JP7829285B2

JP7829285B2 - グリセロール生成が抑制された組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法

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Publication number: JP7829285B2
Application number: JP2021069130A
Authority: JP
Inventors: パクチェ・ヨン; リーキ・スン; リーテ・ヨン
Original assignee: SK Innovation Co Ltd
Current assignee: SK Innovation Co Ltd
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2026-03-13
Anticipated expiration: 2041-04-15
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Description

KCTC

KCTC 13508BP

本発明は、乳酸生成能を有するとともに、グリセロール生成が抑制された組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関し、より詳細には、乳酸生成に関与する遺伝子が導入され、グリセロール生成に関与する遺伝子が欠失又は弱化した組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関する。

ＰＬＡ（ＰｏｌｙｌａｃｔｉｃＡｃｉｄ）は、乳酸（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）をラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）に転換し、これを開環重合して作る生分解性ポリマーであり、その原料である乳酸発酵によって生産している。ＰＬＡは、使い捨て食品容器に広範囲に利用可能であり、単独或いは組成物や共重合体の形態で自動車、繊維産業を含む様々な産業的プラスチックとしても使用可能な強度を持っている。また、最近では３Ｄプリンティングにも用いられる代表的なポリマーであり、特に、３Ｄプリンタ使用時に有害ガス発生及び臭い発生が少ない、環境にやさしいポリマーである。

伝統的な乳酸生産工程は、乳酸菌を用いて生産するが、乳酸菌によって生成される乳酸の蓄積によって酸による菌株死滅或いは成長止めが発生することを防止するために、様々な形態のＣａ塩／Ｍｇ塩又はアンモニアのような中和剤を用いて、ｐＨを中性ｐＨである６～８に合わせながら発酵を行う。発酵が終了すると微生物を分離するが、塩（ｓａｌｔ）形態では水での分離及びラクチド転換が難しいため、硫酸を添加してラクテートを乳酸に転換させながらＣａ塩はＣａＳＯ_４の形態で除去する。このような過程は、乳酸よりも多い量の副産物であるＣａＳＯ_４を発生させ、工程経済性の低下を招く。

ＰＬＡは、発酵を用いて乳酸を生産した後、生産された乳酸を精製工程を経てラクチドに転換する工程が一般的である。ラクチド転換のためには、乳酸を水素化された形（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄｆｏｒｍ）に転換する工程が必要であり、通常の中性発酵へのｐＨは６～７である点から、多量の硫酸を用いて酸性ｐＨに転換する。この過程で多量の中和塩が発生し、このような中和塩を除去するための工程投資費及び中和塩の低い価値により、経済性が低下する。

一方、乳酸は、Ｌ型とＤ型の光学異性質体を有する。Ｌ型を主に生産する乳酸菌でも約５～１０％のＤ型を共に生産する場合が多く、Ｄ型を主に生産する菌株は、Ｄ型とＬ型を共に生産する形態及びＤ型とエタノールを共に生産する形態で存在するなど、多くの多様性を有する微生物群がある（非特許文献１）。

一方、自然系で乳酸を生産するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の場合、乳酸を商業的レベルに生産するためには、多量の高価栄養分（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）を培地として使用しなければならず、このような過量の栄養成分は、後段工程の重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）工程或いはラクチドを中間体とする場合にはラクチド転換工程に大きな阻害を与え、高収率、高純度のポリマー又はその前駆体を得るためには、吸着、蒸留、イオン交換のような精製工程費用がかかり、同様に、高い生産費用の原因となる。このような問題を解決するための方法として、酵母（Ｙｅａｓｔ）を用いた研究が提示されている。酵母の場合、安価の栄養分を使用しても円滑に成長／発酵するものと知られており、酸性における耐性も高いと知られている。

酸性においてよく育つ酵母（以下、耐酸性酵母）を用いて乳酸を生産する場合、発酵時に中和剤を用いて培地をｐＨ６～７に保つ必要がないので、発酵工程が単純となり、且つ後で中和剤を除去する精製工程が不要である。また、酵母は、代謝に必要な多くの成分を自ら作るため、細菌、特に、ラクトバシラスに比べて比較的栄養レベルの低い培地でも培養可能であり、多くの後段の精製工程を省くことができ、生産単価を大幅に下げることができる。

しかしながら、酵母を用いる乳酸生産技術には前提条件があるが、それは、商業化に適用するためには菌株発酵性能指標である収率、生産性、乳酸の濃度が、乳酸菌の性能に類似するレベルに高く維持される必要があるということである。

酵母を用いた耐酸性乳酸技術の開発が試みられているが、実際には、発酵中に中和反応を利用して、ｐＨを乳酸のｐＫａ値以上である３．７以上に維持しつつ発酵をしてこそ高性能の発酵能が得られる場合が多いため、実質的に耐酸性技術とは言い難く、工程における生産費節減の効果も得難い（非特許文献２）。

したがって、工程費用が節減できる耐酸性酵母は、中和剤を使用しないか或いは最小量で使用しながらｐＨがｐＫａ値以下の発酵液で発酵を終える必要があり、発酵の３代指標を乳酸菌と類似するレベルにしてこそ商業的適用の意味がある。

一般の酵母は、グルコースを発酵するとエタノールを主に生産し、主副産物としてはグリセロールを生産し、乳酸を生産する場合はごく稀である。また、高い耐酸性を持つ微生物から乳酸を生産する菌株を選択する確率が非常に低いため、本発明者らは、耐酸性に優れた酵母菌株を選別し、選別された菌株を遺伝工学的な方法により、乳酸生産能を有するとともに、エタノール及びグリセロールの生成能が抑制された菌株を製造しようとした。

そこで、本発明者らは、乳酸生産能を有するとともに、グリセロール生成能が抑制された耐酸性菌株を製造しようと鋭意努力した結果、耐酸性酵母からグリセロール生成に関与する遺伝子を除去し、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに導入した組換え菌株を製作し、前記組換え菌株を用いて乳酸を製造する場合、組換え酵母を用いた乳酸生産において不純物として作用するグリセロールの生成が減少することを確認し、本発明を完成するに至った。

ＥｌｌｅｎＩ．Ｇａｒｖｉｅ，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，１０６－１３９，１９８０ＭｉｃｈａｅｌＳａｕｅｒｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ，２７：２２９－２５６，２０１０

本発明の目的は、乳酸生成能を有する組換え耐酸性酵母菌株においてグリセロール生成能が減少した組換え菌株を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組換え耐酸性酵母を用いて乳酸を製造する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記耐酸性酵母由来のジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株を提供する。

本発明はまた、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株を提供する。

本発明はまた、（ａ）前記組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階を含む乳酸の製造方法を提供する。

本発明はまた、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。

本発明はまた、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上の相同性を有するタンパク質を提供する。

本発明はまた、配列番号４又は配列番号５で表示される塩基配列を有するｇ１５４４遺伝子のプロモーターを提供する。

本発明に係る組換え耐酸性酵母を用いて乳酸を生産する場合、乳酸生成能は維持されながら、グリセロール生成が減少するため、乳酸精製過程でラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）転換のためのオリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）反応においてグリセロールによる架橋を抑制させることができ、乳酸のラクチドへの転換収率を高めることができる。

本発明においてＹＢＣ４菌株のゲノムからＧＰＤ１（ｇ１５４４）／ＧＰＤ２（ｇ５６１７）遺伝子を削除したり、或いは当該遺伝子を削除してＬＤＨ遺伝子を挿入するために用いた削除カセットの一例を示す図である。本発明に係る組換え酵母菌株であるＹＢＣ５菌株の発酵プロファイルを示す図である。

別に断らない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で用いられる命名法は、本技術分野によく知られており、通常用いられるものである。

耐酸性酵母は、酸性ｐＨにおいても糖を速い速度で消耗し、高い成長率を示し、発酵条件では、消耗した糖を産物に転換する特徴を有する。本発明者らの先行研究では、このような特徴を有する酵母として、多くの酵母ライブラリーから耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）を選別し、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）は、乳酸濃度が４０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌである条件でも高い成長性及び糖消耗速度を示す菌株である。前記耐酸性酵母ＹＢＣ菌株を対象にして乳酸生成能を上げ、エタノール生成能を下げるための代謝回路調節を行うことにより、ＹＢＣ菌株からアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株からラクテートをピルべートに転換するシトクロムｂ２酵素をコードする遺伝子を欠失させて組換え菌株を作製し、該作製された菌株においてグリセロール生成を抑制するために、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール３－リン酸に転換するグリセロール３ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失した組換え菌株を作製し、この組換え菌株が高い乳酸生成能を有する上に、エタノール生成能及びグリセロール生成能も抑制されることを確認した。

また、低減したグリセロールによる余分の炭素は、他の副産物に分散される場合もあるが、これを乳酸に転換させることができる場合（例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼの強化）にさらに乳酸生成収率を増加させることができるポテンシャルもある。

したがって、本発明は、一観点において、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンホスフェートをグリセロール－３－ホスフェートに転換する酵素をコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株に関する。

一般に、グリセロールは酵母類の主要副産物であり、細胞内での役目は、エタノールやラクテートの生産時に発生する細胞内部のＮＡＤ／ＮＡＤＨのバランスを調節する酸化還元バランス（ｒｅｄｏｘｂａｌａｎｃｅ）であり、細胞外部の水分活性度の減少時に発生する浸透圧による細胞内の水損失を抑制する役目を担い、また、主要エネルギー貯蔵庫であるトリグリセリドの前駆体であるグリセロール３ホスフェートの前駆体の役目も担当している（ＲｏｅｌａｎｄＣｏｓｔｅｎｏｂｌｅｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ１６：１４８３－１４９５，２０００；ＥｌｋｅＮｅｖｏｉｇｔａｎｄＵｌｆＳｔａｈｌ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ２１：２３１，１９９７）

酵母においてグリセロール生成反応を抑制するためには、グリセロール生成に直接関連した遺伝子を除去又は弱化させる方法と、浸透圧などの調節機序に関連した遺伝子を変形する方法が知られている。浸透圧などの調節機序に対しては、ＨＯＧ（Ｈｉｇｈ－ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙｇｌｙｃｅｒｏｌ）信号経路があり（ＪｏｓｅｐｈＰＤｅｘｔｅｒｅｔａｌ．，ＢＭＣＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ，９：１７，２０１５）、関連主要因子であるＳＳＫ１（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｐｈｏｓｐｈｏｒｅｌａｙｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｏｓｍｏｓｅｎｓｏｒａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒ）などの除去又は変形によってグリセロール生成を抑制できる方法も研究されている（Ｈｕｂｍａｎｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＢｉｏｆｕｅｌｓ，６：８７，２０１３，Ｈｕｂｍａｎｎｅｔａｌ．，ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１７：６８，２０１３）。

しかしながら、このような信号経路を変異によって調節する研究は、非常に多くの研究が必要であり、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のように特殊な菌株では各段階に対する検証が必要な点から、より一般的な方法であるグリセロールの生成に直接関連した遺伝子であるＧＰＤ（ＮＡＤ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とＧＰＰ（ＤＬ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を除去する方法を用いた。ＧＰＤ１は、酵母の耐浸透性を調節するための役割を主に担当し、ＧＰＤ２は、ＧＰＤ１のアイソフォームであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは嫌気状態で細胞の活動を調節するために発現する。また、グリセロール－３－リン酸をグリセロールに転換するためのＧＰＰ遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて２個がよく知られているが、ＧＰＰ１は嫌気条件で発現をし、ＧＰＰ２は浸透圧によって発現する。ＧＰＤとＧＰＰの各異性質体をそれぞれ除去する場合には、培養条件と該当の菌株によってグリセロール生成量に及ぼす影響が異なるため（ＲｏｅｌａｎｄＣｏｓｔｅｎｏｂｌｅｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ１６：１４８３，２０００；Ｊａｃｏｂｕｓａｌｂｅｒｔｙｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，４１３５，１９９４）、それぞれの影響を実験から確認することが最善の方法であると判断した。

本発明において、前記ジヒドロキシアセトンホスフェートをグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子がＧＰＤ１又はＧＰＤ２遺伝子であることを特徴とし、好ましくは、前記ジヒドロキシアセトンホスフェートをグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子はＧＰＤ１（ｇ１５４４）遺伝子であり、前記遺伝子は配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されることを特徴とし得る。

本発明の一様態では、ＹＢＣ菌株において、主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、前記ｇ４４２３位置にラクトバシラスプランタルム由来の配列番号１２のＬＤＨ遺伝子を導入し、ＣＹＢ２遺伝子であるｇ３００２遺伝子（以下、ｇ３００２－１遺伝子と称する。）を除去し、該ｇ３００２－１遺伝子の位置にＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ２と、組換え菌株ＹＢＣ２においてさらにｇ２９４７遺伝子を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ４を作製し、ＧＰＤ１遺伝子であるｇ１５４４遺伝子を除去した組換え菌株ＹＢＣ５菌株を作製し、これらの組換え菌株を培養させ、乳酸生成能が向上し、エタノール生産能が減少し、グリセロール生成が減少することを確認した。

本発明において、前記組換え菌株は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＡＤＨ遺伝子）がさらに欠失していることを特徴とし、前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はｇ４４２３遺伝子であることを特徴とし、前記ｇ４４２３遺伝子は、配列番号６又は配列番号７で表示されることを特徴とし得る。

本発明において、前記組換え菌株は、前記ＡＤＨ遺伝子に代えてＬＤＨ遺伝子がさらに導入されていることを特徴とし得る。

本発明において、前記組換え菌株は、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）がさらに欠失していることを特徴とし、前記ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はｇ３００２遺伝子であることを特徴とし、前記ｇ３００２遺伝子は、配列番号８又は配列番号９で表示されることを特徴とし得る。

本発明において、前記組換え菌株は、前記ＰＤＣ遺伝子に代えてＬＤＨ遺伝子がさらに導入されていることを特徴とし得る。

本発明において、前記組換え菌株は、ラクテートをピルべートに転換するシトクロムｂ２遺伝子（ＣＹＢ２遺伝子）がさらに欠失していることを特徴とし、前記シトクロムｂ２遺伝子をコードする遺伝子はｇ２９４７遺伝子であることを特徴とし、前記ｇ２９４７遺伝子は、配列番号１０又は配列番号１１で表示されることを特徴とし得る。

本発明において、前記組換え菌株は、前記ＣＹＢ２遺伝子に代えてＬＤＨ遺伝子がさらに導入されていることを特徴とし得る。

本発明において、前記組換え菌株は、前記ＧＰＤ１遺伝子に代えてＬＤＨ遺伝子がさらに導入されてもよい。

本発明において、前記ｇ１５４４遺伝子の欠失又は弱化によって、親菌株であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）に比べて、また親菌株由来の変異菌株であるＹＢＣ１／ＹＢＣ２／ＹＢＣ３／ＹＢＣ４菌株に比べて、グリセロール生成能が減少又は遮断されることを特徴とし得る。

本発明において、前記導入されるラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ＬＤＨ遺伝子、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ由来ＬＤＨ遺伝子又はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子であることが好ましく、より好ましくはＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子である。

本発明は、他の観点において、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）において、ジヒドロキシアセトンホスフェートをグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株に関する。

本発明において、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＣＹＢ２遺伝子、ＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子位置に導入され、前記欠失した遺伝子のプロモーターによって調節されることを特徴とし得る。

本発明の一様態では、ＹＢＣ５菌株（Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ／Δｇ１５４４）が、ＹＢＣ４菌株（Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ）に比べてグリセロール生産能が顕著に減少したことを確認した。しかし、グリセロールが完全に除去されたわけではないが、これはむしろ菌株の環境適応側面では非常に有利な点である。すなわち、グリセロール生産能力を完全に喪失した菌株は、グリセロールの本来の役目である外部浸透圧などのストレス環境で適用できる能力を喪失して非常に弱くなり、このような菌株は通常の商業スケールの圧力と塩濃度及び生産物阻害などのストレス環境に耐えられず、正常の発酵が行えなくなってしまう。したがって、当該発明の菌株は、目的とするグリセロールの低減を遂げた一方、それによる逆効果は有しない非常に優れた性能を示した。

したがって、本発明は、他の観点において、（ａ）前記組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階を含む乳酸の製造方法に関する。

本発明によれば、ラクテート生産が大きく増加し、エタノール生産が大きく減少する他、グリセロール副産物も大きく減少した優れた耐酸性菌株を確保することができる。

さらに他の観点において、本発明は、ヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関する。

本発明において、前記遺伝子は、ヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とし得る。

本発明において、前記遺伝子は、配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されることを特徴とし得る。

さらに他の観点において、本発明は、ジヒドロキシアセトンホスフェートをグリセロール－３－リン酸に転換する酵素に転換する酵素活性を有し、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上の相同性を有するタンパク質に関する。

本発明において、前記タンパク質は、ヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素活性を有し、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質であることを特徴とし得る。

さらに他の観点において、本発明は、配列番号４又は配列番号５で表示される塩基配列を有するＧＰＤ１遺伝子のプロモーターに関する。

本発明において、‘耐酸性酵母’とは、有機酸のｐＫａ値未満のｐＨにおいて、培地に有機酸が含まれていない場合に比べて、培地に１Ｍ以上の有機酸（特に、乳酸）が含まれている場合、少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の非生長率を維持できる酵母と定義する。より具体的に、本発明において、‘耐酸性酵母’とは、ｐＨ５以上の場合に比べて、ｐＨ２～４において少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の非生長率を維持できる酵母と定義する。

本発明に係る組換え酵母は、通常の方法によって前記遺伝子を宿主酵母の染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）上に挿入させたり、或いは前記遺伝子を含むベクターを宿主酵母に導入させることによって製造できる。

前記宿主酵母は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常用いられ、本発明の一実施例では耐酸性酵母を用いているが、これに限定されず、目的ＤＮＡが十分に発現するものであればいかなる種類の酵母でも構わない。

前記組換え酵母は、任意の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法によって製造できる。“形質転換”とは、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体の因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味し、通常の形質転換方法には電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＰＥＧ法などがある。

また、本発明において遺伝子を宿主微生物の染色体上に挿入する方法には、通常知られた任意の遺伝子操作方法を用いることができ、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクターなどを利用する方法がある。“ベクター”は、適当な宿主内でＤＮＡを発現させ得る適当な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは関係なく複製し機能してもよく、或いは、一部の場合にはゲノム自体に統合されてもよい。現在、プラスミドがベクターの最も一般に用いられる形態であり、また、線形化ＤＮＡ（ＬｉｎｅａｒｉｚｅｄＤＮＡ）も酵母のゲノム集積（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のために一般に使用する形態である。

典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりにプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜可能にする抗生剤耐性遺伝子又は栄養要求マーカー遺伝子（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃｍａｒｋｅｒｇｅｎｅ）、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片を挿入可能にする制限酵素切断部位を含む構造を有する。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができ（Ｇｉｂｓｏｎａｓｓｅｍｂｌｙ）、必要によっては、所望の全シーケンスを合成して使用する方法も通常用いられている。

なお、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合される時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合にポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合にコーディング配列に作動可能に連結される。

一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダの場合、接触しリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いる。

勿論、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現させる上で同等に機能を発揮するわけではなく、同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しで本発明の範囲から逸脱しない状態で、他の様々なベクター、発現調節配列及び宿主の中から適宜選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその宿主内で複製されなければならないためであり、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力、及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮される必要がある。

本発明において、炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、ガラクトース、グルコースオリゴマー及びグリセロールで構成された群から選ばれる一つ以上であることを特徴とし得るが、これに限定されない。

本発明において、培養は、微生物、例えば大腸菌などがそれ以上働かないように（例えば、代謝体生産不可能）する条件で行われてよい。例えば、培養は、ｐＨ１．０～６．５、好ましくはｐＨ１．０～６．０、より好ましくはｐＨ２．６～４．０であることを特徴とし得るが、これに限定されない。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１：耐酸性酵母菌株ＹＢＣのゲノム内のグリセロール生産遺伝子分析
本発明者らは、様々な酵母菌株に対するテストにより、耐酸性を有する菌株を選別し、酵母菌に対して乳酸を培養初期に培地に添加して微生物の成長及び糖消耗速度を確認しながら、耐酸性に最も優れた菌株であるＹＢＣ菌株を選定し、韓国生命工学研究院生物資源センターにＫＣＴＣ１３５０８ＢＰとして寄託したことがある。

系統分析から、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと類似な菌株であり、２倍体の遺伝子を有し（Ｄｉｐｌｏｉｄ）、クラブツリー陽性（Ｃｒａｂ－ｔｒｅｅｐｏｓｉｔｉｖｅ）特性があることを確認した。

ＹＢＣ菌株のゲノム全配列データから、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びバイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）情報を用いて、ＹＢＣ菌株のゲノムに存在するジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１（ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１）とアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）された遺伝子としてｇ１５４４を確認し、ＧＰＤ２とアノテーションされた遺伝子としてｇ５６１７を確認した。グリセロール３－リン酸をグリセロールに転換する酵素をコードするＧＰＰ遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムにおいて非常に相同性が類似な２個の遺伝子としてｇ４３５６及びｇ５４４３を確認し、現在の情報ではこれら２つの遺伝子の役目をＧＰＰ１とＧＰＰ２に区分し難く、ＧＰＰ１ｖ．１及びＧＰＰ１ｖ．２と名付けて使用した。

表１には、ＹＢＣとサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＰＤ１とＧＰＤ２のアミノ酸配列間の類似性を比較して示す。

そこで、ＧＰＤ１遺伝子（ｇ１５４４遺伝子）（配列番号１及び配列番号２）及びそのタンパク質（配列番号３）を対象にそれを除去できる削除カセット（ｄｅｌｅｔｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製し、ＧＰＤ２遺伝子（ｇ５６１７遺伝子）（配列番号１３及び配列番号１４）及びそのタンパク質（配列番号１５）を対象にそれを除去できる削除カセット（ｄｅｌｅｔｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製し、ＧＰＰ１遺伝子（ｖ．１；ｇ４３５６遺伝子）（配列番号１６及び配列番号１７）、ＧＰＰ１遺伝子（ｖ．２；ｇ５４４３遺伝子）（配列番号１９及び配列番号２０）及びこれらの各タンパク質（配列番号１８及び配列番号２１）に対してもそれを除去できる削除カセット（ｄｅｌｅｔｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。

本発明で用いた削除カセットは図１に示しており、該当の制限酵素部位又は抗生剤耐性遺伝子の選択及び抗生剤耐性遺伝子除去方式は、関連業界によく知られた方式であり、様々に変形して用いることができる。

一般に、グリセロールを生産する遺伝子のうち、ＧＰＤ１とＧＰＤ２を同時に除去する場合又はＧＰＰ１及びＧＰＰ２を同時に除去する場合は、菌株の生長及び外部環境に適応可能な役目が完全に遮断され、菌株が浸透圧などによって非常に敏感に変わるため発酵に不適切であることは周知の事実である。したがって、ＧＰＤ１又はＧＰＤ２を除去後にグリセロール低減が十分でない場合には、ＧＰＰ１ｖ１又はＧＰＰ１ｖ２をそれぞれのＧＰＤ１／２除去菌株からさらに除去し、グリセロールを低減しようとする戦略を確立した。

実施例２：ＧＰＤ遺伝子の発現量測定
ＹＢＣ菌株のＧＰＤ１（ｇ１５４４）とＧＰＤ２（ｇ５６１７）の発現量を確認するために、下記プライマーを用いてＡＬＧ９遺伝子をハウスキーピング（Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）遺伝子としてＲＴ－ｑＰＣＲを行った。本実施例で用いたＲＴ－ｑＰＣＲ方法では、ＹＢＣ菌株の代数増殖期にＲＮＡを抽出した後、これを鋳型としてｃＤＮＡを作製した。目的遺伝子（ＧＰＤ１及びＧＰＤ２）とハウスキーピング遺伝子（Ｒｅｆ遺伝子として使用）にそれぞれ特異的なプライマーを合成し、これを用いてｑＰＣＲを行った。実験に使用したＲｅｆ遺伝子はＡＬＧ９であり、使用したプライマーで増幅される断片の大きさは１４７３ｂｐである。

ＡＬＧ９順方向プライマー：ＣＴＴＴＧＡＧＴＧＣＡＡＧＴＡＴＣＧＣＣ（配列番号２２）
ＡＬＧ９逆方向プライマー：ＴＧＴＧＴＡＡＴＴＧＴＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣ（配列番号２３）
ＧＰＤ１（ｇ１５４４）順方向プライマー：ＧＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＣ（配列番号２４）
ＧＰＤ１逆方向プライマー：ＣＴＴＡＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＧＡ（配列番号２５）
ＧＰＤ２（ｇ５６１７）順方向プライマー：ＣＡＴＧＴＡＴＣＧＡＡＴＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧ（配列番号２６）
ＧＰＤ２逆方向プライマー：ＣＡＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＧＣ（配列番号２７）

ＹＢＣ菌株において前記の遺伝子の発現量を見ると、ＧＰＤ１は、培養１４時間にＡＬＧ９に比べて約２０倍の発現率を、培養２３時間には約７０倍の発現率を示し、また、ＧＰＤ２は、発現率が非常に低く、ＡＬＧ９と類似の発現率を示した。

この結果から、ＹＢＣ菌株では、ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素としてＧＰＤ１が主な役目を担うと暫定結論付けたが、実際の役目を確認するために、それぞれの遺伝子が除去された菌株を作製した。

実施例３：ＧＰＤ遺伝子が除去された組換え耐酸性酵母菌株作製
ＹＢＣ菌株においてＧＰＤ１遺伝子、ＧＰＤ２遺伝子、ＧＰＰ１ｖ１遺伝子及びＧＰＰ１ｖ２遺伝子とアノテーションされたｇ１５４４遺伝子、ｇ５６１７遺伝子、ｇ５４４３遺伝子及びｇ４３５６遺伝子をゲノムから除去した菌株を作製した。

前記遺伝子を除去するために使用した耐酸性酵母菌株は、ＹＢＣ野生型（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）菌株ではなく既存のＹＢＣ菌株からＡＤＨ（ａｌｃｏｈｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入したＹＢＣ１菌株に、さらにｇ３００２－１遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）が除去されながらＬＤＨが発現した菌株であって、エタノール生成能が封鎖されながら乳酸を高効率で生産するＹＢＣ２菌株に、ラクテートを消耗する遺伝子であるｇ２９４７を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入して乳酸消耗能が除去されたＹＢＣ４菌株を使用した。

前記ＹＢＣ４菌株からＧＰＤ１（ｇ１５４４）遺伝子を除去した（２倍体（Ｄｉｐｌｏｉｄ）菌株であって、アレル（Ａｌｌｅｌｅ）１及びアレル２両方とも除去）菌株であるＹＢＣ５を作製し、当該菌株の遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を確認するために、下の表１のプライマーを作製した後、該当の菌株のゲノムＤＮＡから確認した。また、前記ＹＢＣ５菌株からＧＰＤ２（ｇ５６１７）遺伝子を除去した菌株も同時に作製し、作製した菌株において発酵時にグリセロール生成能を比較した。

前記菌株の作製方法は次の通りである：
前記ＹＢＣ１菌株は、ＹＢＣ菌株の主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、前記ｇ４４２３位置にラクトバシラスプランタルム由来の配列番号１２のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ４４２３及びそれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’と３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＤＮＡ）として使用した。ｇ４４２３の各アレル（ａｌｌｅｌｅ）に対して相応する５’ＵＴＲは、配列番号２８及び配列番号２９に示し、３’ＵＴＲは、配列番号３０及び配列番号３１に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎａｓｓｅｍｂｌｙ）、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。ｇ４４２３のＯＲＦ位置に配列番号１２のＬＤＨを合成した後に導入してドナーＤＮＡを作製し、これをＹＢＣに導入して組換え菌株ＹＢＣ１を作製した。

なお、ｇ３００２－１遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムシーケンシングにおいてスキャフォールド７２位置にある遺伝子であり、ＰＤＣ遺伝子として作動する遺伝子である。ＹＢＣ１菌株のｇ３００２－１遺伝子（スキャフォールド７２に位置している遺伝子）を除去しながら配列番号１２のＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ２を作製した。

このようなｇ３００２の遺伝子を置換するためのカセットは、該当のＵＴＲを組み換え位置として用いて作製した。前記のＹＢＣ１のｇ４４２３遺伝子（ＡＤＨ）の位置にＬＤＨを導入する方法と類似に、ｇ３００２－１のＵＴＲを用いて作製した。ただし、当該遺伝子の置換では過程の単純化のためにアレル変化（ａｌｌｅｌｅｖａｒｉａｔｉｏｎ）を考慮せず、一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。また、遺伝子置換に使用するプライマーに対しても、上記の欠失菌株作製に使用したプライマーの他に、次のようにｇ３００２－１のＵＴＲとＬＤＨを共に確認できるプライマー対を別個に使用し、遺伝子置換確認の正確度を上げた。

ｇ３００２－１ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｆｗｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号３２）
ｇ３００２－１ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｒｅｖ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号３３）

また、ＹＢＣ４菌株は、ＹＢＣ２菌株のＣＹＢ２遺伝子であるｇ２９４７遺伝子を除去し、前記ｇ２９４７位置にラクトバシラスプランタルム由来の配列番号１３のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ２９４７遺伝子はＹＢＣ菌株のゲノムシーケンシングにおいてスキャフォールド４１位置にある遺伝子である。ｇ２９４７及びそれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’と３’ＵＴＲを含む遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして使用した。ｇ２９４７の各アレルに対して、相応する５’ＵＴＲは配列番号３４及び配列番号３５に示し、３’ＵＴＲは配列番号３６及び配列番号３７に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリ、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。

ただし、当該遺伝子の置換では、過程の単純化のために、アレル変化を考慮せず、一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。

前記菌株の作製方法は、次の通りである：
前記ＹＢＣ５菌株は、ＹＢＣ４菌株のＧＰＤ１遺伝子であるｇ１５４４遺伝子を除去した菌株であり、ｇ１５４４遺伝子はＹＢＣ菌株のゲノム配列分析においてスキャフォールド１９位置にある遺伝子である。ｇ１５４４及びそれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’と３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーを持つ遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして用いた。ｇ１５４４の各アレルに対して、相応する５’ＵＴＲは配列番号３８及び配列番号３９に示し、３’ＵＴＲは配列番号４０及び配列番号４１に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリー、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。

ただし、当該遺伝子の置換では過程の単純化のためにアレル変化を考慮せず、一つのアレルを対象にしてドナーカセットを作製したが、アレル別に作製することも可能である。また、抗生剤マーカーも、現在商用化された遺伝工学技術（ＣＲＩＳＰＲ）を適用する場合、それを使用しない形態で作製及び適用することも可能である。

また、遺伝子置換後、遺伝型確認に使用するプライマーに対して、次の表２のようにｇ１５４４及び後で詳述するｇ５６１７の遺伝子型を確認できるプライマー対を別個に使用して遺伝子置換確認の正確度を上げた。

前記作製した組換え菌株の遺伝型は、次の通りである：
ＹＢＣ２：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ
ＹＢＣ４：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ
ＹＢＣ５：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ／Δｇ１５４４
ＹＢＣ５ａ：Δｇ４４２３：：ｌｄｈ／Δｇ３００２－１：：ｌｄｈ／Δｇ２９４７：：ｌｄｈ／Δｇ５６１７

実施例４：ＹＢＣ４菌株からＧＰＤ１遺伝子を欠失した組換えＹＢＣ菌株において乳酸生成及びグリセロール生成阻害効果確認
実施例３で作製した組換え菌株ＹＢＣ５とＹＢＣ５ａに対して、接種ＯＤは０．５、培地は、ｍ－ＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）にグルコース１０％を添加して使用し、５００ｍｌのフラスコ培養で３０℃、１５０ｒｐｍ条件で６４時間培養した。

その結果、表３に示すように、ＹＢＣ５菌株はＹＢＣ４菌株に比べて、グリセロール生成能が８０％抑制された様相を示したにもかかわらず、まだ少量のグリセロールは生産していることが分かる。前述したように、グリセロールは、微生物の環境適応力、特に浸透圧に対する適応力に非常に重要な役目を果たすため、ＧＰＤ１とＧＰＤ２の同時除去或いはＧＰＰ１とＧＰＰ２の同時除去によるグリセロールの完全な生産力抑制は、菌株を浸透圧に対して極めて敏感にさせて正常の成長及び発酵をできなくする点で、現ＹＢＣ５のグリセロール低減率は非常に好適であるといえる。ただし、本菌株は、グリセロールの低減が乳酸生産増加に直接に大きく影響を与えることはできず、その他様々なｂｙ－ｐｒｏｄｕｃｔに一部分散される効果があり、そのため、以降、乳酸発酵収率を増加させ得る方案の適用が必要である。

グリセロールは、環境にやさしい高分子であるＰＬＡ製造時に重合にも影響を与えることができるが、グリセロールの存在時に、ＰＬＡの構造が線形（ｌｉｎｅａｒ）から、グリセロールの構造によって分岐した（ｂｒａｎｃｅｄ）構造に変形されるという報告がある（ＷｅｎＳｈｅｎｅｔａｌ．，Ｒ．Ｓｏｃ．ｏｐｅｎｓｃｉ．５：１８０１３４，２０１８）。このようなＰＬＡの構造変化は、物性にも影響を与えることあり、光学異性質体関係であるＬ型ＰＬＡとＤ型ＰＬＡ間のファンデルワールス力で作られるステレオコンプレックスＰＬＡの形成などにも影響を与えることがあり、ラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）への転換のための乳酸オリゴマー生成時にも影響を与えることがあるなど、多くの後段工程で不純物（ｉｍｐｕｒｉｔｙ）として作用することがある。勿論、グリセロールを除去するための精製工程によってこれを減少させる方案もあるが、当該特許のように遺伝工学を用いてグリセロールを低減させることは、根本的にこのような後段工程における問題を減らすことができる良い方案である。

ＧＰＤ１を除去したＹＢＣ５菌株に比べて、ＧＰＤ２を除去したＹＢＣ５ａ菌株は、グリセロールの低減にほとんど影響がなく、乳酸の生産量は減少し、エタノールの生産量は増加する、多少理解し難い現象を示した。発酵形態の全般が乳酸発酵にも阻害となる影響を示したため、ＧＰＤ２が除去されたＹＢＣ５ａ菌株は乳酸生産菌株として使用するには不適切であるといえる。

前記ＹＢＣ５菌株を製造するまで用いられたＹＢＣ１～ＹＢＣ４菌株の作製時には、主要遺伝子の除去時にはＬＤＨ遺伝子を導入し、菌株の乳酸生成能を高めた。しかし、ＹＢＣ５菌株の作製ではＧＰＤ１遺伝子の除去時にＬＤＨ遺伝子を導入しなく、これは、既に同じラクトバシラスプランタルム由来の配列番号１２のＬＤＨ遺伝子を３個の位置に２個ずつ総６個を導入した状態であったため、同種の遺伝子の導入は内部フィードバック調節を考慮して更なる活性増加に及ぼす影響がわずかであろうと予想でき、実施例２で明示したように、一般条件でのＧＰＤ１／２の発現率がＲｅｆ遺伝子であるＡＬＧ９に比べて高いとはいえ、他のＡＤＨやＰＤＣなどに比べては低いという点、最後に、同じ多数の遺伝子がゲノム中に存在する時に発生し得るゲノムの不安定性を考慮して、単純除去に対してのみ適用した。

実施例５：ＹＢＣ５菌株の発酵性能評価
本実施例では、ＹＢＣ５菌株をフラスコ培養ではなくバイオリアクターで培養し、乳酸発酵性能を確認した。

ＹＢＣ５菌株をｍＹＰ培地（５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／Ｌウラシル）に、１次シード培養４０ｍｌ、２次シード培養２２０ｍｌにして２日間培養した後、全ての細胞を収穫して２ＬｍＹＰ培地に接種した。接種ＯＤは０．８５、培地はｍＹＰ培地にグルコース１２％で培養を始め、ＣａＣＯ_３溶液を間欠的に注入してｐＨをｐＨ３レベルに保持可能にした。３０℃、５００ｒｐｍ、Ａｉｒ０．２５ｖｖｍで注入して培養した。

その結果、図２に示すように、ＹＢＣ５菌株は、バイオリアクター内で短時間に全てのグルコースを消耗しつつ乳酸を生産することが確認でき、最終ｐＨ３．３で乳酸収率が０．８１（ｇ／ｇ）、生産性１．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、生産乳酸濃度８８．２ｇ／Ｌにグリセロール収率０．０１（ｇ／ｇ）を示し、前記実施例３の結果がバイオリアクターでもそのまま具現されることが確認できた。また、将来、初期ＯＤ及び培養条件の改善にしたがって本性能の追加改善も可能であると類推される。

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施態様であり、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言えよう。

Claims

耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子が欠失又は弱化しており、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化しており、ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化しており、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子がさらに欠失又は弱化しており、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株。
前記ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列で表示されるタンパク質と９０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の組み換え菌株。
前記ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子は、ＧＰＤ１又はＧＰＤ２遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
前記ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子は、ＧＰＤ１であり、前記遺伝子は、配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号６又は配列番号７で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
前記ピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、配列番号８又は配列番号９で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
前記ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子は、配列番号１０又は配列番号１１で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
前記ジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子の欠失又は弱化によって、親菌株である前記耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）に比べてグリセロール生成能が減少することを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。
耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロール－３－リン酸に転換する酵素をコードする遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ラクテートをピルべートに転換する酵素をコードする遺伝子であるＣＹＢ２遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＡＤＨ遺伝子、及びピルべートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子であるＰＤＣ遺伝子が欠失し、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株。
前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、欠失したＣＹＢ２遺伝子、ＡＤＨ遺伝子、ＰＤＣ遺伝子及びＧＰＤ１遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子位置に導入され、前記欠失した遺伝子のプロモーターによって調節されることを特徴とする、請求項９に記載の組換え菌株。
前記ＧＰＤ１遺伝子のプロモーターは、配列番号４又は配列番号５で表示される塩基配列を有する、請求項１０に記載の組み換え菌株。
次の段階を含む乳酸の製造方法；
（ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階。