JP3162043B2 - 組換えｄｎａ技術によって構築されるデンプン分解酵素産生微生物及びその発酵法用途 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ
ｓ属の酵母は、二つの細胞外酵素、即ちアミラーゼ（α
−１，４−グルカン−４−グルカノヒドラーゼＥ．Ｃ．
３．２．１．１）及びグルコアミラーゼ（ｓｙｎ．アミ
ログルコシダーゼ）（脱分枝活性Ｅ．Ｃ．３．２．１．
９を有するα−１，４−グルカングルコヒドラーゼＥ．
Ｃ．３．２．１．３）を産生するために、デンプンをグ
ルコースに加水分解することができる。 【０００２】 【従来の技術】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓ
ｔｅｌｌｉｉ及びＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌ
ｌｕｖｉｕｓのデンプン分解系については詳細に報告さ
れている（Ｏｔｅｎｇ−Ｇｙａｎｇら、１９８１；Ｓｔ
ｉｌｌｓら、１９８２、１９８４ａ、１９８４ｂ；Ｗｉ
ｌｓｏｎら、１９８２）。α−アミラーゼは液化活性を
有し、グルコアミラーゼは脱分枝活性を有しており更に
は醸造に通常使用される低温殺菌条件に対してデンプン
分解系は感受性であるため（Ｓｔｉｌｌｓら、１９８４
ａ及びｂ）、これら酵素を産生するＳｃｈｗａｎｎｉｏ
ｍｙｃｅｓ種を用いて発酵を行なうのが望ましい。 【０００３】酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、上述
した酵母Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓの活性のいずれ
も有していないが、醸造工程、ベーキング工程及びエタ
ノール発酵において最もよく使用される生物である。発
酵工程においては、原料としてデンプンが通常使用され
ている。しかしながら上述した如くＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはデンプンを加水分解
することができないため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いてデンプンをエタノール
とＣＯ₂に変換する伝統的方法の場合には、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる発酵を
行なう前に二つの酵素分解工程、即ちα−アミラーゼを
添加して実施する液化工程及び脱分枝活性を有するグル
コアミラーゼを添加して行なう糖化工程が必要である
（Ｆｏｇａｒｔｙら、１９７９）。ヨーロッパ特許出願
番号Ｎｏ．０１２５６１５には、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍ
ｙｃｅｓ属の酵母を低カロリービールの製造に使用する
ことが記載されている。この場合、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏ
ｍｙｃｅｓ属の酵母を使用して、発酵法における、デン
プン分解酵素を産生する生物としているため、上述した
如き酵素を発酵前に加える必要がない。しかしながら醸
造及び工業的エタノール製造において、酵母Ｓｃｈｗａ
ｎｎｉｏｍｙｃｅｓは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同程度に有効なものではなくＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同
様に使用できるものではない。したがって上述したヨー
ロッパ特許記載の方法においては、より有効なＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に加える型でＳｃｈｗａｎｎｉｏ
ｍｙｃｅｓを使用することが提案されており、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓは、分解された炭水化物のエタノー
ルへの発酵及びＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのデンプ
ン分解酵素のために必須の微生物である。そして酵素を
別に加えて使用しているのである。 【０００４】いくつかのデンプン分解酵素をコードする
遺伝子がクローン化されＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現されている。即ち、マウス
のα−アミラーゼ遺伝子（Ｔｈｏｍｓｅｎ、１９８
３）、小麦のα−アミラーゼ遺伝子（Ｒｏｔｈｓｔｅｉ
ｎら、１９８４）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉ
ｓａｓｔａｔｉｃｕｓのグルコアミラーゼ遺伝子（Ｙａ
ｍａｓｈｉｔａ及びＦｕｋｕｉ、１９８３）、Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子
（Ｎｕｎｎｂｅｒｇら、１９８４；Ｉｎｎｉｓら、１９
８５）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのグルコア
ミラーゼ遺伝子（Ｃｏｈｅｎら、１９８５）及びＲｈｉ
ｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ遺伝子
（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．８５ １１５ ９１０．
３）が発現されている。 【０００５】しかしながら上述のドナー生物により産生
されたデンプン分解酵素は、本発明の目的に有用ではな
い。遺伝子操作を受けたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを醸造及びベーキング法並びに工
業的エタノール製造に使用するためには、非常に近似し
た関係にある生物由来のそれぞれの遺伝子をクローン化
するのが極めて望ましい。なぜなら、発現酵素の産生と
その応用が食品工業に極めて適しており、それらが工業
的工程において必要とされる酵素学的及び化学的特性を
持ち合わせているからである。したがって、多くの宿主
微生物において組換えＤＮＡ技術により産生することの
できる微生物Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのデンプン
分解酵素が、次の理由から多くの分野へ適用するのに極
めて適している。即ち微生物Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓと使用する宿主微生物とが密接な関係にあること、
低い最適温度を有していること、温度感受性であるこ
と、そしてＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓにより産生さ
れるデンプン分解酵素が高い安定性を有していることな
どである。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのα−アミラ
ーゼ遺伝子は、酵母からクローン化された最初のα−ア
ミラーゼ遺伝子であり、酵母関連生物の遺伝子として、
例えば醸造、ベーキング工程等の食物工業に必要とされ
る発酵工程に特に適合したものである。 【０００６】加えて、他のα−アミラーゼに比較して、
Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのα−アミラーゼは、約
３７℃の低温度で最適酵素活性を有しており、そのため
に低温発酵あるいは低温工程に適用することが可能であ
る。更にはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのα−アミラ
ーゼは５０℃で不活性化することができる。Ｓｃｈｗａ
ｎｎｉｏｍｙｃｅｓのグルコアミラーゼは、特別の脱分
枝活性を有しており、それ故デンプンをほぼ完全にグル
コースに加水分解することができる。他方、Ｃａｎｄｉ
ｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓのグルコアミラーゼは脱分枝
活性を有していないため、デンプンをグルコースに完全
には加水分解することができない。最適ｐＨ、最適温度
等の特に好適な酵素学的及び化学的特性の外に、Ｓｃｈ
ｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのグルコアミラーゼは、すでに
クローン化された他の遺伝子によりコードされるグルコ
アミラーゼに比べて次の如き利点を有している。即ち、
この酵素は酵母を起源としており、また通常の醸造工程
において使用される低温殺菌条件下で熱的に不活性化で
きるという利点を有している。 【０００７】従って、醸造工程、工業的エタノール及び
酵母バイオマス用として、高度ＣＯ２ 産生能、良好な
発酵効率、高度のエタノール許容性、及びα−アミラー
ゼとグルコアミラーゼを産生分泌としてデンプンを完全
に加水分解する能力を備えたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養物を提供するのが極め
て有利である。またベーキングにおけるＣＯ₂産生用と
して、デンプン分解酵素産生株は極めて有利である。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】しかして本発明の目的
は、醸造工程、ベーキング工程、工業的エタノール製造
及びバイオマスの製造に適した微生物であって、α−ア
ミラーゼとグルコアミラーゼを合成し分泌する能力を有
しそれによって必要によりデンプンを完全に加水分解す
ることのできる微生物を提供することにある。目的とす
る微生物は、組換えＤＮＡ技術を用いた微生物の遺伝子
操作により提供される。組換えＤＮＡ技術を用いてα−
アミラーゼ及びグルコアミラーゼをコードする商業的に
有利な遺伝子がクローン化され、それによりＳｃｈｗａ
ｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の酵母のα−アミラーゼ及び／又
はグルコアミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片がクローン
化される。宿主微生物の形質転換後、デンプン分解酵素
をコードするクローン化遺伝子が、例えばＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの宿主微生
物において発現され、遺伝子産物が培地に分泌される。
発酵微生物に発酵糖を提供するために必要とされてい
た、デンプン及び／又は非発酵デキストリンの酵素的前
処置が、本発明においては不要となり、これによりコス
トが低下し、醸造、工業的エタノール製造及びバイオマ
スの製造分野における発酵工程が簡略化される。ベーキ
ング工程においては、デンプン分解酵素は、ある種の練
り粉の製造には極めて有利である。 【０００９】α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラー
ゼを産生し得る、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの発酵微生物を提供する利点
の１つとして、デンプンを継続的かつ定量的に分解する
ことができ、またデンプンの分解の結果として生じる低
分子量の炭水化物の好気的もしくは嫌気的変換によっ
て、エタノール又はバイオマスを同時に産生することが
できることが挙げられる。上述した如き醸造工程の場合
には、デンプンのこのような分解の結果、低カロリービ
ールが得られる。なぜなら得られる低分子量の炭水化物
は、遺伝子操作により得た微生物によってエタノールと
ＣＯ₂に容易に発酵されるためである。ビール醸造に用
いるデンプン分解性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ株の他の用途としては、低炭水化物ビ
ール、ダイエットビール、特別の風味のあるビールなど
の特定のビール製造に用いる例がある。更には、このよ
うなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ株によって、ビール醸造用に用いるデンプン含有原料
物質の範囲が広がるという利点が生じる。 【００１０】上述した如き本発明の一般的概念は、上述
した発酵工程の１つあるいはバイオマスの製造に好適な
各種の宿主微生物の使用を含むものであるが、以下にデ
ンプン分解酵素を発現し分泌することのできる微生物の
好ましい構築例について述べる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属の酵母構築用に特定の
マーカーを用いる形質転換系が開発され、これによって
アミラーゼ遺伝子の制御及び酵母細胞における該遺伝子
産物の過剰生産が可能となった。 【００１１】 【課題を解決するための手段】本発明によれば、Ｓｃｈ
ｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＳｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅの形質転換用
シャトルベクターとして使用することのできるシャトル
コスミドベクターが開発された。本発明の好ましい態様
によれば、酵母Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓ
ｔｅｌｌｉｉを、α−アミラーゼ及び／又はグルコアミ
ラーゼ遺伝子のクローニング用のドナーとして使用す
る。また酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅは、発現用に用いるクローン化遺伝子を形質
転換により受け入れデンプン分解酵素の遺伝子を発現す
ることができ且つ遺伝子産物を分泌することができる宿
主酵母として使用する。更には、遺伝子操作により酵母
Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓにお
いてデンプン分解酵素の過剰生産が可能である。このよ
うなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ株におけるデンプン
分解酵素の過剰生産は、極めて有利である。即ち、この
ようにして得られる酵素は、公知の方法によって回収
後、上述した如き発酵工程に使用することができ、この
場合デンプン分解酵素として別に添加する型で使用する
ことができる。 【００１２】新規Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓベクタ
ーは、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓにおいて複製及び
維持機能をコントロールすることができる。Ｓｃｈｗａ
ｎｎｉｏｍｙｃｅｓのクロモゾームＤＮＡから単離され
た複製配列（ＳｗＡＲＳ１）によって、Ｓｃｈｗａｎｎ
ｉｏｍｙｃｅｓでの自律的複製が可能となりまたＳｃｈ
ｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓの高頻度形質転換が可能とな
る。ＳｗＡＲＳ１−エレメントはＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも機能することができ、
従ってＳｗＡＲＳ１−プラスミドを有するＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ変異体の高頻度形
質転換が可能である。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓベ
クターの好ましい代表例の一つとして、ＳｗＡＲＳ１配
列、バクテリオファージ入のｃｏｓ（粘着性）配列、ｐ
ＢＲ３２２配列及び選択マーカーとして使用するＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ
５遺伝子から構成されるハイブリッドプラスミドｐＣＪ
Ｄ５−１が挙げられる。このプラスミドは、ゲノムＤＮ
Ａライブラリーの構築用に好適なクローニング部位を有
する新規Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ−Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉ
ｕｓ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコスミドシャ
トルベクターである。 【００１３】更には本発明によれば、酵母Ｓｃｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ用の簡単で且つ迅速な新
規形質転換法が提供される。上記した如きベクター及び
形質転換系を使用することにより、大量生産用の培養中
にアミラーゼを合成することのできる、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属の新規遺伝子工
学酵母株が提供される。このように大量生産が可能であ
ることから、この修正Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を好気的又は嫌気的デンプン変換
工程に使用することができ、酵母バイオマス、エタノー
ル及びＣＯ₂を得ることが可能とある。 【００１４】本発明によれば、酵母での分泌を可能にす
る新規分泌シグナルを含む新規ＤＮＡ配列が提供され、
これによりＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖ
ｉｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐ
ｏｍｂｅ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉ
ｓでの蛋白質の発現及び分泌が可能となる。更には、遺
伝子発現の制御を可能にする新規ＤＮＡ配列が提供され
る。更に本発明の他の目的は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムに組込むためのアミ
ラーゼ遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡ配列を全く
使用しないベクターを提供することにある。 【００１５】 【発明の実施の形態】以下に本発明の全ての態様につい
て詳細に説明する。図面の説明 第１図： Ａ：α−アミラーゼ遺伝子を含むＳ．ｃａｓｔｅｌｌｉ
ｉ ＤＮＡの５ｋｂ断片をコスミドｐＹｃ１に挿入して
誘導されるプラスミドｐＹｃ１−αの平面図を示す。 Ｂ：Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉのクローン化ＥｃｏＲＩ断
片の制限酵素地図を示す。 Ｃ：プラスミドｐＪＤＢ２０７ヘサブローンした断片
（１，２及び３）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲ
Ｆ１８形質転換体においてα−アミラーゼ遺伝子の機能
的発現を誘導しない。 Ｄ：ＤＮＡ配列分析法：マキサム・ギルバート（１９８
０）法による配列分析用に、ＥｃｏＲＩ／ＳａＩＩ断片
の３′末端を³²Ｐ−ｄＴＴＰでラベル化した。配列分析
の方向と延長とは矢印で示した。 【００１６】第２図：α−アミラーゼ構造遺伝子の５′
末端及びその５′フランキング領域のヌクレオチド配列
を示す。第３図： グルコアミラーゼの５つのトリプシンペプチド
のアミノ酸配列を示す。第４図： 異なる生育相の形質転換体の分泌α−アミラー
ゼ活性を示す。細胞を０．６７％ＹＮＢ及び４％グルコ
ースで一晩前培養した。異なる主要培養の培地で細胞を
洗浄後、主要培養の培地に接種してＯ．Ｄ．₆₀₀を０．
２とした。Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３形質転換
体の主要培養物（Ｆｅｒｎｂａｃｈ容器中の炭素源を有
する１リットル ＹＮＢ培地）を０．２Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．２）で緩衝化し、またＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ ＭＣ３４形質転換体の主要培養物は
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）で緩衝化した。
培養物を縦振とう器で一定振とう（２ヘルツ）しながら
３０℃でインキュベートした。培養上清中のα−アミラ
ーゼ活性及びグルコース濃度を、以下に記述する方法に
より測定した。 【００１７】第５図：ｐＹｃ１−αで形質転換したＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＣ３４の濃縮細胞外培地から
α−アミラーゼ蛋白質を分離する、Ｍｏｎｏ Ｑカラム
によるＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーを示す。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液ｐＨ７．５を使用し、
α−アミラーゼを、上昇ＮａＣｌ勾配を用いて約３００
ｍＭ ＮａＣｌで溶出せしめた。 ａ：Ａ₂₅₄ｎｍ ｂ：％緩衝液Ｂ 緩衝液Ａ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５ 緩衝液Ｂ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、２
Ｍ ＮａＣｌ 【００１８】第６図：プラスミドｐＹｃ１−αで形質転
換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＣ３４の細胞外培
地から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製したα−アミラー
ゼ蛋白質の分析結果を示す。 レーンａ：精製α−アミラーゼ レーンｂ：分子量スタンダード蛋白質ウサギ筋肉のミオ
シン（２０５ｋｄ）；Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダ
ーゼ（１１６ｋｄ）；ウサギ筋肉のホスホリラーゼｂ
（９７ｋｄ）；牛アルブミン（６６ｋｄ）：卵アルブミ
ン（４５ｋｄ）：牛赤血球の炭酸アンヒドラーゼ。第７図： デンプン加水分解生成物の薄層クロマトグラフ
ィーを示す。４０℃、２時間後の溶解デンプン上の培養
上清のα−アミラーゼ活性を、反応生成物の薄層クロマ
トグラフィー（ＭｅｒｋのＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０を
使用）を用いて特徴化を行ない測定した。２：２：１ア
セトン−イソプロパノール−０．１Ｍ乳酸の溶媒系を使
用してクロマトグラフィーを行なった。Ｔｏｕｃｈｓｔ
ｏｎｅ及びＤｏｂｂｉｎｓ（１９７８）に記載された方
法に従い、ナフトレゾルシノールを用いて展開した。 【００１９】第８図：Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓプラスミド
の構築を示す。 Ａａ：プラスミドＹＲｐ７のＳ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ
ＤＮＡのゲノミックＳａｕ３Ａライブラリーから、Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２のｈｉｓ ４−５１９
変異体の相補性によりプラスミドＹＲｐ７ＨＩＳ４を単
離し、ＢａｍＨＩ及びＣｌａＩで消化し再連結した。得
られるプラスミドの１つは（ＹｐＲＨＩＳ４）、ＹＲｐ
７のＳ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ｈｉｓ ４領域からの
１．５ｋｂＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ断片を含んでいる。
ｂ：プラスミドＹｐＲＨＩＳ４から１．４５ｋｂ ＡＲ
Ｓ１−ＴＲＰ１−ＥｃｏＲＩ断片の除去を示す。 ｃ：プラスミドｐＢＲＳｗＡＲＳ１への５ｋｂ ＡＭＹ
−ＥｃｏＲＩ断片の挿入を示す。 ｄ：分離用ゲル電気泳動による、プラスミドｐＹＡＳ１
からの３．２ｋｂ ＴＲＰ５−ＢａｍＨＩ断片の単離を
示す。 ｅ：プラスミドＹｐＲＨＩＳ４、ｐＢＲＳｗＡＲＳ１及
びｐＢＲＳｗＡＲＳ１−αへの３．２ｋｂＴＲＰ５−Ｂ
ａｍＨＩ断片の挿入を示す。 Ｂ．ｐＹＡＳ１からの３．２ｋｂＴＲＰ５−ＢａｍＨＩ
断片をＹＲｐ７へ挿入することにより、プラスミドＹＲ
ｐ７ＴＲＰ５−Ａ及び−Ｂを構築した。該断片の方向が
異なる２つのプラスミド（−Ａ及び−Ｂ）が得られた。 Ｃ．ｐＹＡＳ１からの３．２ｋｂＴＲＰ５−ＢａｍＨＩ
断片をＫ．ｌａｃｔｉｓベクターｐＥＫ２に、異なる二
つの方向を持たせて（−Ａ及び−Ｂ）挿入することによ
りプラスミドｐＥＫ２ＴＲＰ５−Ａ及び−Ｂを構築し
た。 【００２０】第９図：Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２
３及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ３６５６２Ｄでの
プラスミドＹＲｐＪＤ２のコピー数評価を示す。 Ａ：０．７％アガロースゲル上で分離されたプラスミド
及び酵母最少溶解物ＤＮＡをエチジウムブロマイドで発
色せしめた。 Ｂ：ニックトランスレーション化ＹＲｐＪＤ１ ＤＮＡ
とのサザンブロット及びハイブリダイゼーション後のオ
ートラジオグラムを示す（−７０℃で４８時間暴露し
た）。 Ｃ：−７０℃で３１２時間暴露後のレーンｊ−ｑのオー
トラジオグラムを示す。 Ｄ：ハイブリダイゼーションプローブＹＲｐＪＤ１の地
図を示す（点線、ｐＢＲ３２２；オープンボックス，
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＮＡ；ブラックボック
ス、Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ＤＮＡ）。 レーンａ−ｃ、コントロールプラスミド； ａ：ＹＲｐＪＤ１ ＥｃｏＲＩ ｂ：非開裂ＹＲｐＪＤ１ ｃ：非開裂ＹＲｐＪＤ２ レーンｄ−ｇ、酵母最少溶解物ＤＮＡ；ｄ−ｆ、Ｓ．ａ
ｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３のＤＮＡ：ＹＲｐＪＤ２形
質転換体、ｄ及びｆはＥｃｏＲＩで開裂；ｅ及びｇは非
開裂；ｈ及びｉ、ＮＧＡ２３：ＥｃｏＲＩで開裂したＹ
ＲｐＪＤ１ ＤＮＡ（ｈ）及び非開裂（ｉ）；ｊ及び
ｋ、ＥｃｏＲＩで開裂した非形質転換ＮＧＡ２３のＤＮ
Ａ（ｊ）及び非開裂（ｋ）；ｌ及びｍ、Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅＸ３６５６２ＤのＤＮＡ：ＥｃｏＲＩで開裂
したＹＲｐＪＤ２形質転換体（ｌ）及び非開裂（ｍ）；
ｎ−ｑ、ＥｃｏＲＩで開裂した非形質転換体Ｘ３６５６
２ＤのＤＮＡ（ｎ及びｐ）及び非開裂（ｏ及びｑ）。 【００２１】第１０図：Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ
２３での異なるプラスミドのコピー数評価を示す。 Ａ：０．７％アガロースゲル上で分離後のコントロール
プラスミドのＥｃｏＲＩ断片及び酵母最少溶解物ＤＮＡ
をエチジウムブロマイドで発色せしめた。 Ｂ：ニックトランスレーション化ＹＲｐ７ＨＩＳ４ＤＮ
Ａとのサザンブロット及びハイブリダイゼーション後の
オートラジオグラムを示す（−７０℃で１５時間暴露し
た）。 Ｃ：−７０℃で６時間（レーンａ−ｄ）、１２５時間
（レーンｅ−ｐ）暴露後のそれぞれのオートラジオグラ
ムを示す（レーンｊ及びｍ上の弱いバンド及びクロモゾ
ームＨＩＳの場所でのバンドの位置を矢印で示した）。 Ｄ：ＹＲｐＪＤ１及びクロモゾームＳｃｈｗａｎｎｉｏ
ｍｙｃｅｓ ＨＩＳ４領域のハイブリダイゼーションブ
ローブＹＲｐ７ＨＩＳ４に対する相同性を示す。 レーンａ−ｅ、コントロールプラスミド：ａ、ｐＥＫ２
ＴＲＰ５−Ａ；ｂ、ＹＲｐ７ＴＲＰ５−Ａ、Ｃ、ｐＹＡ
Ｓ１；ｄ、ＹＲｐＪＤ１；レーンｅ、非形質転換Ｓ．ａ
ｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３のＤＮＡ；レーンｆ、非形
質転換Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ２６０７６のＤＮＡ；
レーンｇ−ｐ、形質転換Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ
２３のＤＮＡ：ｇ、ＹＲｐＪＤ１；ｈ及びｊ、ＹＲｐ７
ＴＲＰ５−Ａ；ｉ、ｋ及びｌ、ＹＲｐ７ＴＲＰ５−Ｂ；
ｍ、ｐＥＫ２ＴＲＰ５−Ａ；ｎ、ｐＥＫ２ＴＲＰ５−
Ｂ；ｏ及びｐ、ｐＹＡＳ１（レーンｏのＤＮＡは非開裂
である）。 【００２２】第１１図：Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ及びＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＳｗＡＲＳ１及びＡＲＳ
１プラスミドのコピー数を比較したものである。 Ａ：０．７％アガロースゲル上で分離後のコントロール
プラスミドのＥｃＯＲＩ断片及び酵母最少溶解物ＤＮＡ
をエチジウムブロマイドで発色せしめた。 Ｂ：ニックトランスレーション化ＹＲｐＪＤ２−αＤＮ
Ａとのサザンブロット及びハイブリダイゼーション後の
オートラジオグラムを示す。 レーンａ−ｄ、コントロールプラスミド：ａ、ｐＣＪＤ
５−１；ｂ、ＹＲｐＪＤ２−α；ｃ、ＹＲｐＪＤ１；
ｄ、ＹＲｐ７ＴＲＰ５−Ａ；レーンｅ−ｈ、Ｓ．ａｌｌ
ｕｖｉｕｓ ＮＪＤ１のＤＮＡ；ｅ、ｆ及びｉ、非形質
転換；ｇ、ｐＣＪＤ５−１で形質転換；ｈ、ＹＲｐＪＤ
２で形質転換；レーンｊ−ｍ、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ
ＮＧＡ２３のＤＮＡ；ｊ、非形質転換；形質転換；ｋ、
ＹＲｐＪＤ２−α；ｌ、ＹＲｐＪＤ２；ｍ、ＹＲｐＪＤ
１；レーンｎ−ｒ、形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｘ３６５６２ＤのＤＮＡ：ｎ、ＹＲｐＪＤ２−α；
ｏ、ＹＲｐＪＤ２；ｐ、ＹＲｐＪＤ１；ｑ、ＹＲｐ７Ｔ
ＲＰ５−Ａ；レーンｒ、非形質転換。 【００２３】第１２図：Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓＮＧＡ２
３形質転換体からの細胞外酵素のｉｎ ｖｉｖｏラベル
化を示す。形質転換体は、１００μＣｉ³⁵Ｓ−メチオニ
ン（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ添加後）の１ｍｌ培養中で誘
導あるいは阻止条件下に生育せしめた（第４図のａ、
ｂ、ｃ参照）。３０℃でそれぞれ異なる時間（１８、２
２、２８、４３及び９０時間）インキュベーション後、
細胞を含まない上清３０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び
オートラジオグラフィーで分析した。 ａ、ＮＧＡ２３：２％グルコースを含むＹＮＢ中のＹＲ
ｐＪＤ２（阻止条件）； ｂ、ＮＧＡ２３：２％マルトースを含むＹＮＢ中のＹＲ
ｐＪＤ２（誘導条件）； ｃ、ＮＧＡ２３：２％グルコースを含むＹＮＢ中のＹＲ
ｐＪＤ２−α（阻止条件）； ｄ、ＮＧＡ２３：２％マルトースを含むＹＮＢ中のＹＲ
ｐＪＤ２（誘導条件）。 分子量スタンダード蛋白質（第６図参照）の位置は矢印
で示した。 【００２４】第１３図：コスミドｐＣＪＤ５−１及びｐ
ＣＪＤ５−２の制限酵素地図及び制限酵素分析を示す。 Ａ：制限酵素地図を示す。 Ｂ：０．７％アガロースゲル上で分離した制限酵素処理
断片を示す。レーンａ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
で開裂したラムダＤＮＡ；レーンｑ、ＨｉｎｄＩＩＩで
開裂したラムダＤＮＡ；左から右へコスミドＹＲｐＪＤ
２、ｐＣＪＤ５−１、ｐＣＪＤ５−２：レーンｂ、ｃ、
ｄ、ＥｃｏＲＩで開裂；レーンｈ、ｉ、ｊ、ＢａｍＨＩ
で開裂；レーンｋ、ｌ、ｍ、ＢｇｌＩＩで開裂；レーン
ｎ、ｏ、ｐ、ＰｖｕＩＩで開裂。 【００２５】第１４図：プラスミドｐＫＡＲ２−αの制
限酵素地図を示す。プラスミドｐＹｃ１−αからの５ｋ
ｂ ＡＭＹ−ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＫＡＲＳ
２−ｄの単一ＥｃｏＲＩ部位へ挿入した。第１５図： Ａ：グルコアミラーゼ機能遺伝子（ＡＧＭ）を含む２つ
のサブクローン断片の制限酵素地図を示す。 Ｂ：ＡＭＧ断片を、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ−Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅベクターｐＣＪＤ５−１ヘサブクローン
化してｐＣＪＤ５−ＡＭＧ１及びｐＣＪＤ５−ＡＭＧ２
を得、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−Ｓ．ｐｏｍｂｅベク
ターｐＪＤＢ２０７ヘサブクローン化してｐＪＤＢ２０
７−ＡＭＧ１及びｐＪＤＢ２０７−ＡＭＧ２を得、Ｋ．
ｌａｃｔｉｓベクターｐＥＫ２ヘサブクローン化してＰ
ＥＫ２−ＡＭＧ２を得た。 【００２６】第１６図：異なる温度でのグルコアミラー
ゼの不活性化を示す。第１７図： グルコアミラーゼ構造遺伝子及びフランキン
グ領域のヌクレオチド配列を示す。 【００２７】 【表１】 【００２８】 【表２】【００２９】 【表３】【００３０】 【表４】【００３１】本発明で使用する酵母株： Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ＡＴＣＣ ２６０７６．（ＤＳＭ ３７９４） Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３及びＮＧＳ１．（ＤＳＭ ３７９２、３７９
３） Ｋｌｕｖｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＳＤ１１．（ＤＳＭ ３７９５） Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ｌｅｕ１−３２、ｈｉｓ５−３０３．（ＤＳＭ ３７９
６） Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８ ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ
３−１１、ｈｉｓ３−１５．（ＤＳＭ ３７９７） Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２ａ ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ
４−５１９、ｃａｎ１．（ＤＳＭ ３８２０） Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ３６５６ ２Ｄ ａ、ａｄｅ、ａｒｇ４−１、ｈｉｓ
６、ｌｅｕ１、ｔｒｐ５．（ＤＳＭ ３７９８） Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｈｉｓ Ｍａｌ１⁺（ＤＳＭ ３７９９） 【００３２】本発明で使用する大腸菌株：Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＨＢ１０１Ｆ^-、ｈｓｄ Ｓ２
０、ｒ_B ^-ｍ_B ^-、ｒｅｃＡ１３、ａｒａ−１４、ｐｒｏＡ
２、ｌａｃＹ１、ｇａｌＫ２、ｒｐｓＬ２０（Ｓ
ｍ^r）、ｘｙ１５、ｍｔｌ−１、ｓｕｐＥ４４、λ^-（Ｄ
ＳＭ３７８８） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＡ２２１、ｒｅ
ｃＡ−１、ｌｅｕＢ６、ｔｒｐＥ５、ｈｓｄＲ^-、ｈｓ
ｄＭ⁺、ｌａｃＹ１．（ＤＳＭ ３７８９） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＨＢ２６８８、
Ｎ２０５ ｒｅｃＡ^-〔ｉｍｍ⁴³⁴、ｃＩｔｓ、ｂ２、ｒ
ｅｄ³、Ｅａｍ４、Ｓａｍ７〕／λ（ＤＳＭ３７９０） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＨＢ２６９０、
Ｎ２０５ ｒｅｃＡ^-〔ｉｍｍ⁴³⁴、ｃＩｔｓ、ｂ２、ｒ
ｅｄ³ｍ、Ｄａｍ１５、Ｓａｍ７〕／λ（ＤＳＭ３７９
１） 【００３３】本発明で使用するプラスミド及びコスミド コスミドｐＹＣ１ プラスミドｐＥＫ２ プラスミドＹＲＰ２ プラスミドｐＪＤＢ２０７ 上述した微生物で、本発明の実施に必須のものはＤｅｕ
ｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に寄託されている。酵母
株の完全培地としてＹＥＰＤ（２％バクトペプトン、１
％酵母抽出物、２％グルコース）を使用した。最少培地
は２％グルコース及びアミノ酸でない０．６７％窒素源
（Ｄｉｆｃｏ）を含んでおり、適当なアミノ酸が添加さ
れていた。グルコースの代わりに２％溶解性デンプン中
でＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ細胞を生育せしめた。
デンプン発酵酵母株のα−アミラーゼ産生、したがって
１％グルコース、１％溶解性デンプン及び２％寒天を含
むＹＮＢ最少培地プレート上のハロ（ｈａｌｏ）形成に
ついてスクリーニングした。ヨード飽和チャンバー中で
プレートを２、３秒間インキュベートすることによって
ハロを成熟化させた。バクテリア細胞はＬＢ培地（０．
５％酵母抽出物、１％トリプトン、１％ＮａＣｌ）で生
育せしめた。必要に応じて、アンピシリン、テトラサイ
クリンを、最終濃度１５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ
でそれぞれ加えた。バクテリアの形質転換は、Ｒ．Ｗ．
Ｄａｖｉｓら（１９８０）の文献に記載された方法と同
様にして実施した。酵母の形質転換は、本明細書に記載
した方法に従って実施した。 【００３４】本明細書を通して各種の文献は、著者名及
び発刊年を引用して記載した。これら引用文献の詳細
は、「発明の詳細な説明」の欄の最後にアルファベット
順で示した。これら文献の記述は、本願出願時の技術水
準を十分に理解するために本明細書中に引用する。プラ
スミドＤＮＡは、ＣｓＣｌ勾配遠心（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、１９８２）あるいはＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ
ら（１９７９）の文献に記載されたプラスミドＤＮＡの
迅速アルカリ抽出により精製した。酵母粗抽出物は、Ｓ
ｃｈａｔｚ（１９７９）の方法によって調製した。酵母
最少溶解物（ｍｉｎｌｙｓａｔｅｓ）はＳｈｅｒｍａｎ
ら（１９８３）の方法により調製した。ＤＮＡ断片は、
Ｇａｆｎｅｒら（１９８３）の文献に記載された“低溶
融アガロース”法により単離した。 【００３５】本発明実施に用いる方法 ＤＮＡ配列分析は、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔ（１９
８０）の文献に記載された方法に従って実施した。Ｒｉ
ｇｂｙら（１９７７）の文献に記載された方法に従って
ＤＮＡのニックトランスレーション化を行なった。サザ
ンハイブリダイゼーションは、サザン（１９７５）の文
献に記載された方法に従って行なった。制限酵素エンド
ヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリ
メラーゼＩ及びクレノーポリメラーゼはベーリンガーマ
ンハイム社から入手し得る。α−³²ＰｄＮＴＰ及び（³⁵
Ｓ）メチオニンは、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ社から入手
し得る。Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ５，０００及びＺｙｍｏ
ｌｙａｓｅ ６０，０００はキリンビール（日本）社か
ら入手し得る。ニトロセルロースフィルターはＳｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ社から入手し得
る。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉ
ｉ ＤＮＡのコスミドライブラリーを、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクター
ｐＹｃ１（Ｈｏｈｎ及びＨｉｎｎｅｎ、１９８０）及び
本発明により構築されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ａｌｌｕｖｉｕｓ−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐ
ＣＪＤ５−１中において、Ｉｓｈ Ｈｏｒｏｗｉｃｚ及
びＢｕｒｋｅ（１９８１）の文献に記載された方法に従
って構築した。スタンダードとして牛血清アルブミンを
用いるＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法により、蛋
白質濃度を測定した。Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）の方
法によるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、蛋白質を分離した。 【００３６】アミラーゼ活性は、例えばＭｅｒｃｋ社の
α−アミラーゼＭｅｒｃｋｏテスト等の酵素的カラーテ
ストにより動力学的に測定した。２−クロロ−４−ニト
ロフェノールの形成割合いは、試料中の０．１Ｍリン酸
カリウム活性を３７℃４０５ｎｍで光度測定することに
より求めた。酵素単位（Ｕ）は、３７℃で１分当り２−
クロロ−４−ニトロフェノール１μｍｏｌの形成を触媒
する酵素量として定義した。グルコアミラーゼ活性は、
１０％溶解性デンプンを含む０．０５Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄−
ＮａＯＨ（ｐＨ５．０）中にて５０℃でサンプルをイン
キュベーション後ストップアッセイ法により測定した。
グルコースの生成量を、グルコースデヒドロゲナーゼ法
（システムグルコース、Ｍｅｒｃｋ社製）により測定し
た。生成するＮＡＤＨの量はグルコース濃度に比例す
る。 【００３７】酵素単位（Ｕ）は、５０℃で１分間当りグ
ルコース１μｍｏｌの生成を触媒する酵素量として定義
した。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌ
ｉｉの培養上清から単離されるα−アミラーゼは、ヨー
ドで発色後、溶解性デンプンを含む寒天プレート上にハ
ロ（ｈａｌｏ）を形成する。このような事実から、ハロ
を形成しないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ細胞は、デンプン加水分解酵素、即ちα−ア
ミラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドベクター
を導入することによりハロ形成細胞に変換されると言う
前提に基いて、α−アミラーゼのクローン化を計画する
ことができる。α−アミラーゼ遺伝子をクローン化する
ために、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌ
ｌｉｉ ＡＴＣＣ２６０７６のゲノムＤＮＡから組換え
コスミドライブラリーを構築した。上述したコスミドク
ローニング技術を使用して、約１７，０００の独立した
クローンのゲノムライブラリーをベクターｐＹｃ１（Ｈ
ｏｈｎ及びＨｉｎｎｅｎ、１９８０）中に生成すること
ができた。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ ＧＲＦ１８をヒスチジン原栄養株に形質転換
しデンプン分解能をチェックすることによって、コスミ
ドライブラリーがα−アミラーゼ遺伝子を含む挿入部位
を有するか否かをスクリーニングした。約４５００個の
ＧＲＦ１８形質転換体について、ヨード発色後のロイシ
ン、グルコース及び溶解性デンプンを含むプレート上で
のハロ形成能をスクリーニングした。１３個のハロ形成
形質転換体を得た。この形質転換体から、全酵母ＤＮＡ
を抽出し、アンピシリン耐性を選択マーカーとするＥ．
ｃｏｌｉ ＪＡ２２１の形質転換に使用した。 【００３８】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ｅｌｌｉｉ ＤＮＡの３２ｋｂ断片、３９ｋｂ断片をそ
れぞれ含む２つの異なる組換えコスミドを得た。この組
換えコスミドをＧＲＦ１８に再導入した。この形質転換
体は、Ｈｉｓ⁺及びハロ形成表現型を示した。分裂安定
性テスト（Ｂｅｇｇｓ、１９７８）では、両者のコスミ
ドマーカー即ちＨＩＳ３及びハロ形成機能が同時に分離
され、これにより両者の遺伝子がコスミド中に存在する
ことが示された。３２ｋｂ断片を含むより小さいコスミ
ドを用いて、ハロ形成表現型をつかさどるＤＮＡ領域を
同定した。これを行なうため、コスミドをＥｃｏＲＩで
消化し再連結し、ＪＡ２２１に導入した。アンピシリン
耐性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のＤＮＡを用いて、ヒスチジン表
現型を選択マーカーとしてＧＲＦ１８を形質転換した。 【００３９】５個のハロ形成形質転換体から、全酵母Ｄ
ＮＡを単離し、ＪＡ２２１の形質転換に用いた。アンピ
シリン耐性Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを単離した。制限酵素分析により、これらのプラスミ
ドのそれぞれは、もとのベクターｐＹｃ１中に５ｋｂ
ＥｃｏＲＩ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ｅｌｌｉｉ ＤＮＡ断片を保有していることが判かっ
た。このプラスミドはｐＹｃ１−α（第１図のＡ）と呼
ばれる。５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片の制限酵素地図は、第
１図のＢに示した。断片１、２及び３（第１図のｃ）を
ベクターｐＪＤＢ２０７（Ｂｅｇｇｓ、１９８１）にサ
ブクローン化しＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＧＲＦ１８に導入されたが、その結果と
してα−アミラーゼを分泌する形質転換体は得られなか
った。従ってこれら断片には機能的遺伝子が含まれてい
ない。そこで、α−アミラーゼ機能的遺伝子は、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位に広がっていると考えられ
る。α−アミラーゼの分子量が約６１，０００ダルトン
であること（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８２）を考慮に入れ
ると、約２ｋｂのＤＮＡ断片が機能的遺伝子を含んでい
ると予想できる。この想定を証明するために、ＤＮＡ配
列分析をＭａｘａｎ及びＧｉｌｂｅｒｔ（１９８０）の
方法に従って行なった。配列分析のために、５ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ断片の両者のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片のＳａ
ｌＩ部位を放射活性によりラベル化した（第１図の
Ｄ）。ＤＮＡ配列分析により、ＳａｌＩ部位に広がるオ
ープンリーディングフレームに続いて５′非コード領域
が存在することが判った。ＤＮＡ配列は第２図に示し
た。 【００４０】通常、転写開始点から２５−３２ｂｐ下流
に位置するＴＡＴＡボックス（Ｇａｎｎｏｎら、１９７
９）及び約８０ｂｐ下流に見出されるＣＡＡＴボックス
（Ｂｅｎｏｉｓｔら、１９８０）が、転写開始に重要で
あると考えられる。ＴＡＴＡボックスは、ほとんどすべ
ての遺伝子に存在するのに対し、ＣＡＡＴボックスは常
に存在することはない。α−アミラーゼ遺伝子の調節領
域中には、−８９の位置に完全なＴＡＴＡボツクスが存
在し、−１１５の位置にＣＡＡＴボックスが存在する。
α−アミラーゼ遺伝子の５′領域においては、−７の位
置にＣＡＡＧ配列がある。α−アミラーゼで使用される
コドンは、前述した表Ｉに示した。 【００４１】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ α−アミ
ラーゼ遺伝子の発現及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる蛋白質の分泌 ＧＲＦ１８：ｐＹｃ１−α形質転換体は、溶解性デンプ
ンを唯一の炭素源とする場合には生育することができな
い。これはマルトースを利用することができないためで
ある。したがって、プラスミドｐＹｃ１−αを用いて、
デンプン分解能を選択マーカーとするＭａｌ⁺表現型の
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＭＣ３４（ｈｉｓ３）を形質転換せしめた。すべてのヒ
スチジン光栄養形質転換体は、デンプンを唯一の炭素源
とする場合にも生育することができ、ヨードで発色後コ
ロニーのまわりにハロを形成することもできる。α−ア
ミラーゼ活性測定のために、グルコースを含むＹＮＢ培
地中でヒスチジン原栄養株を選択マーカーとしてＭＣ３
４：ｐＹｃ１−αを培養した。非緩衝化ＹＮＢ培地中で
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを
生育せしめた場合には、ｐＨ値は約３．５に低下した。 【００４２】α−アミラーゼは、ｐＨ４以下で不活性化
され、約６．２に最適ｐＨ値を有する（Ｓｉｌｌｓ及び
Ｓｔｅｗａｒｔ、１９８４）。従って培地を０．１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ６．２）で緩衝化した。 ＭＣ３４：ｐＹｃ１−αの生育期間中に、粗抽出物及び
細胞外培地のα−アミラーゼ活性をアッセイした。α−
アミラーゼ活性は、細胞外培地においてのみ検出され、
粗抽出物では検出されなかった。これによりα−アミラ
ーゼが分泌されたことが示された。細胞外培地の全活性
は対数増殖期には減少した（第４図のＤ）。対数増殖期
か定常増殖期へ推移する間にタンパク分解活性は集中す
ることから（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、１９７３）、この酵
素活性の減少は、α−アミラーゼの酵素的分解によって
説明できる。しかしながらα−アミラーゼの安定性は、
プロテアーゼインヒビターＰＭＳＦの添加によっては改
善することができない。従って、α−アミラーゼの不活
性化はセリンプロテアーゼによるものではないというこ
とのみが結論として言える。 【００４３】完全培地ＹＥＰＤでのＭＣ３４：ｐＹｃ１
−α細胞の定常増殖期における細胞外培地の全α−アミ
ラーゼ活性は、ＹＮＢ培地の細胞に比べて有意に高かっ
た。この事実は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅをＹＮＢで生育せしめた場合にはＹＥＰ
Ｄで生育せしめた場合に比べて２倍高いタンパク分解活
性がある（Ｔｓａｉら、１９７３）ということによって
最もよく説明できる。酵母は時として基質を添加するこ
とによって安定化される（Ｋａｔｓｕｎｕｍａら、１９
７２）。溶解性デンプンを唯一の炭素源として含むＹＮ
Ｂ中で生育せしめたＭＣ３４：ｐＹｃ１−α形質転換体
は、グルコースを唯一の炭素源として生育せしめた細胞
と比べた場合、異なる増殖期においてα−アミラーゼ活
性のプロファイルに何らの相違も認められなかった。こ
のことから、α−アミラーゼは基質の存在によって安定
化されないことが判る。しかしながら、マルトース取り
込みの誘導期あるいは培地へのα−アミラーゼ分泌の時
間に依る累積量によって、ＭＣ３４：ｐＹｃ１−αは初
期誘導期を有していることが観察された。 【００４４】最近の研究から、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおいてα−アミラーゼ遺伝子
が発現され、その遺伝子産物が分泌されたことが示され
ている。この目的のために、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅはプラスミドｐＹｃＩα
（第１図）により、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａ
ｃｔｉｓはプラスミドｐＫＡＲＳ２−α（第１４図の
ａ）により形質転換されている。前者の形質転換体はヨ
ード発色後デンプンプレート上にハロを形成することが
出来た。これら２つの形質転換酵母株によるα−アミラ
ーゼ系の定量が本発明の目的の１つでもある。更には、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
野生型ボトム（ｂｏｔｔｏｍ）発酵醸造家の酵母株（ｂ
ｒｅｗｅｒｓ’ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ）にα−アミ
ラーゼ遺伝子がクローン化された。この株はα−アミラ
ーゼ遺伝子（ｐＹｃ１−α）を含むプラスミドで形質転
換することによってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇｅｎｉｓに変換され、溶解性デンプンを
含むプレート上でのハロ形成によりそのα−アミラーゼ
活性をスクリーニングした。 【００４５】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ｅｌｌｉｉのα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの単
離及び特徴化 両者の酵素を、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓ
ｔｅｌｌｉｉの連続培養培地から単離した。 酵母細胞を限外濾過（ＵＦ）により培地から分離し、濾
液をＵＦ−膜（１０，０００Ｄカットオフ）で濃縮し
た。濃縮濾液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中
のＤＥＡＥ−セファセルカラムに付した。 【００４６】１５０−１８０ｍＭ ＮａＣｌを用いてグ
ルコアミラーゼをカラムから溶出させた。１８０−２５
０ｍＭ ＮａＣｌを用いてα−アミラーゼを溶出せしめ
た。酵素活性を有する画分を集め、１００ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析し次いでＡ
ｍｉｃｏｎ ＹＭ１０濾過により濃縮した。それぞれ蛋
白質の±４ｍｇアリコートを、１００ｍＭ酢酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用してＴＳＫ２０００Ｓ
ＷカラムのＨＰＬＣ浸透クロマトグラフィーにより更に
精製した。このようして精製した酵素の均質性をＳＤＳ
−ＰＡＧＥでテストしたところ、それぞれの酵素につい
て１本の蛋白質バンドが得られた。 【００４７】グルコアミラーゼペプチド 画分の精製 グルコアミラーゼ（５０ｍｇ）を、５０ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で３７℃、２４時間、ト
リプシン（１ｍｇ）とインキュベートした。その結果±
３０％の酵素が崩壊した。ペプチドをＴＳＫ２０００Ｓ
Ｗカラムを用いたＨＰＬＣで分離し、更にＣ１８及びＣ
８カラムを用いたＲＰＨＰＬＣで精製した。０−１００
％アセトニトリル勾配を用いて溶出を行なった。５つの
ペプチドからアミノ酸配列を決定した（第３図）。 【００４８】グルコアミラーゼの特徴化 ＭＷ ：１２０，０００Ｄ 最適ｐＨ：５．０ 最適温度：５０℃ Ｋｍ ：１．０−１．５％デキストリン（Ｓｅｒｖ
ａ） ｐＩ ：３．５ グリコシル化 グルコースにより活性抑制 不活性化温度−第１６図参照α−アミラーゼの特徴化 ＭＷ ：５３，０００Ｄ 最適ｐＨ：６．０ 最適温度：３７℃ Ｋｍ ：０．００４−０．０７％溶解性デンプン 【００４９】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅから分泌されたα−アミラーゼの単離 ＹＮＢ培地で生育したＭＣ３４：ｐＹｃ１形質転換体か
ら分泌された測定し得る最大の酵素活性は、初期対数増
殖期の細胞から得られた（第４図のＤ）。最初の比活性
（α−アミラーゼ活性／蛋白質比）はＹＥＰＤ培地より
もＹＮＢ培地の方が有意に高いので、酵母抽出物及びバ
クトペプトン（ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）を含む複合
培地ではなく細胞外ＹＮＢ培地からα−アミラーゼを単
離した方が有利である。更には、α−アミラーゼの分泌
量は、活動的に生育する酵母細胞の量に直接関係してい
るので、各段階毎のＭＣ３４：ｐＹｃ１−α、即ちＹＮ
Ｂ培地（プラスミドの選択）、ＹＥＰＤ培地（最適生育
条件）及び最終のＹＮＢ培地（活動的生育細胞の量が高
くなった時のα−アミラーゼの分泌）でのＭＣ３４：ｐ
Ｙｃ１−αを、分泌されたα−アミラーゼの単離に使用
した。 【００５０】詳細には、グルコースを含むＹＮＢ培地で
形質転換体を生育せしめた。６００ｎｍでの光学濃度が
約４に達した時（対数増殖後期）に、細胞を遠心により
集めて、あらかじめ温めた（３０℃）ＹＥＰＤに再懸濁
せしめてＯＤ₆₀₀を７．５とした。３０℃で２時間生育
後に、細胞を沈降せしめ、グルコース及び０．１Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．２）を含むあらかじめ温めた（３
０℃）等量のＹＮＢ培地中へ再懸濁せしめた。３０℃で
４時間インキュベーション後（６００ｎｍでの光学濃度
が１７に達した時）、Ｍｏｎｏ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）を用いたＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフ
ィーにより、濃縮細胞外培地からα−アミラーゼを精製
した。α−アミラーゼは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ
（ｐＨ７．５）での上昇ＮａＣｌ勾配を用いて、３００
ｍＭ ＮａＣｌの時に溶出した。活性蛋白画分を凍結乾
燥により濃縮し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動（第６図）により分析した。約５５，０００Ｄの分子
量を有する唯一のバンドが現われ、これによりα−アミ
ラーゼ蛋白質が高度に精製されたことが示された。酵素
の特徴化のため、単離したα−アミラーゼによるデンプ
ン分解生成物を薄層クロマトグラフィーにより分析した
（第７図）。デンプン加水分解生成物は、マルトース、
大量のマルトトリオース及び高度のオリゴサッカライド
である。グルコースは検出し得る量では産生されなかっ
た。このことは、ＧＲＦ１８（Ｍａｌ^-）：ｐＹｃ１−
α形質転換体は、デンプンを唯一の炭素源とする場合に
は生育できないという上述した知見結果と一致する。 【００５１】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕ
ｖｉｕｓの形質転換 形質転換システムを確立するための必要条件の１つは、
クローン化遺伝子によって機能的に補充可能な適当な変
異株を利用できることである。各種のトリプトファン独
立栄養Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕ
ｓ変異株について、Ｌ−トリプトファン生合成経路の欠
除を分析した。変異株について、Ｌ−トリプトファン生
合成の最終工程、即ち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合にはトリプトファンシンセ
ターゼによって触媒されるインドールとＬ−セリンとの
縮合反応の欠除についてテストした。この最終工程の欠
除によってインドールの蓄積が起こる（Ｍａｎｎｅｙ
ら、１９６９）。トリプトファン栄養要求株ＮＧＡ２３
は、ＹＮＢ培地で生育せしめた時にインドールを蓄積す
る。更には、他のトリプトファン栄養要求株に比べて、
ＮＧＡ２３はインドールを含むＹＮＢ培地中では生育で
きない。従ってＮＧＡ２３のトリプトファンシンセター
ゼ遺伝子には変異があると結論することができる。ＮＧ
Ａ２３は低いリバージョン（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）比
（１０^-8）を示し、したがって、トリプトファンシンセ
ターゼ遺伝子（Ｗａｌｚら、１９７８；Ｚａｌｋｉｎ
ら、１９８２）をコードするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ５遺伝子（Ｃａｒｂ
ｏｎら、１９７７）の相補性を研究するのに適してい
る。最初の試みとして、染色体への組込みによりＮＧＡ
２３の形質転換を行なった。 【００５２】この形質転換実験は次のような想定に基い
ている。即ち、ニックトランスレーション化ｐＹＡＳ１
ＤＮＡ（Ｓｔｒａｓｓｅｒ、１９８２）とＳｃｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓのクロモゾームＤ
ＮＡとのサザンハイブリダイゼーションで明らかな如
く、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅのＴＲＰ５遺伝子とＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ａｌｌｕｖｉｕｓの変異したトリプトファンシンセター
ゼ遺伝子との間には高い相同性はないという想定に基い
ている。ＹＲＰ７でのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ＤＮＡの部分的Ｓａｕ３Ａバンク（ｂａｎｋ）から、９
ｋｂ ＤＮＡ断片をクローン化し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＨ２２のｈｉｓ
４変異株と相補性を有するプラスミドＹＲＰ７ＨＩＳ４
を得た（第８図）。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃ
ａｓｔｅｌｌｉｉのこのＨＩＳ４領域から得られる１．
５ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ断片は、相同組換えによ
りＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ
ＮＧＡ２３のゲノムに直接組込むことができる程度に十
分に相同性を有すると考えられた。従って、選択マーカ
ーとしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ Ｔｒｐ５遺伝子及び１．５ｋｂ ＢａｍＨＩ−
ＣｌａＩ断片を含むプラスミドＹＲｐＪＤ２を構築した
（第８図）。 【００５３】ＹＲｐＪＤ２を用いて、Ｂｅｇｇｓ（１９
７８）の文献に記載されたプロトプラスト法によりＮＧ
Ａ２３を形質転換し、ＹＮＢプレート上でトリプトファ
ン光栄養性をスクリーニングした。プラスミドＤＮＡ１
μｇ当り５個の形質転換体が得られた。形質転換前に染
色体への組込みの可能性を高める直線化（Ｏｒｒ−Ｗｅ
ａｖｅｒら、１９８１）が起こらず、またプロトプラス
ト法を用いたＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓの再生度が
０．１％よりも低いことを考慮に入れると、この驚くべ
きほどに高い形質転換度は染色体への組込みによるとは
考え難い。 【００５４】ＹＥＰＤ培地での非選択的条件下に形質転
換体の生育後、Ｔｒｐ⁺表現型が不安定となることから
判るように、ＹＲｐＪＤ２によるＮＧＡ２３の形質転換
は自律的複製に基いている。１５世代後、細胞の８０−
９０％は選択培地で生育能力を失なった。酵母最少溶解
物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換しＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
ｃｅｓＮＧＡ２３を再形質転換することにより、自律的
複製が確認された。更には、サザン分析によりもとのＹ
ＲｐＪＤ２配列の存在が示され（第９図）、従ってトリ
プトファン光栄養性を誘導するＴＲＰ５遺伝子の染色体
への組込み可能性は否定された。 【００５５】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ｅｌｌｉｉの１．５ｋｂ断片を含んでいないｐＹｅ（ｔ
ｒｐ５）１−５３でＮＧＡ２３を形質転換後には、いく
つかの発育不全な形質転換体を除いては、如何なる形質
転換体も得られなかった。このことから、このＳｃｈｗ
ａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＤＮＡ断片には、Ｓｃｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３での
プラスミドＹＲｐＪＤ２の自律的複製を可能にする配列
が含まれていることが示唆される。従って、ベクターＹ
ＲｐＪＤ２におけるＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃ
ａｓｔｅｌｌｉｉの１．５ｋｂ ＤＮＡ断片には、自律
的複製配列、即ちＳｗＡＲＳ１が含まれていると結論す
ることができる。 【００５６】形質転換法 形質転換用のプロトプラスト法（Ｂｅｇｇｓ、１９７
８）によるＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ細胞の再生割
合いは約０．１％であった。再生割合いあるいはプロト
プラスト形成は形質転換度に直接関係しているため、ヘ
リカーゼあるいは酵素分解酵素（ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）
の濃度を変えあるいはＮＧＡ２３へのＹＲｐＪＤ２の導
入のためのインキュベーション時間を変えて、プロトプ
ラスト形成条件を変えることを試みた。ヘリカーゼを用
いた場合には形質転換体は得られなかった。０．１％の
再生割合いで３７℃で３０分間、酵素分解酵素（１ｍｇ
／ｍｌ）のみを用いた場合には、ＹＲｐＪＤ２プラスミ
ドＤＮＡ１μｇ当り５個の形質転換体を得ることができ
た。インキュベーション時間を短縮することによって、
再生割合いは約０．５％に上昇したが、形質転換体は得
られなかった。この知見から、プロトプラスト形成は
（再生度ではなく従って細胞壁の酵素分解）、プロトプ
ラスト法を用いるＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓの形質
転換には臨界的工程であることが証明される。それ故
に、Ｉｔｏら（１９８３）及びＫｌｅｂｅら（１９８
３）の文献に記載された形質転換法をテストした。両者
の方法は細胞壁の酵素的分解を必要としないものであ
る。Ｉｔｏら（１９８３）のリチウムスルフェート法で
は形質転換体は得られなかった。しかしながら、Ｋｌｅ
ｂｅら（１９８３）の凍結溶解法を用いることにより、
ＮＧＡ２３はＹＲｐＪＤ２プラスミドで形質転換されＹ
ＲｐＪＤ２プラスミドＤＮＡ１μｇ当り５０−１００個
の形質転換体が再現性よく得られた。 【００５７】Ｋｌｅｂｅら（１９８３）の方法を用い
て、対数増殖期の酵母（１０ｍｌ）を、２２℃で３分間
１００×ｇで遠心することによりＳＢＥＧ５ｍｌ（１Ｍ
ソルビトール、１０ｍＭビシン、ｐＨ８．３５、３％エ
チレングリコール）で洗った。次いで３０℃でインキュ
ベーションを実施した。得られるペレットをＳＢＥＧ
０．２ｍｌに再懸濁せしめ、５分後にプラスミドＤＮＡ
１−２０μｌを加えた。１０分後に調製物を−７０℃の
フリーザー中に１０分間（あるいはそれ以上）置き、次
いで３７℃水浴中で激しく振とうして溶解した。４０％
精製ＰＥＧ１０００（Ｋｌｅｂｅら、１９８３）及び２
００ｍＭビシンｐＨ８．３５（凍結して保存した）を含
む溶液１．５ｍｌを加え、１時間インキュベーション
後、細胞を０．１５ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭビシン
ｐＨ８．３５を含む溶液２ｍｌで洗った。遠心後、ペレ
ットを０．１５ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭビシンｐＨ
８．３５を含む溶液１ｍｌ中に再懸濁し、選択培地上に
プレートした。上述した条件下に、細胞を−７０℃で凍
結前にプラスミドＤＮＡを添加した。しかしながら、溶
解直前に凍結細胞にＤＮＡを加えることができれば、い
かなるプラスミドで形質転換する場合でも、任意の時期
にコンピテント細胞を得ることができるので有利であ
る。 【００５８】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕ
ｖｉｕｓ変異株ＮＧＡ２３の凍結細胞にＹＲｐＪＤ２
ＤＮＡを加える試みを行なった所、上述した従来法と同
様の形質転換頻度（１μｇ当り５０−１００個の形質転
換体）が得られた。Ｋｌｅｂｅら（１９８３）の文献に
は、再現性ある形質転換にはＰＥＧを使用するのが臨界
的であることが記載されている。従って、Ｋｌｅｂｅら
（１９８３）は最高の形質転換効率を得るために、時間
経過につれて消費されるＰＥＧ１０００の調整を行なっ
ている。 【００５９】このめんどうな方法を回避するために、Ｓ
ｅｒｖａ及びＲｏｔｈ社のいくつかのＰＥＧの影響につ
いてテストした。今までに、Ｒｏｔｈ社のＰＥＧ１００
０を用いた場合に、最高の形質転換効率が得られた。Ｓ
ＢＥＧ中の１Ｍソルビトールを１．２５Ｍ ＫＣｌ及び
３０ｍＭ ＣａＣｌ₂で置換することにより形質転換度
が上昇し（ファクター２で）、ＹＲｐＪＤ２プラスミド
ＤＮＡ１μｇ当り２００個のＮＧＡ２３が得られた。酵
母細胞の凍結中に、血漿膜が損傷を受け、高い浸透性を
有するようになる。加えて、細胞の損傷度は凍結速度に
依存している（Ｌｅｐｏｃｋら、１９８４）。かかる知
見に基き、フリーザー中での−７０℃の凍結（比較的遅
い凍結）、−７８℃でのドライアイスアセトンによる凍
結（早い凍結）及び−１９６℃での液体窒素による凍結
（非常に早い凍結）後の、細胞の形質転換受容能力につ
いてテストした。 【００６０】液体窒素を使用した場合には、形質転換度
は４０％減少し、ドライアイスアセトンを使用した場合
には、−７０℃でのフリーザーによる凍結に比べて形質
転換体の収量は３０％上昇した。凍結細胞（−７０℃で
１０分間−６ケ月保存）にＤＮＡを加え、３７℃で激し
く振とうして溶解した。３７℃の水浴中で振とうする変
わりに、５４３２型エッペンドルミキサーを用いた。溶
解中に激しく振とうする条件の場合に、最も高い再現性
の形質転換度が得られた。この改良法により、Ｓｃｈｗ
ａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３
変異株について、ＹＲｐＪＤ２プラスミドＤＮＡ１μｇ
当り３００−１０００個の形質転換体が生成する形質転
換度が得られた。この簡略形質転換法により、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及びＫｌ
ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（表ＩＩ）につ
いても高い形質転換度が得られる。 【００６１】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕ
ｖｉｕｓ及びＳａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ形質転換体におけるプラスミドコピー数
の評価 本発明による簡略形質転換法を用いて、Ｓｃｈｗａｎｎ
ｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３を以下
のもので形質転換した。 ｐＹｅ（ｔｒｐ５）１−５３：ｐＢＲ３１３（Ｂｏｌｉ
ｖａｒら、１９７７）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ５遺伝子を含む。 ｐＹＡＳ１：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのＬＥＵ２及びＴＲＰ５遺伝子を含む２μＭ
誘導体。 ＹＲＰ７ＴＲ５：ＡＲＳ１及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１とＴＲＰ５遺伝
子を含む。 ＹＲｐＪＤ１：ＳｗＡＲＳ１とＡＲＳ１及びＳａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１と
ＴＲＰ５遺伝子を含む。 ＹＲｐＪＤ２：ＳｗＡＲＳ１及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ５遺伝子を含
む。 ｐＥＫ２ＴＲＰ５：ＫＡＲＳ１とＡＲＳ１及びＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ５
遺伝子を含む。 プラスミドは第８図にまとめて示した。 【００６２】形質転換度及びＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３でのプラスミドの
安定性を表ＩＩＩにまとめて示した。種々のプラスミド
のコピー数はサザンブロット分析（第９図及び第１０
図）により評価した。１個の細胞当り１個のコピー数で
存在するクロモゾームＨＩＳ４遺伝子を内部スタンダー
ドとして使用した。³²Ｐ−ラベル化ＹＲＰ７ＨＩＳ４
ＤＮＡとハイブリダイズする３つのクロモゾームＥｃｏ
ＲＩ断片（０．９ｋｂ、０．６ｋｂ、８．０ｋｂ）が存
在する。ハイブリダイゼーションプローブＹＲＰ７ＨＩ
Ｓ４とクロモゾームＨＩＳ４及びＹＲｐＪＤ１プラスミ
ドとの相同性を第１０図のＤに示した。プラスミドｐＹ
ＡＳ１、ＹＲＰ７Ｔｒｐ５、ＹＲｐＪＤ１（ＹＲｐＪＤ
２）及びｐＥＫ２ＴＲＰ５のコピー数評価のために、
５．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ共通バンドの強さとクロモゾー
ムＨＩＳ４遺伝子の６ｋｂ ＥｃｏＲＩバンドとを比較
した。 【００６３】オートラジオグラムでの発色の強さから、
プラスミドＹＲｐＪＤ１とＹＲｐＪＤ２とは細胞１個当
り約５−１０のコピー数を有していることが判る（第９
図及び第１０図）。プラスミドＹＲＰ７ＴＲＰ５とｐＥ
Ｋ２ＴＲＰ５とは、細胞１個当りほぼ同じ平均コピー数
を有しており、約０．２−約１の範囲内にあり、ＴＲＰ
５断片の方向に無関係である。一方ｐＹＡＳ１は細胞１
個当り約２−約３のコピー数の範囲内である（第１０
図）。ＡＲＳ１とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅの２μｍ ＤＮＡ配列とは、ＳｗＡＲＳ
１と同様の有効性を有してはいないが、Ｓｃｈｗａｎｎ
ｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３での自
律的複製用に使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＡＲＳ１と同様
に、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ
においてＳｗＡＲＳ１と作用し、細胞１個当り５−１０
のコピー数を与える（第１１図、表ＩＶ）。 【００６４】ＳｗＡＲＳ１エレメントに加えてＡＲＳ１
エレメントを有するプラスミドＹＲｐＪＤ１の場合に
は、ＳｗＡＲＳ１エレメントのみしか持たないＹＲｐＪ
Ｄ２に比べてそのコピー数は全く増加しない。ＡＲＳ１
エレメントに加えてＫＡＲＳ２エレメントを持つプラス
ミドｐＥＫ２ＴＲＰ５の場合には、ＡＲＳ１エレメント
のみしか持たないプラスミドＹＲｐ７ＴＲＲ５と同様の
コピー数を有する。従って、ＫＡＲＳ２はＳｃｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓにおいて有効な自
律的複製エレメントとはなり得ないと考えられる。ｐＹ
ｅ（ｔｒｐ５）１−５３（Ｗａｌｔｚら、１９７８）に
よるＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ
の形質転換については、その形質転換体の安定性は極め
て低く（表ＩＩＩ）、不充分な形質転換が起こる。 【００６５】クローン化Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｃａｓｔｅｌｌｉｉα−アミラーゼ遺伝子の調節及び
Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓでの蛋
白質の過剰生産 酵母Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ種のα−アミラーゼ
産生は、グルコースの存在下に異化代謝産物抑制を受け
ている（Ｓｉｌｌｓら、１９８２）。α−アミラーゼの
合成は、溶解性デンプンデキストリン及びマルトースに
よって誘導される（Ｓｉｌｌｓら、１９８２）。デンプ
ンの分解後の生成物の一部であるマルトースは、溶解性
デンプンより強いインデューサーであることが判った
（Ｓｉｌｌｓら、１９８４ｂ）。非常に低レベルのアミ
ラーゼが組織的に産生されている。この低レベルのα−
アミラーゼがデンプンを加水分解し、マルトースの如き
低分子量の糖を遊離し、これが細胞膜に浸透してα−ア
ミラーゼの合成を誘導している（Ｓｉｌｌｓら、１９８
４ｂ）。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ ａｌｌｕｖｉｕ
ｓでのクローン化α−アミラーゼ遺伝子の調節と発現を
調べるために、α−アミラーゼ構造遺伝子を含む５ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片をＹＲｐＪＤ２に挿入して（第８
図）、プラスミドＹＲｐＪＤ２−αを得、ＹＮＢプレー
ト上でのトリプトファン原栄養性を選択マーカーとし
て、このプラスミドＹＲｐＪＤ２−αをＳｃｈｗａｎｎ
ｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３に導入
した。 【００６６】第５図のＢに示されているように、ＹＮＢ
マルトース培地で誘導条件下に生育したＮＧＡ２３：Ｙ
ＲｐＪＤ２−α形質転換体の全α−アミラーゼ活性は、
α−アミラーゼをコードするプラスミドを含まないコン
トロール形質転換体ＮＧＡ２３：ＹＲｐＪＤ２に比べ
て、４−５倍に増加した（第４図のＡ）。α−アミラー
ゼ合成の誘導期においては、コントロール形質転換体に
比べて、細胞濃度（ＯＤ₆₀₀ｎｍ）当りの細胞外α−ア
ミラーゼ活性が７倍に著しく上昇するのは、Ｓｃｈｗａ
ｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓのＳｗＡＲＳ１
プラスミドの５−１０のコピーと密接に関連している。
従って、α−アミラーゼ活性の上昇は、遺伝子量の効果
によるものと結論することができる。ＮＧＡ２３：ＹＲ
ｐＪＤ１及びＮＧＡ２３：ＹＲｐＪＤ２形質転換体を、
２％グルコースを含むＹＮＢ培地で抑制条件下に生育せ
しめた時には、グルコース濃度が約０．２ｍＭ（第４図
のＣ及びＥ）に下がるまで細胞外培地のα−アミラーゼ
活性は測定不能である。しかして、α−アミラーゼをコ
ードするプラスミドは、クロモゾームα−アミラーゼと
しての異化代謝産物抑制により調節されている。 【００６７】ＰＤＣ１又はＰＧＫ遺伝子のプロモーター
などの高度発現プロモーターのコントロール下にあるα
−アミラーゼ構造遺伝子を構築することにより、生育段
階及び炭素源とは無関係の高度発現株を得ることができ
る。α−アミラーゼ蛋白質の過剰生産は、培養上清のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏラベル化蛋白質をフルオログラフィーに
よって分析することにより示された（第１２図）。２％
グルコース及び唯一の炭素源としての４％グルコースを
含むＹＮＢ培地でＭＣ３４：ｐＹＣ１α形質転換体を生
育せしめた場合、その細胞外培地のα−アミラーゼ活性
が測定できた。このことは、α−アミラーゼをコードす
るプラスミドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅでは異化代謝産物抑制による調節を受け
ていないことを示している。 【００６８】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕ
ｖｉｕｓの栄養要求株の単離 グルコアミラーゼ遺伝子のクローニングを行なうため、
Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓグル
コアミラーゼ変異株の機能的相補性を選択した。クロー
ン化遺伝子によって相補可能な適当な変異株を入手する
ことが１つの必要条件である。この目的のために、マル
トースあるいは溶解性デンプンを唯一の炭素源とした場
合に生育することができないＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ変異株ＮＧＳ１を分析した。こ
の変異株を、１％グルコース及び１％溶解性デンプンを
含むプレート上で生育せしめた場合、ヨード発色後にハ
ロ形成が観察された。これは変異株によってα−アミラ
ーゼが分泌されたことを示している。粗抽出物及び培養
上清中には、グルコアミラーゼ活性は検出されなかっ
た。 【００６９】すでに述べた如く、α−アミラーゼはデン
プンをデキストリン、マルトース及びより高度のオリゴ
サッカライドに加水分解することができる（第７図）。
一方、グルコアミラーゼは、これらの生成物をグルコー
スへの酵素的加水分解用基質として利用することができ
る。ＮＧＳ１変異株の興味ある特徴は、マルトースでは
生育できないことである。Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ
ｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ野生型は、細胞外培地においてマ
ルトースをグルコースに加水分解するグルコアミラーゼ
を分泌することができ、従ってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとは対照的にマルトース取
り込みシステムを必要としない。従ってＮＧＳ１はα−
アミラーゼ＋ グルコアミラーゼ− 変異株であって、
構造遺伝子あるいはプロモーター領域のいずれかに変異
点を有していて機能的グルコアミラーゼを有さないもの
である。本発明者らは、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｃａｓｔｅｌｌｉｉのグルコアミラーゼ遺伝子を機能
的相補性によりクローン化するため、このグルコアミラ
ーゼ変異株に注目した。 【００７０】クローニングのため、このα−アミラーゼ
＋ グルコアミラーゼ− 変異株に更に変異を好ましく
はｔｒｐ５変異（これによりインドールトリプトファン
反応が欠除される）をもたらす必要がある。なぜなら
ば、例えばＹＲｐＪＤ１、ＹＲｐＪＤ２などのプラスミ
ドを含むＳｗＡＲＳ１上の選択マーカーとしてＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ５
遺伝子を用いて、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌ
ｌｕｖｉｕｓを効率的に形質転換できるためである。更
には、これら変異株はインドール蓄積特性により容易に
同定できるためである。ｔｒｐ栄養要求株の単離のため
に、３０℃ですべての手法を実施した。ＮＧＳ１培養１
０ｍｌを複合培地中でＯＤ₆₀₀＝０．６まで生育せし
め、水で２回洗浄し、次いでＵＶ光（２５４ｎｍ）で５
０秒間さらした（１％生存）。ｔｒｐ栄養要求株を分離
するため、変異を受けた細胞を複合培地で２日間インキ
ュベートし、次いで、トリプトファンを含む最少培地及
びすべてのアミノ酸を含むがトリプトファンは含まない
最少培地でレプリカ培養を行なうためにＹＥＰＤプレー
ト上にプレートした。 【００７１】２６１４個のテストコロニーから、トリプ
トファンを含む最少培地で生育するが、トリプトファン
以外のすべてのアミノ酸を含む最少培地では生育しない
７個のｔｒｐ栄養要求株を単離した（回収比：１０^-7−
１０^-8）。この７個のうち２個の変異株が、インドール
を蓄積するためインドールトリプトファン反応経路を欠
失していることが判った。このｔｒｐ５、αアミラーゼ
⁺グルコース^-変異株を、ＮＪＤ１、ＮＪＤ２と命名し
た。この２つの株はＹＲｐＪＤ１によって有効に形質転
換され、ＤＮＡ１μｇ当り約８００個の形質転換体が得
られた。このことは、ＮＪＤ１及びＮＪＤ２はＴＲＰ５
遺伝子において実際に変異を受けたことを示している。
更に、α−アミラーゼ遺伝子の場合と同様にして、クロ
ーニング法を実施した。 【００７２】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕ
ｖｉｕｓでの遺伝子クローニング用のＥ．ｃｏｌｉ−Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−Ｓ
ｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓコスミ
ドシャトルベクターの構築 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで
の遺伝子クローニング用に構築されたコスミドｐＹｃ１
（２μ）とｐＹｃ２（ＡＲＳ）と同様にして（Ｈｏｈｎ
及びＨｉｎｎｅｎ、１９８０）、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍ
ｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓでのクローニング用のコス
ミドを構築した。コスミドは、クローニングに必須の配
列（複製起点、選択マーカーとしての遺伝子及び適当な
クローニング部位）とともにバクテリオファージλのｃ
ｏｓ（付着配列）領域（Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＨｏｈｎ、
１９７８）を含むプラスミドである。ｃｏｓ配列は、イ
ンタクトバクテリオファージλを産生する（Ｈｏｈｎ、
１９７５）ためのＤＮＡパッケージングに必要な構造情
報を含んでいる。ｃｏｓ配列が、λファージゲノムの約
７３％−１０５％に対応する３７−５２ｋｂ ＤＮＡ断
片（Ｆｅｉｓｓら、１９７７）によって分離されている
場合には、高分子量のオリゴマーコスミドＤＮＡをｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージング法（Ｈｏｈｎ、１９７９）
により有効に導入することができる。クローニング断片
が比較的大きい場合には、約３０−４０ｋｂの平均サイ
ズを有する断片を含む１，２００個のコスミドクローン
で、９５％以上のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅゲノムを包含することができる。 【００７３】大きなＤＮＡ断片をクローニングするため
には、高濃度ＤＮＡを連結することによって比較的高分
子量のオリゴマーＤＮＡが容易に得られるという点で、
プラスミドＤＮＡを用いるよりもコスミドを用いた方が
有利である。他方、大きなＤＮＡ断片を小さなベクター
ＤＮＡと連結させて環状の導入可能なプラスミドを形成
するのは、断片の大きさとフリー末端の有効濃度との間
の関係があるために、一般的に不利である（Ｄｕｇａｉ
ｃｚｙｋら、１９７５）。更には、コスミドの場合、取
り込まれたＤＮＡは、λ感受性Ｅ．ｃｏｌｉを感染する
ことによって有効に導入することができる（Ｈｏｈｎ及
びＨｉｎｎｅｎ、１９８０）。 【００７４】かかる知見に基き、ｃｏｓ領域を含むプラ
スミドｐＨＣ７９（Ｈｏｈｎ及びＣｏｌｌｉｎｓ、１９
８１）の１．７ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ断片を、ＹＲｐＪＤ
２の２つのＢａｍＨＩ部位の１つにサブクローンするこ
とによって、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコスミドシャトルベクターを構
築した。従って、ＹＲｐＪＤ２をＢａｍＨＩ（０．５単
位／μｇ ＤＮＡ、３０℃）で部分消化し、ＢａｍＨＩ
による単一開裂で生じる最も長い直線状のＤＮＡを分離
用ゲル電気泳動で単離し、ｐＨＣ７９ＤＮＡの完全消化
後分離用ゲル電気泳動で単離されたｐＨＣ７９の１．７
ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ断片と連結した。得られた連結体を
用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１を形質転換し、アンピ
シリン耐性をマーカーとして形質転換体を選択した。ニ
ックトランスレーション化１．７ｋｂ Ｂｇｌ Ｉ断片
を放射活性プローブとして用いるコロニーハイブリダイ
ゼーションにより、サブクローンをスクリーニングし
た。 【００７５】陽性のクローンから、２つのコスミド、即
ちｐＣＪＤ５−１及びｐＣＪＤ５−２（第１３図のａ）
を単離し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩＩで開
裂後分析した（第１３図のｂ）。第１３図のｂから、コ
スミドｐＣＪＤ５−１の場合には、ＳｗＡＲＳ１とＴＲ
Ｐ遺伝子の間のＹＲｐＪＤ２のＢａｍＨＩ部位に、ｃｏ
ｓ配列がサブクローン化されていることが判る。ｐＣＪ
Ｄ５−２の場合には、ｃｏｓ領域は同じ位置に縦に並ん
で挿入されていた。縦に並んで２つのｃｏｓエレメント
が存在することにより、１つのｃｏｓエレメントしか含
まないコスミドに比べて、はるかに高いパッケージング
効率を示すものと考えられる（Ｌｉｎｄｅｎｍｅｉｅｒ
ら、１９８２）。今日まで、これがｐＣＪＤ５−２の場
合にもあてはまるかどうかテストされていない。 【００７６】コスミドｐＣＪＤ５−１及びｐＣＪＤ５−
２については、トリプトファンに基いて選択することに
より、コスミドＤＮＡ１μｇ当り５００−１０００個の
ＮＪＤ１形質転換体が得られた。このことは、ｃｏｓエ
レメントは形質転換度に影響を及ぼさないことを示して
いる。両者のコスミドは以下のものを含んでいる。 （ａ）：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ同様Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖ
ｉｕｓにおいても複製起点として作用するＳｗＡＲＳ１
配列； （ｂ）：Ｅ．ｃｏｌｉ複製用起点； （ｃ）：Ｅ．ｃｏｌｉでの選択マーカーであるアンピシ
リン耐性遺伝子； （ｄ）：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ｒｐ５変異株同様Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｎｙｃｅ
ｓ ａｌｌｕｖｉｕｓにおいても選択マーカーとして作
用するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのＴＲＰ５遺伝子；及び （ｅ）：コスミドライブラリー構築に必要なｃｏｓ領
域。 更には、これら２つのコスミドは適当なクローニング部
位、即ちＢａｍＨＩ部位及びＳａｕ３Ａ、ＢａｍＨＩ、
Ｂｇｌ ＩＩ、ＳａｌＩ及びＸＨＯＩ断片をクローニン
グするためのＳａｌＩ部位を有しており、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ及びＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕ
ｓで遺伝子をクローンするためゲノムＤＮＡライブラリ
ー構築用の新規なコスミドベクターが提供される。 【００７７】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ｅｌｌｉｉのグルコアミラーゼ遺伝子のクローニング Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉの
ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで部分消化し得られるＤＮＡ
断片を、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚら（１９８１）の文
献に記載された技術を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−Ｓｃｈｗ
ａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓシャトルベク
ターｐＣＪＤ５−１に連結してＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
ｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉ ＡＴＣＣ２６０７６コスミ
ドプール（ｐｏｏｌ）を得て、グルコアミラーゼ遺伝子
のクローニングを開始した。このＤＮＡ連結体のｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージング後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１株に感染せしめ約１５，０００個のアンピシリン耐性
コロニーを得た。これは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（約１５，０００ｋｂ）と同様
のゲノムサイズを有すると考えられるＳｃｈｗａｎｎｉ
ｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉの約３０ゲノムサイズ
当量、及び３０と４０ｋｂの間のクローン化ＤＮＡ断片
に対応する。この形質導入体から、コスミドＤＮＡを単
離し、２％グルコースを含む最少培地でのｔｒｐ原栄養
性を選択マーカーとして、ＮＪＤ１（α−アミラーゼ⁺
グルコアミラーゼ^-ｔｒｐ５）を形質転換せしめた。 【００７８】プロトプラス法（Ｂｅｇｇｓ、１９７８）
及び本発明の簡略凍結溶解法を用いた場合の形質転換度
は比較的低かった（コスミドＤＮＡ１μｇ当り１−１０
個の形質転換体）。それにもかかわらず、溶解性デンプ
ンを唯一の炭素源として生育できる能力を回復した３，
０００個の形質転換体が得られた。Ｔｒｐ⁺及びグルコ
アミラーゼ⁺表現型を有する１個のＮＪＤ１形質転換体
がデンプンプレートから単離された。分裂安定性テスト
（Ｂｅｇｇｓ、１９７８）により、ＴＲＰ５表現型とグ
ルコアミラーゼ相補性機能とが分離された。従ってこの
ことから、両者の遺伝子がコスミドによって運ばれてい
たことが判る。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を酵母最少溶
解物で形質転換しアンピシリン耐性をマーカーとして選
択することによりコスミドが回収された。コスミドＤＮ
Ａを単離しＮＪＤ１の再形質転換に使用して、グルゴア
ミラーゼ相補性機能が単離したコスミドＤＮＡによって
運ばれていることを確認した。ＢａｍＨｌでコスミドを
開裂後、２つのＢａｍＨｌ部位をクローン化断片中へ集
め、次いでそれを３つの断片に分けた。そのうちの２つ
は、それぞれ約１０ｋｂ、約１２ｋｂの断片である。 【００７９】約４０ｋｂのコスミドのサイズを小さくす
るために、ＢａｍＨＩ断片を、ｐＣＪＤ５−１プラスミ
ドの唯一のＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した。従っ
て、コスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、再連結し
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１に導入した。アンピシリン耐
性の細胞から得たプラスミドＤＮＡを用いてＮＪＤ１を
形質転換し、溶解性デンプンを唯一の炭素源として生育
できるか否かをスクリーニングした。ＨＢ１０１を酵母
最少溶解物で形質転換し、アンピシリン耐性をマーカー
として選択することによりプラスミドＤＮＡを回収し
た。ＢａｍＨＩで消化後の制限酵素分析に付すためにプ
ラスミドＤＮＡを単離した。 【００８０】グルコアミラーゼ相補性機能は１２ｋｂ
ＢａｍＨＩ断片によって運ばれ、ｐＣＪＤ５−１にサブ
クローン化されたことが、第１５図に示されている。こ
のプラスミドをｐＣＪＤ５−ＡＭＧ１と命名した（第１
４図）。このプラスミドは、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ同様にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいても活動できるＳｗ
ＡＲＳ１エレメントを含んでいるため、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでクローン化され
た遺伝子は、Ｘ３６５６を形質転換せしめトリプトファ
ン原栄養性で選択することによって分析した。残念なが
ら、形質転換体は溶解性デンプンを唯一の炭素源として
利用することはできなかった。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのｐＣＪＤ５−ＡＭＧ１
の５−１０個のコピーでは起り得るタンパク質分解酵素
による分解に打ち勝つことができないという最初の説明
が否定されたことになる。なぜなら、約１２ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩ断片を、細胞１個当り５０−１００個のコピー数
を有するプラスミドｐＪＤＢ２０７（Ｂｅｇｇｓ、１９
８１）（第１４図）にサブクローン化し次いでＧＲＦ１
８Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
を形質転換した場合でも、溶解性デンプンを唯一の炭素
源として生育できる形質転換体は全く得られなかったか
らである。 【００８１】グルコアミラーゼ活性は、ＮＪＤ１：ｐＣ
ＪＤ５−ＡＭＧ２形質転換体では測定できたが、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換
体の粗抽出物及び培養濾液のいずれにおいてもグルコア
ミラーゼ活性は検出されなかった。高等真核生物遺伝子
の転写体から介在配列を正確に取り除くことができると
いう点ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅよりもＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｐｏｍｂｅの方がはるかに有利であるということ
が、Ｋａｖｆｅｒら（１９８５）によって最近報告され
たため、フィション（ｆｉｓｓｉｏｎ）酵母でグルコア
ミラーゼを発現させることを試みた。しかしながら、Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ
ｌｅｕ １−３２（プラスミドｐＪＤＢ２０７−ＡＭＧ
１で形質転換後、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅのＬＥＵ２で相補した（ｃｏｍｐｌｅｍ
ｅｎｔ）もの（第１４図）では、発現も分泌もいずれも
検出されなかった。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａ
ｃｔｉｓ ＳＤ１１（ｔｒｐ１）をｐＥＫ２−ＡＭＧ２
（第１４図）で形質転換した場合にも、溶解性デンプン
を唯一の炭素源として生育できる形質転換体は得られな
かった。以上から、異なるスプライシング特異性、異な
るプロモーター認識あるいはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓに特異的な転写後のスプライシングがあるため、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及
びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおいて
機能的に発現できないＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ遺
伝子がクローン化されたと結論することができる。 【００８２】更に分析を行なうため、機能的相補性特性
を保持した可能な最も小さいＤＮＡ断片を得ることを目
的として、１２ｋｂ ＤＮＡ断片のサブクローニングを
実施した。グルコアミラーゼの分子量は約１１７，００
０ｄであり（Ｓｉｍｏｅｓ−Ｍｅｎｄｅｓ、１９８
４）、これは約３ｋｂの構造遺伝子に相当する。更に、
遺伝子の配列を決定して、有用なコドン及び存在可能な
イントロンの分析を行なうことができる。更には、Ｓｃ
ｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ＤＮ
Ａの５′非コードリーダー配列を、よく特性が解明され
たプロモーター例えばＡＤＨ１（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、
１９８１）、ＰＤＣプロモーター（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ
ｇら、１９８３）と交換して、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
ｃｅｓ ｐｒｏｍｏｔｏｒの他の酵素種での非効率性を
除くことができる。 【００８３】グルコアミラーゼ遺伝子の特性を解明する
ために、グルコアミラーゼ特異的抗体産生用にグルコア
ミラーゼを単離した。そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅあるいはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅと同様にＮＪＤ１の粗
抽出物及び培養濾液をアッセイし、またＫｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓについて不活性グルコアミ
ラーゼの存在をアッセイした。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体では、ノーザン
分析によってはプロモーター活性は検出されなかった。
更には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ形質転換体の培養上清液及び粗抽出物において
も、グルコアミラーゼに特異的な抗体を用いて測定して
も蛋白質は何んら検出されなかった。更に、クローン化
遺伝子分析用の合成オリゴヌクレオチドを合成するため
に、精製グルコアミラーゼのペプチドを、アミノ酸配列
決定用に単離した。 【００８４】Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓコスミドラ
イブラリーの構築の際に生じたクローニング合成物を除
くため、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）の文献に記載
されたと同様にして、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分断片（１
０−３０ｋｂ）を含み約１５００００個の挿入物を有す
るＣｈａｒｏｎ ４Ａ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
ｃａｓｔｅｌｌｉｉライブラリーについて、直接グル
コアミラーゼ遺伝子のスクリーニングを行なった。ペプ
チド３（アミノ酸１１−１８）の一部及びペプチド４に
それぞれ由来する、２つの異なるオリゴヌクレオチド混
合物によって、Ｃｈａｒｏｎライブラリーを更に分析し
た（第３図参照）。両者の５′ラベル化オリゴヌクレオ
チド混合物とハイブリダイズする最も小さい制限酵素断
片は、３．７ｋｂのＢｇｌ ＩＩＤＮＡ断片であった。
Ｓ１マッピングにより、この断片内に完全な転写マップ
が現われた。この断片のＤＮＡ配列を、マキサムとギル
バート（１９８０）法により決定した。このＤＮＡ配列
は第１７図に示した通りである。５つのペプチド配列の
全ては、２８７４個の塩基のオープンリーディングフレ
ーム内にあった（第３図）。 【００８５】プロモーターを変換することにより、グル
コアミラーゼ遺伝子の発現が達成された。Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター領
域が、グルコアミラーゼ遺伝子のコード配列の５′上流
側に挿入されたとき、転写の開始と調節が行なわれた。
グルコアミラーゼ遺伝子の翻訳開始点の前には、プロモ
ーターを融合させるために使用できる適当な制限酵素部
位はなかった。そこで本発明者らは、Ｋｒａｍｅｒらの
文献記載のギャップ化２重鎖ＤＮＡ法による特定部位突
然変更誘発により、翻訳開始コドンの５′側にＢａｍＨ
ＩとＳａｌＩ部位を導入した。 【００８６】４２個の塩基の合成オリゴヌクレオチド
（５′ＣＴＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣ
ＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＣ３′）をア
ニール化してギャップ化した２重鎖ＤＮＡを得た。ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ラージ フラグメント）で１本鎖領域
を充填し、連結及びＥ．ｃｏｌｉ形質転換を行ない、翻
訳開始コドンの最初の塩基に対して−１５の位置にＳａ
ｌＩ部位を、−９の位置にＢａｍＨＩ部位を有する組換
え変異プラスミドを単離した。得られる組換えプラスミ
ドから、構造遺伝子を、適当な発現ベクターのＢａｍＨ
Ｉ／Ｓａｌ，ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｌＩ／
ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ／Ｐｓｔ
Ｉ，ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩあるいはＳａｌＩ／ＸｂａＩ
としてサブクローン化することができた。この適当な発
現ベクターは、これらの制限酵素部位の１つを有する遺
伝子を異なるプロモーターに融合したものである。他の
いずれの適当な制限酵素部位も、適当なリンカーを用い
ることにより導入することができる。 【００８７】酵母の異なるプロモーター、異なる選択マ
ーカー及び異なる複製起点（２μ，ＡＲＳ及び（ＥＮ）
を用いた異なる発現ベクターを構築した。例えば、プラ
スミドｐＢＭ２７２の誘導可能なガラクトキナーゼ（Ｇ
ＡＬ１）プロモーターに遺伝子を融合した。このプラス
ミドは、ＢａｍＨＩ部位の直ぐ後にＨｉｎｄＩＩＩ部位
を導入することにより、ベクターｐＢＭ１５０（Ｊｏｈ
ｓｔｏｎとＤａｖｉｓ １９８４）から直接得ることが
できる。融合物のＤＮＡ配列は以下の通りである。 5′..... 上流の活性部位 .................................. ....GATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCG GTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACC TCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCAAGATGATTTTTCTGAAGC.....3′ 【００８８】グルコアミラーゼ遺伝子を含む断片を、Ｂ
ａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてベクターｐＢＭ
２７２にサブクローン化した。得られるプラスミドを、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
αＭＺ４（αｇａｌ１，ｔｒｐ１，ｕｒａ３，ｌｅｖ
２）に導入した。これにより、グルコアミラーゼ遺伝子
の発現及び活性グルコアミラーゼの分泌が可能になっ
た。培養上清における活性量は、誘導条件下に生育せし
めたＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ
の培養上清で測定した範囲内にあった。 【００８９】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ形質転換体により分泌されたグルコアミラー
ゼは、５０℃において最大活性を有し、Ｓｃｈｗａｎｎ
ｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓのグルコアミラーゼ
の場合と同様に６０℃で不活性化される。グルコアミラ
ーゼの発現及びグルコアミラーゼ蛋白質の分泌は、ピル
ベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）プロモーター（Ｈ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、１９８３）、ホスホグリセラー
ト キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Ｄｏｂｓｏｎ
ら、１９８２）、ｐｇａｐ４９１（ＨｏｌｌａｎｄとＨ
ｏｌｌａｎｄ、１９７９）の遺伝子のグリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ
Ｈ）プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ１（Ａ
ＤＨ１）プロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎｒら、１９８
１）、カッパーキレーション（ＣＵＰ１）プロモーター
（Ｋａｒｉｎら、１９８４、Ｂｕｔｔら、１９８４）及
びアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＲ２又はＡＤＨ
２）でプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３、Ｂ
ｅｉｅｒら、１９８５）のコントロール下においても達
成することが出来る。 【００９０】グルコアミラーゼの過剰生産は、ＰＤＣ−
プロモーターと高コピー数プラスミド（ｌｅｖ２ｄを有
する２μ）を用いることにより達成できる。グルコアミ
ラーゼ遺伝子の発現及びグルコアミラーゼ蛋白質の分泌
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写シグナルの融合
後のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおい
ても検出することができる（Ｂｒｅｕｎｉｇら、１９８
４）。グルコアミラーゼ遺伝子の発現及びグルコアミラ
ーゼ蛋白質の分泌は、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ
ＤＨ１）遺伝子の転写シグナルの融合後のＳｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおいても検
出することができる（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）。
グルコアミラーゼ遺伝子の発現及びグルコアミラーゼ蛋
白質の分泌は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨ
ＡＳ）（Ｊａｎｏｗｉｃｚら、１９８５）メタノールオ
キシダーゼ（ＭＯＸ）の転写シグナルの融合後のＨａｎ
ｓｅｎｖｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいても検出する
ことができる（Ｌｅｄｅｂｏｅｒら、１９８５）。 【００９１】更には、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓプ
ロモーターをＨａｎｓｅｎｖｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
のＭＯＸプロモーターに変換後に、α−アミラーゼの分
泌を検出することができる。グルコアミラーゼ遺伝子
を、Ｅ．ｃｏｌｉ配列を使用することなく、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのクロモゾー
ムに組み込んだ。従って、異なるプロモーター−グルコ
アミラーゼ融合体が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅの適当なＤＮＡ配列、好ましくはホ
モタリズム（ｈｏｍｏｔｈａｌｉｓｍ）遺伝子（ＨＯ）
又はＡＲＳ−配列に挿入された。次いで、グルコアミラ
ーゼの機能的遺伝子に接するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列内に終点を有する線状Ｄ
ＮＡ断片が産生された。ＹＥＰ３６によるＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの同時形質転換
（Ｂｕｔｔら、１９８４）により、遺伝子が安定に組み
込まれた。組み込み体は、培養上清においてグルコアミ
ラーゼ活性を発揮し、野性型と同様の発酵及び生育特性
を有していた。 【００９２】本明細書に記載した如く、遺伝子操作によ
って得られた微生物好ましくは酵母は、高分子量の炭水
化物を加水分解することができるため、多くの発酵工程
に非常に有利なものである。前述した如き遺伝子的に変
換された酵母株の可能な用途の１つは、バイオマス製造
における用途である。α−アミラーゼとグルコアミラー
ゼを分泌することができる新しい能力を有する本発明の
酵母株は、更に他の優れた発酵能力をも有しているた
め、かかる酵母株を使用することにより、バイオマスを
最も効率よく製造することができる。バイオマスを製造
する方法自体は当業者に公知の通常の方法である。α−
アミラーゼとグルコアミラーゼとを産生できるＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの更に他の
用途は、パン酵母を用いたパンの製造及びパン酵母の製
造である。 【００９３】本発明の酵母は、例えば慣用的なドラムド
ライ工程により製造されるペレット酵母として使用する
ことができ、また、例えば粒子径１．７ｍｍ又はそれ以
上の粉末状酵母とすることもできる。粉末状酵母は、液
状酵母組成物を空気中でスプレードライし、次いで公知
の方法により乾燥することにより製造することができ
る。本発明の酵母は、ＧＢ−ＰＳ１４５９４０７、ＧＢ
−ＰＳ１４５９０８５又はＧＢ−ＰＳ１２３０２０５に
記載された如き方法により乾燥酵母とすることもでき
る。パン酵母を製造する他の全ての公知の方法あるいは
本発明の酵母を用いて焼いて得られる生産物を製造する
全ての公知の方法を適用することができる。 【００９４】本発明により提供される遺伝子操作により
得られた酵母株は、エタノールの製造に極めて適してい
る。発酵によるエタノール製造に好適な微生物は、酵母
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで
あり、エタノール製造に用いられる好ましい炭水化物は
デンプンである。しかして、デンプンを定量的に発酵す
ることのできるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅがエタノール製造に極めて有利である。本
発明で提供される遺伝子操作により得られる酵母株を用
いて飲むに適した酒あるいはエタノールを製造するため
には、それ自体公知の方法を採用することができる。本
発明の酵母株は、高濃度炭水化物溶液を発酵することが
でき、エタノールトレランスを有し、高濃度のエタノー
ルを産生することができ、くり返しリサイクルして使用
することができ、また温度トレランスを有する。 【００９５】α−アミラーゼとグルコアミラーゼを産生
することができる新規Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅの最も重要な用途は、特別のビー
ル、好ましくは低炭水化物ビールの製造である。本明細
書に既に記述した如く、低炭水化物のビールを製造する
１つの技術は、発酵中にウワート（ｗｏｒｔ）にデンプ
ン分解酵素を加えることである。ウワート中の７０％−
７５％のデキストリンは分枝型であるため、ウワートデ
キストリンを発酵可能な糖に完全に加水分解するために
は、脱分枝活性を有する酵素が必須である。遺伝子操作
により得られるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅの産生するグルコアミラーゼは脱分枝活性
を有しており、従ってデキストリンを完全に加水分解す
ることができる。新規Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅによって産生されるデンプン分解酵
素の重要な特徴は、醸造工程において通常使用される低
温殺菌サイクルに対する感受性である。 【００９６】ビールを製造する方法は、一連の工程から
成り、麦芽にする工程でスタートする。この時に、大麦
を水に浸して発芽せしめ、この工程で穀粒からのデンプ
ンを糖に変換するアミラーゼが遊離される。次の工程
で、濾過により穀粒を除き、得られる液状のウワートを
ホップで醸造する。ホップによりビールににが味が与え
られ、この工程でデンプンから糖への酵素的変換が終了
する。次いでウワートを冷却して、濾過により沈殿した
蛋白質を除く。次いで酵母をウワートに加えて糖をアル
コールとＣＯ₂に変換し、その後得られる混合物を保存
し、酵母を沈殿させて、再びビールを濾過し、ボトル又
はカンにつめて低温殺菌する。低カロリービールを製造
するためには、できるだけ多くの炭水化物を発酵工程に
おいて消費するのが望ましい。この目的のためには、α
−アミラーゼとグルコアミラーゼを産生する新規Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に適
している。低カロリービールを製造する方法は、醸造工
程においてデンプン分解酵素を加えない以外は、ヨーロ
ッパ特許出願Ｎｏ．０１６３１３５に記載された一般的
方法により実施することができる。上記の醸造方法は、
時間がかからず高価なデンプン分解酵素を加えることな
く実施することができる。 【００９７】本発明で得られる遺伝子操作によるＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用い
て、公知の醸造工程を実施することにより、特別のビー
ル好ましくは低炭水化物ビール、糖の発酵度に依る低カ
ロリービールが得られる。本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて醸造工程を実
施する場合には、発酵工程での最後のＥｓにおいて時間
が短縮するため、醸造工程の所要時間が短かくなる。本
発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅを用いた製造方法は、高重量ウワートからのビール
製造に適用することができる。ビールの炭水化物レベル
は発酵時間及びその後の稀釈によって調節することがで
きる。更には、その成分のかなりの部分が懸濁した炭水
化物水和物である基質の発酵に適用することができる。
遺伝子工学により得られたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを発酵ウワートに接触せしめ、
次いでコンディショニング前に発酵を行なう。低カロリ
ービールの製造方法について、次の実施例により更に詳
細に説明する。 【００９８】 【実施例】実施例Ｉ遺伝子操作により得られたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたビール醸造 醸造ウワートを慣用的醸造法により調製した。即ち、ウ
ワートの抽出物の８０％は麦芽からのものであり、２０
％はコーングリット（ｃｏｒｎ ｇｒｉｔｓ）である。
このウワートは１１．７⁰Ｐ．の重量を有していた。３
リットルフレーカーにウワート２．５リットルを入れ、
更に遺伝子工学により得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのラガー醸造株のウエット酵母
１．５ｇ／ｌを加えた。少量発酵のため、９℃の温度で
嫌気的条件下に機械的に攪拌しながら発酵を行った。こ
の株は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌ
ｌｉｉのα−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼ遺
伝子を形質転換により受け入れている。形質転換酵母株
から両者の酵素が分泌された。コントロールとして、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの本
来のラガー株を用いた。発酵の最後にビールを０℃に冷
却し、酵母をビールから除き、残った抽出物とエタノー
ル％について分析した。また出来たてのビールのガスク
ロマトグラムを実施し、エステル及び高級アルコールの
量を測定した。本来のラガー醸造株を用いた場合
（Ａ）、α−アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅
したラガー醸造株を用いた場合（Ｂ）、グルコアミラー
ゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株を用
いた場合（Ｃ）、あるいはα−アミラーゼとグルコアミ
ラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株
を用いた場合（Ｄ）に得られる出来たてのビールについ
て分析した。 【００９９】 A B C D 元の重量⁰Ｐ 11.70 11.53 11.60 11.57 エタノール％ ｗ／ｗ 3.99 4.02 4.72 4.74 見かけの抽出物⁰Ｐ 2.14 1.88 0.30 0.22 見かけの発酵度 ％ 81.7 83.7 97.4 98.1 実際の抽出物 ⁰Ｐ 3.96 3.71 2.43 2.36 実際の発酵度 ％ 66.2 67.8 79.0 79.6 【０１００】 ガスクロマトグラフィー分析 アセトアルデヒド mg/l 2.0 2.1 3.1 3.9 アセトン mg/l 0.29 0.37 0.38 0.38 エチル ホルメート mg/l 0.05 0.18 0.19 0.14 エチルアセテート mg/l 20.6 21.7 33.0 39.9 エチル プロピオネート mg/l 0.07 0.06 0.06 0.07 イソアミルアセテート mg/l 2.45 2.21 2.95 2.92 メタノール mg/l 2.0 2.5 2.3 2.6 Ｎ−プロパノール mg/l 17.5 16.3 21.0 17.7 イソブタノール mg/l 14.2 12.6 14.7 15.3 光学活性アミルアルコール mg/l 21.5 19.0 21.8 20.4 イソアミルアルコール mg/l 62.5 54.2 57.6 55.1 全高級アルコール mg/l 115.7 102.1 115.1 108.5 【０１０１】実施例ＩＩ 発酵温度を１３．５℃とする以外は実施例Ｉと同様にし
て発酵を行なった。発酵７日後にビールを０℃に冷却し
た。本来のラガー醸造株を用いた場合（Ａ）、α−アミ
ラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株
を用いた場合（Ｂ）、あるいはグルコアミラーゼを分泌
する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株を用いた場合
（Ｃ）に得られる出来たてのビールについて分析した。 Ａ Ｃ 元の重量⁰Ｐ １１．８ １１．８ エタノール％ ｗ／ｗ ４．１０ ４．６０ 見かけの抽出物⁰Ｐ ２．００ ０．８５ 見かけの発酵度 ％ ８３．１ ９２．８ 実際の抽出物⁰Ｐ ３．９０ ２．９０ 実際の発酵度 ％ ６７．０ ７５．４ α−アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガ
ー醸造株で発酵して得た出来たてのビール（Ｂ）の分析
結果はコントロールとほとんどかわらなかった。 【０１０２】実施例ＩＩＩ 調製したウワートの重量が１５⁰Ｐである以外は実施例
Ｉと同様にして発酵を行なった。発酵９日後、ビールを
０℃に冷却した。本来のラガー醸造株を用いた場合
（Ａ）、α−アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅
したラガー醸造株を用いた場合（Ｂ）、あるいはグルコ
アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸
造株を用いた場合（Ｃ）に得られる出来たてのビールに
ついて分析した。 Ａ Ｃ 元の重量⁰Ｐ １５．０ １５．０ エタノール％ ｗ／ｗ ４．５７ ５．２２ 見かけの抽出物⁰Ｐ ４．３０ ２．７６ 見かけの発酵度 ％ ７１．４ ８１．６ 実際の抽出物⁰Ｐ ６．３１ ５．０６ 実際の発酵度 ％ ５８．０ ６６．３ α−アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガ
ー醸造株で発酵して得た出来たてのビール（Ｂ）の分析
結果はコントロールとほとんどかわらなかった。 【０１０３】実施例ＩＶ 調製したウワートの重量が８．２３⁰Ｐである以外は実
施例Ｉと同様にして発酵を行なった。発酵時間及び発酵
温度のプロファイルは次の通りであった。 ４日間：９．５℃，３日間：１３．５℃ 本来のラガー醸造株を用いた場合（Ａ）、α−アミラー
ゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株を用
いた場合（Ｂ）、あるいはグルコアミラーゼを分泌する
遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株を用いた場合
（Ｃ）に得られる出来たてのビールについて分析した。 Ａ Ｃ 元の重量⁰Ｐ ８．２３ ８．２３ エタノール％ ｗ／ｗ ２．８８ ３．６０ 見かけの抽出物⁰Ｐ １．１６ −０．５６ 見かけの発酵度 ％ ８５．９ １０７．０ 実際の抽出物⁰Ｐ ２．４８ １．１４ 実際の発酵度 ％ ６９．９ ８６．７ α−アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガ
ー醸造株で発酵して得た出来たてのビール（Ｂ）の分析
結果はコントロールとほとんどかわらなかった。 【０１０４】実施例Ｖ 調製したウワートの６６．７％は実施例Ｉに記述した標
準醸造ウワートであり、３３．３％は懸濁しデンプン水
和物（１２％ ｗ／ｖ）である以外は実施例Ｉと同様に
して発酵を行なった。本来のラガー醸造株を用いた場合
（Ａ）、α−アミラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅
したラガー醸造株を用いた場合（Ｂ）、グルコアミラー
ゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株を用
いた場合（Ｃ）、あるいはα−アミラーゼとグルコアミ
ラーゼを分泌する遺伝子工学的に増幅したラガー醸造株
を用いた場合（Ｄ）に得られる出来たてのビールについ
て分析した。 A B C D 元の重量⁰Ｐ 12.01 12.14 12.13 12.22 エタノール％ ｗ／ｗ 2.86 4.03 4.19 4.96 見かけの抽出物⁰Ｐ 5.15 2.49 1.63 0.37 見かけの発酵度 ％ 57.1 79.5 86.6 96.9 実際の抽出物⁰Ｐ 6.47 4.32 3.62 2.61 実際の発酵度 ％ 46.2 64.4 70.2 78.6 【０１０５】 ガスクロマトグラフィー分析 アセトアルデヒド mg/l 3.9 3.4 8.4 11.6 アセトン mg/l 0.24 0.20 0.17 0.23 エチル ホルメート mg/l 0.07 0.13 0.22 0.25 エチルアセテート mg/l 8.7 20.5 39.6 43.3 エチル プロピオネート mg/l - 0.02 0.01 0.01 イソアミルアセテート mg/l 0.62 1.25 1.62 1.70 メタノール mg/l - - - - Ｎ−プロパノール mg/l 13.6 14.9 18.3 19.7 イソブタノール mg/l 13.0 11.5 14.7 16.5 光学活性アミルアルコール mg/l 10.4 12.5 20.1 18.2 イソアミルアルコール mg/l 50.9 57.1 67.5 79.2 全高級アルコール mg/l 87.9 96.0 120.5 133.6 【０１０６】実施例ＶＩ 小麦とトウモロコシの製粉粒子を、適当なバッファーに
懸濁し、デンプンをゼラチン化するため煮沸し、次いで
商業的に入手したα−アミラーゼ酵素調製物処理により
液化した。このブロースは、本来の重量１８．９ ０Ｐ
を有しており、２．５リットルファーメンター中で３０
℃で７２時間発酵した。用いた酵母株はＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ蒸留株であり、こ
れはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉ
ｉのグルコアミラーゼ遺伝子を形質転換により受け入れ
たものである。この形質転換酵母株によってグルコアミ
ラーゼが分泌された。コントロールとして、本来の非形
質転換蒸留株を用いて同様の発酵を行なった。７２時間
後、ブロースを濾過し、エタノール濃度を測定した。 酵母 エタノール（％ ｗ／ｗ） 非形質転換蒸留株 ８．９ 形質転換蒸留株 ９．６ 【０１０７】引用文献 ＢＥＮＯＩＳＴ，Ｃ．，Ｏ’ＨＡＲＡ，Ｋ．，ＢＲＥＡ
ＴＨＮＡＣＨ，Ｒ．及びＣＨＡＭＯＮ，Ｐ．（１９８
０）：Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．８，２７−１４２． ＢＥＧＧＳ，Ｊ．Ｄ．（１９７８）：複製ハイブリッド
プラスミドによる酵母の形質転換． Ｎａｔｕｒｅ ２７５，１０４−１０８： ＢＥＧＧＳ，Ｊ．Ｄ．（１９８１）：酵母における分子
遺伝学，ＡｌｆｒｅｄＢｅｎｚｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ １６，３８３−３９５． ＢＩＲＮＢＯＩＭ，Ｈ．Ｃ．及びＤＯＬＹ，Ｓ．（１９
７９）：組換えプラスミドＤＮＡスクリーニングのため
の迅速アルカリ抽出法． Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．７，１５１３−１５２３． ＢＯＬＩＶＡＲ，Ｓ．，ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ，Ｒ．
Ｌ．，ＥＴＬＡＣＨ，Ｍ．Ｃ．及びＢＯＹＥＲ，Ｈ．
Ｗ．（１９７７）：新規クローニングビヒクルの構築及
び特徴化．ＩプラスミドｐＭＢ９のアンピシリン耐性誘
導体． Ｇｅｎｅ ２，７５−９３． ＢＲＡＤＦＯＲＤ，Ｍ．（１９７６）：蛋白質−染料結
合の原理を利用したｍｇ量の蛋白質の迅速で且つ鋭敏な
定量法． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７７，２４８−２５４． ＣＡＲＢＯＮ，Ｊ．，ＲＡＴＺＫＩＮ，Ｂ．，ＣＬＡＲ
ＫＥ，Ｌ．及びＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ，Ｄ．（１９７
７）：原核生物でのクローン化真核生物ＤＮＡの発現． Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｓｙｍｐ． Ｂｉｏｌ． ２
９，２７７−２９６． ＣＯＨＥＮ，Ｊ．，ＧＯＲＭＡＮ，Ｊ．，ＫＯＬＴＩ
Ｎ，Ｙ．及びＤｅＷＩＬＤＥ．Ｍ．（１９８５）：Ｃａ
ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓのグルコアミラーゼ遺伝
子の分子クローニング：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現及び分泌． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．
Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．ｏｆ Ｙｅａｓｔｓ，３４
５． 【０１０８】ＣＯＬＬＩＮＳ，Ｊ．及びＨＯＨＮ，Ｂ．
（１９７８）：コスミド：バクテリオファージλヘッド
でのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージが可能なプラスミド遺
伝子クローニングベクター． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ７
５，４２４２−４２２４６： ＤＡＳ，Ｓ．，及びＨＯＬＬＥＮＢＥＲＧ，Ｃ．Ｐ．
（１９８２）：酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａ
ｃｔｉｓ用の高頻度形質転換システム． Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ． ６，２３−１２８． ＤＡＳ，Ｓ．，ＫＥＬＬＥＲＭＡＮＮ，Ｅ．及びＨＯＬ
ＬＥＮＢＥＲＧ．Ｃ．Ｐ．（１９８４）：Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓの形質転換． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５８，１１６５−１１６
７． ＤＡＶＩＳ．Ｒ．Ｗ．，ＢＯＳＴＥＩＮ，Ｄ．及びＲＯ
ＴＨ，Ｊ．Ｆ．（１９８０）：バクテリア遺伝学．遺伝
子工学マニアル． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ 【０１０９】ＤＵＧＡＩＣＺＹＫ，Ａ．，ＢＯＹＥＲ．
Ｈ．Ｗ．及びＤＯＯＤＭＡＮ．Ｈ．Ｍ．（１９７５）：
ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ再生断片の直線及び環状
構造への連結． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９６，１７１−１８４． ＦＥＩＳＳ，Ｍ．ＦＩＳＨＥＲ，Ｒ．Ａ．，ＣＲＡＹＴ
ＩＯＮ，Ｍ．Ａ．及びＥＧＮＥＲ，Ｃ．（１９７７）：
バクテリオファージλクロモゾームのパッケージング：
クロモゾームの長さの効果． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７，２８１−２９３． ＦＥＲＧＵＳＯＮ，Ａ．Ｒ．，ＫＡＴＳＵＮＵＭＡ，
Ｔ．，ＢＥＴ ２，Ｈ．及びＨＯＬＺＥＲ，Ｈ．（１９
７３）：酵母のトリプトファンシンセターゼ不活性化酵
素のインヒビターの精製及び特性． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２，４４０−４５
０． 【０１１０】ＦＯＧＡＲＹ，Ｗ．Ｍ．及びＫＥＬＬＹ，
Ｃ．Ｔ．（１９７９）：細菌由来のデンプン分解酵素． Ｉｎ：ＢＵＬＬ．Ｍ．Ｊ．，（ｅｄ．）業微生物学の進
歩． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
５，８７−１５０． ＧＡＦＮＥＲ，Ｊ．，ＤＥ ＲＯＢＥＲＴＩＳ；Ｅ．
Ｍ．及びＰＨＩＬＩＰＰＳＥＮ，Ｐ．（１９８３）． ＥＭＢＯ Ｊ． ２，５８３−５９１． ＧＡＮＮＯＮ，Ｆ．，Ｏ’ＨＡＲＡ，Ｋ．，ＰＥＲＲＩ
Ｎ，Ｆ．，ＬＥ ＰＥＮＮＥＣ，Ｊ．Ｐ．，ＢＥＮＯＩ
ＳＴ，Ｃ．，ＣＯＣＨＥＴ，Ｍ．，ＢＲＥＡＴＨＮＡＣ
Ｈ，Ｒ．，ＲＯＹＡＬ，Ａ．，ＧＡＲＡＰＩＩＮ，Ａ．
及びＣＨＡＭＢＯＮ．Ｐ．（１９７９）． Ｎａｔｕｒｅ ２７８，２４８−４３４． ＨＩＴＺＥＭＡＮ，Ｒ．Ａ．，ＨＡＧＩＥ，Ｆ．Ｅ．，
ＬＥＶＩＮＥ，Ｈ．Ｌ．，ＧＯＥＤＥＬ，Ｄ．Ｖ．，Ａ
ＭＭＥＲＥＲ，Ｇ．及びＨＡＬＬ，Ｂ．Ｄ．（１９８
１）：酵母でのインターフェロンヒト遺伝子の発現． Ｎａｔｕｒｅ ２９４，７１７−７２２． 【０１１１】ＨＯＨＮ，Ｂ．（１９７５）：ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏバクテリオファージλへのパッケージ用基質とし
てのＤＮＡ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９８，９３−１０６． ＨＯＨＮ，Ｂ．（１９７９）：ラムダ及びコスミドＤＮ
Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージ． Ｉｎ ＷＵ，Ｒ．（ｅｄ．）：組換えＤＮＡ、酵素学
法． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ６
８，２９９−３０９． ＨＯＨＮ，Ｂ．及びＣＯＬＬＩＮＳ，Ｊ．（１９８
０）：大きなＤＮＡ断片の効果的クローニングのための
小さなコスミド． Ｇｅｎｅ １１，２９１−２９８． ＨＯＨＮ，Ｂ．及びＨＩＮＮＥＮ，Ａ．（１９８０）：
コスミドを用いたＥ．ｃｏｌｉ及び酵母でのクローニン
グ． Ｉｎ ＳＥＴＬＯＷ，Ｊ．Ｋ．及びＨＯＬＬＡＥＮＤＥ
Ｒ，Ａ．（ｅｄ．）：遺伝子工学−原理と方法． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ｌ
ｏｎｄｏｎ ２，１６９−１８３． 【０１１２】ＨＳＩＡＯ．Ｃ．Ｌ．及びＣＡＲＢＯＮ，
Ｊ．（１９８１ｂ）：酵母複製起点の特徴及びクローン
化動原体ＤＮＡ（ＣＥＮ３）を含む安定ミニクロモゾー
ムの構築． Ｇｅｎｅ １５，１５７−１６６． ＩＮＮＩＳ，Ｍ．Ａ．，ＨＯＬＬＡＮＤ，Ｍ．Ｊ．，Ｍ
ｃＣＡＢＥ，Ｐ．Ｌ．，ＣＯＬＥ，Ｇ．Ｅ．，ＷＩＴＴ
ＭＡＮ，Ｖ．Ｐ．，ＴＡＬ，Ｒ．，ＷＡＴＴ，Ｋ．Ｗ．
Ｋ．，ＧＥＬＦＡＮＤ，Ｄ．Ｈ．，ＨＯＬＡＮＤ，Ｊ．
Ｐ．及びＭＥＡＤＥ，Ｊ．Ｈ．（１９８５）： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに
よるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓグルコアミラーゼの発現、
グリコンレーション及び分泌． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８，２１−２６． ＩＳＨ−ＨＯＲＯＷＩＣＺ，Ｄ．及びＢＵＲＫＥ，Ｊ．
Ｆ．（１９８１）：迅速で効率の良いコスミドベクター
クローニング． Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． ９，２９８９−２９９
８． 【０１１３】ＩＴＯ，Ｈ．，ＦＵＫＵＤＡ，Ｙ．，ＭＵ
ＲＡＴＡ，Ｋ．及びＫＩＭＵＲＡ，Ａ．（１９８３）：
アルカリカチオンで処理されたインタクト酵母細胞の形
質転換． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３，１６３−１６８． ＫＡＴＳＵＮＵＭＡ，Ｔ．，ＳＣＨＯＴＴ，Ｅ．，ＥＬ
ＳＡＳＳＥＲ．Ｓ．及びＨＯＬＺＥＲ，Ｍ．（１９７
２）：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７，５２０−
５２６． ＫＡＵＦＥＲ，Ｎ．Ｆ．，ＳＩＭＡＮＩＳ，Ｖ．及びＮ
ＵＲＳＥ，Ｐ．（１９８５）：分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅによる哺乳動物
ＲＮＡ転写介在配列の切り出し． Ｎａｔｕｒｅ ３１８，７８−８０． ＫＬＥＢＥ，Ｒ．Ｊ．，ＨＡＲＲＩＳＳ，Ｊ．Ｖ．，Ｓ
ＨＡＲＰ，Ｚ．Ｄ．及びＤＯＵＧＬＡＳ，Ｍ．Ｇ．（１
９８３）：酵母及びバクテリアのポリエチレングリコー
ル誘導遺伝子形質転換の一般的方法． Ｇｅｎｅ ２５，３３３−３４１． ＬＡＥＭＭＬＩ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）：バクテリオフ
ァージＴ４の頭部構築中の構造蛋白質の開裂。 Ｎａｔｕｒｅ ２２７，８０−６８５． 【０１１４】ＬＥＰＯＣＫ，Ｊ．Ｒ，ＫＥＩＴＨ，Ａ．
Ｄ．及びＫＲＵＵＶ，Ｊ．（１９８４）：結溶解損傷後
の酵母の浸透性変化；生存酵母との比較． Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｓ． ５，２７７−２８０． ＬＩＮＤＥＮＭＡＩＥＲ，Ｗ．，ＨＡＵＳＥＲ，Ｈ．，
ＧＲＥＩＳＥＲ ＤＥＷＩＬＫＥ，Ｉ，及びＳＣＨＵＴ
Ｚ，Ｇ．（１９８２）：遺伝子シャトリング；クローン
化ＤＮＡの真核生物への及びからの移動． Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． １０，１２４３−１
２５６． ＭＡＮＩＡＴＩＳ，Ｔ．，ＦＲＩＴＳＣＨ，Ｅ．Ｆ．及
びＳＡＭＢＲＯＣＫ，Ｊ．（１９８２）：分子クローニ
ング、実験室法． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＭＡＮＮＥＹ，Ｔ．Ｒ．，ＤＵＮＴＺＥ，Ｗ．，ＪＡＮ
ＡＳＫＯ，Ｎ．，及びＳＡＬＡＺＡＲ，Ｊ．（１９６
９）：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅの部分的活性トリプトファンシンセターゼ変異株の
遺伝的及び生化学的研究． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ９９，５９０−５９６． 【０１１５】ＭＡＸＡＭ，Ｓ．Ｍ．及びＧＩＬＢＥＲ
Ｔ，Ｗ．（１９８０）：塩基特異的開裂を利用したラベ
ル化ＤＮＡのシークエンシング． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６５，４９９−５
６１． ＮＵＮＢＥＲＧ，Ｊ．Ｈ．，ＭＥＡＤＥ，Ｊ．Ｈ．，Ｃ
ＯＬＥ，Ｇ．，ＬＡＷＹＥＲ，Ｆ．Ｃ．，ＭｃＣＡＢ
Ｅ，Ｐ．，ＳＣＨＷＥＩＣＫＡＲＴ，Ｖ．，ＴＡＬ，
Ｒ．，ＷＩＴＴＭＡＮ，Ｖ．Ｐ．，ＦＬＡＴＧＡＡＲ
Ｄ，Ｊ．Ｅ．及びＩＮＮＩＳ，Ｍ．Ａ．（１９８４）：
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミ
ラーゼ遺伝子の分子クローニング及び特徴化． Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４，２３０６−２３１
５． ＯＲＲ−ＷＥＡＶＥＲ，Ｔ．Ｌ．，ＳＺＯＳＴＡＫ，
Ｊ．Ｗ．及びＲＯＴＨＳＴＥＩＮ，Ｓ．Ｊ．（１９８
１）：酵母形質転換：組換え研究用モデルシステム． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
８，６３５４−６３５８． 【０１１６】ＯＴＥＮＧ−ＧＹＡＮＧ，Ｋ．，ＭＯＵＬ
ＩＮ，Ｇ．，ＧＡＬＺＹ，Ｐ．（１９８１）：Ｚｅｉｔ
ｓｃｈｒｉｆｔ ａｌｌｇ． Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．
２１，５３７−５４４． ＲＩＧＢＹ，Ｐ．Ｗ．Ｊ．，ＤＩＥＫＭＡＮＮ，Ｍ．，
ＲＨＯＤＥＳ，Ｃ．及びＢＥＲＧ．Ｐ．（１９７７）：
ＤＮＡ−ポリメラーゼＩを用いたニックトランスレーシ
ョンによるｉｎ ｖｉｔｒｏ高比活性のデオキシリボ核
酸のラベル化． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １１３，２３７−２５１． ＲＯＴＨＳＴＥＩＮ，Ｓ．Ｊ．，ＬＡＺＡＲＵＳ，Ｃ．
Ｍ．，ＳＭＩＴＨ，Ｗ．Ｅ．，ＵＬＣＯＭＥ，Ｄ．Ｃ．
及びＧＡＴＥＮＢＹ，Ａ．Ａ．（１９８４）：酵母で発
現された大麦アルファ−アミラーゼの分泌． Ｎａｔｕｒｅ ３０８，６６２−６６５． ＳＣＨＡＴＺ，Ｇ．（１９７９）：Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．Ｌ ＶＩ，４０５−５０． 【０１１７】ＳＨＥＲＭＡＮ，Ｆ．，ＦＩＮＫ，Ｇ．
Ｒ．及びＨＩＣＫＳ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）：酵母遺伝
学における方法． Ｉｎ Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ．Ｓ．
Ｈ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１９． ＳＩＬＩＳ，Ａ．Ｍ．及びＳＴＥＷＡＲＴ，Ｇ．Ｇ．
（１９８２）：いくつかの酵母種によるデンプン分解酵
素の産生． Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ． ８８，３１３−３１６． ＳＩＬＬＳ，Ａ．Ｍ．，ＰＡＮＣＨＡＬ，Ｃ．Ｊ．，Ｒ
ＵＳＥＬＬ，Ｉ．及びＳＴＥＷＡＲＴ，Ｇ．Ｇ．（１９
８３ａ）：酵母デンプン分解酵素産生の遺伝子操作、酵
母での遺伝子発現． Ｐｒｏｃｃｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｋｏ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓｙｍｐｏｓｉｍ Ｈｉｌｓｉｎｋｉ １９
８３，ｅｄ．Ｍ．Ｋｏｒｈｏｌａ及びＥ．Ｖａｉｓａｎ
ｅｎ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １，２０９−２
２８． ＳＩＬＬＳ，Ａ．Ｍ．，ＲＵＳＥＬＬ，Ｉ．及びＳＴＥ
ＷＡＲＴ，Ｇ．Ｇ．（１９８３ｂ）：低炭水化物ビール
醸造における酵母アミラーゼの産生． ＥＢＣ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，３７７−３８４． 【０１１８】ＳＩＬＩＳ，Ａ．Ｍ．，ＳＡＵＤＥＲ，
Ｍ．Ｅ．及びＳＴＥＷＡＲＴ，Ｇ．Ｇ．（１９８４
ａ）：Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌ
ｉｉのデンプン分解系の単離及び特徴化． Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ． ９０，３１１−３１４． ＳＩＬＬＳ，Ａ．Ｍ．，ＺＹＧＯＲＡ，Ｐ．Ｓ．Ｊ．及
びＳＴＥＷＡＲＴ，Ｇ．Ｇ．（１９８４ｂ）：アミラー
ゼ生産性が高いＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｃａｓｔ
ｅｌｌｉｉ変異株の特徴化． Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ． ２０，１２４−１２８． ＳＩＭＯＥＳ−ＭＥＮＤＥＳ，Ｂ．（１９８４）：酵母
Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓの細
胞外酵素の精製及び特徴化． Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３０，１１６３−
１１７０． ＳＯＵＴＨＥＲＮ，Ｅ．Ｍ．（１９７５）：ゲル電気泳
動により分離されるＤＮＡ断片中の特異的配列の検出． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９８，５０３−５１７． 【０１１９】ＳＴＲＡＳＳＥＲ，Ａ．Ｗ．Ｍ．（１９８
２）：トリプトファンシンセターゼの高生産性について
の生化学的及び生物物理的研究． Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ
Ｂａｓｅｌ． ＳＴＲＵＨＬ，Ｋ．ＳＴＩＮＣＨＣＯＭＢ，Ｄ．Ｔ．，
ＳＣＨＥＲＥＲ，Ｓ．及びＤＡＶＩＥＳ Ｒ．Ｗ．（１
９７９）：酵母の高頻度形質転換：ハイブリッドＤＮＡ
分子の自律的複製． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
６，１０３５−１０３９． ＴＨＯＭＳＥＮ，Ｋ．Ｋ．（１９８３）：Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって合成さ
れたマウスα−アミラーゼの培地への遊離． Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ４８，
５，５４５４−５５５． ＴＯＵＣＨＳＴＯＮＥ，Ｊ．Ｌ．及びＤＯＢＢＩＮＳ，
Ｍ．Ｆ．（１９７８）：層クロマトグラフィーの実際． Ａ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ
ｓ． 【０１２０】ＴＳＡＩ，Ｈ．，ＴＳＡＩ，Ｊ．Ｈ．Ｊ．
及びＹＵ，Ｐ．Ｈ．（１９７３）：酵母プロテインアー
ゼの効果及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａの
トリプトファンシンセターゼ不活性化抑制． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４０，２２５−２３
２． ＷＡＬＺ，Ａ．，ＲＡＴＺＫＩＮ，Ｂ．及びＣＡＲＢＯ
Ｎ，Ｊ．（１９７８）：バクテリア挿入エレメントによ
るクローン化酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子発現のコントロール． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
５，６１７２−６１７６． ＷＩＬＳＯＮ，Ｊ．Ｊ．及びＩＮＧＬＥＤＥＷ，Ｗ．
Ｍ．（１９８２）：Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａ
ｌｌｕｖｉｕｓデンプン分解酵素の単離及び特徴化． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４
４，３０１−３０７． ＹＡＭＡＳＨＩＴＡ，Ｉ．及びＦＵＫＵＩ，Ｓ．（１９
８３）：酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでのグルコア
ミラーゼ産生遺伝子の分子クローニング． ＺＡＬＫＩＮ，Ｈ．及びＹＡＮＯＦＳＫＹ，Ｃ．（１９
８２）：酵母ＴＲＰ５：構造、機能、調節． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５７，１４９１−１５０
０． 【配列表】 ＜１１０＞ Ｒｏｂｅｒｔ ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＜１２０＞ Ｍｙｌｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｌｓ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｉ ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ Ｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＜１３０＞ ＰＡ−２４４８０ ＜１５０＞ ＥＰ ＜１５１＞ １９８６−８−２１ ＜１６０＞ ７ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ２２９０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ １ ggtacctgag ctaaatttag aaccggctat agatccgctt gtctaaagaa gagataatga 60 agaaaacaat taaccgagca ctcttattaa gtttttttct attttctttt gctcctactt 120 caataattta tctaaattgt attgtgcgtt agatcagaat gtactgataa cagagagtat 180 tatcatacac ttgtggattt caaaaggcgg aatcaaaagc atacgtagtc aaacccttgg 240 ttatttgatg caattaaggt tgtagtcgtt cttaccgatc catcattata ccccacacgg 300 tttcatggta tgtaggtgtt tcaatagtga agtacaatga atgttttggt aatgctgtat 360 gtggatcagt aattatgtta aacaattaag tctgaaaatt tattaaaatt ttacctacaa 420 attaagccga aatccaatcg aaggtgccgc ccagctggtg tataaattac tcttgaaatt 480 caagttgaac gttgatctct ctaaagcaaa gctgttattc tacaatacta aataaaataa 540 aagcaagac atg aga ttt tca act gaa gga ttt aca agt aaa gtt gtt gca 591 Met Arg Phe Ser Thr Glu Gly Phe Thr Ser Lys Val Val Ala 1 5 10 gca att tta gca ttc tca aga ttg gta tct gct caa ccg att att ttt 639 Ala Ile Leu Ala Phe Ser Arg Leu Val Ser Ala Gln Pro Ile Ile Phe 15 20 25 30 gac atg aga gat gtt agc tcg tca gct gat aaa tgg aaa gac caa tcg 687 Asp Met Arg Asp Val Ser Ser Ser Ala Asp Lys Trp Lys Asp Gln Ser 35 40 45 att tat caa atc gtt act gat agg ttt gcc aga tct gat ggc tcg acc 735 Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Arg Ser Asp Gly Ser Thr 50 55 60 aca gct gac tgt tta gtg agt gat cgc aag tac tgt ggt gga tct tat 783 Thr Ala Asp Cys Leu Val Ser Asp Arg Lys Tyr Cys Gly Gly Ser Tyr 65 70 75 aaa ggg att atc gac aag ttg gat tat att caa ggt atg ggt ttc act 831 Lys Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr 80 85 90 gcg atc tgg atc tcc cca gtt gtt gag caa att cct gac aat act gct 879 Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Val Glu Gln Ile Pro Asp Asn Thr Ala 95 100 105 110 tat ggt tat gct tac cat ggt tat tgg atg aaa aat att gat gaa ttg 927 Tyr Gly Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Met Lys Asn Ile Asp Glu Leu 115 120 125 aac act aat ttt ggt acc gct gat gaa ttg aaa caa tta gct agc gaa 975 Asn Thr Asn Phe Gly Thr Ala Asp Glu Leu Lys Gln Leu Ala Ser Glu 130 135 140 ttg cat ttc aga agc atg tat gat ggt cga cga tgt tac aac cat tat 1023 Leu His Phe Arg Ser Met Tyr Asp Gly Arg Arg Cys Tyr Asn His Tyr 145 150 155 gct tgg aac gga gat ggt tca agc gta gat tat tct agt ttc act cca 1071 Ala Trp Asn Gly Asp Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Ser Phe Thr Pro 160 165 170 ttc aat caa caa tct tac ttc cac gat tat tgt ttg att aca aat tat 1119 Phe Asn Gln Gln Ser Tyr Phe His Asp Tyr Cys Leu Ile Thr Asn Tyr 175 180 185 190 aat gat caa acc aat gtt gaa gat tgt tgg gaa ggt gat act gaa gtc 1167 Asn Asp Gln Thr Asn Val Glu Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Glu Val 195 200 205 tcc ctt cca gat tta agt acc gag gat aat gaa gtt ata gga gta ttt 1215 Ser Leu Pro Asp Leu Ser Thr Glu Asp Asn Glu Val Ile Gly Val Phe 210 215 220 caa act tgg gtg tca gat ttt gtt caa aac tat tca atc gat ggt tta 1263 Gln Thr Trp Val Ser Asp Phe Val Gln Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu 225 230 235 aga att gat agt gca aag cac gta gat acc gct tca tta acg aag ttt 1311 Arg Ile Asp Ser Ala Lys His Val Asp Thr Ala Ser Leu Thr Lys Phe 240 245 250 gag gac gct tct ggt gtt tat aac tta ggt gaa gtt tat caa gga gat 1359 Glu Asp Ala Ser Gly Val Tyr Asn Leu Gly Glu Val Tyr Gln Gly Asp 255 260 265 270 cca act tat act tgt cca tat cag aat tat atg aaa gga gtt acc aac 1407 Pro Thr Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Tyr Met Lys Gly Val Thr Asn 275 280 285 tat cca tta tac tat cca gta tat aga ttc ttc agt gat act tcg gcg 1455 Tyr Pro Leu Tyr Tyr Pro Val Tyr Arg Phe Phe Ser Asp Thr Ser Ala 290 295 300 act tcc agt gag tta act tca atg atc tcc acg tta cag tca tct tgt 1503 Thr Ser Ser Glu Leu Thr Ser Met Ile Ser Thr Leu Gln Ser Ser Cys 305 310 315 tcg gac gtc tct ttg ttg gga aac ttt att gaa aac cat gac caa ggt 1551 Ser Asp Val Ser Leu Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Gln Val 320 325 330 aga ttt cca tca gtt acc tca gac aca tcc ttg att aag aat gac atg 1599 Arg Phe Pro Ser Val Thr Ser Asp Thr Ser Leu Ile Lys Asn Asp Met 335 340 345 350 gct ttt ata att ttg ggt gat ggt atc cca att att tat tat ggc caa 1647 Ala Phe Ile Ile Leu Gly Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Tyr Gly Gln 355 360 365 gaa caa ggt ctc aat ggt ggt tcc gat cct gcc aat aga gaa gct tta 1695 Glu Gln Gly Leu Asn Gly Gly Ser Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Leu 370 375 380 tgg tta agt gga tat aat acc gat tca gaa tac tac gag cta atc agt 1743 Trp Leu Ser Gly Tyr Asn Thr Asp Ser Glu Tyr Tyr Glu Leu Ile Ser 385 390 395 aaa cta aat caa ata aga aat caa gct att aag aag gat tct gcc tat 1791 Lys Leu Asn Gln Ile Arg Asn Gln Ala Ile Lys Lys Asp Ser Ala Tyr 400 405 410 tca act tac aaa tcc tca gtt gtt tct tct tca gac cac tat ata gcc 1839 Ser Thr Tyr Lys Ser Ser Val Val Ser Ser Ser Asp His Tyr Ile Ala 415 420 425 430 act agg aag ggt agc gat gct aat caa ttg att tcc att ttt aat aat 1887 Thr Arg Lys Gly Ser Asp Ala Asn Gln Leu Ile Ser Ile Phe Asn Asn 435 440 445 tta ggt tca aac ggg tca cag gat att act gtc agc aac acc ggc tat 1935 Leu Gly Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Thr Val Ser Asn Thr Gly Tyr 450 455 460 tct agt ggt gat aaa gtt atc gat att att tct tgc aat tcc gtt tta 1983 Ser Ser Gly Asp Lys Val Ile Asp Ile Ile Ser Cys Asn Ser Val Leu 465 470 475 gct ggt gac tcc gga agc tta tct gta tca att tct ggt gga atg cca 2031 Ala Gly Asp Ser Gly Ser Leu Ser Val Ser Ile Ser Gly Gly Met Pro 480 485 490 caa gtt tac gct ccg tcc tct gtt ctt tcg gga tct ggc atc tgc aat 2079 Gln Val Tyr Ala Pro Ser Ser Val Leu Ser Gly Ser Gly Ile Cys Asn 495 500 505 510 caa tag attgatccag cgctaaccct ttttttagca acgacaagtt tattttagaa 2135 Gln End aaagttttct aagaatggtc aaaacaagtt cttattactt ctatgtccct ggatatctgt 2195 tttcaatgtt ctctgactcc acattcctca tgtttagttc tctatttttt gtcgatcttc 2255 taagtttttt tattcttaat tttaatccaa aagtt 2290 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ １８ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ ２ Gly Gly Asn Val Leu Pro Thr Glu Gln Pro Gly Tyr Thr Val Ala Gln 48 1 5 10 15 Ser Arg 54 ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ １７ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ ３ Ala Thr Ser Tyr Pro Val Gly Phe Asn Val Ser Cys Ala Ser Gln Trp 48 1 5 10 15 Lys 51 ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ １８ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ ４ Gly Val Phe Pro Gly Ala Gly Lys Glu Val Tyr Tyr Asp Trp Tyr Thr 48 1 5 10 15 Gln Arg 54 ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ８ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ ５ Trp Gly Tyr Asp Thr Ile Gln Lys 24 1 5 ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ２６ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ ６ Thr Leu Phe Ala Asn Asp Val Gly Asp Pro Ile Asp Gly Asn Ile Tyr 48 1 5 10 15 Gly Val His Pro Val Try Leu Asp Gln Arg 78 20 25 ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ ３６４３ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ＜４００＞ ７ agatctacat tttaaacccc agtctactcc agatattgga gtataacccc attcttaccg 60 ttatatccat gacccgcatc gaaattttca aaggatttcg aggaaattct ttcctaaaat 120 acgaagtgtt attggtgatt caattactac ggaaactact catatggtag tagagttggt 180 gaatgtagcg caattgtaat ttgcgaagtt atagtaatag tttggcaaac tggagaattt 240 ttcattattg ggaaaatata aataaaggca agtatccatt gaaattttaa aatgaactca 300 tgactgtatt ataacaagca ag atg att ttt ctg aag ctg att aaa agt ata 352 Met Ile Phe Leu Lys Leu Ile Lys Ser Ile 1 5 10 gta att ggt ttg gga tta gtt agt gct atc caa gca gcc cct gcc tct 400 Val Ile Gly Leu Gly Leu Val Ser Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ala Ser 15 20 25 tcg att gga tct agt gct tca gca tct agt tca agt gag agt tct cag 448 Ser Ile Gly Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Glu Ser Ser Gln 30 35 40 gct aca att ccc aat gat gta aca tta ggt gtt aaa caa att cct aat 496 Ala Thr Ile Pro Asn Asp Val Thr Leu Gly Val Lys Gln Ile Pro Asn 45 50 55 atc ttt aat gac tct gct gtc gat gct aat gca gct gct aaa ggg tat 544 Ile Phe Asn Asp Ser Ala Val Asp Ala Asn Ala Ala Ala Lys Gly Tyr 60 65 70 gac ttg gta aat gtt act aat act cca aga gga tta acc ggt atc tta 592 Asp Leu Val Asn Val Thr Asn Thr Pro Arg Gly Leu Thr Gly Ile Leu 75 80 85 90 aaa tta aaa gaa gct acc aat att tat ggt tat gat ttt gat tat tta 640 Lys Leu Lys Glu Ala Thr Asn Ile Tyr Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr Leu 95 100 105 aac tta act gtt gaa tac caa gct gat acc aga tta aac gtt cat att 688 Asn Leu Thr Val Glu Tyr Gln Ala Asp Thr Arg Leu Asn Val His Ile 110 115 120 gaa cca act gat tta tct gat gta ttt gtt tta cca gag cat tta gtt 736 Glu Pro Thr Asp Leu Ser Asp Val Phe Val Leu Pro Glu His Leu Val 125 130 135 gtt aaa cca ctg gtg gaa ggt gat gca caa tct tat aac ttc gac att 784 Val Lys Pro Leu Val Glu Gly Asp Ala Gln Ser Tyr Asn Phe Asp Asn 140 145 150 TCC GAT TTG GTT TTC GAA TAC TCT AAT ACT GAC TTC TCC TTT GAA GTT 832 Ser Asp Leu Val Phe Glu Tyr Ser Asn Thr Asp Phe Ser Phe Glu Val 155 160 165 170 att aga tca tct act aaa gaa gtt tta ttt tct act aaa ggt aat cca 880 Ile Arg Ser Ser Thr Lys Glu Val Leu Phe Ser Thr Lys Gly Asn Pro 175 180 185 ttg gtt ttt tca aat caa ttc att caa ttc aat tcg tca ttg cca aag 928 Leu Val Phe Ser Asn Gln Phe Ile Gln Phe Asn Ser Ser Leu Pro Lys 190 195 200 aac cat gtt att act ggt ctt ggt gaa tct att cac ggt tta gtt aac 976 Asn His Val Ile Thr Gly Leu Gly Glu Ser Ile His Gly Leu Val Asn 205 210 215 gaa cca ggt agc gtt aaa aca tta ttt gct aat gat gtt ggt gat cca 1024 Glu Pro Gly Ser Val Lys Thr Leu Phe Ala Asn Asp Val Gly Asp Pro 220 225 230 atc gat ggt aat att tat ggt gtc cat cca gtt tat ctt gat caa aga 1072 Ile Asp Gly Asn Ile Tyr Gly Val His Pro Val Tyr Leu Asp Gln Arg 235 240 245 250 tat gac act gaa act acc cat gct gtt tat tgg aga act tct gct att 1120 Tyr Asp Thr Glu Thr Thr His Ala Val Tyr Trp Arg Thr Ser Ala Ile 255 260 265 caa gaa gta tta atc ggt gag gaa tct att act tgg aga gct ctt tca 1168 Gln Glu Val Leu Ile Gly Glu Glu Ser Ile Thr Trp Arg Ala Leu Ser 270 275 280 ggt gtt att gat tta tac ttc ttt agt ggt cct aca cca aaa gat gcc 1216 Gly Val Ile Asp Leu Tyr Phe Phe Ser Gly Pro Thr Pro Lys Asp Ala 285 290 295 att caa cag tat gtc aaa gag att ggt tta cca gct ttc caa cca tac 1264 Ile Gln Gln Tyr Val Lys Glu Ile Gly Leu Pro Ala Phe Gln Pro Tyr 300 305 310 tgg tcg tta ggt tac cat caa tgt aga tgg ggt tac gat act atc gaa 1312 Trp Ser Leu Gly Tyr His Gln Cys Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ile Glu 315 320 325 330 aaa tta tct gaa gtt gtt gaa aac ttc aag aaa ttt aat att cca tta 1360 Lys Leu Ser Glu Val Val Glu Asn Phe Lys Lys Phe Asn Ile Pro Leu 335 340 345 gaa act atc tgg tca gac att gat tac atg gac tct tat aaa gat ttc 1408 Glu Thr Ile Trp Ser Asp Ile Asp Tyr Met Asp Ser Tyr Lys Asp Phe 350 355 360 act tat gat cca cac aga ttc cca cta gat gaa tat cgt aaa ttc ctt 1456 Thr Tyr Asp Pro His Arg Phe Pro Leu Asp Glu Tyr Arg Lys Phe Leu 365 370 375 gat gag ttg cac aaa aat aat caa cac tat gtt cct att ttg gat gct 1504 Asp Glu Leu His Lys Asn Asn Gln His Tyr Val Pro Ile Leu Asp Ala 380 385 390 gct att tac gtt cca aac cca aac aat gct acg gat aac gaa tac caa 1552 Ala Ile Tyr Val Pro Asn Pro Asn Asn Ala Thr Asp Asn Glu Tyr Gln 395 400 405 410 cct ttc cac tat ggt aat gaa acc gat gtc ttc tta aag aat cca gat 1600 Pro Phe His Tyr Gly Asn Glu Thr Asp Val Phe Leu Lys Asn Pro Asp 415 420 425 ggt tca tta tat att ggt gct gtt tgg cag gtt aca ctg ttt tcc aga 1648 Gly Ser Leu Tyr Ile Gly Ala Val Trp Gln Val Thr Leu Phe Ser Arg 430 435 440 ttt ctt agc aga aaa cat tca gat atg gat aaa gtc att aaa gat tgg 1696 Phe Leu Ser Arg Lys His Ser Asp Met Asp Lys Val Ile Lys Asp Trp 445 450 455 tat gaa tta act cct ttt gat ggt att tgg gct gat atg aat gaa gtc 1744 Tyr Glu Leu Thr Pro Phe Asp Gly Ile Trp Ala Asp Met Asn Glu Val 460 465 470 tca tca ttc tgt gtt ggt tct tgt ggt act ggt aaa tac ttc gaa aac 1792 Ser Ser Phe Cys Val Gly Ser Cys Gly Thr Gly Lys Tyr Phe Glu Asn 475 480 485 490 cca gca tat cct cca ttt act gtt gga agt aaa gct acc tct tat cca 1840 Pro Ala Tyr Pro Pro Phe Thr Val Gly Ser Lys Ala Thr Ser Tyr Pro 495 500 505 gtt ggt ttc gat gtt tct aac gca tct gaa tgg aaa tct att caa agc 1888 Val Gly Phe Asp Val Ser Asn Ala Ser Glu Trp Lys Ser Ile Gln Ser 510 515 520 tca att tct gct act gct aag act tct tca act tct tcc gta tcg tcg 1936 Ser Ile Ser Ala Thr Ala Lys Thr Ser Ser Thr Ser Ser Val Ser Ser 525 530 535 tct tca tcc aca atc gat tat atg aac act tta gct cca ggt aaa ggt 1984 Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Met Asn Thr Leu Ala Pro Gly Lys Gly 540 545 550 aat att aat tat cca cca tat gct att tac aac atg caa ggt gac tcc 2032 Asn Ile Asn Tyr Pro Pro Tyr Ala Ile Tyr Asn Met Gln Gly Asp Ser 555 560 565 570 gat ctt gct act cat gca gta tct cca aat gct aca cat gct gat ggt 2080 Asp Leu Ala Thr His Ala Val Ser Pro Asn Ala Thr His Ala Asp Gly 575 580 585 aca gtt gaa tat gat att cac aat ctt tat ggt tac ttg caa gaa att 2128 Thr Val Glu Tyr Asp Ile His Asn Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Glu Asn 590 595 600 gct act tat cat gca tta ttg gaa gtt ttt cct aac aag aga cca ttc 2176 Ala Thr Tyr His Ala Leu Leu Glu Val Phe Pro Asn Lys Arg Pro Phe 605 610 615 atg att tcc aga tca acc ttt cca xgc gct ggt aaa tgg acc ggc cat 2224 Met Ile Ser Arg Ser Thr Phe Pro Ala Gly Lys Trp Thr Gly His 620 625 630 tgg ggt ggt gac aac act gct gat tgg gct tat gct tac ttc tct atc 2272 Trp Gly Gly Asp Asn Thr Ala Asp Trp Ala Tyr Ala Tyr Phe Ser Ile 635 640 645 650 cct caa gca ttc tca atg ggt att gct ggc ctt cca ttc ttt ggt gcc 2320 Pro Gln Ala Phe Ser Met Gly Ile Ala Gly Leu Pro Phe Phe Gly Ala 655 660 665 gat gtt tgt ggt ttc aat ggt aat tct gat tct gaa tta tgt tca aga 2368 Asp Val Cys Gly Phe Asn Gly Asn Ser Asp Ser Glu Leu Cys Ser Arg 670 675 680 tgg atg caa tta ggt tct ttc ttc cca ttc tac aga aac cac aac tat 2416 Trp Met Gln Leu Gly Ser Phe Phe Pro Phe Tyr Arg Asn His Asn Tyr 685 690 695 tta ggt gct att gat cag gaa cca tat gtc tgg gaa tca gtt gct gaa 2464 Leu Gly Ala Ile Asp Gln Glu Pro Tyr Val Trp Glu Ser Val Ala Glu 700 705 710 gct act aga act tct atg gcc att aga tac tta tta tta cca tat tac 2512 Ala Thr Arg Thr Ser Met Ala Ile Arg Tyr Leu Leu Leu Pro Tyr Tyr 715 720 725 730 tac act tta tta cat gaa tct cat act act ggt tta cca atc tta aga 2560 Tyr Thr Leu Leu His Glu Ser His Thr Thr Gly Leu Pro Ile Leu Arg 735 740 745 gct ttc tcg tgg caa ttc cct aac gat cgt tcc tta agt ggt gtc gat 2608 Ala Phe Ser Trp Gln Phe Pro Asn Asp Arg Ser Leu Ser Gly Val Asp 750 755 760 aac caa ttt ttt gtc ggt gat ggt tta gtt gtt act cct gtc tta gaa 2656 Asn Gln Phe Phe Val Gly Asp Gly Leu Val Val Thr Pro Val Leu Glu 765 770 775 cct ggt gtt gat aag gtt aaa ggt gtt ttc cca gga gct ggt aaa gag 2704 Pro Gly Val Asp Lys Val Lys Gly Val Phe Pro Gly Ala Gly Lys Glu 780 785 790 gaa gtt tac tac gac tgg tac acc caa aga gaa gtt cac ttt aaa gac 2752 Glu Val Tyr Tyr Asp Trp Tyr Thr Gln Arg Glu Val His Phe Lys Asp 795 800 805 810 ggt aag aat gaa act tta gat gca cca tta ggt cat att cca tta cac 2800 Gly Lys Asn Glu Thr Leu Asp Ala Pro Leu Gly His Ile Pro Leu His 815 820 825 att aga ggt ggt aac gtc ttg cca act caa gag cca ggt tat act gtt 2848 Ile Arg Gly Gly Asn Val Leu Pro Thr Gln Glu Pro Gly Tyr Thr Val 830 835 840 gct gag tca aga caa aat cca ttt ggt tta att gtc gct tta gat aac 2896 Ala Glu Ser Arg Gln Asn Pro Phe Gly Leu Ile Val Ala Leu Asp Asn 845 850 855 gat ggc aaa gct caa ggt agc tta tac ctt gat gat ggt gaa tca tta 2944 Asp Gly Lys Ala Gln Gly Ser Leu Tyr Leu Asp Asp Gly Glu Ser Leu 860 865 870 gta gta gac tct tca ttg ttg gtt agt ttc tct gtt tct gat aac aca 2992 Val Val Asp Ser Ser Leu Leu Val Ser Phe Ser Val Ser Asp Asn Thr 875 880 885 890 tta tca gca tct cca tct ggt gac tat aaa gct gat caa cct tta gct 3040 Leu Ser Ala Ser Pro Ser Gly Asp Tyr Lys Ala Asp Gln Pro Leu Ala 895 900 905 aat gtt acc atc tta ggg gtt ggc cat aaa cca aaa tca gtt aaa ttt 3088 Asn Val Thr Ile Leu Gly Val Gly His Lys Pro Lys Ser Val Lys Phe 910 915 920 gaa aac gct aat gtt gat ttc acc tac aag aaa tca acc gtt ttc gtt 3136 Glu Asn Ala Asn Val Asp Phe Thr Tyr Lys Lys Ser Thr Val Phe Val 925 930 935 act ggc tta gat aaa tac acc aag gat ggt gca ttt tct aag gat ttc 3184 Thr Gly Leu Asp Lys Tyr Thr Lys Asp Gly Ala Phe Ser Lys Asp Phe 940 945 950 acc att act tgg taattttaac atccacttag ttcaattcca ttcttttctt 3236 Thr Ile Thr Trp 955 tttcccgtga aattctgaat ttgaaattat ttgaatgata tcattttagt tttcttcagc 3296 ttatgctatg tttatttcga ttttaaatgt taaaagtttt ttatgtttat gttgttttat 3356 tgatgtagtt gataaaatat agcaaataca tcgaaaaatt tgcgatgaaa ttttgcagct 3416 cattagaaat gtagtcaatc attagtcaca ttggaccact atataacaaa caacaactat 3476 tccaagaaaa atatatgtaa ggatactaga tcataaattc ttattgactt tgtttttttt 3536 aacaatagtt acataaggaa tattcgttta ctacaaaacc attggtcttg taaagaagca 3596 gacgaggcgt atgtttgtgg ttgcggccgc aatactagtt tacaaag 3643

【図面の簡単な説明】 【図１】図１はコスミドｐＹｃ１、そこへ挿入されるＥ
ｃｏＲＩ断片等を示し、ＡはコスミドｐＹｃ１、ＢはＥ
ｃｏＲＩ断片、ＣはプラスミドｐＪＤＢ２０７へサブク
ローンした断片、ＤはＥｃｏＲＩ／ＳａＩＩ断片のシー
クエンジング法を表わす。 【図２Ａ】図２Ａはα−アミラーゼ遺伝子の５′末端及
びその５′フランキング領域のヌクレオチド配列を示
す。 【図２Ｂ】図２Ｂはα−アミラーゼ遺伝子の５′末端及
びその５′フランキング領域のヌクレオチド配列を示
す。 【図２Ｃ】図２Ｃはα−アミラーゼ遺伝子の５′末端及
びその５′フランキング領域のヌクレオチド配列を示
す。 【図３】図３はグルコアミラーゼの５つのトリプシンペ
プチドのアミノ酸配列を示す。 【図４Ａ】図４ＡはＮＧＡ２３−ＹＲｐＪＤ２のα−ア
ミラーゼ活性を表わす。 【図４Ｂ】図４ＢはＮＧＡ２３−ＹＲｐＪＤ２−αのα
−アミラーゼ活性を表わす。 【図４Ｃ】図４ＣはＮＧＡ２３−ＹＲｐＪＤ２及びＮＧ
Ａ２３−ＹＲｐＪＤ２−αのα−アミラーゼ活性を表わ
す。 【図４Ｄ】図４ＤはＭＣ３４−ｐＹＣ１−αのα−アミ
ラーゼ活性を表わす。 【図４Ｅ】図４Ｅはグルコース濃度を表わす。 【図５】図５はα−アミラーゼ蛋白質を分離するＦＰＬ
Ｃイオン交換クロマトグラフィーを示す。 【図６】図６は粒子構造を示す写真であり、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによるα−アミラーゼ蛋白質の分析結果を表わ
す。 【図７】図７は粒子構造を示す写真であり、デンプン分
解生成物の薄層クロマトグラフィーを表わす図面であ
る。 【図８Ａ】図８ＡはプラスミドＹｐＲＨ１Ｓ４の構築を
表わす。 【図８Ｂ】図８ＢはプラスミドＹＲｐＪＤ１の構築を表
わす。 【図８Ｃ】図８ＣはプラスミドＹＲｐＪＤ２及びＹＲｐ
ＪＤ２−ｎの構築を表わす。 【図８Ｄ】図８ＤはプラスミドＹＲｐＪＤ２の構築を表
わす。 【図８Ｅ】図８ＥはプラスミドＹＲｐＪＤ２−ｎの構築
を表わす。 【図８Ｆ】図８ＦはプラスミドｐＥＫ２−ＴＲＰ５−Ｂ
及びｐＥＫ２−ＴＲＰ５−Ａの構築を表わす。 【図９Ａ】図９Ａは、電気泳動の結果を示す写真であ
り、発色後のプラスミド及び酵母最少溶解物ＤＮＡを表
わす。 【図９Ｂ】図９Ｂは、電気泳動の結果を示す写真であ
り、ニックトランスレーション化ＹＲｐＪＤ１ＤＮＡと
のサザンブロット及びハイブリダイゼーション後のオー
トラジオグラムを表わし、Ｃはレーンｊ−ｇのオートラ
ジオグラムを表わし、Ｄはハイブリダイゼーションプロ
ーブＹＲｐＪＤ１の地図を表わす。 【図１０Ａ】図１０Ａは電気泳動の結果を示す写真であ
り、Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３での異なるプラ
スミドのコピー数評価を表わす。Ａはコントロールプラ
スミドのＥｃｏＲＩ断片及び酵母最少溶解物ＤＮＡをエ
チジウムブロマイドで発色せしめたものであり、Ｂはニ
ックトランスレーション化ＹＲｐ７ＨＩＳ４ＤＮＡとの
サザンブロット及びハイブリダイゼーション後のオート
ラジオグラムを表わす。 【図１０Ｂ】図１０Ｂは電気泳動の結果を示す写真であ
り、Ｃはレーンａ−ｐのオートラジオグラムを表わし、
ＤはＹＲｐＪＤ１及びクロモゾームＳｃｈｗａｎｎｉｏ
ｍｙｃｅｓ ＨＩＳ４領域のハイブリダイゼーションプ
ローブＹＲＰ７ＨＩＳ４に対する相同性を表わす。 【図１１Ａ】図１１Ａは電気泳動の結果を示す写真であ
り、ＡはコントロールプラスミドのＥｃｏＲＩ断片及び
酵母最少溶解物ＤＮＡをエチジウムブロマイドで発色せ
しめたものである。 【図１１Ｂ】図１１Ｂは電気泳動の結果を示す写真であ
り、Ｂはニックトランスレーション化ＹＲｐＪＤ２−α
ＤＮＡとのサザンブロット及びハイブリダイゼーション
後のオートラジオグラムを示す。 【図１２】図１２は電気泳動の結果を示す写真であり、
Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ ＮＧＡ２３形質転換からの細胞
外酵素のｉｎ ｖｉｖｏラベル化したもののＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及びオートラジオグラフィー分析を表わす。 【図１３Ａ】図１３ＡはプラスミドｐＣＪＤ５−２の構
築を示す。 【図１３Ｂ】図１３Ｂは電気泳動の結果を示す写真及び
制限酵素地図を示すものであり、Ａは制限酵素地図を表
わしＢはアガロースゲル上で分離した制限酵素処理断片
を表わす。 【図１４】図１４はプラスミドｐＫＡＲ２−αの制限酵
素地図を表わす。 【図１５Ａ】図１５ＡはプラスミドｐＥＫ２の制限酵素
地図を示す。 【図１５Ｂ】図１５ＢはプラスミドｐＣＪＤ５−２及び
ｐＣＪＤ５−２の制限酵素地図を示す。 【図１５Ｃ】図１５ＣはプラスミドｐＪＤＢ２０７及び
ｐＪＤＢ２０７の制限酵素地図を示す。 【図１６】図１６は各種温度でのグルコアミラーゼの不
活性化を示したものである。 【図１７Ａ】図１７Ａはグルコアミラーゼ構造遺伝子及
びフランキング領域のヌクレオチド配列を示す。 【図１７Ｂ】図１７Ｂはグルコアミラーゼ構造遺伝子及
びフランキング領域のヌクレオチド配列を示す。 【図１７Ｃ】図１７Ｃはグルコアミラーゼ構造遺伝子及
びフランキング領域のヌクレオチド配列を示す。 【図１７Ｄ】図１７Ｄはグルコアミラーゼ構造遺伝子及
びフランキング領域のヌクレオチド配列を示す。 【図１７Ｅ】図１７Ｅはグルコアミラーゼ構造遺伝子及
びフランキング領域のヌクレオチド配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｚ 7/06 7/06 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/34 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 コルネリウス ピー．ホレンベルグ ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ，チ ョピンストラーセ ７ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/56 A21D 8/04 C12C 11/02 C12N 9/30 - 9/34 C12P 1/02 - 7/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．原料としてデンプンを用いる醗酵工程の実施方法で
   あって、 酵母細胞として、ドナー酵母から組換えＤＮＡ技術によ
   りＤＮＡ配列を受け入れ、その結果、デンプン分解酵素
   を発現することのできる酵母細胞であって、該酵母細胞
   は、α−アミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼである
   Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ酵素をコードする配列を
   含むＤＮＡ配列であって、配列表の配列番号：１に示し
   たα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列、あるいは該
   ＤＮＡ配列の１又は数個の塩基の欠失、置換及び／又は
   付加による変異ＤＮＡ配列であってコードされる蛋白質
   はα−アミラーゼの機能を保持した変異ＤＮＡ配列、あ
   るいは配列表の配列番号：７に示したグルコアミラーゼ
   をコードするＤＮＡ配列、あるいは該ＤＮＡ配列の１又
   は数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加による変異Ｄ
   ＮＡ配列であってコードされる蛋白質はグルコアミラー
   ゼの機能を保持した変異ＤＮＡ配列であるＤＮＡ配列
   を、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ酵母から受け入れ、
   その結果、該酵素のいずれかまたは両者を発現すること
   のできる酵母細胞を用い、 該酵母細胞を醗酵工程に使用するか、あるいは、該酵母
   細胞を適当な培地で培養し、該培地からのα−アミラー
   ゼ及び／又はグルコアミラーゼを回収して醗酵工程に使
   用する、 上記実施方法。 ２．バイオマスの製造のための請求項１の実施方法。 ３．ビールの製造のための請求項１の実施方法。 ４．ベーキングブレッドの製造のための請求項１の実施
   方法。 ５．エタノールの製造のための請求項１の実施方法。 ６．酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈ
   ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉ
   ｏｍｙｃｅｓ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属から
   なる群より選ばれる請求項１から５のいずれかの実施方
   法。 ７．酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
   ｅｖｉｓｉａｅである請求項６の実施方法。 ８．酵母細胞は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌ
   ｌｕｖｉｕｓである請求項６の実施方法。 ９．ドナー酵母は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｃ
   ａｓｔｅｌｌｉｉである請求項１から８のいずれかの実
   施方法。 １０．ドナー酵母は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
   ｃａｓｔｅｌｌｉｉ ＡＴＣＣ ２６０７６である請求
   項９の実施方法。 １１．酵母細胞によって発現されるα−アミラーゼは約
   ３７℃の最適温度を有し、約６０℃で不活性化される請
   求項１から１０のいずれかの実施方法。 １２．酵母細胞によって発現されるα−アミラーゼは、
   配列表の配列番号：１に示したＤＮＡ配列、あるいは該
   ＤＮＡ配列の１又は数個の塩基の欠失、置換及び／又は
   付加による変異ＤＮＡ配列であってコードされる蛋白質
   はα−アミラーゼの機能を保持した変異ＤＮＡ配列によ
   ってコードされる、請求項１から１１のいずれかの実施
   方法。 １３．酵母細胞によって発現されるグルコアミラーゼ
   は、約５０℃の最適温度を有し、約６０℃で不活性化さ
   れ、そしてオオムギデンプンを完全にグルコースに加水
   分解することのできる請求項１から１２のいずれかに記
   載の実施方法。 １４．酵母細胞によって発現されるグルコアミラーゼ
   は、配列表の配列番号：７に示したＤＮＡ配列、あるい
   は該ＤＮＡ配列の１又は数個の塩基の欠失、置換及び／
   又は付加による変異ＤＮＡ配列であってコードされる蛋
   白質はグルコアミラーゼの機能を保持した変異ＤＮＡ配
   列によってコードされる、請求項１から１３のいずれか
   の実施方法。