자 (referenced molecule) 또는 언급된 활성 (referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미한다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산 (encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원 (source)는 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성 (homologous) 또는 이질성 (heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성 (endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성 (heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성 (heterologous) 또는 동질성 (homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.

본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.

일 양상은 락테이트 데히드로게나제의 변이체를 제조하는 단계; 상기 락테이트 변이체를 유전적으로 조작된 미생물에 도입하는 단계; 야생형 락테이트 데히드로게나제에 비하여 활성이 증가된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 선별하는 단계를 포함하는, 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법은 락테이트 데히드로게나제의 변이체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 변이체는 야생형 락테이트 데히드로게나제에 돌연변이를 유발하여 제조할 수 있다. 상기 변이체는 야생형 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 유발하여 제조할 수 있다. 상기 돌연변이 유발 방법은 무작위 돌연변이 유발, 지향된 돌연변이 유발(directed mutagenesis), DNA 셔플링 (DNA shuffling), 및 점 돌연변이(point mutagenesis)로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 유발 방법에 의해 생성되는 것일 수 있다. 상기 지향된 돌연변이 유발은 위치-선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 포함할 수 있다.

상기 무작위 돌연변이 유발은 에러-유발 PCR(Error-prone PCR)일 수 있다. 상기 무작위 돌연변이 유발은 당업계에 알려진 PCR 돌연변이 유발 키트 (PCR mutagenesis kit)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 에러-유발 PCR를 통해 돌연변이를 유발하는 경우, 주형의 양, dNTP의 비율, 및 DNA 폴리머라제의 종류로부터 선택된 하나 이상의 조건을 조절하여 다양한 변이체를 선택적으로 제조할 수 있다.

상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법은 상기 변이체를 유전적으로 조작된 미생물에 도입하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 미생물은 그 모균주에 비하여 퓨마레이트를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드, L-락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 및 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드로부터 선택된 하나 이상의 활성이 감소된 미생물일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 미생물은 퓨마레이트를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, L-락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 파괴는 상술한 용어 “파괴”에 관하여 기재한 바와 동일하다.

상기 도입하는 단계는 형질전환일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 통상의 형질전환방법은, 예를 들면 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 미세주사법, DNA-함유 리포좀 방법, 리포펙타민-DNA 복합체 방법, 또는 전기천공법일 수 있다. 상기 세포주, 즉 숙주세포는 동물세포, 대장균 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포 또는 암세포일 수 있다. 상기 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 대장균 세포는 DH5α컴피턴트 셀일 수 있다.

상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법은 야생형 락테이트 데히드로게나제에 비하여 활성이 증가된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 선별하는 단계는 상기 변이체가 도입된 상기 유전적으로 조작된 미생물을 배양하여, 야생형 락테이트 데히드로게나제 변이체가 도입된 미생물에 비하여 상기 변이체가 도입된 유전적으로 조작된 미생물의 성장이 높은 것을 활성이 증가된 락테이트 데히드로게나제로 결정하는 단계일 수 있다. 상기 성장은 성장률, 또는 성장속도일 수 있다. 상기 결정하는 단계는 야생형 락테이트 데히드로게나제 및 변이체가 도입된 락테이트 데히드로게나제가 도입된 미생물을 동일한 조건에서 배양하여 소정의 시간 내에 세포 성장이 높은 미생물을 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체로 결정하는 것일 수 있다. 상기 개량은 활성이 증가된 것을 의미할 수 있다.

상기 활성은 비활성일 수 있다. 상기 활성이 증가된 락테이트 데히드로게나제 변이체는 락테이트 데히드로게나제의 기질인 NADH를 소모하는 속도가 야생형 락테이트 데히드로게나제의 NADH 소모 속도에 비하여 증가된 것일 수 있다.

일 양상은 락테이트 데히드로게나제 변이체를 제공한다.

상기 변이체는 서열변호 1의 15번째 아미노산 또는 329번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 락테이트 데히드로게나제는 에스케리키아 콜라이(E. coli)로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 다른 아미노산은 극성이고 비전하 아미노산일 수 있다. 상기 다른 아미노산은 세린, 글루타민, 아스파라진, 트레오닌, 또는 시스테인일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1에서 15번째 아미노산인 프롤린(P)이 세린(S)으로 치환된 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1에서 329번째 아미노산인 프롤린(P)이 글루타민(Q)으로 치환된 것일 수 있다. 상기 서열번호 1에서 15번째 아미노산인 프롤린(P)이 세린(S)으로 치환된 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 1에서 329번째 아미노산인 프롤린(P)이 글루타민(Q)으로 치환된 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제(LDH)는 피루베이트로부터 락테이트로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 LDH는 D-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소이거나 L-락테이트를 생산하는 것인 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다.

D-락테이트 데히드로게나제(D-LDH)는 상기 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 D-LDH는 D-특이 2-히드록시산 데히드로게나제(D-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase)로 지칭될 수 있다. 상기 D-LDH는 피루베이트와 NADH를 (R)-락테이트와 NAD+로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다.

L-락테이트 데히드로게나제(L-LDH)는 상기 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 L-LDH는 L-특이 2-히드록시산 데히드로게나제(L-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase)로 지칭될 수 있다. 상기 L-LDH는 피루베이트와 NADH를 (S)-락테이트와 NAD+로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 야생형 또는 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 비활성 (specific activity)보다 개선된 비활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제의 비활성은 아생형 또는 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 비활성보다 약 10% 내지 100% 이상, 약 15% 내지 50% 이상, 약 20% 내지 40% 이상, 또는 약 25% 내지 30% 이상 증가된 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트(expression cassette)를 제공한다. 상기 벡터 또는 발현 카세트에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 카세트는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열일 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있다. 상기 조절 서열은 복제 개시점, 프로모터, 터미네이터, 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 또한 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합될 수 있다. 상기 프로모터는 Covalently linked Cell Wall protein 12 (CCW12), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD), Pyruvate DeCarboxylase 1(PDC1), phosphoglycerate kinase (PGK), Transcription enhancer factor 1(TEF1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH), triose phosphate isomerase (TPI), purine-cytosine permease (PCPL3), 및 alcohol dehydrogenase (ADH) 유전자 유래의 프로모터로부터 선택된 하나 이상의 프로모터일 수 있다. 상기 CCW12 프로모터, CYC 프로모터, TEF1 프로모터, PGK1 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 11, 12, 13, 14, 15, 및 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선택 마커(selection marker)를 더 포함할 수 있다. 상기 선택 마커는 ura3(orotidine-5'-phosphate decarboxylase)일 수 있다.

다른 양상은 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공한다.

상기 미생물은 미세적 크기를 갖는 원핵생물, 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함할 수 있다. 상기 미생물은 고세균; 진정세균; 또는 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포함할 수 있다. 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 대장균(E. coli)일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제 변이체에 관해서는 상술한 바와 같다.

상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 미생물은 상기 변이체를 코딩하는 외인성 유전자를 포함한 발현 카세트 또는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 미생물은 벡터, 예를 들면 발현 벡터를 통하여 모세포에 도입된 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 선형 폴리뉴클레오티드 형태, 예를 들면 발현 카세트로 모세포 내에 도입된 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터, 예를 들면 플라스미드로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전 물질, 예를 들면 염색체에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다.

상기 미생물은 상술한 락테이트 데히드로게나제 변이체를 발현할 수 있다. 상기 미생물은 그 모균주에 비하여 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.

상기 미생물은 비-천연 미생물을 포함할 수 있다. 용어 "비-천연"은 기준 종의 야생형 균주를 포함하여, 상기 기준 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변형을 가지는 것을 의미할 수 있다. 유전자 변형은 예를 들면 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입, 다른 폴리뉴클레오티드의 첨가, 폴리뉴클레오티드의 결실 및/또는 상기 효모 세포 유전 물질의 파괴를 포함할 수 있다. 상기 유전적 변형은 예를 들어 상기 기준 종들에 대한 이종, 동종, 또는 이종 및 동종 모두의 폴리펩티드에 대한 코딩 부위 및 그의 작용성 단편을 포함할 수 있다. 추가적인 변형은 예를 들어 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-코딩 조절 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 미생물은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 외인성 유전자를 갖고, NADH를 소모하는 경로의 활성이 감소된 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 NADH를 소모하는 경로는 PEP로부터 숙시네이트를 생산하는 경로, 피루베이트로부터 L-락테이트를 생산하는 경로, 아세틸-CoA로부터 에탄올을 생산하는 경로의 활성, 또는 이의 조합이 감소된 것일 수 있다. 상기 PEP로부터 숙시네이트를 생산하는 경로에 관여하는 효소는 퓨마레이트 리덕타제(fumarate reductase)일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 L-락테이트를 생산하는 경로에 관여하는 효소는 L-락테이트 데히드로게나제(l-lactate dehydrogenase)일 수 있다. 상기 아세틸-CoA로부터 에탄올을 생산하는 경로에 관여하는 효소는 알코올 데히드로게나제일 수 있다.

상기 미생물은 그 모균주에 피하여 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.

상기 미생물은 그 모균주에 비하여 퓨마레이트를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드, L-락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 및 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드로부터 선택된 하나 이상의 활성이 감소된 것일 수 있다.

퓨마레이트를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드는 퓨마레이트 리덕타제(fumarate reductase)일 수 있다. 상기 퓨마레이트 리덕타제는 하기 반응을 촉매할 수 있다:

퓨마레이트 + 환원된 수용체(reduced acceptor) ↔ 숙시네이트 + 수용체.

상기 퓨마레이트 리덕타제는 EC 1.3.99.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 퓨마레이트 리덕타제는 4개의 서브유닛, 서브유닛 A, 서브유닛 B, 서브유닛 C, 및 서브유닛 D을 포함할 수 있다. 퓨마레이트 리덕타제 서브유닛 A는 상기 퓨마레이트를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 아미노산을 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

L-락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 L-락테이트 데히드로게나제일 수 있다. 상기 L-락테이트 데히드로게나제에 관해서는 상술한 바와 같다.

아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: Adh)일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 NADH의 NAD+로의 산화와 함께 아세틸 CoA를 에탄올로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 EC.1.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12753141의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 adhE일 수 있다. 상기 adhE유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기한 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 미생물에 관해서는 상술한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건 또는 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 용어 "혐기 조건 (anaerobic conditions)"은 산소가 없는 환경을 나타낸다. 용어 "미세호기 조건 (microaerobic conditions)"은 배양 또는 성장 조건에 참조되어 사용되는 경우, 배지 중의 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 액체 배지 중의 용존 산소에 대한 포화 (saturation)의 0% 보다 크고 약 10%이하로 유지되는 것을 의미한다. 미세호기 조건은 또한, 1% 미만의 산소를 가진 분위기 (atmosphere)로 유지된 봉인된 챔버 (sealed chamber) 내에 액체 배지 중 또는 고체 아가 플레이트 상에서 세포를 성장시키거나 유지시키는 (resting) 것을 포함한다. 산소의 농도는 예를 들면, 배양물을 N₂/CO₂ 혼합물 또는 다른 적당한 비산소 기체로 스파징함으로써 유지될 수 있다. 상기 산소 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%로 유지하는 것을 포함한다.

용어 "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 질소원의 예는 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다.

상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

배양물로부터의 락테이트의 회수는 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법에 의하면, 야생형 락테이트 데히드로게나제의 활성보다 증가된 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제 변이체를 수득할 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트 데히드로게나제 변이체는 야생형 락테이트 데히드로게나제보다 활성이 증가되어, 락테이트를 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 변이체 각각은 야생형 락테이트 데히드로게나제보다 활성이 증가되어, 락테이트를 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 상기 변이체를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 p416-ldh-HPH 벡터 개열도를 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락테이트 데히드로게나제 변이체 생산

100 ng의 야생형 D-ldh DNA를 주형으로 하여 서열번호 18 및 19의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 서열번호 2의 야생형의 D-ldh 유전자를 증폭하였다.

50 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 하기와 같이 준비하였다:

100 ng의 증폭된 야생형 D-ldh 유전자를 포함하는 42.5 ㎕의 물, 5 ㎕의 10 ×Mutazyme II 반응 버퍼, 1 ㎕의 40 mM dNTP mix (최종적으로 각각의 dNTP는 200 μM임), 0.5 ㎕의 서열번호 18 및 19의 프라이머 믹스 (각각의 프라이머는 250 ng/㎕), 및 1 ㎕의 2.5 U/㎕ Mutazyme II DNA 폴리머라제.

각각의 반응을 온도 시클러(temperature cycler)에 넣고, 95 ℃에서 2분 동안, (95 ℃에서 30초, 58 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분) × 25회, 10분동안 72 ℃에서 PCR 하였다. 상술한 PCR은 error-prone PCR로 GeneMorph II randome mutagenesis kit(Agilent 사)를 사용하였고, 이를 통해 D-ldh 변이체 유전자를 수득하였다.

실시예 2. E. coli K12 ㅿ ldhA ㅿ adhE ㅿ ldhA 제작

2.1 ldhA , adhE , frdAB 유전자의 결실

대장균(E. coli) K12 에서 one-step inactivation 방법 [Warner et al., PNAS,6;97(12):6640-6645, 2000; lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149, 2007]을 이용하여, ldhA, adhE, frdAB 유전자를 결실시켰다.

ldhA 유전자를 결실시키기 위해, pMloxC 벡터[lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149 (2007)]를 주형으로 하여 서열번호 20 및 21의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다-레드 리콤비나제 (λ-red recombinase)가 발현된 대장균 K12균주의 컴피턴트 세포(competent cell)에 일렉트로포레이션(electroporation)하여 ldhA 유전자가 결실된 돌연변이 균주인 대장균 K12 ㅿldhA를 제작하였다.

또한, adhE 유전자를 결실시키기 위해, 위와 동일한 방법으로 서열번호 22 및 23의 프라이머를 사용하여 수득된 PCR 절편을 상기 대장균 K12 ㅿldhA에 도입하여 adhE 유전자가 결실된 돌연변이 균주인 대장균 K12 ㅿldhA ㅿ adhE를 제작하였다.

또한, frdAB 유전자를 결실시키기 위해, 위와 동일한 방법으로 서열번호 24 및 25의 프라이머를 사용하여 수득된 PCR 절편을 상기 대장균 K12 ㅿldhAㅿ adhE에 도입하여 frdAB 유전자가 결실된 돌연변이 균주인 대장균 K12 ㅿldhA ㅿ adhEㅿfrdAB를 제작하였다.

실시예 3. 락테이트 데히드로게나제 변이체의 도입 및 선별

실시예 1에서 수득한 D-ldh 변이체 유전자(ldh_M)를 pT7R3H 벡터에 도입하였다. 상기 pT7R3H 벡터는 서열번호 26의 유전자 서열을 갖는다. 각각의 수득된 D-ldh 변이체 유전자와 pT7R3H 벡터를 Clontech社의 In-fusion HD cloning kit를 사용하여 pT7R3H-ldh_M 벡터를 각각 제작하였다.

제작된 pT7R3H-ldh_M 벡터를 실시예 2에서 제작한 대장균 K12 ㅿldhA ㅿ adhEㅿfrdAB에 각각 열 충격 (heat shock) 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 도입하였다. 상기 형질전환된 균주를 M9 평판 최소배지를 포함하는 플레이트에서 미세호기 조건에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 M9 배지의 조제는 다음과 같다: M9 염을 제조하였다. 그 후, M9 염 분취량(aliquot)을 제조하기 위해, 800 ml H2O과 64 g Na2HPO4-7H2O, 15 g KH2PO4, 2.5 g NaCl, 및 5.0 g NH4Cl을 첨가하고, 이들이 용해될 때까지 교반하였다. 그 후 상기 M9 염 분취량에 증류수를 첨가하여 1,000 ml로 조정한 후, 오토클레이브로 멸균하였다. 그 후, 약 700 ml의 멸균된 증류수를 측정하고, 상기 M9 염 분취량의 200 ml를 상기 증류수에 첨가하였다. 그 후 수득된 혼합물에 2ml의 멸균된 1M MgSO4, 및 20 ml의 20 % 글루코스를 첨가하고, 뒤이어 증류수를 첨가하여 1,000 ml의 M9 배지를 제조하였다.

도 1은 배양 후 플레이트를 나타낸 사진이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 2개의 콜로니가 보이는 것을 알 수 있다. 상기 콜로니는 상기 배양 조건하에서 신속하게 성장한 것을 알 수 있다. 상기 콜로니가 성장 속도가 빠름을 알 수 있다.

상기 2개의 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 유전자 서열을 확인하였다. 확인된 유전자는 각각 서열번호 4 및 서열번호 6이었다. 이로부터 변이체의 아미노산 서열을 확인한 결과, 각각 서열번호 3 및 서열번호 5이었다. 서열번호 3의 아미노산을 mut1라고 지칭하고 서열번호 5의 아미노산을 mut2라고 지칭한다.

실시예 4. 선별된 락테이트 데히드로게나제 변이체의 활성 측정

실시예 3에서 확인된 변이체 아미노산의 ldh assay를 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로 20 ㎕의 1M 피루베이트 및 10 ㎕의 10 mM NADH를 pH 8.0인 1 ml의 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼에 첨가하였다. 5 ul의 1ng/㎕ ldh 변이체 각각(mut1 및 mut2)을 상기 버퍼에 첨가하고 2분 동안 NADH의 감소를 측정하였다. 또한, 야생형 ldh도 위와 동일하게 ldh assay를 수행하였다.

표 1은 측정된 값을 토대로 락테이트 데히드로게나제 야생형 및 변이체의 비활성, Km, kcat을 나타낸 것이다. 표 1에 나타낸 바와같이, 변이체 mut1 및 mut2는 각각 NADH에 대한 kcat값이 야생형 ldh에 비하여 증가한 것을 알 수 있다. 이는 각각의 변이체가 NADH를 소모하는 속도가 증가된 것이고, 이는 상기 변이체의 활성이 증가된 것을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 또한, 변이체 mut1 및 mut2는 피루베이트에 대한 Km이 감소한 것을 알 수 있다. 이는 각각의 변이체가 기질인 피루베이트에 대한 친화성(affinity)가 증가하였다는 것을 나타낸다.

	비활성 (U/mg)	NADH에 대한 Km (mM)	NADH에 대한 kcat	NADH에 대한 kcat/Km	피루베이트에 대한 Km (mM)	피루베이트에 대한 kcat	피루베이트에 대한 kcat/Km
야생형 ldh	1824.9	0.387	1.41 × 10⁷	3.66 × 10⁷	2.326	1.74 × 10⁷	0.75 × 10⁷
Mut1(P¹⁵S)	1669.6	0.529	1.68 × 10⁷	3.18 × 10⁷	1.010	1.38 × 10⁷	1.37 × 10⁷
Mut2(P³²⁹Q)	2313.8	1.207	3.52 × 10⁷	3.42 × 10⁷	1.546	1.74 × 10⁷	1.13 × 10⁷

실시예 5. 락테이트 데히드로게나제 변이체를 포함한 미생물의 당소모 , D- 락 테이트 생산 및 세포 성장 측정

야생형 ldh, 변이체 mut1, 및 mut2를 각각 실시예 2에서 제작한 대장균 K12 ㅿldhA ㅿ adhEㅿfrdAB 균주에 열 충격 (heat shock) 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 도입하였다. 상기 형질전환된 균주를 125 ml flat-cap 플라스크 중 20 ml 글루코스 최소 배지에서 6시간 동안 37 ℃에서 미세호기 조건에서 접종하여 배양하였다. 초기 글루코스의 양은 17.2 g/L이었다. 배양 후 OD₆₀₀ 값은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다. 글루코스 및 D-락테이트의 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 야생형 ldh를 포함하는 대장균에 비하여 mut1 및 mut2 ldh를 포함하는 대장균이 당소모, D-LA생산량, 생산 수율, 및 세포 성장이 증가한 것을 확인하였다.

	글루코스 소모(g/L)	D-락테이트 생산 농도 (g/L)	D-락테이트 생산 수율 (%)	OD₆₀₀
No ldh	1.81	0.00	0.00	2.11
야생형 ldh	2.09	0.40	19.11	2.05
Mut1(P¹⁵S)	2.78	1.10	39.65	2.54
Mut2(P³²⁹Q)	2.73	1.40	51.41	2.13

<110> Samsung Electronic Co. Ltd <120> Method for screeninig a lactate dehydrogenase mutant, lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide, vector, microorganism including the mutant, and method for preparing a lactate using the microorganism <130> PN109445 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> E.coli <400> 1 Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe 11 15 20 25 Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr 30 35 40 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp 45 50 55 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln 60 65 70 Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 75 80 85 90 Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 95 100 105 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 110 115 120 Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys 125 130 135 Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 140 145 150 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 155 160 165 170 Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 175 180 185 Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 190 195 200 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 205 210 215 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys 220 225 230 Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val 235 240 245 250 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly 255 260 265 Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp 270 275 280 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala 285 290 295 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 300 305 310 Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Glu Leu 315 320 325 330 Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly 335 340 <210> 2 <211> 1002 <212> DNA <213> E.coli <400> 2 atgactaaaa tcttcgctta cgctataaga gaggacgaaa agccattttt gaaagagtgg 60 gaggatgcgc ataaagatgt tgaagttgag tacacggata aacttttaac tcctgaaact 120 gctgcattgg caaagggtgc agacggcgta gtagtatatc aacagcttga ttatacagct 180 gaaaccctcc aagctctcgc tgataatggg attacaaaaa tgtctttgcg taatgtaggt 240 gttgacaaca tagacatggc caaagcaaag gaactaggct ttcaaatcac aaatgtgcct 300 gtgtactcac caaatgctat cgctgaacac gctgccatac aagccgctag aatcttaaga 360 caggcgaagg ctatggatga aaaggttgca agacatgatc taagatgggc tcctactatc 420 ggtagggaag taagagatca agttgtcggt gtggtgggaa caggacatat tggccaagtt 480 ttcatgcaga ttatggaagg attcggggca aaagtcattg cctacgacat ttttcgaaac 540 cctgagctgg agaaaaaggg ttactacgtt gattctctgg atgacctata caaacaagca 600 gatgttattt ctcttcatgt gccagatgtc ccagcaaatg tccacatgat caacgacaaa 660 tcaattgcca agatgaaaca agatgtcgta atcgttaatg tgagtagagg gcctttggtt 720 gacaccgacg ctgttataag gggtttggat tccggtaaag tatttggata tgcgatggat 780 gtttacgaag gtgaagtcgg tgtctttaac gaagattggg aaggcaaaga gttcccagac 840 gcaagattag ccgatttgat cgcaagacca aatgttttag taacaccaca cactgccttc 900 tatacaacac atgccgtgag aaacatggtt attaaggcat ttgataataa cttagaattg 960 atcgaaggca aggaagctga aactccagtt aaggtcggtt aa 1002 <210> 3 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> d-ldh mutation1 <400> 3 Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Ser Phe 13 17 22 27 Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr 32 37 42 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp 47 52 57 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln 62 67 72 Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 77 82 87 92 Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 97 102 107 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 112 117 122 Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys 127 132 137 Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 142 147 152 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 157 162 167 172 Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 177 182 187 Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 192 197 202 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 207 212 217 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys 222 227 232 Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val 237 242 247 252 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly 257 262 267 Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp 272 277 282 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala 287 292 297 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 302 307 312 Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Glu Leu 317 322 327 332 Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Pro Val Lys Val Gly 337 342 <210> 4 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> d-ldh mutation1 <400> 4 atgactaaaa tcttcgctta cgctataaga gaggacgaaa agtcattttt gaaagagtgg 60 gaggatgcgc ataaagatgt tgaagttgag tacacggata aacttttaac tcctgaaact 120 gctgcattgg caaagggtgc agacggcgta gtagtatatc aacagcttga ttatacagct 180 gaaaccctcc aagctctcgc tgataatggg attacaaaaa tgtctttgcg taatgtaggt 240 gttgacaaca tagacatggc caaagcaaag gaactaggct ttcaaatcac aaatgtgcct 300 gtgtactcac caaatgctat cgctgaacac gctgccatac aagccgctag aatcttaaga 360 caggcgaagg ctatggatga aaaggttgca agacatgatc taagatgggc tcctactatc 420 ggtagggaag taagagatca agttgtcggt gtggtgggaa caggacatat tggccaagtt 480 ttcatgcaga ttatggaagg attcggggca aaagtcattg cctacgacat ttttcgaaac 540 cctgagctgg agaaaaaggg ttactacgtt gattctctgg atgacctata caaacaagca 600 gatgttattt ctcttcatgt gccagatgtc ccagcaaatg tccacatgat caacgacaaa 660 tcaattgcca agatgaaaca agatgtcgta atcgttaatg tgagtagagg gcctttggtt 720 gacaccgacg ctgttataag gggtttggat tccggtaaag tatttggata tgcgatggat 780 gtttacgaag gtgaagtcgg tgtctttaac gaagattggg aaggcaaaga gttcccagac 840 gcaagattag ccgatttgat cgcaagacca aatgttttag taacaccaca cactgccttc 900 tatacaacac atgccgtgag aaacatggtt attaaggcat ttgataataa cttagaattg 960 atcgaaggca aggaagctga aactccagtt aaggtcggtt aa 1002 <210> 5 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> d-ldh mutation2 <400> 5 Met Thr Lys Ile Phe Ala Tyr Ala Ile Arg Glu Asp Glu Lys Pro Phe 15 19 24 29 Leu Lys Glu Trp Glu Asp Ala His Lys Asp Val Glu Val Glu Tyr Thr 34 39 44 Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala Asp 49 54 59 Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Thr Leu Gln 64 69 74 Ala Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly 79 84 89 94 Val Asp Asn Ile Asp Met Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ile 99 104 109 Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala Ala 114 119 124 Ile Gln Ala Ala Arg Ile Leu Arg Gln Ala Lys Ala Met Asp Glu Lys 129 134 139 Val Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Val 144 149 154 Arg Asp Gln Val Val Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Gln Val 159 164 169 174 Phe Met Gln Ile Met Glu Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp 179 184 189 Ile Phe Arg Asn Pro Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Tyr Val Asp Ser 194 199 204 Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu His Val Pro 209 214 219 Asp Val Pro Ala Asn Val His Met Ile Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys 224 229 234 Met Lys Gln Asp Val Val Ile Val Asn Val Ser Arg Gly Pro Leu Val 239 244 249 254 Asp Thr Asp Ala Val Ile Arg Gly Leu Asp Ser Gly Lys Val Phe Gly 259 264 269 Tyr Ala Met Asp Val Tyr Glu Gly Glu Val Gly Val Phe Asn Glu Asp 274 279 284 Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ile Ala 289 294 299 Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr His 304 309 314 Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Leu Glu Leu 319 324 329 334 Ile Glu Gly Lys Glu Ala Glu Thr Gln Val Lys Val Gly 339 344 <210> 6 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> d-ldh mutation2 <400> 6 atgactaaaa tcttcgctta cgctataaga gaggacgaaa agccattttt gaaagagtgg 60 gaggatgcgc ataaagatgt tgaagttgag tacacggata aacttttaac tcctgaaact 120 gctgcattgg caaagggtgc agacggcgta gtagtatatc aacagcttga ttatacagct 180 gaaaccctcc aagctctcgc tgataatggg attacaaaaa tgtctttgcg taatgtaggt 240 gttgacaaca tagacatggc caaagcaaag gaactaggct ttcaaatcac aaatgtgcct 300 gtgtactcac caaatgctat cgctgaacac gctgccatac aagccgctag aatcttaaga 360 caggcgaagg ctatggatga aaaggttgca agacatgatc taagatgggc tcctactatc 420 ggtagggaag taagagatca agttgtcggt gtggtgggaa caggacatat tggccaagtt 480 ttcatgcaga ttatggaagg attcggggca aaagtcattg cctacgacat ttttcgaaac 540 cctgagctgg agaaaaaggg ttactacgtt gattctctgg atgacctata caaacaagca 600 gatgttattt ctcttcatgt gccagatgtc ccagcaaatg tccacatgat caacgacaaa 660 tcaattgcca agatgaaaca agatgtcgta atcgttaatg tgagtagagg gcctttggtt 720 gacaccgacg ctgttataag gggtttggat tccggtaaag tatttggata tgcgatggat 780 gtttacgaag gtgaagtcgg tgtctttaac gaagattggg aaggcaaaga gttcccagac 840 gcaagattag ccgatttgat cgcaagacca aatgttttag taacaccaca cactgccttc 900 tatacaacac atgccgtgag aaacatggtt attaaggcat ttgataataa cttagaattg 960 atcgaaggca aggaagctga aactcaagtt aaggtcggtt aa 1002 <210> 7 <211> 602 <212> PRT <213> E.coli <400> 7 Met Gln Thr Phe Gln Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Ala Gly Gly Ala 177 181 186 191 Gly Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ala Asn Pro Asn Ala Lys 196 201 206 Ile Ala Leu Ile Ser Lys Val Tyr Pro Met Arg Ser His Thr Val Ala 211 216 221 Ala Glu Gly Gly Ser Ala Ala Val Ala Gln Asp His Asp Ser Phe Glu 226 231 236 Tyr His Phe His Asp Thr Val Ala Gly Gly Asp Trp Leu Cys Glu Gln 241 246 251 256 Asp Val Val Asp Tyr Phe Val His His Cys Pro Thr Glu Met Thr Gln 261 266 271 Leu Glu Leu Trp Gly Cys Pro Trp Ser Arg Arg Pro Asp Gly Ser Val 276 281 286 Asn Val Arg Arg Phe Gly Gly Met Lys Ile Glu Arg Thr Trp Phe Ala 291 296 301 Ala Asp Lys Thr Gly Phe His Met Leu His Thr Leu Phe Gln Thr Ser 306 311 316 Leu Gln Phe Pro Gln Ile Gln Arg Phe Asp Glu His Phe Val Leu Asp 321 326 331 336 Ile Leu Val Asp Asp Gly His Val Arg Gly Leu Val Ala Met Asn Met 341 346 351 Met Glu Gly Thr Leu Val Gln Ile Arg Ala Asn Ala Val Val Met Ala 356 361 366 Thr Gly Gly Ala Gly Arg Val Tyr Arg Tyr Asn Thr Asn Gly Gly Ile 371 376 381 Val Thr Gly Asp Gly Met Gly Met Ala Leu Ser His Gly Val Pro Leu 386 391 396 Arg Asp Met Glu Phe Val Gln Tyr His Pro Thr Gly Leu Pro Gly Ser 401 406 411 416 Gly Ile Leu Met Thr Glu Gly Cys Arg Gly Glu Gly Gly Ile Leu Val 421 426 431 Asn Lys Asn Gly Tyr Arg Tyr Leu Gln Asp Tyr Gly Met Gly Pro Glu 436 441 446 Thr Pro Leu Gly Glu Pro Lys Asn Lys Tyr Met Glu Leu Gly Pro Arg 451 456 461 Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe Trp His Glu Trp Arg Lys Gly Asn Thr 466 471 476 Ile Ser Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Tyr Leu Asp Leu Arg His Leu 481 486 491 496 Gly Glu Lys Lys Leu His Glu Arg Leu Pro Phe Ile Cys Glu Leu Ala 501 506 511 Lys Ala Tyr Val Gly Val Asp Pro Val Lys Glu Pro Ile Pro Val Arg 516 521 526 Pro Thr Ala His Tyr Thr Met Gly Gly Ile Glu Thr Asp Gln Asn Cys 531 536 541 Glu Thr Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ala Val Gly Glu Cys Ser Ser Val 546 551 556 Gly Leu His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Ser Asn Ser Leu Ala Glu Leu 561 566 571 576 Val Val Phe Gly Arg Leu Ala Gly Glu Gln Ala Thr Glu Arg Ala Ala 581 586 591 Thr Ala Gly Asn Gly Asn Glu Ala Ala Ile Glu Ala Gln Ala Ala Gly 596 601 606 Val Glu Gln Arg Leu Lys Asp Leu Val Asn Gln Asp Gly Gly Glu Asn 611 616 621 Trp Ala Lys Ile Arg Asp Glu Met Gly Leu Ala Met Glu Glu Gly Cys 626 631 636 Gly Ile Tyr Arg Thr Pro Glu Leu Met Gln Lys Thr Ile Asp Lys Leu 641 646 651 656 Ala Glu Leu Gln Glu Arg Phe Lys Arg Val Arg Ile Thr Asp Thr Ser 661 666 671 Ser Val Phe Asn Thr Asp Leu Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Gly His Gly 676 681 686 Leu Asn Val Ala Glu Cys Met Ala His Ser Ala Met Ala Arg Lys Glu 691 696 701 Ser Arg Gly Ala His Gln Arg Leu Asp Glu Gly Cys Thr Glu Arg Asp 706 711 716 Asp Val Asn Phe Leu Lys His Thr Leu Ala Phe Arg Asp Ala Asp Gly 721 726 731 736 Thr Thr Arg Leu Glu Tyr Ser Asp Val Lys Ile Thr Thr Leu Pro Pro 741 746 751 Ala Lys Arg Val Tyr Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ala Asp Lys Ala Glu 756 761 766 Ala Ala Asn Lys Lys Glu Lys Ala Asn Gly 771 776 <210> 8 <211> 1809 <212> DNA <213> E.coli <400> 8 gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgcggg attacgtgct 60 gcaattgctg ccgcgcaggc aaatccgaat gcaaaaatcg cactaatctc aaaagtatac 120 ccgatgcgta gccataccgt tgctgcagaa gggggctccg ccgctgtcgc gcaggatcat 180 gacagcttcg aatatcactt tcacgataca gtagcgggtg gcgactggtt gtgtgagcag 240 gatgtcgtgg attatttcgt ccaccactgc ccaaccgaaa tgacccaact ggaactgtgg 300 ggatgcccat ggagccgtcg cccggatggt agcgtcaacg tacgtcgctt cggcggcatg 360 aaaatcgagc gcacctggtt cgccgccgat aagaccggct tccatatgct gcacacgctg 420 ttccagacct ctctgcaatt cccgcagatc cagcgttttg acgaacattt cgtgctggat 480 attctggttg atgatggtca tgttcgcggc ctggtagcaa tgaacatgat ggaaggcacg 540 ctggtgcaga tccgtgctaa cgcggtcgtt atggctactg gcggtgcggg tcgcgtttat 600 cgttacaaca ccaacggcgg catcgttacc ggtgacggta tgggtatggc gctaagccac 660 ggcgttccgc tgcgtgacat ggaattcgtt cagtatcacc caaccggtct gccaggttcc 720 ggtatcctga tgaccgaagg ttgccgcggt gaaggcggta ttctggtcaa caaaaatggc 780 taccgttatc tgcaagatta cggcatgggc ccggaaactc cgctgggcga gccgaaaaac 840 aaatatatgg aactgggtcc acgcgacaaa gtctctcagg ccttctggca cgaatggcgt 900 aaaggcaaca ccatctccac gccgcgtggc gatgtggttt atctcgactt gcgtcacctc 960 ggcgagaaaa aactgcatga acgtctgccg ttcatctgcg aactggcgaa agcgtacgtt 1020 ggcgtcgatc cggttaaaga accgattccg gtacgtccga ccgcacacta caccatgggc 1080 ggtatcgaaa ccgatcagaa ctgtgaaacc cgcattaaag gtctgttcgc cgtgggtgaa 1140 tgttcctctg ttggtctgca cggtgcaaac cgtctgggtt ctaactccct ggcggaactg 1200 gtggtcttcg gccgtctggc cggtgaacaa gcgacagagc gtgcagcaac tgccggtaat 1260 ggcaacgaag cggcaattga agcgcaggca gctggcgttg aacaacgtct gaaagatctg 1320 gttaaccagg atggcggcga aaactgggcg aagatccgcg acgaaatggg cctggctatg 1380 gaagaaggct gcggtatcta ccgtacgccg gaactgatgc agaaaaccat cgacaagctg 1440 gcagagctgc aggaacgctt caagcgcgtg cgcatcaccg acacttccag cgtgttcaac 1500 accgacctgc tctacaccat tgaactgggc cacggtctga acgttgctga atgtatggcg 1560 cactccgcaa tggcacgtaa agagtcccgc ggcgcgcacc agcgtctgga cgaaggttgc 1620 accgagcgtg acgacgtcaa cttcctcaaa cacaccctcg ccttccgcga tgctgatggc 1680 acgactcgcc tggagtacag cgacgtgaag attactacgc tgccgccagc taaacgcgtt 1740 tacggtggcg aagcggatgc agccgataag gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg 1800 aatggctga 1809 <210> 9 <211> 891 <212> PRT <213> E.coli <400> 9 Met Ala Val Thr Asn Val Ala Glu Leu Asn Ala Leu Val Glu Arg Val 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gln Arg Glu Tyr Ala Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Asp 20 25 30 Lys Ile Phe Arg Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Ala Arg Ile Pro 35 40 45 Leu Ala Lys Met Ala Val Ala Glu Ser Gly Met Gly Ile Val Glu Asp 50 55 60 Lys Val Ile Lys Asn His Phe Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Asn Ala Tyr 65 70 75 80 Lys Asp Glu Lys Thr Cys Gly Val Leu Ser Glu Asp Asp Thr Phe Gly 85 90 95 Thr Ile Thr Ile Ala Glu Pro Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ile Val Pro 100 105 110 Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125 Lys Thr Arg Asn Ala Ile Ile Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Asp 130 135 140 Ala Thr Asn Lys Ala Ala Asp Ile Val Leu Gln Ala Ala Ile Ala Ala 145 150 155 160 Gly Ala Pro Lys Asp Leu Ile Gly Trp Ile Asp Gln Pro Ser Val Glu 165 170 175 Leu Ser Asn Ala Leu Met His His Pro Asp Ile Asn Leu Ile Leu Ala 180 185 190 Thr Gly Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro 195 200 205 Ala Ile Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Val Val Ile Asp Glu Thr 210 215 220 Ala Asp Ile Lys Arg Ala Val Ala Ser Val Leu Met Ser Lys Thr Phe 225 230 235 240 Asp Asn Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Val Val Val Asp 245 250 255 Ser Val Tyr Asp Ala Val Arg Glu Arg Phe Ala Thr His Gly Gly Tyr 260 265 270 Leu Leu Gln Gly Lys Glu Leu Lys Ala Val Gln Asp Val Ile Leu Lys 275 280 285 Asn Gly Ala Leu Asn Ala Ala Ile Val Gly Gln Pro Ala Tyr Lys Ile 290 295 300 Ala Glu Leu Ala Gly Phe Ser Val Pro Glu Asn Thr Lys Ile Leu Ile 305 310 315 320 Gly Glu Val Thr Val Val Asp Glu Ser Glu Pro Phe Ala His Glu Lys 325 330 335 Leu Ser Pro Thr Leu Ala Met Tyr Arg Ala Lys Asp Phe Glu Asp Ala 340 345 350 Val Glu Lys Ala Glu Lys Leu Val Ala Met Gly Gly Ile Gly His Thr 355 360 365 Ser Cys Leu Tyr Thr Asp Gln Asp Asn Gln Pro Ala Arg Val Ser Tyr 370 375 380 Phe Gly Gln Lys Met Lys Thr Ala Arg Ile Leu Ile Asn Thr Pro Ala 385 390 395 400 Ser Gln Gly Gly Ile Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Lys Leu Ala Pro Ser 405 410 415 Leu Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Gly Asn Ser Ile Ser Glu Asn 420 425 430 Val Gly Pro Lys His Leu Ile Asn Lys Lys Thr Val Ala Lys Arg Ala 435 440 445 Glu Asn Met Leu Trp His Lys Leu Pro Lys Ser Ile Tyr Phe Arg Arg 450 455 460 Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Asp Glu Val Ile Thr Asp Gly His Lys 465 470 475 480 Arg Ala Leu Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Phe Asn Asn Gly Tyr Ala 485 490 495 Asp Gln Ile Thr Ser Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Glu Thr Glu Val 500 505 510 Phe Phe Glu Val Glu Ala Asp Pro Thr Leu Ser Ile Val Arg Lys Gly 515 520 525 Ala Glu Leu Ala Asn Ser Phe Lys Pro Asp Val Ile Ile Ala Leu Gly 530 535 540 Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ile Met Trp Val Met Tyr Glu 545 550 555 560 His Pro Glu Thr His Phe Glu Glu Leu Ala Leu Arg Phe Met Asp Ile 565 570 575 Arg Lys Arg Ile Tyr Lys Phe Pro Lys Met Gly Val Lys Ala Lys Met 580 585 590 Ile Ala Val Thr Thr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe 595 600 605 Ala Val Val Thr Asp Asp Ala Thr Gly Gln Lys Tyr Pro Leu Ala Asp 610 615 620 Tyr Ala Leu Thr Pro Asp Met Ala Ile Val Asp Ala Asn Leu Val Met 625 630 635 640 Asp Met Pro Lys Ser Leu Cys Ala Phe Gly Gly Leu Asp Ala Val Thr 645 650 655 His Ala Met Glu Ala Tyr Val Ser Val Leu Ala Ser Glu Phe Ser Asp 660 665 670 Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Ala 675 680 685 Ser Tyr His Glu Gly Ser Lys Asn Pro Val Ala Arg Glu Arg Val His 690 695 700 Ser Ala Ala Thr Ile Ala Gly Ile Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly 705 710 715 720 Val Cys His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ser Gln Phe His Ile Pro 725 730 735 His Gly Leu Ala Asn Ala Leu Leu Ile Cys Asn Val Ile Arg Tyr Asn 740 745 750 Ala Asn Asp Asn Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Ser Gln Tyr Asp Arg 755 760 765 Pro Gln Ala Arg Arg Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Asp His Leu Gly Leu 770 775 780 Ser Ala Pro Gly Asp Arg Thr Ala Ala Lys Ile Glu Lys Leu Leu Ala 785 790 795 800 Trp Leu Glu Thr Leu Lys Ala Glu Leu Gly Ile Pro Lys Ser Ile Arg 805 810 815 Glu Ala Gly Val Gln Glu Ala Asp Phe Leu Ala Asn Val Asp Lys Leu 820 825 830 Ser Glu Asp Ala Phe Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Tyr 835 840 845 Pro Leu Ile Ser Glu Leu Lys Gln Ile Leu Leu Asp Thr Tyr Tyr Gly 850 855 860 Arg Asp Tyr Val Glu Gly Glu Thr Ala Ala Lys Lys Glu Ala Ala Pro 865 870 875 880 Ala Lys Ala Glu Lys Lys Ala Lys Lys Ser Ala 885 890 <210> 10 <211> 2676 <212> DNA <213> E.coli <400> 10 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60 cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120 gctgctgcag atgctcgaat cccactcgcg aaaatggccg ttgccgaatc cggcatgggt 180 atcgtcgaag ataaagtgat caaaaaccac tttgcttctg aatatatcta caacgcctat 240 aaagatgaaa aaacctgtgg tgttctgtct gaagacgaca cttttggtac catcactatc 300 gctgaaccaa tcggtattat ttgcggtatc gttccgacca ctaacccgac ttcaactgct 360 atcttcaaat cgctgatcag tctgaagacc cgtaacgcca ttatcttctc cccgcacccg 420 cgtgcaaaag atgccaccaa caaagcggct gatatcgttc tgcaggctgc tatcgctgcc 480 ggtgctccga aagatctgat cggctggatc gatcaacctt ctgttgaact gtctaacgca 540 ctgatgcacc acccagacat caacctgatc ctcgcgactg gtggtccggg catggttaaa 600 gccgcataca gctccggtaa accagctatc ggtgtaggcg cgggcaacac tccagttgtt 660 atcgatgaaa ctgctgatat caaacgtgca gttgcatctg tactgatgtc caaaaccttc 720 gacaacggcg taatctgtgc ttctgaacag tctgttgttg ttgttgactc tgtttatgac 780 gctgtacgtg aacgttttgc aacccacggc ggctatctgt tgcagggtaa agagctgaaa 840 gctgttcagg atgttatcct gaaaaacggt gcgctgaacg cggctatcgt tggtcagcca 900 gcctataaaa ttgctgaact ggcaggcttc tctgtaccag aaaacaccaa gattctgatc 960 ggtgaagtga ccgttgttga tgaaagcgaa ccgttcgcac atgaaaaact gtccccgact 1020 ctggcaatgt accgcgctaa agatttcgaa gacgcggtag aaaaagcaga gaaactggtt 1080 gctatgggcg gtatcggtca tacctcttgc ctgtacactg accaggataa ccaaccggct 1140 cgcgtttctt acttcggtca gaaaatgaaa acggctcgta tcctgattaa caccccagcg 1200 tctcagggtg gtatcggtga cctgtataac ttcaaactcg caccttccct gactctgggt 1260 tgtggttctt ggggtggtaa ctccatctct gaaaacgttg gtccgaaaca cctgatcaac 1320 aagaaaaccg ttgctaagcg agctgaaaac atgttgtggc acaaacttcc gaaatctatc 1380 tacttccgcc gtggctccct gccaatcgcg ctggatgaag tgattactga tggccacaaa 1440 cgtgcgctca tcgtgactga ccgcttcctg ttcaacaatg gttatgctga tcagatcact 1500 tccgtactga aagcagcagg cgttgaaact gaagtcttct tcgaagtaga agcggacccg 1560 accctgagca tcgttcgtaa aggtgcagaa ctggcaaact ccttcaaacc agacgtgatt 1620 atcgcgctgg gtggtggttc cccgatggac gccgcgaaga tcatgtgggt tatgtacgaa 1680 catccggaaa ctcacttcga agagctggcg ctgcgcttta tggatatccg taaacgtatc 1740 tacaagttcc cgaaaatggg cgtgaaagcg aaaatgatcg ctgtcaccac cacttctggt 1800 acaggttctg aagtcactcc gtttgcggtt gtaactgacg acgctactgg tcagaaatat 1860 ccgctggcag actatgcgct gactccggat atggcgattg tcgacgccaa cctggttatg 1920 gacatgccga agtccctgtg tgctttcggt ggtctggacg cagtaactca cgccatggaa 1980 gcttatgttt ctgtactggc atctgagttc tctgatggtc aggctctgca ggcactgaaa 2040 ctgctgaaag aatatctgcc agcgtcctac cacgaagggt ctaaaaatcc ggtagcgcgt 2100 gaacgtgttc acagtgcagc gactatcgcg ggtatcgcgt ttgcgaacgc cttcctgggt 2160 gtatgtcact caatggcgca caaactgggt tcccagttcc atattccgca cggtctggca 2220 aacgccctgc tgatttgtaa cgttattcgc tacaatgcga acgacaaccc gaccaagcag 2280 actgcattca gccagtatga ccgtccgcag gctcgccgtc gttatgctga aattgccgac 2340 cacttgggtc tgagcgcacc gggcgaccgt actgctgcta agatcgagaa actgctggca 2400 tggctggaaa cgctgaaagc tgaactgggt attccgaaat ctatccgtga agctggcgtt 2460 caggaagcag acttcctggc gaacgtggat aaactgtctg aagatgcgtt cgatgaccag 2520 tgcaccggcg ctaacccgcg ttacccgctg atctccgagc tgaaacagat cctgctggat 2580 acctactacg gtcgtgatta tgtagaaggt gaaactgcag cgaaaaaaga agccgctccg 2640 gctaaagctg agaaaaaagc gaaaaaatcc gcttaa 2676 <210> 11 <211> 292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCW12 promoter <400> 11 ttcgcggcca cctacgccgc tatctttgca acaactatct gcgataactc agcaaatttt 60 gcatattcgt gttgcagtat tgcgataatg ggagtcttac ttccaacata acggcagaaa 120 gaaatgtgag aaaattttgc atcctttgcc tccgttcaag tatataaagt cggcatgctt 180 gataatcttt ctttccatcc tacattgttc taattattct tattctcctt tattctttcc 240 taacatacca agaaattaat cttctgtcat tcgcttaaac actatatcaa ta 292 <210> 12 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC promoter <400> 12 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 13 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF1 promoter <400> 13 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 14 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGK1 promoter <400> 14 ctttcctctt tttattaacc ttaattttta ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc 60 acagatatta taacatctgc ataataggca tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag 120 agtgaggaac tatcgcatac ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt 180 ttggcttcac cctcatacta ttatcagggc cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg 240 aattgatgtt accctcataa agcacgtggc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc 300 gtgatttgtt tgcaaaaaga acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct 360 tcctattgat tgcagcttcc aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg 420 ttttgtaaca agcaatcgaa ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta 480 tgatgcccac tgtgatctcc agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt 540 tcaaacagaa ttgtccgaat cgtgtgacaa caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt 600 ctaaccaagg gggtggttta gtttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat 660 aaacttgcat aaattggtca atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt 720 tttcaagttc ttagatgctt tctttttctc ttttttacag atcatcaagg aagtaattat 780 ctacttttta caacaaat 798 <210> 15 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 15 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 16 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH promoter <400> 16 gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaag 60 acaaatataa gggtcgaacg aaaaataaag tgaaaagtgt tgatatgatg tatttggctt 120 tgcggcgccg aaaaaacgag tttacgcaat tgcacaatca tgctgactct gtggcggacc 180 cgcgctcttg ccggcccggc gataacgctg ggcgtgaggc tgtgcccggc ggagtttttt 240 gcgcctgcat tttccaaggt ttaccctgcg ctaaggggcg agattggaga agcaataaga 300 atgccggttg gggttgcgat gatgacgacc acgacaactg gtgtcattat ttaagttgcc 360 gaaagaacct gagtgcattt gcaacatgag tatactagaa gaatgagcca agacttgcga 420 gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt 1320 ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc 1380 attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca agctatacca 1440 agcatacaat caactccaag ctggccgc 1468 <210> 17 <211> 252 <212> DNA <213> CYC1 terminator <400> 17 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atgactaaaa tcttcgctta cg 22 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aaaacagcca agcttttaac cgaccttaac tggag 35 <210> 20 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 21 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 22 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcggcttctt tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 24 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgcggg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 25 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ttagcgtggt ttcagggtcg cgataagaaa gtctttcgaa ctttctactt tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 26 <211> 3997 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pT7R3H vector <400> 26 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120 cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 180 gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 240 catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 300 ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 360 gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 420 ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 480 tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 540 caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 600 ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 660 gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 720 gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 780 atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg 840 caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtaattcact 900 ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 960 tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 1020 ttcccaacag ttgcgggggg ggggggaaag ccacgttgtg tctcaaaatc tctgatgtta 1080 cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag 1140 taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcttgctcga ggccgcgatt 1200 aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca 1260 atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa 1320 acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct 1380 gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg 1440 gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga 1500 ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc 1560 tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg 1620 aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt 1680 tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac 1740 tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat 1800 tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg 1860 cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa 1920 tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aatcagaatt 1980 ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg gcggctttgt 2040 tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca 2100 gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct 2160 ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg gggcgattca ggcctggtat 2220 gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc cccccccccc gcaaactatt 2280 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 2340 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 2400 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2460 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2520 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2580 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2640 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2700 agcgtcagac cccttaataa gatgatcttc ttgagatcgt tttggtctgc gcgtaatctc 2760 ttgctctgaa aacgaaaaaa ccgccttgca gggcggtttt tcgaaggttc tctgagctac 2820 caactctttg aaccgaggta actggcttgg aggagcgcag tcaccaaaac ttgtcctttc 2880 agtttagcct taaccggcgc atgacttcaa gactaactcc tctaaatcaa ttaccagtgg 2940 ctgctgccag tggtgctttt gcatgtcttt ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 3000 ataaggcgca gcggtcggac tgaacggggg gttcgtgcat acagtccagc ttggagcgaa 3060 ctgcctaccc ggaactgagt gtcaggcgtg gaatgagaca aacgcggcca taacagcgga 3120 atgacaccgg taaaccgaaa ggcaggaaca ggagagcgca cgagggagcc gccaggggga 3180 aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc actgatttga gcgtcagatt 3240 tcgtgatgct tgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg gctttgccgc ggccctctca 3300 cttccctgtt aagtatcttc ctggcatctt ccaggaaatc tccgccccgt tcgtaagcca 3360 tttccgctcg ccgcagtcga acgaccgagc gtagcgagtc agtgagcgag gaagcggaat 3420 atatcctgta tcacatattc tgctgacgca ccggtgcagc cttttttctc ctgccacatg 3480 aagcacttca ctgacaccct catcagtgcc aacatagtaa gccagtatac actccgctag 3540 caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 3600 acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 3660 ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 3720 gaggatccgg agcttatcga cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 3780 ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 3840 aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagga 3900 tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tatagggaga ccacaacggt ttccctctag 3960 aaataatttt gtttaacttt aagaaggcga tatacat 3997

Claims

락테이트 데히드로게나제의 변이체를 제조하는 단계;
상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 유전적으로 자작된 미생물에 도입하는 단계;
야생형 락테이트 데히드로게나제에 비하여 활성이 증가된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 선별하는 단계를 포함하는, 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 퓨마레이트 리덕타제, L-락테이트 데히드로게나제, 및 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 파괴를 갖는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 퓨마레이트 리덕타제는 EC 1.3.99.1로 분류되는 효소이고, 상기 L-락테이트 데히드로게나제는 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소이고, 상기 알코올 데히드로게나제는 EC 1.1.1.1로 분류되는 효소인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 선별하는 단계는 상기 변이체가 도입된 상기 유전적으로 조작된 미생물을 배양하여, 야생형 락테이트 데히드로게나제 변이체가 도입된 미생물의 성장에 비하여 상기 변이체가 도입된 유전적으로 조작된 미생물의 성장이 높은 것을 활성이 증가된 락테이트 데히드로게나제로 결정하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체는 야생형 락테이트 데히드로게나제에 비하여 NADH 소모 속도가 증가된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체는 야생형 락테이트 데히드로게나제에 비하여 피루베이트에 대한 친화도가 증가된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체는 야생형 락테이트 데히드로게나제에 비하여 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 제조하는 단계는 방법은 무작위 돌연변이 유발, 지향된 돌연변이 유발(directed mutagenesis), DNA 셔플링 (DNA shuffling), 및 점 돌연변이(point mutagenesis)로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 유발 방법에 의해 생성되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체는 서열번호 1의 15번째 프롤린(P) 및 329번째 프롤린(P)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개량된 락테이트 데히드로게나제 변이체는 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
락테이트 데히드로게나제 변이체로서, 상기 변이체는 서열번호 1의 15번째 프롤린(P) 및 329번째 프롤린(P)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 변이체.
청구항 11에 있어서, 상기 다른 아미노산은 극성이고 비전하 아미노산인 것인 변이체.
청구항 11에 있어서, 상기 다른 아미노산은 세린, 글루타민, 아스파라진, 트레오닌, 또는 시스테인인 것인 변이체.
청구항 11에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 것인 변이체.
락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 변이체는 서열변호 1의 15번째 프롤린(P) 및 329번째 프롤린(P)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 폴리뉴클레오티드.
청구항 15에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 또는 6의 폴리뉴클레오티드와 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 변이체.
조절 서열과 작동하게 연결된, 청구항 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
청구항 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물.
청구항 18에 있어서, 상기 미생물은 퓨마레이트 리덕타제, L-락테이트 데히드로게나제, 및 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 유전자로부터 선택된 하나 이상의 파괴를 갖는 것인 미생물.
청구항 18의 미생물을 배양하여 D-락테이트를 생산하는 단계; 및
배양물로부터 D-락테이트를 회수하는 단계를 포함하는 D-락테이트를 생산하는 방법.