PT2169063E

PT2169063E - Promotor de ácido nucleico derivado de bactérias do género corynebacterium, cassete de expressão compreendendo o promotor e o vector que compreende a cassete, a célula hospedeira compreendendo o vector e método para a expressão de um gene usando a célula

Info

Publication number: PT2169063E
Application number: PT91668228T
Authority: PT
Inventors: Young-Hoon Park; Hyun-Soo Kim; Hye-Jin Choi; Jin-Ho Lee; Soo-Youn Hwang; Jae-Ick Sim; Won-Sik Lee; Tae-Sun Kang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2005-12-16
Publication date: 2013-07-05
Also published as: CN101712956A; EP1824977A4; CN101087880B; PT2169066E; CN101712956B; KR20060068505A; CN101798571A; CN101798571B; EP2169063B1; US7662943B2; EP2169064A1; JP2011004762A; JP5204179B2; ATE550430T1; EP2169062B1; KR100620092B1; JP5204178B2; ES2418454T3; JP4616889B2; JP2008523802A

Description

DESCRIÇÃO

PROMOTOR DE ÁCIDO NUCLEICO DERIVADO DE BACTÉRIAS DO GÉNERO CORYNEBACTERIUM, CASSETE DE EXPRESSÃO COMPREENDENDO O PROMOTOR E O VECTOR QUE COMPREENDE A CASSETE, A CÉLULA HOSPEDEIRA COMPREENDENDO O VECTOR E MÉTODO PARA A EXPRESSÃO DE UM GENE USANDO A CÉLULA

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um novo promotor de ácido nucleico derivado de bactérias do género Corynebacterium, uma cassete de expressão incluindo o mesmo, um vector incluindo a cassete de expressão, uma célula hospedeira incluindo o vector, e um método de expressar um gene utilizando a célula hospedeira.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Bactérias corineformes são microorganismos usados para produzir vários materiais químicos usados em muitas aplicações, tais como alimentos para animais, medicamentos e alimentos, incluindo a L-lisina, L-treonina, e vários ácidos nucleicos. A estirpe de bactérias corineformes mostra que alta produtividade pode ser desenvolvida por meio de engenharia genética e engenharia metabólica. Para obter uma tal estirpe de bactérias corineformes que mostram uma elevada produtividade, um gene ligado a diferentes vias metabólicas precisa de ser expresso nas bactérias corineformes. Para este fim, um promotor adequado deve ser desenvolvido.

Geralmente, em bactérias corineformes, um gene é expresso sob o promotor inerentemente nelas incluídas. (Ver, por exemplo, Journal of Bacteriology, 181 (19), 6188-6191, 1 1999) . Enquanto isso, a estrutura de uma sequência promotora para a expressão de um gene em bactérias corineformes não é conhecida, enquanto que as estruturas de outros microrganismos industriais, tais como E. coli e Bacillus subtilis, são conhecidas. Portanto, o método seguinte foi sugerido para a produção de promotores que permitem a expressão de um gene em bactérias corineformes. Em primeiro lugar, uma região promotora de um gene que é resistente a um antibiótico, tal como o cloranfenicol é removida. Separadamente, um ADN cromossómico separado da bactéria corineforme é clivado usando uma enzima de restrição adequada, e o fragmento resultante é introduzido com o gene a partir do qual a região promotora é removida. Em seguida, o gene obtido é usado para transformar bactérias corineformes para produzir uma estirpe transformada sendo a resistência aos antibióticos da estirpe transformada medida: (veja Gene, 102, 93-98, 1991,

Microbiology, 142, 1297-1309, 1996.) Em particular, tem sido desenvolvido um número muito pequeno de promotores utilizados em corynebacterium ammoniagenes, conhecido um microrganismo produtor de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor possuindo actividade de cerca de 10% superior a um promotor tac é utilizado em E. coli (veja Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003.) No entanto, quando é usado numa expressão de genes de massa, tal promotor apresenta fraca eficiência. A Patente dos EUA No. 5.593.781 descreve um promotor DNA, que é separado a partir de uma estirpe de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) e possui uma actividade mais elevada do que um promotor tac. No entanto, um tal promotor ADN que está separado de um género Brevibacterium pode não ser accionados noutras bactérias. Portanto, existe uma necessidade de desenvolver uma sequência promotora que é derivada de Corynebacterium 2 ammoniagenes disponíveis comercialmente, e possui uma actividade elevada noutras bactérias.

Assim sendo, os inventores da presente invenção procuraram por uma sequência promotora forte em Corynebacterium ammoniagenes e descobriram que um promotor de acordo com a presente invenção pode expressar genes com elevada actividade em Corynebacterium ammoniagenes.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 mostra os resultados de dois ensaios de electroforese dimensional de uma amostra extraída a partir de uma bactéria Corynebacterium ammoniagenes, em que os resultados do ensaio foram tingidos de prata e desenvolvidos para a identificação; FIG. 2 ilustra um método de produção de um vector de rastreio P117-GFP de acordo com uma forma de realização da presente invenção; e FIG. 3 ilustra um método para produzir um vector recombinante incluindo a sequência promotora pcj1 até pcj7 de um vector de rastreio P117-GFP de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

PROBLEMA TÉCNICO A presente invenção proporciona um promotor com actividade elevada em Corynebacterium. 3 A presente invenção também proporciona uma cassete de expressão, incluindo o promotor e um vector incluindo a cassete de expressão. A presente invenção também proporciona uma célula hospedeira incluindo o vector. A presente invenção também fornece um método de expressar um gene usando a célula hospedeira.

SOLUÇÃO TÉCNICA A presente invenção proporciona um promotor que compreende um polinucleótido da SEQ ID NO: 4. 0 promotor de acordo com a presente invenção é um ácido nucleico isolado e tem actividade de promotor. Aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de ADN à qual uma polimerase de ARN é ligada para iniciar a transcrição de um gene. 0 termo "promotor tac" refere-se a um promotor obtido por fusão de uma sequência obtida a partir da - região 35 de promotor de um operão de triptofano de E. coli e uma sequência obtida a partir da - região 10 de um promotor do operão da lactose de E. coli. O promotor tac é conhecido por ter elevada actividade de promotor. Um promotor com pelo menos um ácido nucleico seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 4, 5, 6 e 7, tem uma actividade mais elevada em bactérias do género Corynebacterium que o promotor tac. Em particular, um promotor com pelo menos um ácido nucleico seleccionado a partir da SEQ ID NOS: 1 e 4 tem uma actividade 10 vezes maior do que o promotor tac das bactérias do género Corynebacterium. 4 0 promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção possui actividade promotora em bactérias do género Esherichia, em adição ao às bactérias do género Corynebacterium.

As células nas quais o promotor da presente invenção podem funcionar podem ser qualquer género de bactéria Corynebacterium. Exemplos de bactérias do género Corynebacterium incluem Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e ATCC 6871, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e ATCC 13060, e semelhantes. No entanto, as bactérias do género Corynebacterium não se limitam aos mesmos. Exemplos de bactérias do género Esherichia género nas quais um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção podem funcionar, incluem E. coli. A sequência do promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção pode ser facilmente alterada, por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica por meio de um processo de mutagénese conhecidas, tais como a evolução dirigida e mutagénese dirigida ao local. Por conseguinte, um ácido nucleico que possui, por exemplo, 70% ou mais de homologia, preferivelmente 80% ou mais de homologia, e, mais preferivelmente, 90% ou mais de homologia com a sequência promotora isolada incluindo pelo menos um ácido nucleico seleccionado a partir da SEQ ID NO: 4, e pode actuar como um promotor no género de bactérias Corynebacterium está incluido no âmbito da presente invenção. A presente invenção também proporciona uma cassete de expressão incluindo o promotor que está operativamente ligado a uma sequência de codificação. A sequência de 5 codificação pode ser, por exemplo, todo o gene ou uma sequência de codificação que codifica uma região pré-determinada do gene. Aqui, o termo "operativamente ligado" indica que a sequência de codificação é funcionalmente ligado ao promotor de modo a que a sequência do promotor pode iniciar ou mediar a transcrição da sequência de codificação. A cassete de acordo com uma forma de realização da presente invenção pode ainda incluir 5' e 3' sequências de controlo operativamente ligadas à sequência promotora. A sequência de codificação pode ser um gene associado com um produto metabólico, tal como IMP, GMP, L-lisina e L-treonina. A presente invenção também proporciona um vector incluindo a cassete de expressão de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Nisto, o vector não é limitado, e pode ser qualquer vector conhecido na técnica. Exemplos do vector de acordo com formas de realização da presente invenção incluem um vector pCR2.1-T0P0 (produzido pela Invitrogen Inc. , EUA) e pECCGH7 (KFCC-10673) . No entanto, o vector não é limitado aos mesmos. Exemplos do vector incluindo a cassete de expressão de acordo com uma forma de realização da presente invenção incluem pll7-cjl-gfp, pll7-cj2-gfp, pll7-cj3-gfp, pll7-cj4-gfp, pll7-cj5-gfp, pll7-cj6 -gfp e pll7-cj7-gfp. A presente invenção também proporciona uma célula hospedeira incluindo o vector de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A célula hospedeira pode ser um género de bactérias Corynebacterium ou um género de bactérias Esherichia, mas não está limitado a eles. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) ou E. coli. 6 A presente invenção também fornece um método de expressar um gene exógeno por cultura da célula hospedeira. A célula hospedeira é cultivada em um de vários meios de cultura conhecidos e sob diversas condições de cultura conhecidos de acordo com a célula hospedeira seleccionada.

EFEITOS VANTAJOSOS

Um gene que está operativamente ligado a um promotor de acordo com a presente invenção é eficientemente expresso em E. coli e Corynebacterium ammoniagenes. 0 promotor é adequado para o desenvolvimento de uma estirpe usando bactérias género Corynebacterium.

Uma cassete de expressão, incluindo o promotor de acordo com a presente invenção, e um vector incluindo a cassete de expressão de acordo com a presente invenção são adequados para a expressão de um gene exógeno de forma eficiente em E coli e Corynebacterium ammoniagenes.

Uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção podem expressar eficazmente um gene exógeno.

Ao usar um método de expressar um gene de acordo com a presente invenção, um gene exógeno pode ser eficientemente expresso.

MELHOR MODO A presente invenção será descrita em maior detalhe com referência aos exemplos seguintes. Estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção. 7

Exemplos

Extratos bacterianas foram preparadas a partir de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (CCCM-10330) em vários estágios culturais. Electroforese bi-dimensional foi realizada nos extractos bacterianos para encontrar proteínas sobrexpressas neles existentes, que foram depois clivados para analisar sequências peptidicas. As sequências peptidicas obtidas foram utilizadas para identificar os genes das proteínas sobrexpressas. Em seguida, as regiões de promotor foram isolados, e os vectores foram produzidos utilizando as regiões promotoras. Em seguida, foram medidas as actividades do promotor em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e E. coli.

Exemplo 1: A cultura de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e de selecção da proteína sobrexpressa de acordo com as fases culturais (1) A cultura de bactérias

Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) foram cultivadas num meio que tem de melaço de açúcar em bruto (mistura contendo 50% de glicose e 50% de frutose) . Neste tempo, foi medida a concentração de células. Amostras da cultura de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) foram colhidas na fase estacionária precoce e fases estacionárias. As amostras foram centrifugadas e a solução resultante superior foi removida. O sedimento celular obtido foi lisado num tampão de desintegração para produzir cerca de 100 pm de um extracto bacteriano. (2) Ensaio de Eletroforese Bidimensional 0 extracto bacteriano obtido a partir da secção (1), foi diluído com 6M de ureia, 2M de tioureia, 4% CHAPS, e 0,4% de DTT, para obter uma mistura com um volume total de 350 μΐ. Em seguida, 7 μΐ de um tampão IPG e 3 μΐ de 1% de azul de bromofenol (BPB) foram-lhe adicionados. A solução resultante foi carregada numa bandeja de re-hidratação utilizando um gradiente Immobiline de pH de decapagem. A amostra no tabuleiro de re-hidratação foi coberta com 2 ml de um líquido de cobertura para impedir a evaporação da amostra e a cristalização da ureia, e, em seguida, re-hidratada à temperatura ambiente durante cerca de 24 horas. A tira re-hidratada de gel foi submetida a focalização isoelétrica a 20°C a 0-100 V, durante 1 hora, a 300 V durante 1 hora, a 600 V durante 1 hora, e em 8000 V por um período de tempo predeterminado, o qual foi ajustado para executar a focalização para 43-97 kVhr (pH 4-7: 43,4 kVhr, pH 4,5-5,5, pH 5,5-6,7: kVhr 97) utilizando um dispositivo de focagem isoeléctrica (Multiphor II: produzido pela Amersham Bioscience, EUA).

Quando a focagem isoeléctrica foi completada, as respectivas tiras de gel foram equilibradas numa solução de pH de 8,8 contendo 20 mM de Tris-HCl, 6M de ureia, 2% de SDS, 20% glicerol, 2,5% de acrilamida e 5 mM de TBP durante 15 minutos. As respectivas tiras equilibradas foram carregadas num gel bidimensional (9-16% de gradiente de concentração)) e depois selados com uma solução de SDS, contendo 0,5% de agarose com um baixo ponto de ebulição e 0,001% de BPB. A electroforese foi realizada a 100 V durante cerca de 19 horas.

Após a electroforese estar completa, o gel foi imobilizado numa solução de 45% de metanol e 5% de solução de ácido 9 acético. 0 ácido acético foi lavado durante 1 hora com água destilada. 0 gel foi sintetizado com 0,02% de tiossulfato de sódio, durante 2 minutos e lavadas com água destilada. Em seguida, o gel foi feito reagir com 0,1% de nitrato de prata durante 20 minutos e lavado com água destilada. O produto de reacção foi desenvolvido com uma solução contendo 2% (w/v) de carbonato de sódio e 0,04% (v/v) de formaldeido. Quando uma mancha com uma resistência desejada apareceu, a reacção foi parada utilizando 1% de ácido acético. 0 gel foi lavado com água destilada e armazenado num saco de plástico fechado a 4°C.

Quando a coloração coomassie é utilizada, após a electroforese estar completa, o gel foi fixado através de uma solução de 30% de metanol e uma solução de 10% de ácido acético durante 1 hora, lavada com água destilada, coradas com Coomassie coloidal brilhante G-250 24 horas, e, em seguida, branqueadas com uma solução de metanol a 10% e uma solução de 7% de ácido acético, durante 4 horas. (3) Preparação de amostra de péptido utilizada para a espectrometria de massa com base em pontos O péptido foi separado a partir de pontos, usando uma versão modificada de um método conhecido (Shevchenko et ai. Anal. Chem., 68 (5), 850-8, 1996.)

Em primeiro lugar, uma mancha de proteína foi clivada a partir do gel preparado na Secção (2), branqueada em 120 μΐ de uma solução mista de 30 mM de ferricianeto de potássio e 100 mM de tiossulfato de sódio a uma razão de 1:1, e lavado com água destilada e, em seguida, com 120 μΐ de 50% de acetonitrila/25 mM de bicarbonato de amónio (pH 7,8) durante 10 minutos. O produto resultante foi feito reagir 10 com 50 μΐ de 100% de acetonitrilo até que a cor branca tenha aparecido durante cerca de 5 minutos e, em seguida, seco sob vácuo. 10 μΐ de tripsina de grau de electroforese bidimensional (0,02 pg/μΐ) foi adicionado aos pontos secos e, em seguida, feito reagir em gelo durante 45 minutos. Em seguida, a 50 mM de um tampão de bicarbonato de amónio (pH 7,8) foi adicionado ao produto de reacção e reagiu a 37° C durante 12-14 horas. 0 produto resultante foi tratado três vezes com ondas de ultra-sons durante 10 minutos em 10 μΐ de 0,5% de TFA e 50% de acetonitrilo para extrair um péptido. (4) Espectrometria de Massa O péptido extraido como descrito acima foi testado através de HPLC-MS/MS. O HPLC-MS/MS foi realizada com 1100 série de sistema HPLC (produzidos pela Agilient Inc, EUA) e um dispositivo de espectrometria de massa de barreira iónica Finnigan LCQ Deca (produzido por ThermoQuest, EUA), na qual uma fonte de pulverização ionizada nano foi instalada. O HPLC foi realizado com uma de coluna de fase reversa microssonda C18, 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e solução (solvente B) de 90% (v/v) de acetonitrilo e 0,1% de ácido fórmico foi fornecida num grau linear (taxa de fluxo = 1 μΐ/min) para isolar um péptido. A detecção de péptidos foi realizada três vezes usando nano ionização de pulverização (NSI) (tensão de pulverização: 1,8 kV, temperatura capilar: 200 °C; tensão capilar: 34 V; compensar lente do tubo: 40 V, e multiplicador de elétrons: -60 V) . As medições foram obtidas no modo de centróide. Depois de todo o MS de varredura de 400-2000 Da foi obtido um valor limite foi definido para lxlO5 conta e os ions 11 mais fortes foram separados através de uma varredura de zoom de alta resolução. Em seguida, a dissociação induzida por colisão (CID) de MS/MS foi realizada. A sequência de um espectro CID que não foi codificada foi identificada usando o software TurboQuest (produzido pela Thermo Finnigan Inc, EUA) . Os resultados de uma pesquisa SEQUEST foram identificados através de correlação cruzada e ACn (delta de correlação normalizado). A sequência de um aminoácido do péptido foi confirmada e identificada usando Q-estrela Pulsar LC MS/MS (produzido pela Applied Biosystems Inc., EUA).

Como resultado, 50 proteínas foram encontradas, e foram seleccionadas sete proteínas sobrexpressas das 50 proteínas FIG. 1 mostra os resultados de dois ensaios de electroforese dimensional de uma amostra extraída a partir de uma Corynebacterium ammoniagenes, em que os resultados do ensaio foram corados com prata e desenvolvido para identificação. Na FIG. 1, sete pontos sobrexpressos denotados por CJ1 através CJ7 foram identificados. As funções destas sete proteínas sobrexpressas foram indicadas na Tabela 1. As funções destas proteínas foram identificadas através da comparação da sequência do peptídeo a uma sequência de aminoácidos contida na base de dados do banco de genes NCBI.

Tabela 1

Nome de local Proteína Acesso Banco de gene N° Proteína de choque térmico hsp60 AE 008903.1 5-carboxi-desidrogenase semialdeído metil-2-hidroximuconato NC-006461.1 12

Homoprotocateculate 2,3-dioxigenase NC-005835.1 Tradução temporária extensão fator EF-Tu YP-145957 Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato AAA69094 cisteina sintase AAV89445 Manganês superóxido dismutase NP-940564 A sequência de gene foi assumida a partir das sete proteínas sobrexpressas e analisadas para seleccionar uma região promotora. Como resultado, verificou-se que os oligonucleótidos da SEQ. ID NOS: 1 a 7 separadas a partir da sequência do gene que corresponde às proteínas designadas por CJ1 de CJ7 têm actividade promotora.

Exemplo 2: Fabrico de vector recombinante P117 CJl~7-gfp ter sequência promotora e confirmação da actividade promotora em Corynebacterium ammoniagenes (1) Amplificação da sequência promotora a partir do genoma de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 500 pg de ADN cromossómico foi separado a partir de 25ml de cultura CJHB100 de Corynebacterium ammoniagenes incubadas durante um dia, utilizando um método sugerido por Eikmann et al. (Gene, 102, 93-98, 1991). O ADN cromossómico separado foi usado como molde. PCRs foram realizadas utilizando os primeiros conjuntos (SEQ ID: 10 e 11, 12 e 13, 14 e 15, 16 e 17, 18 e 19, 20 e 21, e 22 e 23) para amplificar promotores de CJ1 a CJ7 por 30 segundos a 94°C, a 55°C, e a 72°C. foi repetida 30 vezes, respectivamente. Como resultado, as respectivas sequências promotoras pcj1 a pcj7 foram amplificadas. 13 (2) Fabrico de vector de rastreio

Em primeiro lugar, as PCRs foram realizadas utilizando um vector pGFuv (produzido por Clontech Inc, EUA) como um molde e utilizando a SEQ ID NOS: 8 e 9, tal como um iniciador a 94°C durante 30 segundos, e a 55°C durante 30 segundos e a 72°C durante um minuto, respectivamente. O PCR foi realizado 30 vezes a cada temperatura. Como resultado, um gene da proteina verde fluorescente (GFP), que não inclui uma região promotora foi amplificada. Em seguida, o gene da GFP obtido, que não inclui uma região promotora foi clonado para os Vectores pCR2.1-TOPO (produzidos pela Invitrogen, EUA), que foram então clivados por PstI e EcoRI e introduzidos em PstI e EcoRI de pECCG117 (KFCC-10673/KFCC-l 0674), que é um vector de transporte e pode ser expresso em E. coli e bactéria corinformes. O resultado foi usado como um vector de rastreio (P117-GFP) para separar o promotor. A FIG. 2 ilustra um método para produzir o vector de rastreio de P117-GFP de acordo com uma forma de realização da presente invenção (3) a introdução de sequência promotora para vector de rastreio e identificação da actividade promotora em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 O vector de rastreio obtido na Secção (2), foi clivado com uma enzima de restrição Kpn/EcoRV e em seguida ligado às sequências promotoras de pcj 1 até pcj7 que tinha sido clivada pela mesma enzima de restrição para produzir vectores recombinantes de P117-Cj1-7-GFP em que os oligonucleótidos de pcj 1 até pcj7, que foram separados a partir de Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 e assumiram a actividade promotora, foram ligados ao GFP. A FIG. 3 ilustra um método para produzir um vector recombinante 14 incluindo SEQ. NOS ID: pcjl até pcj7 a partir do vector de rastreio P117-GFP de acordo com uma forma de realização da presente invenção. 0 vector recombinante obtido foi introduzido em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (CCCM-10330) pronto para a transformação através de um método introduzido por van der Resto et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999) . A estirpe transformada resultante foi espalhada sobre um meio CM (1% de peptona, 1% de caldo de carne, 0,25%de cloreto de sódio, 1% de extracto de levedura, 100 mg/ml de adenina, 100 mg/ml de guanina, 2% de ágar (pH 7,2)) contendo 10 pg/ml de canamicina e disposto em cultura a 32°C durante 3 dias. Uma estirpe viável apresentando um crescimento foi exibida a partir das colónias. Em seguida, a luz ultravioleta foi irradiada na estirpe filtrada e estirpes que irradiam fluorescência foram seleccionadas.

Rastreio de estirpes que irradiam uma fluorescência indica que os promotores de PCJ a pcj7 exibem actividade promotora numa bactéria corineforme.

Enquanto isso, a actividade promotora foi quantitativamente medida. O vector recombinante de P117-CJ1-7-GFP foi introduzido em Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) e cultivado da mesma maneira como descrito acima. A cultura foi centrifugada para obter pelete bacteriana. Em seguida, a pelete bacteriana foi suspensa em tampão de extracto de proteina (EDTA a 1 mM de PBS, 3% de glicerol, 1% de solução de triton-X-100, pH 7,5) foram lisadas através de ultra-sons. O lisado foi centrifugado e a solução resultante contendo um extracto bacteriano superior foi separada. A quantidade de proteina contida no extracto bacteriano foi medida através de um método de ensaio de 15

Bradford. Subsequentemente, 488 nm de luz foi irradiada sobre um extracto bacteriano de quantia igual ao extracto bacteriano descrito acima, utilizando um método introduzido por Laure Gory et al. (FEMS Microbiology Letters 194, 127-133, 2001) e a luz emitida foi medida utilizando um espectrofotómetro LS-50B (Perkin-Elmer) para encontrar um grau de expressão do gene da GFP e verificou-se ter um comprimento de onda de 511 nm.

Os resultados são apresentados na Tabela 2. Como mostrado na Tabela 2, o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção dirige uma expressão eficiente de um gene GFP. Mais particularmente, os promotores de pcj 1 e pcj4 exibiram a mais alta eficiência em comparação com os outros promotores.

Tabela 2

Promotor pcjl pcj 2 pcj 3 Pcj 4 pcj 5 pcj 6 pcj 7 12309 437 479 11790 1363 5651 2493

Exemplo 3: Comparação das actividades do promotor tac e o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção, em Corynebacterium ammoniagenes

Na presente experiência, foram comparadas as actividades de um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção e um promotor tac, que é convencionalmente usado em Corynebacterium ammoniagenes. (1) Produção de vector contendo sequência de promotora de tac e gene GFP combinado

Em primeiro lugar, a técnica de PCR foi realizada utilizando um vector pKK223-2 (produzido pela Pharmacia 16

Biotech, EUA) como um molde e utilizando SEQ ID NOS: 24 e 25 como um iniciador da mesma maneira como no Exemplo 1 para amplificar a sequência promotora de tac. 0 produto amplificado foi clonado num vector pCR2.1-T0P0 (Invitrogen, EUA) . Em seguida, a sequência do promotor tac obtido foi clivado com as enzimas de restrição Kpn1 e EcoRV e ligou-se a P117-gfp, que tinha sido clivada com as mesmas enzimas de restrição para se obter um vector de expressão recombinante (pll7-tac-gfp.) 0 vector recombinante foi usado para transformar a Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 da mesma maneira que no Exemplo 1, e a actividade de um gene da GFP foi medido. A actividade do gene da GFP devido ao tac promotor foi comparada com a actividade do gene da GFP devido ao promotor seleccionado de acordo com o Exemplo 2. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Promotor pcj 1 pcj 2 pcj 3 pcj 4 pcj 5 pcj 6 pcj 7 Ptac 1140% 40% 44% 1092% 126% 523% 231% 100%

Como mostrado na Tabela 3, verificou-se que um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção expressou eficientemente um gene GFP. Além disso, quando a actividade dos promotores de acordo com uma forma de realização da presente invenção, em Corynebacterium ammoniagenes é comparada com a actividade do promotor tac em Corynebacterium ammoniagenes, os promotores pcjl, pcj4, pcj5, pcj 6 e pcj 7 exibiram intensidades mais elevadas do que o promotor tac. Em particular, os promotores de pcjl pcj4 e exibiu 10 vezes a actividade do promotor tac. 17

Exemplo 4: Confirmação da actividade do promotor de acordo com o presente invento em E. coli

Verificou-se que o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção exibiram actividade em E. coli, em adição às bactérias corineformes. E. coli foi transformada com o vector de expressão recombinante usado nos Exemplos 1 e 2.

Determinou-se se o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção permite que a expressão eficiente do gene da GFP em E. coli através da medição da actividade do gene da GFP, da mesma maneira que no Exemplo 1. Um vector de referência era um promotor contendo um vector recombinante de P117-tac tac-GFP. A Tabela 4 mostra a actividade do promotor de promotores de acordo com concretizações do presente invento em E. coli.

Tabela 4

Promotor pcj 1 pcj 2 pcj 3 pcj 4 pcj 5 pcj 6 pcj 7 ptac 296% 15% 20% 17% 19% 24% 24% 100%

Como mostrado na Tabela 4, verificou-se que o promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção expressa eficientemente o gene da GFP em E.coli. Mais particularmente, o promotor pcj1 exibiu elevada actividade em ambos Coryneform bactéria e E. coli.

Exemplo 5: Efeitos de IPTG na actividade promotora de acordo com a presente invenção É bem conhecido que um promotor tac é um promotor representativo pela qual a expressão do gene é induzida por IPTG (isopropiltio^-D-galactósido) em E.coli. Por outras 18 palavras, em E. coli, a quantidade de um gene expresso pelo promotor tac varia de acordo com a presença ou ausência de IPTG.

Na presente experiência, os efeitos de IPTG na expressão de um gene GFP por um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção foram medidos. Para este fim, um vector recombinante contendo o promotor pcj 1 que tem uma actividade mais elevada do que os outros promotores de P117-CJ1-GFP foi introduzido no E. coli e

Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) da mesma forma que nos Exemplos 1 e 2, e mediu-se a quantidade do gene GFP assim expresso. A referência era um promotor contendo vector recombinante P117-tac tac-GFP.

Os resultados são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5 Célula hospedeira Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 E E.coli Indução Indução Sem indução Indução Sem IPTG IPTG indução Promotor ptac Pcj 1 ptac Pcj 1 pta c pcj 1 ptac Intensidade 2089 5530 1959 5048 648 7165 2314 Fluorescência 0

Como se mostra no Quadro 5, um promotor de acordo com uma forma de realização da presente invenção de forma mais eficiente expressa um gene da GFP em E. coli e

Corynebacterium ammoniagenes que um promotor tac, independentemente da presença de IPTG.

Os promotores de pCJl, pCJ2, pCJ3, pCJ4, pCJ5, pCJ6 e pCJ7 obtidos nos Exemplos acima descritos foram inseridos em 19 pECCG117. Os vectores obtidos foram usados para transformar E. coli DH5. Os transformantes resultantes foram depositados no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (CCCM), que é uma organização internacional de deposição nos termos do Tratado de Budapeste, em 11 de Junho de 2004 (números de deposição: KCCM-10611, KCCM-10612, KCCM-10613, KCCM-10614, CCCM-10615, CCCM-10616 e CCCM-10617) . <110> CJ Corporation <120> Novo ácido nucleico promotor derivado de bactérias do género Corynebacterium, a cassete de expressão compreendendo o promotor e o vector que compreende a cassete, a célula hospedeira compreendendo o vector e um método para a expressão de um gene usando a célula. <130> PN05941 <160> 24

<170> Kopatentln 1.71 <210> 1 <211> 301 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 1 caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60 gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120 caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180 gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240 tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 300 a 301 20 <210> 2

<211> 285 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 2 aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg 60 atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag 120 cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag 180 atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc 240 aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca 285 <210> 3 <211> 291

<212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 3 gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa 60 gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc 120 gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac 180 caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc 240 aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c 291 <210> 4 <211> 312

<212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 4 actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg 60 ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg 120 cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt 180 21 gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct 240 caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca 300 ggaggacata ca 312

<210> 5 <211> 249 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 5 tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa 60 ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc 120 gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct 180 ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag 240 acaactacc 249 <210> 6 <211> 332

<212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 <400> 6 ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt 60 aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta 120 acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca 180 cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct 240 gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc 300 aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc 332 <210> 7 <211> 318

<212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes CJHB100 22 <400> 7 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 8 <211> 31

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 8

acgcgatatc atgagtaaag gagaagatct t 31 <210> 9 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 9 aaaactgcag ttatttgtag agctcatcca t 31 <210> 10 <211> 32 23

<212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 10 cggggtacca ccgcgggctt attccattac at 32 <210> 11 <211> 32 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 11 acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc 32 <210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 12 cggggtacca attccaccag acgttgttta gta 33 <210> 13 24 <211> 32 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 13 acgcgatatc tgtgcactcc ttgttcttcg tg 32 <210> 14 <211> 33 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 14 cggggtaccg ctgcctacat ctggacttct gac 33 <210> 15 <211> 31 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 15 acgcgatatc gatgactcct agtgaggtta a 31 25 <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 16 cggggtacca ctgggagggt aggggtcac 29 <210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 17 acgcgatatc tgtatgtcct cctggacttc 30 <210> 18 <211> 32 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 18 26 cggggtacct cggacatata cggatttacc tg 32 <210> 19 <211> 31 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 19 acgcgatatc gttgtctcct aaaaagttgg g 31 <210> 20 <211> 25 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 20 cggggtaccg gcttcatcgt cgtct 25 <210> 21 <211> 30 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador 27 <4Ο0> 21 acgcgatatc atggcctcct cttaatagac 30 <210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 22 cggggtacca gaaacatccc agcgctacta ata 33 <210> 23 <211> 29 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> iniciador <400> 23 acgcgatatc agtgtttcct ttcgttggg 29 <210> 24 <211> 29 <212> ADN <213> <22 0> Sequência Artificial 28 <223> iniciador <400> 24 cggggyaccc ggagcttatc gactgcacg 29 25-06-2013 29

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um promotor que compreende um polinucleótido da SEQ ID NO: 4.
2. Uma cassete de expressão, que compreende o promotor da reivindicação 1 e está ligado operativamente a uma sequência de codificação.
3. Um vector que compreende a cassete de expressão da reivindicação 2.
4. Uma célula hospedeira compreendendo o vector da reivindicação 3.
5. A célula hospedeira da reivindicação 4 que é uma célula bacteriana que pertence a um qénero Corynebacterium ou um género Esherichia.
6. Um método de expressar um gene exógeno compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 4 ou reivindicação 5. 25-06-2013