FI112091B - DNA-rekombinaatiotekniikalla rakennetut amylaaseja tuottavat mikro-organismit ja niiden käyttö käymisprosesseissa - Google Patents

DNA-rekombinaatiotekniikalla rakennetut amylaaseja tuottavat mikro-organismit ja niiden käyttö käymisprosesseissa Download PDF

Info

Publication number
FI112091B
FI112091B FI873637A FI873637A FI112091B FI 112091 B FI112091 B FI 112091B FI 873637 A FI873637 A FI 873637A FI 873637 A FI873637 A FI 873637A FI 112091 B FI112091 B FI 112091B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
amylase
yeast
schwanniomyces
dna
glucoamylase
Prior art date
Application number
FI873637A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI873637A0 (fi
FI873637A (fi
Inventor
Alexander Strasser
Juergen Dohmen
Cornelius P Hollenberg
Feodor Bernard Martens
Original Assignee
Heineken Tech Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP86111586A external-priority patent/EP0257115A1/en
Application filed by Heineken Tech Services filed Critical Heineken Tech Services
Publication of FI873637A0 publication Critical patent/FI873637A0/fi
Publication of FI873637A publication Critical patent/FI873637A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112091B publication Critical patent/FI112091B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/047—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
    • C12C12/004—Genetically modified microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
    • C12C12/006—Yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/02—Beer with low calorie content
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Description

112C91 DNA-rekombinaatiotekniikalla rakennetut amylaaseja tuottavat mikro-organismit ja niiden käyttö käymisprosesseissa
Keksintö koskee hiivasolua, joka kykenee ilmentä-5 mään termolabiileja amylolyyttisiä entsyymejä sen johdosta, että se on yhdistelmä-DNA-tekniikalla vastaanottanut DNA-sekvenssejä luovuttajahiivalta, sekä näitä entsyymejä koo-daavaa yhdistelmä-DNA:ta. Keksintö koskee edelleen menetelmää termolabiilin α-amylaasin valmistamiseksi ja maini-10 tun hiivasolun tai entsyymin käyttöä fermentaatioproses-seissa.
Schwanniomyces-hiivasuvun lajit hydrolysoivat tärkkelystä glukoosiksi kahden solunulkoisen entsyymin, nimittäin amylaasin (α-1,4-glukaani-4-glukanohydrolaasin, 15 E.C.3.2.1.1.) ja glukoamylaasin (syn. amyloglukosidaasi) (α-1,4-glukaaniglukohydrolaasin, E.C.3.2.1.3., ketjua haa-rautumiskohdista pilkkovaa aktiivisuutta omaavana E.C.3.2.1.9) tuotannon seurauksena.
Schwanniomyces castelliin ja Schwanniomyces allu-20 viuksen amylolyyttiset järjestelmät on kirjallisuudessa hyvin dokumentoitu (Oteng-Gyang et ai., 1981, Sills et : ai., 1982, 1984a, 1984b, Wilson et ai., 1982).
| Schwanniomyces -serotyyppien käyttö työskentelyssä ! on edullista, koska α-amylaasilla on nesteyttävä vaikutus ’·*. 25 glukoamylaasin pilkkoessa ketjua haarautumiskohdista ja koska amylolyyttinen järjestelmä on herkkä oluenpanossa ·.·. yleensä käytetyille pastörointiolosuhteille (Sills et ai., 1984a ja b).
. . Saccharomyces-hiiva, jolla ei ole mitään Schwan- (#) 30 niomyces-hiivan edellä mainituista ominaisuuksista, on ’···* eniten käytetty organismi oluenpanossa, leipomoprosesseis- sa ja etanolin käymisteollisuudessa. Käymisprosesseissa käytetään perinteisesti tärkkelystä raaka-aineena. Koska * . Saccharomyces cerevisiae ei kuitenkaan kuten mainittu ky- 35 kene hydrolysoimaan tärkkelystä, tärkkelyksen perinteinen konversio Saccharomyces cerevisiaella etanoliksi ja 112091 2 C02:ksi vaatii kaksi Saccharomyces cerevisiaella fermen-tointia edeltävää entsymaattista hajotusprosessia, nimittäin nesteytymisen, jota varten lisätään a-amylaasia, ja sokeroitumisen, jota varten lisätään haarautumiskohdista 5 ketjua pilkkovaa aktiivisuutta omaavaa glykoamylaasia (Fogarty et ai., 1979).
EP-hakemusjulkaisussa 0 125 615 on jo kuvattu Schwanniomyces-suvun hiivan käyttöä alhaisen kaloripitoi-suuden omaavien oluiden valmistuksessa. Schwanniomyces-10 suvun hiivaa käytettäessä fermentointiin tuodaan amylaase-ja tuottamaan kykenevä organismi, jolloin mainittuja entsyymejä ei tarvitse ennen fermentaatiota lisätä. Kuitenkaan Schwanniomyces-hiiva ei ole panimo- ja etanolikäymis-teollisuudessa läheskään yhtä tehokas ja käyttöön sovel-15 lettu kuin Saccharomyces cerevisiae. Edellä mainitussa EP-hakemus j ulkaisussa on siksi ehdotettu käytettäväksi Schwanniomycestä tehokkaamman Saccharomyces-suvun ohella, jolloin jälkimmäinen on edelleen keskeinen hajotetut hiilihydraatit etanoliksi käyttävä mikro-organismi tärkkelys-20 tä hajottavien entsyymien ollessa peräisin Schwanniomyces-tä. Nämä entsyymit lisätään edelleen erikseen alalla ta-• ’ · vanomaiseen tapaan.
j ' : Useita amylaaseja koodaavia geenejä on pystytty : : : kloonaamaan ja ilmaisemaan Saccharomyces cerevisiaessä, 25 nimittäin hiiren (Thomsen et ai., 1983) ja vehnän (Roth-:\ stein et ai., 1984) cx-amylaasigeeni sekä Saccharomyces . , diastaticuksen (Yamashita ja Fukui, 1983), Aspergillus ni- gerin (Nunnberg et ai., 1984, Innis et ai., 1985), Candida . albicansin (Cohen et ai., 1985) ja Rhizopus oryzaen (EP- h,; 30 hakemus 85 115 910.3) glukoamylaasigeeni.
’*·*’ Edellä mainittujen luovuttajaorganismien tuottamat : : : amylaasit eivät kuitenkaan ole hyödyllisiä esillä olevan keksinnön tarkoituksiin. Geenimanipuloidun Saccharomyces ‘ , cerevisiaen käytölle panimo-, leipomo- sekä etanolikäymis- 35 prosesseissa on erittäin toivottavaa, että kloonataan vastaavat geenit hyvin läheistä sukua olevasta organismista, 112091 3 koska silloin ilmennettyjen entsyymien tuotanto ja käyttö on elintarviketeollisuuden paljon helpommin hyväksymä ja niillä on teollisten prosessien edellyttämät entsymologi-set ja kemialliset ominaisuudet. Siksi Schwanniomyces-5 mikro-organismin amylaasit, joita voidaan tuottaa DNA-rekombinaatiotekniikan avulla lukuisissa isäntäorganis-meissa, sopivat paremmin lukuisiin sovellutuksiin johtuen Scin^anniomyces-mikro-organismin ja käytetyn isäntämikro-organismin läheisestä sukulaisuudesta ja Schwanniomycesin 10 tuottamien amylaasien alhaisesta lämpötilaoptimista, läm pötilalle rkkyy des tä ja hyvästä stabiilisuudesta.
Schwanniomycesin α-amylaasigeeni on ensimmäinen kloonattu hiivalajin α-amylaasigeeni ja soveltuu läheistä sukua olevan hiivaorganismin geeninä paremmin käytettä-15 väksi elintarviketeollisuuden tarvitsemissa käymisproses- seissa, esimerkiksi panimo- ja leipomoprosesseissa.
Lisäksi muihin a-amylaaseihin verrattuna Schwanniomycesin α-amylaasin entsymaattisella aktiivisuudella on optimi verraten alhaisessa noin 37 °C:n lämpötilassa, mikä 20 mahdollistaa käytön alhaisemmissa fermentointi- tai pro- sessilämpötiloissa. Lisäksi Schwanniomycesin α-amylaasi i ’·· voidaan inaktivoida 50 °C:ssa.
• Schwanniomycesin glukoamylaasi pystyy erityisesti i : pilkkomaan tärkkelysketjua haarautumiskohdista ja kykenee ·*·’: 25 täten hydrolysoimaan tärkkelyksen käytännöllisesti katsoen _ täydellisesti glukoosiksi, kun taas Candida albicansin tai
Saccharomyces diastaticuksen glukoamylaasit eivät kykene » · pilkkomaan ketjua haarautumiskohdista, eivätkä täten pysty ,, , hydrolysoimaan tärkkelystä täydellisesti glukoosiksi.
‘30 Schwanniomycesin glukoamylaasilla erityisen edullisten entsymaattisten ja kemiallisten ominaisuuksiensa, mukaan : ; : lukien sen pH- ja lämpötilaoptimit, ohella on ne lisäedut verrattuna muilla jo kloonatuilla geeneillä koodattuihin ' . glykoamylaaseihin, että tämä entsyymi on peräisin hiivala- 35 jista ja se lämpöinaktivoituu panimoteollisuuden yleensä käyttämissä pastörointiolosuhteissa (Sills et ai., 1983).
112091 4
Siksi panimoprosessille, teolliselle etanolikäymi-selle ja hiivabiomassan tuotannolle olisi erittäin edullista, jos pystyttäisiin tuottamaan Saccharomyces cere-visiae -viljelmiä, joilla luontaisesti on korkea C02-5 tuottokyky, hyvä fermentointitehokkuus ja hyvä etanolin sietokyky, jotka kykenisivät täydellisesti hydrolysoimaan tärkkelyksen syntetisoimalla ja erittämällä a-amylaasia ja glukoamylaasia. Myös leipomoprosesseissa tarvittavalle C02-muodostukselle voisi olla suurta hyötyä amylaaseja 10 tuottavista kannoista.
Esillä olevan keksinnön päämäärä oli täten tuottaa mikro-organismi, joka soveltuu käytettäväksi panimo- ja leipomoprosesseissa sekä teollisessa etanolikäymisessä ja biomassan tuotannossa, koska se pystyy hydrolysoimaan 15 tärkkelyksen täydellisesti kyetessään syntetisoimaan ja erittämään cc-amylaasia ja glukoamylaasia.
Esillä oleva keksintö koskee siten hiivasolua, joka kykenee ilmentämään termolabiileja amylolyyttisiä entsyymejä sen johdosta, että se on yhdistelmä-DNA-tekniikalla 20 vastaanottanut DNA-sekvenssejä luovuttajahiivalta, jolle hiivasolulle on tunnusomaista, että se kykenee ilmentämään • '· organismin Schwanniomyces α-amylaasia ja glukoamylaasia sen • · s :johdosta, että se on Schwanniomyces-luovuttajahiivalta vas-: taanottanut DNA-sekvenssejä, jotka käsittävät mainittua a- j‘·*; 25 amylaasia ja glukoamylaasia koodaavat sekvenssit.
Keksintö koskee edelleen yhdistelmä-DNA: ta, jolle • * « on tunnusomaista, että se sisältää Schwanniomyces-οί-amylaasia ja -glukoamylaasia koodaavat sekvenssit, sekä yhdis-,, , telmä-DNA:ta, jolle on tunnusomaista, että se sisältää ku- 30 viossa 2 esitetyn DNA-sekvenssin, joka koodaa Schwanniomy-ces-a-amylaasia, jolla on kuviossa 2 esitetty aminohappose-: V: kvenssi.
Keksintö koskee myös hiivasolua, joka kykenee il-‘. mentämään termolaabiilia amylolyyttistä entsyymiä sen joh- ’ 35 dosta, että se on yhdistelmä-DNA-tekniikalla vastaanottanut DNA-sekvenssin luovuttajahiivalta, jolle hiivasolulle on 112091 5 tunnusomaista, että se kykenee ilmentämään organismin Schwanniomyces α-amylaasia sen johdosta, että se on Schvran-niomyces-luovuttajahiivalta vastaanottanut DNA-sekvenssin, joka käsittää α-amylaasia, jolla on kuviossa 2 esitetty 5 aminohapposekvenssi, koodaavan nukleotidisekvenssin tai sen modifikaation, joka säilyttää koodatun α-amylaasin aktiivisuuden .
Keksintö koskee myös menetelmää termolabiilin a-amylaasin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnus-10 omaista, että keksinnön mukainen hiivasolu kasvatetaan sopivassa kasvatusalustassa ja α-amylaasi otetaan talteen mainitusta kasvualustasta.
Lisäksi keksintö koskee menetelmää sellaisen fer-mentaatioprosessin suorittamiseksi, jossa käytetään tärkke-15 lystä raaka-aineena, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että keksinnön mukaista hiivasolua käytetään mainitussa fermentaatioprosessissa tai keksinnön mukaisessa menetelmässä α-amylaasin valmistamiseksi, jota sitten otetaan talteen ja käytetään fermentaatioprosessissa.
20 Edelleen keksintö koskee menetelmää biomassan val mistamiseksi, menetelmää oluen valmistamiseksi, menetelmää • **· leivän valmistamiseksi ja menetelmää etanolin valmistami- • seksi, joille kaikille on tunnusomaista, että käytetään : : : keksinnön mukaista menetelmää fermentaatioprosessin suorit- ·*·*: 25 tamiseksi.
Halutut mikro-organismit voidaan tuottaa käytetty-jen mikro-organismien geenimanipulaatiolla DNA-rekombinaa-tiotekniikan avulla. DNA-rekombinaatiotekniikkaa käytetään .. , kaupallisesti kiinnostavien α-amylaasia ja glukoamylaasia 3 0 koodaavien geenien kloonauksessa, jolloin kloonataan DNA- fragmentteja, jotka sisältävät Schwanniomyces-suvun hiivan : '. *. α-amylaasi- ja/tai glukoamylaasigeenit. Isäntämikro-orga- nismin transformoinnin jälkeen amylaaseja koodaavat kloonatut geenit ilmennetään isäntämikro-organismissa, esimerkik- • · 35 si Saccharomyces cerevisiaessä, ja geenituotteita erittyy kasvualustaan. Täten voidaan välttää tärkkelyksen ja/tai ei 112091 6 käymiskelpoisten dekstriinien esikäsittely entsyymeillä, mikä oli välttämätön tuottamaan fermentoiville mikro-organismeille käymiskelpoista sokeria, ja saadaan lisäksi kaikki halvempaan ja yksinkertaisempaan käymisprosessiin 5 liittyvät edut esimerkiksi panimoteollisuuden sekä teollisen etanolikäymisen ja biomassatuotannon piirissä. Leipomo-prosesseissa amylolyyttisestä hiivasta voi olla suurta etua valmistettaessa tietyn tyyppisiä taikinoita.
Eräs fermentoiva mikro-organismi, esimerkiksi a-10 amylaasia ja glukoamylaasia tuottamaan kykenevä Saccharomyces cerevisiae, tuottamalla saatavista eduista perustuu siihen, että tällöin tärkkelys voidaan hajottaa jatkuvasti ja kvantitatiivisesti, kun samalla muodostuu biomassaa tai etanolia tärkkelyksen hajoamistuotteina syntyneiden pieni-15 molekyylisten hiilihydraattien aerobisen tai anaerobisen käymisen tuloksena. Edellä mainitun panimokäymisen kyseessä ollen tämän tärkkelyksen täydellisen hajoamisen tuloksena saadaan alhaisen kaloripitoisuuden omaavaa olutta, koska geenimanipuloidut mikro-organismit käyttävät helpos-20 ti muodostuneet pienimolekyyliset hiilihydraatit etanoliksi ja C02:ksi.
• '·· Lisäesimerkki amylolyyttisten Saccharomyces cere- j ' visiae -kantojen käyttösovellutuksista oluenpanossa on : erityissolujen valmistus, kuten alhaisten hiilihydraatti- 25 pitoisuuden omaavan oluen, dieettioluen ja erityiset aro- • · j\ mi- ja makutekijät omaavan oluen valmistus. Lisäksi nämä .·.·, kannat mahdollistavat olutkäymisessä käyttökelpoisen tärk kelyspitoisten raaka-aineiden skaalan laajentamisen.
... Vaikka edellä kuvattu keksinnön perusajatus käsit- 30 tää erilaisten yhteen edellä mainituista käymisprosesseis- t · ta tai biomassan tuotantoon soveltuvien isäntämikro-organismien käytön, kuvataan nyt edullinen esimerkki ra-kennettaessa mikro-organismi, jotta kyettäisiin ilmentä-’ , mään amylaaseja ja saamaan niitä erittymään.
I t i I I
35 Saccharomyces cerevisiae -lajin hiivan rakentami seksi kehitettiin erityistä merkkiä käyttävä transformoin- 112091 7 tijärjestelmä, joka tarjoaa sekä amylaasigeenien säätelyn että niiden geenituotteen ylituotannon hiivasoluissa.
Esillä olevan keksinnön mukaan on rakennettu lisäksi edestakaisin liikkumaan kykenevä (shuttle) kosmidi-5 vektori, jota voidaan käyttää kuljetinvektorina transformoitaessa Schwanniomycestä, Saccharomycestä, Escherichia colia ja Schizosaccharomyces pombea.
Keksinnön edullisen sovellusmuodon mukaan Schwanniomyces castellii -hiiva toimii luovuttajana kloonattaes-10 sa a-amylaasi ja glukoamylaasigeenejä. Saccharomyces cere-visiae toimii isäntähiivana, joka kykenee ilmentämään mainitut amylaasigeenit vastaanotettuaan transformointimenet-telyillä ilmentymiselle otollisiksi tehdyt kloonatut geenit, ja joka lisäksi kykenee erittämään geenituotteita.
15 Lisäksi geenimanipulaation tuloksena mahdollistuu amylaasien ylituotanto Schwanniomyces alluvius -hiivassa. Tämä amylaasituotanto Schwanniomyces-kannoissa on sinänsä erittäin edullista tuotettaessa näitä entsyymejä, joita talteenoton sinänsä tunnetulla tavalla jälkeen voidaan li-20 säksi käyttää kuten edellä kuvattu käymisprosesseissa, joissa vielä on välttämätöntä lisätä amylaasit erikseen, ί ’·· Uudet Schwanniomyces-vektorit kontrolloivat • '/ Schwanniomycessa toisiintumisen ja ylläpidon toimintaa.
: : : Tämä Schwanniomycesin kromosomi-DNA:sta eristetty toisiin- ·*·’: 25 tumissekvenssi (SwARSl) toisiintuu Schwanniomycessa itse- !*. näisesti ja tuottaa korkealla tiheydellä transformantteja.
SwARSl-yksikkö kykenee toimimaan myös Saccharomyces cere-
• I
visiaessä ja tuottaa täten korkealla tiheydellä transfor- .. . mäntteinä SwARSl-plasmidin sisältäviä Saccharomyces cere- > » 30 visiae -mutantteja.
• I
*·;** Eräs Schwanniomyces-vektorien sovelias edustaja on : : pCJD5-l, hydridiplasmidi, joka koostuu SwARSl-sekvenssis- tä, bakteriofagi λ-.n cos- (koheesio-) sekvenssistä, pBR322-sekvenssistä ja Saccharomyces cerevisiaen TRP5-gee-35 nistä, jota käytetään valinnaisena merkkinä.
112091 8 Tämä plasmidi on uusi Saccharomyces cerevisiae -Schwanniomyces alluvius - Escherichia coli -kosmidikulje-tinvektori, joka sisältää sopivia kloonauskohtia DNA-geenikirjastojen rakentamiseksi.
5 Tässä julkaisussa kuvataan myös uutta yksinker taista ja nopeaa transformointimenettelyä hiivoille Schwanniomyces alluvius, Saccharomyces cerevisiae, Schi-zosaccharomyces pombe ja Kluyveromyces lactis.
Edellä kuvattua vektoria ja transformointijärjes-10 telmää käyttämällä on mahdollista tuottaa uusia geeni-manipuloituja Saccharomyces cerevisiae -suvun hiivakanto-ja, jotka kykenevät syntetisoimaan amylaaseja teollisissa tuotantovilj elmissä.
Seurauksena tästä tuotannosta teollisissa viljel-15 missä tulee olemaan tämän modifioidun Saccharomyces cerevisiae -kannan käyttö aerobisissa ja anaerobisissa tärkke-lyskonvertointiprosesseissa tuotettaessa hiivabiomassaa, etanolia ja C02:ta.
Tässä kuvataan edelleen uusia DNA-sekvenssejä, 20 jotka johtavat vastaavien geenien ilmentymiseen Saccharomyces cerevisiaessä, Schwanniomyces alluviuksessa, Schi- I ’·* zosaccharomyces pombessa ja Kluyveromyces lactiksessa ja * näissä proteiinien eritykseen, koska uudet DNA-sekvenssit : : : sisältävät mainituille hiivoille erityksen sallivia uusia *' * *: 25 erityssignaaleja.
:·. Lisäksi uudet DNA-sekvenssit ovat sekvenssejä, jotka sallivat säädellyn geeni - ilmentymisen.
Lisäksi kuvataan yhtään E. coli -sekvenssiä sisäl- .. . tämätön vektori amylaasigeenien integroimiseksi Saccharo- • · 3 0 myces cerevisiaen perimään.
• » *·;** Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisemmin kaikkia : : : esillä olevan keksinnön näkökohtia.
> I
» * · ! « 9 112091
Lyhyt selostus kuvioista Kuvio 1 A: Plasmidin ρΥοΙ-α, joka on saatu insertoimalla 5 kb: n a-amylaasigeenin sisältävä S. castelliin DNA-frag-5 mentti kosmidiin pYcl, suuntautuminen.
B: Kloonatun S. castelliin EcoRI-fragmentin res- triktiokartta.
C: Plasmidiin pJDB207 subkloonatut fragmentit (1, 2 ja 3) eivät johda α-amylaasigeenin toiminnalliseen il-10 maisuun S. cerevisiae GRF18 -transformanteissa.
D: Sekvensointistrategia
Sekvensoinnin suorittamiseksi Maxamin ja Gilbertin (1980) mukaan EcoRl/Sall-fragmentit 3'-leimattiin 32P-dTTPrllä. Sekvensoinnin suuntautuminen ja laajuus on mer-15 kitty nuolilla.
Kuvio 2 a-amylaasin rakennegeenin 5'-pään ja sen 5'-sivustan nukleotidisekvenssi.
Kuvio 3 20 Glukoamylaasin viiden eristetyn trypsiinipeptidin aminohapposekvenssit. i '·· Kuvio 4 j ',** Transformanttien erittämän α-amylaasin aktiivisuus : : ,· eri kasvuvaiheissa.
25 Soluja kasvatettiin yön yli esiviljelminä 0,67 %
I I
YNB:tä ja 4 % glukoosia sisältävässä kasvualustassa. Kun t solut oli pesty vastaavan pääviljelmän kasvualustalla, i * » * · pääviljelmät siirrostettiin pitoisuuteen ODgoo = 0,2. S.
.. , alluvius NGA -transformantien pääviljelmät (1 litra annet- » » 30 tuja hiililähteitä sisältävää YNB-kasvualustaa Fernbach- i · astioissa) puskuroitiin 0,2 M natriumfosfaattipuskurilla, : : pH 6,2, ja S. cerevisiae MC34 -transformanttien vastaavat pääviljelmät 0,1 M sitraattipuskurilla, pH 6,2. Viljelmiä inkuboitiin 30 °C:ssa jatkuvalla ravistelulla (2 Hz) pit- * » 35 kittäisravistelulaitteessa. Viljelysupernatantin a-amylaa- siaktiivisuus- ja glukoosimääritykset suoritettiin kuten » ' I ! > 10 112091 kuvattu. Yksityiskohtaisemmin, katso julkaisun selitysosaa .
Kuvio 5 FPLC-ioninvaihtokromatografia Mono Q -kolonnissa 5 α-amylaasiproteiinien erottamiseksi pYcl-oclla transformoidun S. cerevisiae MC34:n konsentroidusta solunulkoises-ta supernatantista.
10 mM Tris-Cl-puskuria, pH 7,5, käyttäen a-amylaa-si pystyttiin eluoimaan kasvavaa NaCl-gradienttia käyttä-10 mällä pitoisuudessa noin 300 mM NaCl.
a : A254 nm
b: % puskuria B
puskuri A: 10 mM Tris-Cl, pH 7,5 puskuri B: 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 2M NC1 15 Kuvio 6
Plasmidilla pYcl-a-transformoidun S. cerevisiae MC34:n solunulkoisesta supernatantista saadun puhdistetun a-amylaasiproteiinin SDS-PAGE-analyysi.
vyöhyke a: puhdistettu u-amylaasi 20 vyöhyke b: molekyylipainostandardiproteiinit kaniininlihasmyosiini (205 kd) , E. coli /3-galakto- 1 · • ’·· sidaasi (116 kd) , kaniininlihasfosforylaasi b (97 kd) , • · · j naudan albumiini (66 kd) , muna-albumiini (45 kd) , naudan : punasoluhiilidioksidaasi (29 kd) .
2 5 Kuvio 7 Tärkkelyshydrolyysituotteiden ohutlevykromatogra- fia.
Viljelysupernatanttien a-amylaasiaktiivisuutta .. , liukoisen tärkkelyksen suhteen 2 tunnissa 40 °C:ssa selvi- * * * 30 tettiin edelleen suorittamalla reaktiotuotteiden ohutlevy-kromatografia käyttäen Merckin Kieselgel 60:tä. Kromato-; grafia-ajo suoritettiin käyttäen eluointisysteemiä 2:2:1 asetoni-isopropanoli-0,1 M maitohappo. Kromatogrammi kehi-’ , tettiin käyttämällä naftoresorsinolia kuten ovat kuvanneet 35 Touchstone ja Dobbins (1978).
» » “ 112091
Kuvio 8 S. alluvius plasmidien rakentaminen A a: plasmidia YRp7HIS4, joka eristettiin S. castel- lii DNA:n Sau34-geenikirjastosta plasmidissa YRp7 (Struhl 5 et ai., 1979) komplementoimalla S. cerevisiaen AH22 his4-519-mutaatiota, hajotettiin BamHI:llä ja Claltllä ja uu-delleenligatoitiin. Yksi saaduista plasmideista (YRpHIS4) sisältää 1,5 kb:n BamHI/CIal-fragmentin S. castelliin his4-alueelta YRp7:ssä, 10 b: 1,45 kb:n ARSl-TRPl-EcoRI -fragmentin poistami nen plasmidista YRpHIS4.
c: 5 kb:n AMY-EcoRI -fragmentin insertointi plas- midiin pBRSwARSl.
d: 3,2 kb:n TRP5-BamHI -fragmentin eristäminen 15 plasmidista pYASl preparatiivisella geelielektroforeesil- la.
e: 3,2 kb:n TRP5-BamHI -fragmentin insertointi plasmideihin YRpHIS4, pBRSwARSl ja pBRSwARSl-α.
B Plasmidit YRp7TRP5-A ja -B rakennettiin insertoi- 20 maila pYASl:n 3,2 kb:n TRP5-BamHI -fragmentti YRp7:ään.
Saatiin fragmentin kummankin suuntautumisen (-A ja -B) mu-: ’·· kaisia plasmideja.
\ \* C Plasmidit pEK2TRP5-A ja -B rakennettiin insertoi- ; : : maila pYASl:n 3,2 kb:n TRP5-BamHI -fragmentti K. lactis 1'·'i 25 -vektoriin pEK2 kummankin kyseeseen tulevan suuntautumisen :*,t (-A ja -B) mukaisesti.
, *. ·. Kuvio 9 * » ·
Plasmidin YRpJD2 kopioluvun arviointi S. alluvius .. . NGA23:ssa ja S. cerevisiae X3656 2D:ssä.
*,,) 30 A Etidiumbromidilla värjätyt plasmidi- ja hiivami- i · **;' nilysaatti-DNA erotettuina 0,7-%:isella agaroosigeelillä.
: : : B Autoradiogrammi Southern-blotin ja -hydridisaation jälkeen nick-translatoituun YRpJDl DNA:hän (48 tunnin ke- ’ , hitys -70 °C:ssa).
» » 35 C Vyöhykkeiden j-q autoradiogrammi 312 tunnin kehi tyksen -70 °C:ssa jälkeen.
112091 12 D Hydridisaatiokoettimen YRpJDl kartta (ohut viiva: pBR322, avoimet kotelot, S. cerevisiae DNA, musta kotelo,
S. castellii DNA). Vyöhykkeet a-c, kontrolliplasmidit, a: YRpJDl EcoRI
5 b: YRpJDl, ei pilkottu c: YRpJD2, ei pilkottu vyöhykkeet d-g, hiivaminilysaatti-DNA, d-f, S. al-luvius NGA23:YRpJD2-transformantti DNA, d ja f pilkottu EcoRI:11a, e ja g, ei pilkottu, h ja i, EcoRI:11a pilkottu 10 NGA23:YRpJDl DNA (h) ja ei pilkottu (i) , ja j ja k, EcoRI :11a pilkottu ei transformoitunut NGA23 DNA (j) ja ei pilkottu (k), 1 ja m, EcoRI:lla pilkottu S. cerevisiae X3656 2D:YRpJD2 -transformantti DNA (1) ja ei pilkottu (m), n-q, EcoRI:11a pilkottu ei transformoitunut X3656 2D 15 DNA (n ja p) ja ei pilkottu (o ja q) .
Kuvio 10
Eri plasmidien kopioluvun arviointi S. alluvius NGA23:ssa.
A Kontrolliplasmidien ja hiivaminilysaatin DNA: n 20 etidiumbromidilla värjätyt EcoRI-fragmentit erotettuina 0,7-%:isella agaroosigeelillä, i ’’· B Autoradiogrammi Southern-blotin ja -hydridisaation • jälkeen nick-translatoituun YRp7HIS4 DNA:han (15 tunnin kehitys -70 °C:ssa), ·'''; 25 C Autoradiogrammi kuuden tunnin (vyöhykkeet a-d) ja vastaavasti 125 tunnin (vyöhykkeet e-p) kehityksen -70 °C: ssa jälkeen (himmeät nauhat vyöhykkeissä j ja m ja nauhojen asema HIS4-kromosomipaikassa on merkitty nuolilla). ... D Kaavio YRpJDl-homologeista ja Schwanniomyces HIS4- 3 0 kromosomialueesta hybridisaatiokoettimelle YRp7HIS4.
'···* vyöhykkeet a-e, kontrolliplasmidit; a, pEK2TRP5-A, ::: b, YRp7TRP5-A, c, pYASl, d, YRpJDl, vyöhyke e, ei trans- formoitunut S. alluvius NGA23 DNA, vyöhyke f, ei transformoitunut S. castellii 26076 DNA, vyöhykkeet g-p, S. allu-35 vius NGA23 DNA, kun NGA23 transformoitu: g, YRpJDl:llä, h ja j, YRp7TRP5-A:11a, i, k ja 1, YRp7TRP5-B:llä, m, 112091 13 pEK2TRP5-A:11a, n, pEK2TRP5-B:llä, o ja p, pYASl:llä (DNA:ta vyöhykkeellä o ei ole pilkottu)
Kuvio 11
SwARSl- ja ARSI-plasmidien kopiolukujen vertailu 5 S. alluviuksessa ja S. cerevisiaessä.
A Kontrolliplasmidien ja hiivaminilysaatin DNA: n etidiumbromidilla värjätyt EcoRI-fragmentit erotettuina 0,7-%:isella agaroosigeelillä.
B Autoradiogrammi Southern-blotin ja -hybridisaation 10 jälkeen nick-translatoituun YRpJD2-o; DNA: hän. S. cere-visiae TRP5-kromosomipaikan 2,0 kb:n nauhan asema on merkitty nuolella.
vyöhykkeet a-d, kontrolliplasmidit: a, pCJD5-l, b, YRpJD2-a, c, YRpJDl, d, YRp7TRP5-A, 15 vyöhykkeet e-h, S. alluvius NJD1 DNA, e, f ja i, ei transformoituneita, g, transformoitu pCJD5-l:llä, h, transformoitunut YRpJD2:lla, vyöhykkeet j -m, S. alluvius NGA23 DNA, j, ei transformoitunut, transformoitu YRpJD2-ct: 11a, k, YRpJD2 :11a, 1, YRpJDl: llä, m, 20 vyöhykkeet n-r, S. cerevisiae X3656 2D DNA trans formoitu YR-JD2-a:11a, n, YRpJD2:lla, o, YRpJDl:llä, p, • » : " YRp7TRP5-A:11a, q, vyöhyke r, ei transformoitunut.
• · I
• V Kuvio 12 S. alluvius NGA23 - transf ormanteista saatujen so-25 lunulkoisten proteiinien in vivo -leimaus.
• ‘•tt Transf ormantit kasvatettiin ehkäisevissä tai in- dusoivissa olosuhteissa (katso kuviot 4a, b ja c) 1 ml:n viljelminä, kun oli lisätty 100 μΟί:tä 35S-metioniiniä ;.>>t (800 Ci/mmol) . Inkuboitiin 30 °C:ssa vaihtelevan pituisen 30 ajan (18, 22, 28, 43 ja 90 tuntia), minkä jälkeen 30 μΐ • · soluvapaata supernatantt ia analysoitiin SDS-PAGE:lla ja 1^/· autoradiograf iällä.
a, NGA23 : YRpJD2 YNB-.ssä, 2 % glukoosia (ehkäisty) b, NGA23:YRpJD2 YNB:ssä, 2 % maltoosia (indusoitu) 35 c, NGA23:YRpJD2-a YNB:ssä, 2 % glukoosia (ehkäisty) 14 -? η r r ρ η
s U t y I
d, NGA23:YRpJD2-a YNB:ssä, 2 % maltoosia (indusoitu)
Molekyylipainostandardiproteiinien (katso kuvio 6) asemat on merkitty nuolilla.
5 Kuvio 13
Kosmidien pCJD5-l ja pCJD5-2 restriktiokartta ja -analyysi.
A restriktiokartta B 0,7-%:isessa agaroosigeelissä erotetut restriktio- 10 fragmentit vyöhyke a, EcoRI:lla ja Hindlllrlla ja pilkottu lambda DNA-vyöhyke q, HindIII:lla pilkottu lambda DNA vasemmalta oikealle: plasmidit YRpJD2, pCJD5-l, pCJD5-2: vyöhykkeet b, c ja d, pilkottu EcoRI:11a, 15 vyöhykkeet h, i ja j, pilkottu BamHI:llä, vyöhykkeet k, 1 ja m, pilkottu BgIII:llä, vyöhykkeet n, o ja p, pilkottu PvuII:lla Kuvio 14
Plasmidin pKARS2-o? restriktiokartta, 5 kb:n AMY-20 EcoRI -fragmentti plasmidista pYcl-a insertoitiin plasmidin pKARS2-d ainoaan EcoRI-kohtaan.
; ·· Kuvio 15 ; A Kahden toiminnallisen glukoamylaasigeenin (AMG) : : : sisältävän alakloonatun fragmentin restriktiokartta, ·’·*: 25 B AMG-fragment it alakloonattiin S. alluvius - S. ce- revisiae -vektoriin pCJD5-l, jolloin saatiin pCJD5-AMGl ja pCJD5-AMG2, S. cerevisiae - S. pombe -vektoriin pJDB207, jolloin saatiin pJDB207-AMGl ja pJDB207-AMG2, ja K. lactis .. . -vektoriin pEK2, jolloin saatiin pEK2-AMG2.
3 0 Kuvio 16
Glukoamylaasin inaktivoiminen eri lämpötiloissa.
: ; * Kuvio 17
Glukoamylaasin rakennegeenin ja sivusta-alueiden ' . nukleotidisekvenssi.
‘ 35 i » 15 1 12091
Taulukko I
Kodonipreferenssien vertailu S. cerevisiaessä ja Schwanniomyces castelliissa.
Kodonipreferenssi Kodonipreferenssi Aminohappo S. cerevisiaessa S. castelliissa ala GCU, GCC GCU, GCG
ser UCU, UCC UCA, UCC, AGC, UCU, AGU
(ei selvää preferenssiä) thr ACU, ACC ACU, ACC, ACA
vai GUU, GUC GUU; GUA, GUC, GUG
ile AUU, AUC AUU; AUC, AUA, AAU
(ei selvää preferenssiä) asp GAC GAU, GAC
phe UUC UUC, UUU
(ei selvää preferenssiä) tyr UAC UAU, UAC
cys UGU UGU
asn AAC AAU, AAC
hi s CAC CAU, CAC
glu GAA GAA, GAG
; gly GGU GGU, GGA
gin CAA CAA
lys aag aaa
Kolster Oy cca cca, ecu
Ab * *» »
leu UUG UUG, UUA, CUU
* * *
arg AGA AGA
i » s II· I ·
• I
f #
• * I
I I
I I I
• I
I t » » » » I
i6 1 12091
Taulukko II
Muunnettua menetelmää käytettäessä saatuja trans-formoitumistiheyksiä eri hiivasukujen kannoilla.
Toisiin- Transformant -
Laji Kanta Plasmidi tuja Merkki teja pg:aa __DNA: ta kohden S. alluvius NGA19 YRpJDl SwARSl TRP5 300 - 1000 S. alluvius NGA23 YRpJDl SwARSl TRP5 300 - 1000 S. alluvius HTR36 YRpJDl SwARSl TRP5 300 - 1000 S. cerevisiae AH22 YRp7HIS4 ARSI HIS4 500 - 2000 S. cerevisiae X3656 YRpJDl ARSI TRP5 500 - 2000 S. cerevisiae X3656 pYASl 2 pm TRP5 1000 - 10000 S. cerevisiae GRF18 pYcl 2 pm HIS3 200 - 1000 K. lactis SD11 pEK2 KARS2 TRP1 500 - 1000 H. polymorpha LR9 pHARSl HARSI URA3 500 - 1500 S. pombe leul-32 pJDB207 2 pm LEU2 1-10 π 112091
CO
3
'2 m S
3 p, i ^ " H > ^ H
r-J ^ Ή (ti O ] lii tij pl (LI -M 1 I I ' ' ' ' rH pi^CQ . ΓΊ (N (N Λ O , Λί O (ti <N <“* U> -h + snj T3 3
. Λ Λ 03 O rH
W S £ ä I s ti S i > -S W m in tn 2 ‘[^ Ö o o o m 5
1-1 ä 3 £ II H
f) !(0 Λ T) I III
H g 5 § m (N 1 Λ -H O M ti. o' o ti ti 01 m o ^ -H o O o λ; w a ns (U O 3
ft ft rH
rd
-p-j ($ dP dp dP o'p oV= oY5 o\P
m -γί
^Or—ΙγΗγΗγΗΟΟ , V äiti ,(β rH H CN
ti ta <ti ö jS o .
(L> en tn <L) .t: tn 11 ti <u tn O) 3 en te ft ϊ (ti Lno
r. -rt 4-1 1—I l-, -rl rH
d > tn «o ^ > “ -H Pl -n g (ti
H -H H m 4J
rH 4J (ti Ö Q, W
-h ft 3 ω r o o > > H Tl
^ h tn h ft O
.y a) ns o m s ro ω ft cl ε* ε
4J
® .(rt „ I o\P dfi dP dP dP dP dP
B (ti 2 O
ta ta .Ti to id o o cr, h o tn 4J (u tn pH cN Η σι en <U tn (ti x (ti
m -H 4J lj -H I II
\ > tn .73 > ti -n PJ -g (ti O Ln tn 4- > -H rH g 4-1 pH l> 00 -P 4-J (ti rv tn
0 pj ti O
• · η ω > + τί (« . j, H to ft O -n ... ti tu (ti u pi p)
: . . ti ω m h ε rH
; , · B
; tn (ti rv, o ... ~ (ti 4-1 ™ 00 ... -U I ,—1 .·_οοοοοο
;·; Q) JH(tift< (NN(N(NHH
ti O -n S I
5- hh <1) (ti Q I I I I 1 1
• · m , tn JJ tn I
·*· tu + pS4Jtn-H tninminoo rG ft (ti Ö fl 0' tno ,-H μ p (ti tn -h m *· jj h -u ε ft ε ’ ‘ m 1 -g s SS® ... p ε 3 oj oj 5
: · : hjj 3 ^ -4 2 < c 'S
·* i_j ._i jj-h ^^22^-^ ... wn 00 , w ω * ^ ft ω . . H O -H rH ft ft - „ " " fc -H (ti (ti 2 2 CH -
• “ OP tn 4-1 m m rH
' MO -H ΰ Xl S 3 « 5 ιύ 0<U0 Z 3 % :.V * m ^ tn ft ... h d : ; 3 td m ... (tip ip HEHd ^ 4 m < m ..... υ·* ~ tn tn tn m • * d -h tn ft ft ft ft .· Π ft ft Pi ft ft nn -h ChEhPPEh h
• * ro ε 4J I I I I h Q
0. m “ftt^tsitHCQipj
ft (ti id CL CL ft ft 2 CL
U rH >H ft ft H W >H ft
S CL ft>H>Hftftft>H
112091 18
H
jq 3 μ' ω 2 S S
(Ο -¾ <0 m H ^ H
+J · 3 0 * I I
m to o . 3 CD -H in ^ 1n in 4J CQ ft flj 8 co m •h in e
JJ U) <D
4j ro ö c ox $ O ., t A M m ° ° 4-)0) :(¾ 0 Ή (M | ^ ^ •H tC :(0 Ai « C ,,
£ -Η ε O (N
2 ί 5 w s ο ^ ω
-Π ω r-H
4J > <U O
(U o « m Ό h
^ I :(C
1)0 ,h cn £< o w ft 1) oV= o¥> dip j_> t/) ω -Η in -η Η ιο o o o 03 h> 0) in σ. σι cn
-H fO -H 0 IP
£ -r~i Ö -H mill
H O) -U · X
m (0 ti M W ooo -£ m -HO) co oo co -H UJ p
0 W 0) QJ
6 β tn $h m a) n nj -β -h d <>; =d <u m 4-1 ft > m CO ^ C rC cip cäp d Z G (D 4-) (Ö (UOJtnMm^oo Γ\3 Tl rH f—I ^ ^ m
-ο -Η -h =d d O S I I
Γ1 ε -Π β · s m OJ > to > W o o m3 d fi ω oo oo Η Γ-H rH <L) d Q, ^ ft > -« C d ooo ,, ^ . d .ooo : " /c 173 §
• 1 '1 2 ' i) O vo I , I
I 1 ! r1 . co I m flS . S> ^ > -(-. coK°°° . , , P h ¢) Ο o o .,, H -u ö in in in n, o 4J <u '1 ’ $ 9 C Ό : · I g -H d Λ o o . . x η, ε o . o o , ,g 8 1 3 s S Ξ 3 :." a 1 ϊ s < g .,
:,, ft 4-) β . S
·1· Pi 0) d < w ^ in o o * 1 H CQ MS J o o ,H H Q mm P =(0
. , Pi >H d H
: · · >h :(0 η ω • · > =(0 A 3 .
· H S 5 H s s 2 - · Cl) -m ω co ra pi " ’ O -H M β ft 3 34 X) » < ' ·1 .,. Λί -H D -H m w P B M ° g , < § :: 3 co (0 ·'1 rt rH Ί-) E-· ft i .,,,: 4-) in • <y -η Λ TO TO «
..... H -H EH h (N
η ε I a q fn “ 1-3 1-3 “ <e ft ft ft •H rH Pi Pi pi I—I ft >4 >H >4 112091 19 Käytetyt hiivakannat ovat seuraavat:
Schwanniomyces castellii ATCC 26076. (DSM 3794) Schwanniomyces alluvius NGA23 and NGS1. (DSM 3792 and 3793) 5 Kluyveromyces lactis SD11. (DSM 3795)
Schizosaccharomyces pombe leu1'32, his5-303. (DSM
3796)
Saccharomyces cerevisiae GRF18 leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15. (DSM 3797) 10 Saccharomyces cerevisiae AH22a leu2-3, leu2-112, his4-519, canl. (DSM 3820)
Saccharomyces cerevisiae X3656 2D a, ade, arg4-l, his6, leul, trp5. (DSM 3798)
Saccharomyces cerevisiae his3 Mall+ (DSM 3799) 15 Käytetyt Escherichia coli -kannat ovat seuraavat:
Escherichia coli, HB101 F , hsd S20, rB~mB~, recA13, ara-14, proA2, IacYl, galK2, rpsL20 (Smr) , xyl5, mtl-1, supE44, λ' (DSM 3788)
Escherichia coli JA221, recA-1, leuB6, trpE5, 20 hsdR', hsdM+, IacYl. (DSM 3789)
Escherichia coli BHB2688, N205 recA‘ [imm434, cits, i '·· b2, red3, Eam4, Sam7]A (DSM 3790) ,·' Escherichia coli BHB2690, N205 recA~ [imm434, cits, : b2, red3m, Daml5, Sam7]/λ (DSM 3791) 25 Käytetyt plasmidit ja kosmidit ovat seuraavat: kosmidi pYCl plasmidi pEK2 » t plasmidi YRP7 ;.>>> plasmidi pJDB207 30 Sikäli, kun ne ovat oleellisia kyseisen keksinnön * » suorittamiselle, edellä mainitut mikro-organismit on tai- » » V/ letettu (talletuslaitokseen die Deutsche Sammlung fiir Mik- : : ro-organismen, DSM).
>i(i; Hiivakannoilla täydellinen kasvualusta oli YEPD (2 35 % baktopeptonia, 1 % hiivauutetta, 2 % glukoosia). Minimi- f | vaatimusalusta sisälsi 2 % glukoosia ja 0,67 % aminohappo- 112091 20 ja sisältämätöntä hiivatyppiemästä (Difco) sen ollessa täydennetty tarkoituksenmukaisilla aminohapoilla.
Schwanniomyces-solut kasvatettiin 2-%:isessa liuoksessa tärkkelystä glukoosin asemasta.
5 Tärkkelystä käyttävät hiivakannat testattiin a- amylaasin eli täten kehämuodostuksen suhteen 1 % glukoosia, 1 % liukoista tärkkelystä ja 2 % agar-agaria sisältävissä YNB-minimivaatimuskasvualustamaljoissa. Kehät kehitettiin inkuboimalla maljoja jodilla kyllästetyssä kam-10 miossa muutaman sekunnin ajan.
Bakteerisolut kasvatettiin LB-kasvualustassa (0,5 % hiivauutetta, 1 % tryptonia, 1 % NaCl:ää). Tarvittaessa lisättiin ampisilliinia lopullisena pitoisuutena 150 Mg/ml ja vastaavasti tetrasykliiniä 20 Mg/ml.
15 Bakteeritransformaatiot suoritettiin kuten ovat kuvanneet R. W. Davis et ai. (1980).
Hiivatransformaatiot suoritettiin tässä julkaisussa kuvatun menettelyn mukaan.
Kautta tämän patenttijulkaisun eri julkaisuihin 20 viitataan käyttäen kirjoittajan nimeä, jota seuraa julkai suajankohta sulkeissa. Täydellisinä nämä liitteet löytyvät ! * liitteenä patenttijulkaisun lopusta listattuina aakkosjär- jestyksessä välittömästi edeltäen patenttivaatimuksia.
' Näiden julkaisujen tiedot kokonaisuudessaan sisällytetään 25 täten viitteenä tähän julkaisuun alan tilanteen ja kehi- tysvaiheen täydellisemmäksi kuvaamiseksi sellaisena, kuin , v. alan ammattimiehet sen tässä kuvatun ja patentoitavaksi * i < vaaditun keksinnön ajankohtana tuntevat.
. Plasmidi-DNA puhdistettiin joko CsCl-gradientti- 30 sentrifugoinnilla (Maniatis et ai., 1982) tai plasmidi- *;·’ DNA: n nopealla emäksisellä uuttamisella, kuten ovat kuvan- neet Birnhoim ja Doly (1979).
Hiivaraakauutteet valmistettiin Schatzin menetel-• , mällä (1979) .
, 35 Hiivaminilysaatit valmistettiin Shermanin et ai.
(1983) menetelmällä.
21 112091 DNA-fragmentit eristettiin "alhaalla sulavan aga-roosin" -menettelyllä kuten ovat kuvanneet Gafner et ai. (1983).
Keksintöä suoritettaessa käytetyt menetelmät 5 DNA-sekvenssointi suoritettiin kuten ovat kuvan neet Maxam ja Gilbert (1980). DNA nick-translatoitiin Rig-byn et ai. (1977) mukaan.
Southern-hydridisointi suoritettiin kuten on kuvannut Southern (1975).
10 Restriktioendonukleaasit, T4 DNA -ligaasi, E. coli polymeraasi I ja Klenow-polymeraasi voidaan hankkia Boeh-ringeriltä (Mannheim) ja käyttää valmistajien spesifikaa-tioden mukaisesti. a-32P-dNTP: t ja 1S-metioniini voidaan hankkia esimerkiksi Amershamilta. Tsymolyaasi 5 000 ja 15 tsymolyaasi 60 000 voidaan hankkia Kirin Brewlta (Japani). Nitroselluloosasuodattimet voidaan hankkia Schleichlerilta tai Schullita.
Schwanniomyces castelliin DNA:n kosmidikirjasto rakennettiin Saccharomyces cerevisiae -kuljetinvektoriin 20 pYcl (Hohn ja Hinnen, 1980) ja Saccharomyces cerevisiae -Schwanniomyces alluvius - E. coli kuljetinvektoriin pCJD5-: ’* 1, joka rakennettiin tämän keksinnön mukaan kuten ovat ku- • ' ' vanneet Ish-Horowicz ja Burke (1981) .
: | : Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin mene- ·*·': 25 telmällä (1976) käyttäen naudan seerumialbumiinia standar- l’.' dina. Proteiini erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielek- troforeesilla Laemmlin menetelmän (1970) mukaan.
• I
Amylaasiaktiivisuus määritettiin kineettisesti ... entsymaattisella väritestillä, esimerkiksi a-amylaasi 30 Mercko Testillä, saatavana Merckiltä. 2-kloori-4-nitrofe- nolin muodostumisnopeus määritetään fotometrisesti 405 : : l nm:n aallonpituudella 37 °C-.ssa 0,1 M kaliumfosfaatissa.
Entsyymiyksikkö (U) määritetään siksi määräksi entsyymiä, joka katalysoi 1 mikromoolin 2-klooi-4-nitrofe- li**·
t I
nolia muodostumisen minuutissa 37 °C:ssa.
22 112091
Glukoamylaasiaktiivisuus määritettiin pysäytysana-lyysimenetelmällä: kun näytettä on inkuboitu 10 % liukoista tärkkelystä sisältävässä 0,05 M KH2P04-Na0H: ssa (pH 5,0) 50 °C:ssa, määritetään muodostuneen glukoosin määrä 5 glukoosidehydrogenaasimenetelmällä (glukoosisysteemi,
Merck). Muodostuneen NADH:n määrä on verrannollinen glu-koosipitoisuuteen.
Entsyymiyksikkö (U) määritellään siksi entsyymi -määräksi, joka katalysoi 1 mikromoolin glukoosia muodostu-10 misen minuutissa 50 °C:ssa.
Schwanniomyces castellii -viljelysupernatantista eristetty α-amylaasi muodostaa jodivärjäyksellä liukoista tärkkelystä sisältävälle agar-agarille kehän. Näiden havaintojen perusteella suunnitelma kloonata a-amylaasi pe-15 rustui olettamukseen, että kehää muodostamattomat Saccha-
romyces cerevisiae -solut voidaan muuttaa kehän muodostaviksi soluiksi tärkkelystä hydrolysoivan entsyymin, nimittäin a-amylaasin, geenin sisältävän plasmidivektorin ollessa läsnä, a-amylaasigeenin kloonaamiseksi rakennettiin 20 kosmidirekombinanttikirjasto Schwanniomyces castellii ATCC
26076 geeni-DNA:sta. Edellä kuvattua kosmidikloonaustek-i '·· nilkkaa käyttäen voitiin luoda noin 17 000 riippumattoman • kloonin geenikirjasto vektoriin pYcl (Hohn ja Hinnen, : : : 1980) . Kosmidikirjastoa luettiin α-amylaasigeenin sisältä- 25 vien inserttifragmenttien suhteen transformoimalla Saccha- j*.i# romyces cerevisiae GRF18 histidiiniprototrofiksi ja tar- kastamalla tärkkelyksen hajotuskyky.
• ♦ ·
Noin 4500 GRF18-transformanttia testattiin niiden .. , kyvyn suhteen muodostaa jodivärjäyksellä kehiä leusiinia, * » · • · 30 glukoosia ja liukoista tärkkelystä sisältäviin maljoihin.
« I
Saatiin 13 kehiä muodostavaa transf ormanttia. Näistä ; ; .* transf ormanteista eristettiin kokonaishiiva-DNA ja käyt et- tiin sitä tranformoimaan E. coli JA221-soluja valikoiden i > · ‘ , ampisilliinivastustuskyvyn suhteen. Saatiin kaksi erilais- 35 ta rekombinanttikosmidia, jotka sisälsivät 32 kb:n ja vastaavasti 39 kb:n fragementin Schwanniomyces castellii 112091 23 DNA:ta. Nämä rekombinanttikosmidit insertoitiin uudelleen GRT18:aan. Transformanttien fenotyyppi oli His+ sekä kehiä muodostava. Mitoottisen stabiilisuuden testissä (Beggs, 1978) molemmat kosmidimerkit, HIS3 ja kehiä muodostava 5 toiminto, erottuivat samanaikaisesti, mikä osoitti kosmi-din sisältävän molemmat geenit.
Pienempää 32 kb: n inserttifragmentin sisältävää kosmidia käytettiin tunnistamaan kehiä muodostavan feno-tyypin tuottava DNA-alue. Tämän suorittamiseksi kosmidia 10 hajotettiin EcoRI:lla, ligatoitiin se uudelleen ja transformoitiin JA221:een. Ampisilliiniresistententtien E. coli -solujen DNA:ta käytettiin transformoimaan GRF18-soluja valikoiden histidiiniprototrofiän suhteen.
Viidestä kehiä muodostavasta transformantista 15 eristettiin kokonaishiiva-DNA ja käytettiin sitä JA221:n transformoinnissa. Plasmidi-DNA eristettiin ampisilliini-resistenteistä E. coli -transformanteista. Restriktioent-syymianalyysi osoitti kunkin näistä plasmideista sisältävän 5 kb:n EcoRI:lla pilkotun Schwanniomyces castellii 20 DNA-fragmentin alkuperäisestä vektorista pYcl. Tätä plas- midia kutsutaan pYcl-o;:ksi (kuvio IA) . 5 kb:n EcoRI-frag- : “ mentin restriktiokartta on esitetty kuviossa IB.
• V Vektoriin pJDB207 subkloonatut (Beggs, 1981) ja ::: Saccharomyces cerevisiae GRF18:an insertoidut fragmentit 25 1, 2 ja 3 (kuvio 1C) eivät tuottaneet a-amylaasia erittä- • « ;\t viä transformantteja, eivätkä siis sisällä toiminnallista geeniä. Täten voidaan olettaa toiminnallisen n-amylaasi-geenin sijaitsevan Hindlll- ja Bglll-keskuksien välissä.
Ottaen huomioon, että n-amylaasin molekyylipaino 30 on noin 61 000 daltonia (Wilson et ai., 1982), voidaan en-·;·’ nustaa noin 2 kb:n DNA-f ragmentin sisältävän toiminnalli- sen geenin.
Tämän oletuksen toteen näyttämiseksi suoritettiin DNA-sekvenssianalyysi Maxamin ja Gilbertin (1980) mukaan.
, 3 5 Sekvenssoinnin suorittamiseksi kummatkin 5 kb: n EcoRI- • » I » » fragmenttien EcoRI-Sall -fragmentit leimattiin radioaktii- 112091 24 visesti Sail-keskuksessa (kuvio ID) . DNA-sekvenssianalyysillä todettiin 5'-ei koodaava alue, jota seurasi Sali-keskusta sivuava avoin lukualue. DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 2.
5 TATA-kotelon (Gannon et ai., 1979), joka yleensä sijaitsee 25-32 bp:tä ylöspäin, ja CAAT-kotelon (Benoist et ai., 1980), joka on löydetty noin 80 bp:tä ylöspäin transkription alkukohdasta, arvellaan olevan tärkeitä transkription liikkeelle lähdölle. TATA-kotelon ollessa 10 läsnä lähes kaikissa tutkituissa geeneissä ei CAAT-kotelo aina ole läsnä.
a-amylaasigeenin säätelyalueella on täydellinen TATA-kotelo kohdassa -89 ja CAAT-kotelo kohdassa -115.
a-amylaasigeenin 5'-alueella on CAAG-sekvenssi 15 kohdassa -7. a-amylaasin koodikäytäntö on esitetty taulukossa I.
Schwanniomyces α-amylaasigeenin ilmaisu ja proteiinin eritys Saccharomyces cerevisiaessa GRF18 ipYcl-of-transformantit eivät kykene kasva- 20 maan liukoinen tärkkelys ainoana hiililähteenään. Tämän voitiin osoittaa johtuvan puutteellisuudesta maltoosin käytössä. Siksi käytettiin plasmidia pYcl-α transformoi- ; maan Mal+ -fenotyypin omaavaa Saccharomyces cerevisiae MC34 (his3):a valikoiden tärkkelyksen hajotuksen suhteen.
i 25 Kaikki histidiiniprototrofiset transformantit kykenivät • · kasvamaan käyttäen tärkkelystä ainoana hiililähteenään ja kykenivät muodostamaan pesäkkeitä ympäröiviä kehiä jodi-värjäyksessä. α-amylaasin aktiivisuusmääritysten suoritta-. miseksi MC34ipYcl-a-transformantteja viljeltiin valikoiden 30 histidiiniprototrofisuuden suhteen glukoosia sisältävässä YNB-kasvualustassa.
Viljeltäessä Saccharomyces cerevisiaetä puskuroi-mattomassa YNB-kasvualustassa pH laskee noin 3,5:een. i(| . α-amylaasi inaktivoituu alle 4:n olevassa pH:ssa . 35 ja sen pH-optimi on noin 6,2 (Sills ja Stewart, 1984).
112091 25
Siksi kasvualustaa puskuroitiin 0,1 M sitraattipuskurilla, pH 6,2.
MC34 :pYcl-oi: kasvatuksen aikana raakauutteesta ja viljelysupernatantista määritettiin a-amylaasiaktiivisuu-5 det.
a-amylaasiaktiivisuutta havaittiin ainoastaan vil-jelysupernatantissa, eikä sitä havaittu raakauutteissa, mikä viittaa siihen, että a-amylaasi on eritettyä. Koko-naisaktiivisuus solunulkoisessa supernatantissa pienenee 10 logaritmisen kasvuvaiheen loppupuolella (kuvio 4D) . Tämä entsyymiaktiivisuuden pieneneminen voitiin selittää a-amylaasin proteolyysillä, koska proteolyyttinen aktiivisuus kumuloituu siirtymävaiheessa logaritmisesta sta-tionääriseen kasvuun (Ferguson et ai., 1973) Kuitenkaan a-15 amylaasin stabiilisuutta ei voitu parantaa lisäämällä pro- teaasi-inhibiittoria PMSF. Siksi voitiin ainoastaan päätellä, ettei inaktivoituminen johtunut seriiniproteaasis-ta.
Kokonais-a-amylaasiaktiivisuus täydellisessä YEPD-20 kasvualustassa viljeltyjen stationäärivaiheen MC34:pYcl-a- solujen solunulkoisessa supernatantissa oli huomattavasti • · • *<· korkeampi verrattuna YNB-kasvualustassa viljeltyihin so- luihin. Todennäköisin selitys on, että proteolyyttinen ak- : tiivisuus on kaksi kertaa korkeampi viljeltäessä Saccharo- 25 myces cerevisiaetä YNB:ssä verrattuna viljeltyyn YEPD: ssä ··.’ (Tsai et ai. , 1973) .
* * »
Joskus entsyymejä voidaan stabiloida substraattia lisäämällä (Katsunuma et ai., 1972). Liukoista tärkkelystä ainoana hiililähteenä sisältävässä YNB:ssä viljellyillä • ·’ 30 MC34 :pYcl-a-transformanteilla ei ilmennyt eroavuutta ot- amylaasin aktiivisuusprofiilissa kasvun eri vaiheissa ver-rattuna glukoosi ainoana hiililähteenä viljeltyihin solui-hin, mikä osoitti, ettei α-amylaasia voitu stabiloida sub- • t straatin läsnäololla.
35 MC34:pYcl-a:n kyvyssä fermentoida tärkkelystä ha- • · varttiin kuitenkin alussa lag-vaihe johtuen joko induktio- 26 1 12091 ajasta maltoosin käytössä tai todennäköisesti ajasta riippuvaisesta erittyneen a-amylaasin kerääntymisestä kasvualustaan .
Viimeaikaisten tutkimusten perusteella pystyttiin 5 osoittamaan, että a-amylaasigeeni tulee ilmaistuksi ja geenituotetta erittyy myös Schizosaccharomyces pombessa ja Kluyveromyces lactiksessa. Tähän pyrittäessä Schizosaccharomyces pombe transformoitiin plasmidilla pYcl-a (kuvio 1) ja Kluyveromyces lactis plasmidilla pKARS2-a (kuvio 14a). 10 Edelliset transformantit kykenivät muodostamaan kehiä tärkkelysmaljapinnoille jodivärjäyksessä. Näiden kahden transformoidun hiivakannan α-amylaasisysteemin kvantitoin-ti tällä hetkellä tutkimuksen kohteena.
Lisäksi α-amylaasigeeni kloonattiin Saccharomyces 15 cerevisiae var. carlsbergensisin pohjafermentoitavaan pa-nimohiivavillikantaan transformoimalla tämä a-amylaasi-geenin sisältävällä plasmidilla (pYcl-α) ja testaamalla oi-amylaasiaktiivisuuden suhteen käyttäen kehämuodostusta liukoista tärkkelystä sisältävälle maljapinnalle.
20 Schwanniomyces castellii a-amylaasi- ja glukoamy- laasientsyymin eristäminen ja luonnehdinta I · • ’·· Molemmat entsyymit eristettiin Schwanniomyces cas- \ · : telliin jatkuvan viljelmän kasvualustasta.
: Kasvualusta: YNB + 1 % tärkkelystä, 20 mM P04, pH
• t * 25 6,3.
Olosuhteet: lämpötila = 30 °C, P02 = 70 %, D = X·, 0,15 h'1.
Hiivasolut erotettiin kasvualustasta ultrasuoda-tuksella (UF) ja suodos konsentroitiin UF-suodattimella, • *’ 30 cut off 10 000 D. Konsentroitu DEAE-Sepharyl -kolonniin 20 > * '·*·' mM fosfaattipuskurissa, pH 5,6.
Glukoamylaasi eluoitui kolonnista välillä 150 180 NaCl ja a-amylaasi eluoitui välillä 180 - 250 mM NaCl.
• t Entsyymiaktiivisuutta sisältävät fraktiot kerättiin tal-
35 teen, dialysoitiin 100 mM ammoniumasetattipuskuria, pH
i * » * < 112091 27 6,5, vastaan ja konsentroitiin Amicon YM 10 -suodatuksella .
+ 4 mg:n erä kumpaakin proteiinia puhdistettiin edelleen käyttämällä HPLC-geelipermeaatiokromatografia TSK 5 2000 SW -kolonnissa 100 mM eluoiden ammoniumasetaattipus- kurilla, pH 6,5.
Tällä tavalla puhdistettujen entsyymien homogeenisuus testattiin SDS-PAGE:11a, jolloin saatiin yksi yksittäinen proteiininauha kummallekin entsyymille.
10 Glukoamylaasipeptidifraktioiden valmistus
Glukoamylaasia (50 mg) inkuboitiin trypsiinillä (1 mg) 24 tunnin ajan 37 °C:ssa 50 mM ammoniumasetaattipusku-rissa, pH 6,5, mikä johti + 3 0 %:n entsyymistä hajoami
seen. Peptidit erotettiin HPLC:n avulla TSK 2000 SW -ko-15 lonnissa ja niitä puhdistettiin edelleen RPHPLC:llä käyttäen C18- ja C8-kolonneja. Eluointi suoritettiin gradient-tisysteemillä 0 - 100 % asetonitriiliä. 5-peptidille määritettiin aminohapposekvenssi (katso kuvio 3). Glukoamylaasin luonnehdinta 20 MW: 120 000 D
pH-optimi: 5,0
• '·· lämpötilaoptimi: 50 °C
ί ·’: Km: 1,0 - 1,5 % dekstriiniä (Serva) : pi: 3,5 25 glykosidisidoksia sisältävä • · ;·. glukoosi inhiboi aktiivisuutta lämpötilainaktivoituminen: katso kuvio 16.
* · · a-amylaasin luonnehdinta
. MW: 53 00 D
* % * 30 pH-optimi: 6,0
'···' lämpötilaoptimi: 37 °C
Km: 0,004 - 0,07 % liukoista tärk- kelystä » > 2g 112091
Erittyneen Saccharomyces cerevisiae ce-amylaasin eristäminen YNB-kasvualustassa viljeltyjen MC34:pYcl-transfor-manttien erittämän α-amylaasin korkein mitattu aktiivisuus 5 saatiin varhaisessa logaritmisen kasvun vaiheessa oleville soluille (kuvio 4D) . On edullista eristää a-amylaasi so-lunulkoisesta YNB-supernatantista eikä täydellisestä hii-vauutetta ja baktopeptonia sisältävästä kasvualustasta, koska spesifinen lähtöaktiivisuus (a-amylaasiaktiivisuus/-10 painoyksikköä proteiinia) on huomattavasti korkeampi YNB:Ssä kuin YEPD:ssä.
Lisäksi erittyneen α-amylaasimäärän ollessa suoraan verrannollinen aktiivisesti kasvavien hiivasolujen määrään käytettiin erittyneen α-amylaasin eristämiseksi 15 MC34:pYcl-a:n vaiheittaista viljelyä YNBrssä (plasmidin valinta), YEPD:ssä (optimikasvuolosuhteet) ja lopuksi YNB:ssä (α-amylaasin erittyminen suuresta määrästä aktiivisesti kasvavia soluja). Yksityiskohtaisemmin, transfor-mantteja viljeltiin glukoosia sisältävässä YNB-kasvua1us-20 tässä. Kun saavutettiin 600 nm:ssä optinen tiheys noin 4 (myöhäinen logaritmisen kasvun vaihe), solut otettiin tali'·· teen sentrifugoimalla ja suspendoitiin ne uudelleen esi- lämmitettyyn (30 °C) YEPD:hen lopulliseksi pitoisuudeksi ; OD60o = 7,5. Kahden tunnin kasvatuksen 3 0 °C:ssa jälkeen 25 solut saostettiin ja suspendoitiin uudelleen samaan tila- ··. vuuteen esilämmitettyä (30 °C) glukoosia ja 0,1 M sitraat- . tipuskuria, pH 6,2, sisältävään YNB:hen. 4 tunnin inku- boinnin 30 °C:ssa jälkeen (optinen tiheys 600 nm:ssä kohosi 17:ään) a-amylaasi puhdistettiin konsentroidusta solun-• ·’ 30 ulkoisesta supernatantista FPLC-ioninvaihtokromatografiän avulla käyttäen Mono Q -kolonnia (Pharmacia) . a-amylaasi-proteiini voitiin eluoida 10 mM Tris-Cl:ssä, pH 7,5, pi-toisuudessa 300 mM NaCl käytettäessä nousevaa NaCl-gra-• _ dienttia (kuvio 5).
35 Aktiivinen proteiinifraktio konsentroitiin kylmä- »III» ’ ‘ kuivaamalla ja analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielek- 29 1 12091 troforeesilla (kuvio 6). Vain yhden nauhan, jonka molekyy-lipaino oli noin 55 000 D:tä, läsnäolo osoitti a-amylaasi-proteiinin tulleen erittäin hyvin puhdistetuksi tällä menettelyllä .
5 Entsyymin luonnehtimiseksi eristetyllä a-amylaa- silla tuotetut tärkkelyshajoamisen tuotteet analysoitiin ohutlevykromatografiällä (kuvio 7) . Tärkkelyshydrolyysin tuotteet ovat maltoosi ja suuret määrät maltotrioosia ja korkeampia oligisakkarideja. Glukoosia ei muodostu havait-10 tavia määriä. Edellinen on yhtäpitävä aiemmin esitettyyn havaintoon nähden, etteivät GRF18 (Mal") :pYcl-a-transfor-mantit kykene kasvamaan tärkkelys ainoana hiililähteenään. Schwannioyces alluviuksen transformointi Eräs transformointijärjestelmän rakentamisen edel-15 lytys on, että käytettävissä on sopiva mutantti, jota voidaan toiminnallisesti täydentää kloonatulla geenillä.
Analysoitiin eri tryptofaanin suhteen auksotrofis-ten Schwanniomyces alluvius -mutanttien puutteellista L-tryptofäänin biosynteesitietä. Testeissä mutanteilla hava-20 Iittiin vajavaisuus L-tryptofaanin biosynteesin viimeisessä vaiheessa, nimittäin indolin ja L-seriinin välisessä • ’·· kondensaatioreaktiossa, jota Saccharomyces cerevisiaessä : * : katalysoi tryptofaanisyntetaasi.
: Vajavuus tässä viimeisessä vaiheessa johtaa indo- 25 Iin kumulatiiviseen kerääntymiseen (Manney et ai., 1969) . Tryptofaanin suhteen auksotrofinen NGA23-mutantti kerää indolia viljeltäessä sitä YNB-kasvualustassa. Lisäksi ver- • · · rattuna muihin tryptofaaniauksotrofeihin NGA23 ei kykene ,, , kasvamaan indolia sisältävässä YNB:ssä. Tämän vuoksi pää- • 30 teltiin, että NGA23 :n tryptofaanisyntetaasigeenissä on ta- • » pahtunut mutaatio. NGA23:lla on alhainen reversionopeus :Y: (10~8) ja sen täydentäminen tryptofaanisyntetaasia koodaa- • · valla (Walz et ai., 1978, Zalkin et ai., 1982) kloonatulla • , Saccharomyces cerevisiae TRP5-geenillä (Carbon et ai., 35 1977) soveltuu täten tutkittavaksi. Alkuperäinen aikomus oli transformoida NGA23 integraatiolla.
112091 30
Transformointikoe perustui olettamukselle, että Saccharomyces cerevisiae TRP5-geenin ja Schwanniomyces al-luviuksen mutaation sisältävän tryptofaanisyntetaasigeenin välillä ei ole laajaa vastaavuutta, mikä osoitettiin nick-5 translatoidun pYASl (Strasser, 1982) DNAtn Southern-hydri-disaatiolla Schwanniomyces alluviuksen kromosomi-DNA:hän.
Schwanniomyces DNA:n osittaisessa Sau3A-pankista YRP7:ssä kloonattiin 9 kb:n DNA-fragementti, jolloin saatiin Saccharomyces cerevisiae AH22-kannan his4-mutaatiota 10 komplementoiva plasmidi YRP7HIS4 (kuvio 8).
Oletettiin, että 1,5 kb:n BamHI-CIal-fragmentilla tältä Schwanniomyces castelliin HIS4-alueelta on riittävästi vastaavuutta vastaavuusrekombinaatiolla suoritettuun suoraan integrointiin Schwanniomyces alluvius NGA23: peri-15 mään. Siksi rakennettiin plasmidi YRpJD2 (kuvio 8) , joka sisältää Saccharomyces cerevisiae Trp5-geenin valinnaisena merkkinä ja mainitun 1,5 kb:n BamHI-CIal-fragmentin.
NGA23:n transformointiin Beggsin (1978) kuvaamalla protoplastimenetelmällä käytettiin YRpJD2:ta valikoiden 20 tryptofaaniprototrofiän suhteen YNB-maljoissa. Saatiin viisi transformanttia mikrogrammaa plasmidi-DNA:ta kohden, j .. Vaikutti epätodennäköiseltä, että tämä yllättävän korkea transformoitumistiheys johtuisi integrointimenette-i ι'ι lyistä ottaen huomioon, ettei plasmidia ollut linearisoitu 25 ennen transformoinnin suoritusta, mikä olisi lisännyt in-;·. tegraation todennäköisyyttä (Orr Weaver et ai., 1981), ja että protoplastimenetelmää käytettäessä Schwanniomyces in ’ ' uusiutumistiheys oli alle 0,1 %.
NGA23:n transformointi YRpJD2:lla perustuu riippu- i t · : ·’ 30 mattomaan toisiintumiseen, minkä osoitti Trp+-fenotyypin epästabiilisuus, kun transformantteja oli viljelty ei se-lektiivisissä olosuhteissa YEPD:ssä. 15 polven jälkeen 80 - 90 % soluista oli menettänyt kykynsä kasvaa selektiivi-• sessä kasvualustassa.
35 Riippumaton toisiintuminen varmistettiin transfor- ' " moimalla E. coli -soluja hiivaminilysaateilla ja Schwan- 112091 31 niomyces NGA23:n uudelleen transformoinnilla. Lisäksi Southern-analyysi osoitti alkuperäisten YRpJD2-sekvenssien läsnäolon (kuvio 9), mikä sulkee näin pois TRP5-geenin integraation tryptofaaniprototrofiän aiheuttajana.
5 Transformoitaessa NGA23:a pYe(trp5)1-53:11a (Walz et ai., 1978), joka ei sisällä 1,5 kb:n Schwanniomyces castellii -fragementtia, ei saatu transformantteja muutamia keskeneräisiä lukuun ottamatta, mikä osoitti tämän Schwanniomyces DNA-fragementin sisältävän plasmidin YRpJD2 10 riippumattoman toisiintumisen Schwanniomyces alluvius NGA23:ssa sallivan sekvenssin.
Siksi päätellään 1,5 kb:n Schwanniomyces castellii DNA-fragementin vektorissa YRpJD2 sisältävän riippumattoman toisiintumissekvenssin, nimittäin SwARSl:n.
15 Transformaatiomenettely Käytettäessä transformoinnissa protoplastimenetel-mää (Beggs, 1978) Schwanniomyces -solujen uusiutuminen on noin 0,1 %. Koska uusiutumisnopeus tai protoplastimuodos-tus ovat suoraan verrannollisia transformoitumistiheyteen, 20 pyrittiin transformoitaessa YRpJD2:ta NGA23:een muuttamaan protoplastimuodostuksen olosuhteita käyttämällä eri pitoi-'· '·. suuksia helikaasia tai tsymolyaasia sekä eri pituisia ini’ ·': kubointiaikoj a.
• » ; Käytettäessä helikaasia ei saatu transf ormantte j a .
'.V. 25 Vain käyttämällä tsymolyaasia (1 mg/ml) 30 minuutin inku- boinnissa 37 °C:ssa uusiutumistiheyden ollessa 0,1 % saa-’..t tiin viisi transformanttia mikrogrammaa plasmidin YRpJD2 DNA:ta kohden. Lyhyemmässä inkuboinnissa uusiutumisnopeus , kasvoi 0,5 %:iin, mutta transformantteja ei saatu.
» » » • ·' 30 Nämä havainnot osoittavat, että protoplastimuodos- • * tus (eikä uusiutumistiheys ja siis soluseinän entsymaatti-nen hajoaminen) on kriittinen vaihe transformoitaessa Schwanniomycesta protoplastimenetelmällä. Siksi kokeiltiin
* I I
•, Iton et ai. (1983) ja Kleben et ai. (1983) kuvaamia trans- 35 formointimenettelyjä.
Silti I » 32 1 12091
Kumpikaan menettely ei edellytä soluseinän entsymaattista hajoamista. Iton et ai. (1983) litiumsulfaatti-menetelmällä ei saatu transformantteja. Kuitenkin käyttämällä Kleben et ai. (1983) jäädytys-sulatusmenetelmää 5 NGA23 onnistuttiin transformoimaan plasmidilla YRpJD2 saannon ollessa toistettavasti 50 - 100 transformanttia mikrogrammaa plasmidin YRpJD2DNA:ta kohden.
Kleven et ai. (1983) menetelmää käytettäessä pestiin log-kasvuvaiheessa olevaa hiivaa (10 ml) 5 ml :11a 10 SBEGrtä (IM sorbitoli, 10 mM bisiini, pH 8,35, 3 % ety- leeniglykolia) sentrifugoimalla 1 000 g:ssä 3 minuutin ajan 22 °C:ssa. Kaikki tätä seuraavat inkuboinnit suoritettiin 30 °C:ssa. Pelletti uudelleensuspendoitiin 0,2 ml:aan SBEG:tä ja 5 minuutin kuluttua lisättiin 1 - 20 μΐ 15 plasmidi DNA:ta. 10 minuutin ajaksi (tai pidemmäksi) ja sulatettiin nopealla sekoituksella 37 °C:isessa vesihauteessa. Lisättiin 1,5 ml 40 %:ista puhdistettua PEG 1 000:ta. (Klebe et ai., 1983) ja 200 mM bisiiniä, pH 8,35 (säilytetty jäädytettynä), ja 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 20 pestiin solut 2 ml :11a 0,15 mM NaCl:ää, 10 mM bisiiniä, pH 8,35. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti uudelleensuspendoi- i · * tiin 1 ml:aan 0,15 mM NaCl:ää, 10 mM bisiiniä, pH 8,35, ja : ' siirrostettiin selektiiviseen kasvualustaan. Edellä kuva- ; tuissa olosuhteissa lisättiin plasmidi-DNA ennen kuin so- 25 lut jäädytettiin -70 °C:ssa. Kuitenkin olisi edullista, ;·. jos olisi käytettävissä mahdollisuus lisätä DNA jäädytet- * ^ tyihin soluihin juuri ennen sulatusta, jolloin milloin ta hansa olisi käytettävissä käyttökelpoisia soluja transformoitaviksi millä tahansa käsillä olevalla plasmidilla.
i t s * 30 Yritykset lisätä YRpJD2 DNA:ta Schwanniomyces al- luvius NGA23-mutantin jäädytettyihin soluihin olivat sikä-*,Y; li tuloksekkaita, että saatiin samat transf ormoitumisti- heydet (50 - 100 transformanttia/^g) kuin edellä kuvatulla * ( alkuperäisellä menetelmällä.
35 Klebe et ai. (1983) kuvaavat käytetyn PEG:n olevan kriittinen toistettavalle transformoinnille. Siksi Klebe 112091 33 et ai. (1983) suorittivat aikaa vievän PEG 1 000 -valmistuksen päästäkseen optimaaliseen transformointitehok-kuuteen.
Tämän työlään menettelyn välttämiseksi testattiin 5 useiden Serva- ja Roth-yhtiön PEG-valmisteiden vaikutusta. Tähän mennessä optimaaliset transformointitehokkuudet on saatu käytettäessä Roth-yhtiön PEG 1 000:ta. SBEG:ssä IM sorbitolin korvaaminen 1,25 M KCl:llä, 30 mM CaCl2:lla johtaa transformoitumistiheyden kaksinkertaistumiseen, 10 jolloin saantona saadaan 200 NGA23-transformanttia mikro-grammaa plasmidin YRpJD2 DNA:ta kohden.
Hiivasoluja jäädytettäessä niiden plasmamembraani vahingoittuu, mikä johtaa korkeampaan läpäisevyyteen, lisäksi solun vahingoittumisen aste riippuu käytetystä jää-15 dytysnopeudesta (Lepock et ai., 1984). Näiden havaintojen perusteella solujen transformoitumistehokkuutta tutkittiin, kun jäädytys oli suoritettu -70 °C:ssa pakastimessa (verraten hidas jäätyminen), hiilihappojäällä -78 °C:ssa (nopea jäätyminen) tai nestetypellä -196 °C:ssa (hyvin no-20 pea jäätyminen).
Käytettäessä nestetyppeä transformoitumistiheys : laski 40 %:lla, kun taas hiilihappojään käyttö lisäsi transf ormant ti saantoa 30 %:lla verrattuna jäädytykseen -70 ; °C:sessa pakastimessa.
25 DNA lisättiin jäätyneisiin soluihin (säilytetty -70 °C:ssa 10 minuutista aina 6 kuukauteen asti), jotka . sulatettiin nopealla sekoituksella 37 °C:ssa. Nopean se- * * koituksen 37 °C:sessa vesihauteessa asemasta käytettiin 37 °C:ssa Eppendorf-sekoittajaa, tyyppi 5432. Tällä sekoitus- • · * > ·’ 30 menetelmällä sulatuksessa saatiin parhaat toistettavat ’...· transformoitumistiheydet.
Näin mukaellulla menetelmällä Schwanniomyces allu-.···, vius NGA23-mutanteille saatiin transformoitumistiheydeksi » 300 - 1 000 transformanttia mikrogrammaa plasmidin YRpJD2 * ‘ 35 DNA:ta kohden.
» 112091 34 Tällä yksinkertaistetulla transformointimenette-lyllä pystyttiin saamaan korkeita transformoitumistiheyk-siä myös Sa.ccha.romyces cerevisiaessä, Schizosaccharomyces pombessa ja Kluyveromyces lactiksessä (taulukko II).
5 Plasmidien kopioluvun arviointi Schwa.nniom.yces ai - luviuksessa ja Saccharomyces cerevisiaessä tuotettaessa näiden transformantteja
Yksinkertaistettussa transformointimenettelyssämme Schwanniomyces alluvius NGA23:n transformoinnissa käytet- 10 tiin: pYe(trp5)1-53:a, joka sisältää pBR313:n (Bolivar et ai., 1977) ja Sacchramyces cerevisiae TRP5-geenin.
pYASl:tä, 2 μΜ johdannainen, joka sisältää Saccharomyces cerevisiae sekä LEU2- että TRP5-geenin (Strasser, 15 1982) .
YRP7TRP5:tä, joka sisältää ARSl:n ja Saccharomyces cerevisiae sekä TRP1- että TRP5-geenin.
YRpJDl:tä, joka sisältää sekä SwARSlm että ARS:n ja Saccharomyces cerevisiae sekä TRP1- että TRP5-geenin.
20 YRpJD2 : ta, joka sisältää SwARSlm ja Saccharomyces cerevisiae TRP5-geenin.
j · pEK2TRP5:tä, joka sisältää sekä KARSI:n että :’1 : ARSI:n ja Saccharomyces cerevisiae TRP5-geenin.
; · ; Plasmidit on koottu kuvioon 8.
25 Näiden plasmidien transformoitumistiheydet ja sta- ;·, biilisuudet Schwanniomyces alluvius NGA23:ssa on koottu . taulukkoon III. Eri plasmidien kopioitumisluvut arvioitiin
Southern-kuivausanalyysilla (kuviot 9 ja 10).
Sisäisenä standardina käytettiin yhtä kopiota so- : 30 lua kohden edustavaa HIS4-kromosomipaikkaa. Löytyy kolme « »
EcoRI-kromosomitragmenttia (0,9 kb, 6,0 kb, 8,0 kb), jotka hybridisoituvat 32P-leimattuun YRP7HIS4 DNA-.han. HIS4-kro-mosomipaikan ja plasmidin YRpJDl vastaavuus hybridisointi-• f sensoriin YRp7HIS4 on esitetty kuviossa 10D.
35 Plasmidien pYASl, YRP7TRP5, YRpJDl (YRpJD2) ja ‘ ’ pEK2TRP5 kopioitumisluvun arvioimiseksi yhteisen 5,3 kb:n 112091 35
EcoRI-nauhan intensiteettiä verrattiin HIS4-kromosomi-geenin 6 kb:n EcoRI-nauhaan.
Autoradiogrammissa värjääntymisen intensiteetti osoittaa, että plasmidien YRpJDl ja YRpJD2 kopioitumisluku 5 on noin 5-10 kopiota solua kohden (kuvio 9 ja 10).
Plasmidien YRP7TRP5 ja pEK2TRP5 keskimääräinen kopioitumisluku solua kohden on suunnilleen sama ollen luokka noin 0,2 - 1 TRP5-fragementin suuntautumisesta riippumatta, kun taas pYASl:tä löytyy noin 2-3 kopiota solua 10 kohden (kuvio 10).
Saccharomyces cerevisiae ARSI ja 2 μπι DNA-sek-venssejä voidaan käyttää riippumattomaan toisiintumiseen Schwanniomyces alluvius NGA23:ssa, vaikkakaan ei yhtä tehokkaasti kuin SwARSl:tä. SwARSl käyttäytyy Schwanniomyces 15 alluviuksessa kuten ARSI Saccharomyces cerevisiaessa tuottaen saantona 5-10 kopiota solua kohden (kuvio 11, taulukko IV). ARSI-yksikön SwARSl-yksikön lisäksi sisältävällä plasmididlla YRpJDl ei ilmennyt kopioitumisluvun kasvua verrattuna vain SwARSl-yksikön sisältävään YRpJD2:een 20 KARS2-yksikön ARSl-yksikön lisäksi sisältävällä plasmidil- la pEK2TRP5 on sama kopioitumisluku kuin plasmidilla • ·· YRp7TRP5, joka sisältää vain ARSI-yksikköön. Tämän vuoksi päätellään, ettei KARS2 kykene toimimaan tehokkaana riip-; pumattomana toisiintumisyksikkönä Schwanniomyces alluviuk- 25 sessa.
;·, Schwanniomyces alluvius NGA23:n transformointi pYe (trp5) 1-53:11a (Walz et ai., 1978) voidaan selittää keskeneräiseksi transformaatiotapahtumaksi, mikä selittää näiden transformanttien suureen epästabiilisuuteen (tau- * * » ·_ ·' 3 0 lukko III) .
Kloonatun Schwanniomyces castellii a-amylaasi- geenin säätely ja proteiinin ylituotanto Schwanniomyces ,··. alluvius -transformanteissa • t Schwanniomyces -hiivalajien a-amylaasin tuotanto 35 on altis lopputuoteinhibitiolle glukoosin läsnäollessa (Sills et ai. , 1982) .
112091 36 α-amylaasin tuotantoa indusoivat liukoiset tärkke-lysdekstriinit ja maltoosi (Sills et ai., 1982). Maltoo-sin, joka muodostaa osan tärkkelyshajoamisen tuotteista, todettiin olevan voimakkaampi indusori kuin liukoinen 5 tärkkelys (Sills et ai., 1984b). Vaikuttaa siltä, että amylaasin rakenteellinen ominaistuotanto on hyvin alhaisella perustasolla. Tämä alhainen α-amylaasin pitoisuustaso kykenee hydrolysoimaan tärkkelystä vapauttaen alhaisen molekyylipainon omaavia sokereita kuten maltoosia, joka 10 pystyy tunkeutumaan solumembraanin läpi ja puolestaan indusoimaan a-amylaasin syntetisoitumista (Sills et ai., 1984b).
Kloonatun a-amylaasigeenin säätelyn ja ilmaisun tutkimiseksi Schwanniomyces alluviuksessa insertoitiin a-15 amylasirakennegeenin sisältävä 5 kb:n EcoRI-fragmentti YRpJ2: een (kuvio 8), jolloin saatiin plasmidi YRpJD2-a, jolla fragmentti transformoitiin Schwanniomyces alluvius NGA23:een tryptofaaniprototrofiän suhteen YNB-kasvualustassa valiten.
20 Kuten on esitetty kuviossa 5B, NGA23:YRpJD2-a- transformanttien, joita viljellään indusoivissa olosuh- • '·· teissä YNB-maltoosikasvualustassa, kokonais-a-amylaasiak- tiivisuus kasvaa 4-5 kertaiseksi verrattuna ; NGA23:YRpJD2-kontrollitransformantteihin, jotka eivät si- 25 säilä lisättyä plasmidiin koodattua α-amylaasigeeniä (ku- ;·, νίο 4A) .
\ . a-amylaasisynteesin induktiovaiheessa näyttävä 7-
• * I
kertainen nousu solunulkoisessa a-amylaasiaktiivisuudessa solupitoisuutta (OD6oonm) kohden kontrollitransformanttei- : ·’ 30 hin verrattuna vastaa arvioitua SwARSl-plasmidin 5-10 kopion määrää Schwanniomyces alluviuksessa.
;Y; Tämän vuoksi päätellään a-amylaasiaktiivisuuden lisäyksen johtuvan geeniannosvaikutuksesta.
• _ Viljeltäessä NGA23:YRpJDl-ja NGA23:YRpJD2-trans- 35 formantteja inhiboivissa olosuhteissa 2 % glukoosia sisäl- • »ti» ' ' tävässä YNB:ssä solunulkoisessa supernatantissa ei ollut 112091 37 havaittavissa a-amylaasiaktiivisuutta ennen kuin glu-koosipitoisuus laski noin 0,2 mM:een (kuviot 4C ja E). Täten plasmidiin koodattua a-amylaasia kuten kromosomi-ot-amylaasiakin säätelee lopputuoteinhibitio.
5 Rakentamalla a-amylaasin rakennegeeni korkeailmai- supromoottorin, kuten esimerkiksi PDC1- tai PGK-geenien avustuksella voidaan saada paremmin ilmaisevia kantoja, joissa ilmaisu ei riipu kasvuvaiheesta tai hiililähteestä.
a-amylaasiproteiinin ylituotanto osoitettiin vil-10 jelysupernatantin in vitro leimattujen proteiinien fluoro-grafisella analyysilla (kuvio 12). a-amylaasiaktiivisuutta voitiin mitata MC34rpYCl-a-transformanttien solunulkoises-ta supernatantista viljeltäessä niitä 2 % tai myös 4 % glukoosia ainoana hiililähteenä sisältävässä YNB:ssä, mikä 15 osoitti, ettei lopputuoteinhibitio säätele plasmidiin koodattua Q!-amylaasia Saccharomyces cerevisiaessä.
Schwanniomyces alluviuksen auksotrofisten mutant-tien eristäminen
Glukoamylaasigeenin kloonaukseen valittiin käytet-20 täväksi Schwanniomyces alluviuksen glukoamylaasimutantin toiminnallinen täydentäminen.
’·· Edellytyksenä tälle on, että käytettävissä on so- piva mutantti, jota voidaan täydentää kloonatulla geenil- • · ; lä. Tässä tarkoituksessa tutkittiin Schwanniomyces alluvi- * * t 25 us NGSl-mutanttia, joka ei kykene kasvamaan maltoosi tai • · ;·, liukoinen tärkkelys ainoana hiililähteenään. Viljeltäessä » · » .t tätä mutanttia 1 % glukoosia ja 1 % liukoista tärkkelystä sisältävissä maljoissa voitiin havaita kehänmuodostusta jodivärjäyksessä, mikä osoitti mutantin kykenevän erittä- t i » : ·’ 30 mään α-amylaasia. Glukoamylaasiaktiivisuutta ei voitu ha- väitä raakauutteissa tai vil j elysupernatantissa .
i
Kuten jo mainittu, a-amylaasi kykenee hydrolysoi- • · maan tärkkelystä dekstriineiksi, maltoosiksi ja korkeam-
> I I
• t miksi oligosakkarideiksi (kuvio 7) , kun taas glukoamylaasi I I I I » 35 kykenee käyttämään näitä tuotteita substraatteina entsyy-
IIMI
' ‘ mihydrolyysille glukoosiksi. NGS1-mutantilla on se kiin- 112091 38 nostava piirre, ettei se kykene käyttämään maltoosia. Schwanniomyces alluvius -villihiiva erittää glukoamy-laasia, joka hydrolysoi maltoosin glukoosiksi solunulkoi-sessa supernatantissa ja se siis ei tarvitse, vastoin kuin 5 Saccharomyces cerevisiae, maltoosinkäyttösysteemiä. Tämän vuoksi päätellään, että NGS1 on a-amylaasi+-glukoamylaasi" -mutantti, jolla ei ole toiminnallista glukoamylaasigeeniä joko rakennegeenissä tai promoottorialueella tapahtuneen pistemutaation tuloksena.
10 Olemme keskittäneet huomiomme tähän glukoamylaasi- mutanttiin kloonataksemme Schwanniomyces castellii gluko-amylaasigeenin toiminnallisella täydentämisellä.
Kloonauksen suorittamiseksi Q!-amylaasi+-glukoamy-laasi"-mutanttiin piti tuottaa lisämutaatio, edullisesti 15 trp5-mutaatio (joka johtaa indolitryptofaani-konversion puuttumiseen) , koska Schwanniomyces alluvius voitiin transformoida tehokkaasti käyttäen Saccharomyces cerevisiae TRP5-geeniä valinnaisena merkkinä SwARSl:n sisältävissä plasmideissa, esimerkiksi YRpJDl:ssä ja YRpJD2:ssa.
20 Lisäksi nämä mutantit ovat helposti tunnistettavissa niiden indolia keräävän ominaisuuden perusteella.
I ’.· trp5-Auksotrofisiä mutantteja eristettäessä kaikki :’· ; menettelyvaiheet suoritettiin 30 °C:ssa. 10 ml:n NGS1- ; viljelmä kasvatettiin pitoisuuteen OD600 = 0,6 täydellises- • * » 25 sä kasvualustassa, pestiin se kahdesti vedellä ja altis- » · :·, tettiin UV-valolle (254 nm) 50 sekunniksi (eloonjääneitä soluja 1 %) . Mutagenisoituja soluja inkuboitiin sitten 2 päivän ajan täydellisessä kasvualustassa trp-auksotrofien erottamiseksi ja siirrostettiin ne sitten YEPD-maljoihin • 30 toisiintumissiirrostusta varten tryptofaania sisältäviin *...’ minimivaatimuskasvualustamaljoihin ja kaikkia muita amino- ;Y: happoja paitsi tryptofaania sisältäviin minimivaatimuskas- vualustamal joihin.
• t Testatuista 2614:stä NGSl-koloniasta voitiin eris- 35 tää 7 trp-auksotrofista mutanttia, jotka kasvavat trypto- ' ' faania sisältävässä minimivaatimusalustassa mutta eivät 112091 39 kasva muita aminohappoja paitsi tryptofaania sisältävässä minimivaatimusalustassa (reversionopeus 1(T7 - 10"8) . Indo-litryptofaani-konversion voitiin todeta puuttuvan kahdelta näistä seitsemästä mutantista, koska molemmat keräsivät 5 indolia.
Nämä trp5-o;-amylaasi + -glykoamylaasi_-mutantit nimettiin NJDl:ksi ja NDJ2:ksi. Nämä kaksi kantaa voitiin tehokkaasti transformoida YRpJDl:llä saannon ollessa noin 800 transformanttia mikrogrammaa DNA:ta kohden, mikä 10 osoitti NJDlillä ja NDJ2:lla todella tapahtuneen mutaatio TRP5-geenissä.
Kloonauksen jatkovaiheet voidaan suorittaa samoin kuin α-amylaasigeenillä.
E. coli - Saccharomyces cerevisiae - Schwanniomy-15 ces alluvius -kosmidikuljetinvektorin rakentaminen geenien kloonaamiseksi Schwanniomyces ailuviuksessa.
Kosmidi kloonaukseen Schwanniomyces alluviuksessa rakennettiin analogisesti kosmideihin pYcl (2μ) ja pYc2 (ARS) nähden, jotka rakennettiin geenien kloonaamiseksi 2 0 Saccharomyces cerevisiaessä (Hohn ja Hinnen, 1980) .
Kosmidit ovat plasmideja, jotka sisältävät bakte- * ’ ' riofagi lambdan (Collins ja Hohn, 1978) cos- (koheesiosek- : venssi) alueen kloonaukselle oleellisten sekvenssien (toi- : siintumisen alkukohdat, valinnaisena merkkinä toimivan IV; 25 geenin ja soveliaat kloonauskeskukset) ohella, cos-sek- venssi sisältää välttämättömän rakennetiedon DNA:n pakka-ukseen alkuperäisen bakteriofagi lambdan tuottamiseksi i t » (Hohn, 1975). Korkean molekyylipainon omaava oligomeerinen ,, , kosmidi-DNA voidaan siksi pakata tehokkaasti in vitro pak- • ;* 30 kaussysteemillä (Hohn, 1979), jos cos-sekvenssejä erotta- ’··’ vat mitkä tahansa 37 - 52 kb:n DNA-fragementit vastaten ;Y; noin 73 - 105 % lambdafagin perimästä (Feiss et ai., 1977). Kloonauskelpoisten fragmenttien verraten suuri koko ' , tarjoaa mahdollisuuden, että Saccharomyces cerevisiaen pe- 35 rimän kattamiseksi yli 85 %:isesti tarvitaan ainoastaan noin 1 200 kosmidikloonia niiden sisältämien fragmenttien 112091 40 koon ollessa keskimäärin 30 - 40 kb:tä (Hohn ja Hinnen, 1980).
Kloonattaessa suuria DNA-fragmentteja kosmidi-DNA:n, plasmidi-DNA:n asemasta, käytön edullisuus perustuu 5 siihen, että voidaan helposti saada verraten korkean mole-kyylipainon omaavaa oligomeeristä DNA:ta erittäin konsentroidun DNA:n ligatoinnilla, kun taas rengasmaisten trans-formointikelpoisten plasmidien muodostus ligatoimalla suuria DNA-fragmentteja pienempään vektori-DNA:hän on tehol-10 lisesti epäedullista fragmenttikoon ja vapaiden päiden tehollisen pitoisuuden välisen suhteen vuoksi (Dugaiczyk et ai., 1975). Lisäksi pakattu DNA voidaan tehokkaasti siirtää infektoimalla lambdaherkkiä E. coli -soluja (Hohn ja Hinnen, 1980) .
15 Näiden havaintojen perusteella E. coli - Schwan- niomyces alluvius - Saccharomyces cerevisiae -kosmidikul-jetinvektori rakennettiin subkloonaamalla plasmidin pHC79 cos-alueen sisältävä Hohn ja Collins, 1981 1,7 kb:n Bglll-fragmentti toiseen YRpJD2:n kahdesta BamHI-keskuksesta. 20 YRpJD2:ta sulatettiin tämän vuoksi osittain BamHI:llä (0,5 yksikköä/Mg DNA:ta 30 °C:ssa) ja eristettiin saaduista ; ' · suurin yksittäisestä BamHI-lohkaisusta syntyvä lineaarinen : ' : DNA preparatiivisella geelielektroforeesilla ja ligatoi- I tiin tämä pHC79:n 1,7 kb:n Bglll-fragmenttiin, joka niin 25 ikään oli eristetty preparatiivisella geelielektroforee-], silla täydellisen pHC79 DNA:n sulatuksen jälkeen. Tätä li- . gatointiseosta käytettiin E. coli JA221:n tranformoinnissa valiten ampisilliinivastustuskyvyn suhteen. Subkloonit ,,, testattiin kolonianhybridisaatiolla käyttäen nick-transla- * ’’ 30 toitua 1,7 kb:n Bgll-fragementtia radioaktiivisena senso- t » rina.
;V: Positiivisista klooneista voitiin kaksi eri kosmi- dia, nimittäin pCJD5-l ja pCJD5-2 (kuvio 13a), eristää ja i 1 f • t analysoida lohkaisemisen EcoRI-, BamHI- ja PvuII-restrik- 35 tioentsyymeillä jälkeen (kuvio 13b). Kuvio 13b osoittaa, I > s : » ‘ ' että kosmidissa pCJD5-l cos-sekvenssi on subkloonattu 112091 41 YRpJD2:n BamHI-keskukseen SwARSl-sekvenssin ja TRP5-geenin väliin. PCJD5-2:ssa cos-alue oli insertoitunut tandemissa samaan asemaan. Kahden tandemissa suuntautuneen cos-yksikön läsnäolon tulisi näyttävästi lisätä pakkaustehokkuutta 5 verrattuna vain yksittäisen cos-yksikön sisältäviin kosmi-deihin (Lindenmeier et ai., 1982). Tähän mennessä ei ollut tutkittu, pitääkö tämä paikkansa myös pCJD5-2:n kohdalla.
Kosmideilla pCJD5-l ja pCJD5-2 saatiin 500 - 1 000 NJDl-transformattia mikrogrammaa kosmidi DNA:ta kohden valo likoimalla tryptofaanin suhteen, mikä osoitti ettei cos-yksikkö vaikuta transformoitumistiheyteen.
Kumpikin kosmidi sisältää a) SwARSl-sekvenssin, joka toimii toisiintumisen alkukohtana Schwanniomyces alluviuksessa sekä Saccharomy- 15 ces cerevisiaessä b) toisiintumisen alkukohdan E. colissa c) ampisilliinivastustuskykygeenin valinnaisena merkkinä E. colissa d) Saccharomyces cerevisiae TRP5-geenin valinnai- 20 sena merkkinä Schwanniomyces alluvius sekä Saccharomyces cerevisiae trp5-mutanteissa, ja . *'· e) cos-alueen edellytyksenä kosmidikirjaston ra- ; ',· kentamiselle.
: : : Lisäksi kumpikin kosmidi sisältää soveliaita kloo- 25 nauskeskuksia, nimittäin BamHI :n ja SaII:n Sau3A-, BamHI-, j’.ti Bglll-, Sali- ja XHOI - f ragementt ien kloonaukseen, ja ne .V. tarjoavat siis uuden kosmidivektoriperheen DNA-geenikir- » · $ jaston rakentamiseen geenien kloonaamiseksi E. colissa, .. . Saccharomyces cerevisiaessä ja Schwanniomyces alluviukses- 3 0 sa.
4 t
Schwanniomyces castellii glukoamylaasigeenin kloo- : : ; naus
Glukoamylaasigeenin kloonaus aloitettiin Schwanniomyces castellii ATCC 26076 kosmidipoolista, joka raken-, 35 nettiin ligatoimalla osittain BamHI:llä sulatettu Schwan- M > I t niomyces castellii geeni-DNA E. coli - Saccharomyces cere- 112091 42 visiae - Schwanniomyces alluvius -kuljetivektoriin pCJD5-l käyttäen Ish-Horowitzin et al., 1981 kuvaamaa kosmidikloo-naustekniikkaa.
DNA-ligatointiseokseen in vitro pakkauksen jälkeen 5 infektoitiin E. coli -kanta HB101, jolloin saantona oli noin 15 000 ampisilliiniresistenstenttiä koloniaa vastaten noin 30 Schwanniomyces castellii perimäkoko ekvivalenttia olettaen, että Schwanniomyces castelliin ja Saccharomyces cerevisiaen perimät ovat samansuuruiset (noin 15 000 10 kb:tä) ja kloonattu DNA-fragmentti, jonka koko vaihteli välillä 30 - 40 kb:tä. Näistä transduktanteista eristettiin kosmidi DNA ja käytettiin sitä NJDlrn (a-amylaasi+-glukoamylaasi"-trp5) transformointiin trp-prototrofiän suhteen 2 % glukoosia sisältävästä minimivaatimuskasvu- 15 alustassa valiten.
Transformoitumistiheydet olivat verraten alhaiset (1-10 transformanttia/Vg:aa kosmidi-DNA:ta) sekä proto-plastimenetelmää (Beggs, 1978) että yksinkertaistettua jäähdytys-sulatusmenetelmää käytettäessä. Kuitenkin saa-20 tiin noin 3 00 transformanttia, jotka testattiin niiden mahdollisesti palautuneen kyvyn kasvaa liukoinen tärkkelys : '· ainoana hiililähteenään suhteen. Tärkkelysalustoista voi- ;tiin eristää yksi NJD1-transformantti, jolla oli Trp+- ja : j : glukoamylaasi + -fenotyyppi . Mitoottisen stabiilisuuden tes- ; ·*; 25 tissä (beggs, 1978) sekä TRP5-fenotyyppi että glukoamy- laasia täydentävät toiminnot erottuivat samanaikaisesti osoittaen kosmidin sisältävän molemmat geenit. Kosmidi eristettiin transformoimalla E. coli HB 101 hiiva-.. . minilysaatilla ja valikoimalla ampisilliinivastustuskyvyn • t 30 suhteen. Kosmidi-DNA eristettiin ja sitä käytettiin NJD1 : uudelleentransformoinnissa sen varmistamiseksi, että eris-: : tetty kosmidi-DNA:n edelleen sisältää glukoamylaasia täy- dentävät toiminnot. Kun kosmidia oli lohjettu BamHI:llä, voitiin kloonatusta fragmentista paikallistaa kaksi BamHI-35 keskusta, jotka jakoivat sen kolmeen fragmenttiin kahden niistä ollessa noin 10 kb ja 12 kb.
112091 43
Noin 40 kb: n kosmidin koon pienentämiseksi sub-kloonattiin BamHI-fragmentteja plasmidin pCJD5-l yksittäiseen BamHI-keskukseen. Tätä varten kosmidi-DNA:ta sulatettiin BamHI:llä, uudelleenligatoitiin ja transformoitiin E.
5 coli HB101:een. Ampisilliiniresistenttien solujen plasmi-di-DNA:ta käytettiin NJDlrn transformoinnissa sekä testattaessa kasvua liukoinen tärkkelys ainoana hiililähteenä. Plasmidi-DNA:ta kerättiin transformoimalla HB101 hiiva-minilysaatilla ja valikoimalla ampisilliinivastustuskyvyn 10 suhteen. Plasmidi-DNA eristettiin restriktioanalyysiä varten BamHI-endonukleaasilla sulattamisen jälkeen.
Kuvio 15 osoittaa subkloonatun 12 kb:n BamHI-fragmentin sisältävän glukoamylaasia täydentävän toiminnon. Tämä plasmidi nimetään pCJD5-AMGl:ksi (kuvio 14) .
15 Koska tämä plasmidi sisältää Saccharomyces cerevisiaessa sekä Schwanniomyces alluviuksessa aktiivisen SwARSl-yksi-kön, kloonattua geeniä Saccharomyces cerevisiaessa analysoitiin transformoimalla 3656:ta tryptofaaniprototrofiän suhteen valikoiden. Valitettavasti transformantit eivät 20 kyenneet käyttämään liukoista tärkkelystä ainoana hiili-lähteenä. Ensimmäinen selitys, joka oli, ettei 5-10 : " pCJD5-AMG1-kopiota Saccharomyces cerevisiaessa ole riittä- • '/ vä voittamaan mahdollista proteolyyttistä hajoamista, ei : J : pitänyt paikkaansa, koska subkloonattaessa noin 12 kb:n 25 BamHI-fragementti korkea kopioitumisluvun, 50 - 100 kopio- ta solua kohden, omaavaan plasmidiin pJDB207 (Beggs, 1981) (kuvio 14) ja transformoitaessa sitten plasmidilla Saccharomyces cerevisiae GRF18-soluja ei yksikään saaduista .. . transformanteista kyennyt kasvamaan liukoinen tärkkelys • · 3 0 ainoana hiililähteenään.
;·’ Vaikka NJD1 :pCJD5-AMG2-transformanteilla pystytti tiin mittaamaan glukoamyl aasi aktiivi suut ta ei pystytty to- teamaan laisinkaan aktiivisuutta Saccharomyces cerevisiae -transformanttien raakauutteessa tai viljelysupernatantis-, 35 sa. Koska Käufer et ai. (1985) ovat hiljakkoin osoittaneet
Shizesaccharomyces pomben olevan sikäli huomattavasti Sac- 112091 44 charomyces cerevisisaetä edullisempi, että se leikkaa tarkasti väliin tulevan sekvenssin korkeamman eukaryoottisen geenin transkriptistä, tehtiin yrityksiä ilmaista gluko-amylaasigeeni tässä fissiohiivassa. Kuitenkaan Shizosac-5 charomyces pombe leul-32:ssa (täydennetty Saccharomyces cerevisiaen LEU2:lla transformoinnin plasmidilla pJDB207 -AMG1 jälkeen) ei voitu havaita geenin ilmaisua eikä proteiinin eritystä (kuvio 14). Geenin transformointi Kluyvero-myces lactis SD11 (trpl) reen pEK2-AMG2:11a (kuvio 14) ei 10 tuottanut transformantteja, jotka kykenevät kasvamaan liukoinen tärkkelys ainoana hiililähteenä. Tämän vuoksi päätellään, että oli kloonattu Schwanniomyces-geeni, jota ei voida toiminnallisesti ilmaista Saccharomyces cerevisiaes-sä, Schizosaccharomyces pombessa tai Kluyveromyces lactik-15 sessa johtuen erilaisesta liitosspesifisyydestä, promoottorin tunnistuksesta tai Schwanniomycesille spesifisestä posttranskriptiovaiheista.
Lisätiedon saamiseksi suoritettiin 12 kbm DNArn pienempien fragmenttien subkloonaus, jotta löydettäisiin 20 pienin mahdollinen DNA-fragmentti, jolla edelleen on toiminnallisesti täydentävä ominaisuus. Glukoamylaasin mole-: · kyylipaino on noin 117 000 d:tä (Simoes-Mendes, 1984) vas- • täten pitkää noin 3 kbm pituista rakennegeeniä.
: Lisäksi geeni voidaan sekvenssoida koodipreferens- 25 sin selvittämiseksi ja mahdollisten intronien analysoimi-# seksi. Lisäksi Schwanniomyces castellii DNArn 5'-ei koo- daava -johtosekvenssi voidaan vaihtaa tunnetulla promoottorilla kuten ADHlrllä (Hitzeman et ai., 1981) tai PDC-..>I> promoottorilla (Hollenberg et ai., 1983) Schwanniomyces 30 -promoottorin mahdollisen tehottomuuden muissa hiivala-jeissa eliminoimiseksi.
Geenin luonnehtimiseksi glukoamylaasia eristettiin glukoamylaasille spesifisten vasta-aineiden tuottamiseksi, . jotta voitaisiin analysoida NDJlrn raakauutteet sekä vil- 35 jelysupernatantti, sekä samoin Saccharomyces cerevisiae-, Schizosaccharomyces pombe- ja Kluyveromyces lactis -trans- 112091 45 formanttien, inaktiivisen glukoamylaasin läsnäolon suhteen. Saccharomyces cerevisiae -transformanteilla ei Nort-hern-analyysilla havaittu promoottoriaktiivisuutta. Lisäksi ei havaittu proteiinia Saccharomyces cerevisiaen raaka-5 uutteissa tai viljelysupernatanteissa käytettäessä glu-koamylaasille spesifistä vasta-ainetta. Lisäksi puhdistetun glukoamylaasin peptidejä eristettiin aminosekvenssoin-tia varten, jotka voitaisiin syntetisoida synteettisiä oligonukleotidejä kloonatun geenin analysointiin.
10 Schwanniomyces-kosmidikir j astoa rakennettaessa syntyneiden valekloonien tunnistamiseksi luettiin Maniati-sin et ai., 1982, kuvaamaa Charon 4A Schwanniomyces cas-tellii -kirjastoa, joka sisältää Schwanniomyces castellii DNA:n EcoRI-osafragmentteja (10 - 30 kb:tä) noin 150 000 15 inserttiä, suoraan glukoamylaasigeenin suhteen.
Charon-kirjastoa analysoitiin edelleen kahdella eri oligonukleotuidiseoksella, jotka johdettiin osasta peptidiä 3 (aminohapot 11 - 18) ja vastaavasti peptidiä 4 (katso kuvio 3) . Pienin restriktiofragmentti, joka hybri-20 disoitui kumpaankin 5'-leimattuun oligonukleotidiseokseen, oli 3,7 kb:n Bglll DNA-fragmentti. Sl-kartoitus osoitti ’·· täydellisen transkriptin sijaitsevan tuossa fragmentissa.
: * : Tämän fragmentin ovat sekvensoineet Maxam ja Gilbert : (1980) . DNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 17.
25 Kaikki viisi pept idisekvenssiä (kuvio 3) löydet- tiin 2874 emäksen avoimesta lukualueesta.
Glukoamylaasigeeni saadaan ilmaistuksi promootto- rivaihdolla. Saccharomyces cerevisiaen promoottorialue on .. . transkription ja säätelyn alkukohta, kun se insertoidaan * · ♦ *ti) 30 asemaan 5' ylöspäin glukoamylaasigeenin koodaavaan sek-*··' venssiin. Glukoamylaasigeenin translaation alkukohdan :V: edessä ei ole sopivia restriktiokeskuksia, joita voitai- siin käyttää promoottorin fuusioon. Siksi sijoitimme • , BamHI- ja Sali-restriktiokeskuksen asemaan 5' translaation ’ 35 aloituskoodiin keskukseen kohdistetulla mutaatiolla aukko-
» * * « I
112091 46 dupleksi- (gapped duplex)-DNA-menetelmällä (Kramer et al., 1984).
42 emäksen (5’ CTCATGACTGTGTCGACGGATCCAAGATGATTTT-TCTGAAGC 31) synteettinen oligonukleotidi lämpökäsiteltiin 5 aukkodupleksi-DNA:han. Suoritettiin yksijuosteisten alueiden täyttö DNA-polymeraasilla (iso fragmentti), ligatointi ja E. colin transformointi, ja voitiin eristää mutageni-soitu rekombinattiplasmidi, joka sisälsi BamHI-keskuksen asemassa -9 ja Sali-keskuksen asemassa -15 translaation 10 aloituskoodin ensimmäiseen emäkseen nähden.
Saadusta rekombinanttiplasmidista rakennegeeni voidaan subkloonata BamHI/SalI:na, BamHI/Hindlll:na, Sällinä, BamHI/PstI:nä, Sall/PstI:nä, BamHl/Xbal:nä ja Sall/Xbal.-nä sopiviin ilmaisuvektoreihin fuusioimalla gee-15 ni yhdessä mainituista restriktiokeskuksista eri promoot-toreihin. Mikä tahansa muu sopiva restriktiokeskus voidaan luoda sopivalla liittäjällä.
Rakennettiin hiivalle erilaisia ilmaisuvektoreita käyttäen eri promoottoreita, eri valinnaisia merkkejä ja 20 eri toisiintumisalkukohtia (2μ, ARS ja CEN).
Esimerkiksi geeni fuusioitiin indusoituvaan galak-i ’·· tokinaasiin (GAL1) promoottoriin plasmidissa pBM272, joka • ' saadaan suoraan vektorista pBM150 (Johnson ja Davis, 1984) : sijoittamalla Hindlll-keskus välittömästi BamHI-keskuksen 25 perään. Fuusion DNA-sekvenssin on seuraava : :*. _ 5' .....ylöspäin aktivaatiokeskuksesta............
! ·. ·. .....GATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTT
t t · TCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAA-,,. TATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCAAGATGATTTTTC- :, t;' 3 0 TGAAGC.... 3' *··* Glukoamylaasigeenin sisältävä fragmentti subkloo- : V: nättiin vektoriin pBM272 BamHI/Sall-fragmenttina. Saatu plasmidi transformoitiin Saccharomyces cervisiae aMZ4:ään * . (agall, trpl, ura3, leu2). Tämä johtaa glukoamylaasigeenin ‘ 35 indusoituvaan ilmaisuun ja aktiivisen glukoamylaasin eri tykseen.
112091 47
Aktiivisuuden määrä viljelysupernatantissa oli samaa luokkaa kuin mitattiin Schwanniomyces alluviuksen vil-jelysupernatanteissa, kun viljely oli suoritettu indusoivissa olosuhteissa.
5 Saccharomyces cerevisiae -transformantin erittämän glukoamylaasin aktiivisuus on huipussaan 50 °C:ssa ja se voidaan inaktivoida 60 °C:ssa kuten Schwanniomyces alluvi-us glukoamylaasi.
Glukoamylaasigeenin ilmaisuun ja glukoamylaasipro-10 teiinin eritykseen voitiin päästä myös pyruvaattidekarbok-sylaasi- (PDC) promoottorin (Hollenbeg et ai., 1983), fos-foglyseraattikinaasi- (PGK) promoottorin (Dobson et ai., 1982), glyseraldehysi-3-fosfaattidehydrogenaasi- (GAPDH) promoottorin pgap491.-ssä (Holland ja Holland, 1979), alko-15 holidehydrogenaasi 1- (ADH1) promoottorin (Hitzeman et ai., 1981), kuparikelaatti- (CUP1) promoottorin (Karin et ai., 1984, Butt et ai., 1984) ja alkoholidehydrogenaasi 2-(ADR2 tai ADH2) promoottorin (Russell et ai., 1983, Beier et ai., 1985) vaikutuksella.
20 Glukoamylaasin ylituotantoon päästiin käyttämällä PDC-promoottoria ja korkean kopioitumisluvun omaavaa plas- '· midia (2 μ leu2d:n kanssa). Glukoamylaasigeenin ilmaisu ja : · : glukoamylaasiproteiinin eritystä voidaan havaita myös ; Kluyveromyves lactiksella /3-galaktosidaasigeenin trans- jV. 25 kriptiosignaalien fuusioinnin jälkeen (Breunig et ai., ··,* 1984) .
* * · (>f.f Glukoamylaasigeenin ilmaisu ja glukoamylaasiprote- II» iinin eritystä havaitaan myös Schizosaccharomyces pombella ,,, alkoholidehydrogenaasi- (ADH1) geenin transkriptiosignaa- * · » • 30 lien fuusioinnin jälkeen (Russell et ai., 1983).
*··’ Glukoamylaasigeenin ilmaisu ja glukoamylaasiprote- ;Y: iinin eritystä voidaan havaita myös Hansenula polymorphal- la dihydroksiasetonisyntaasi (DHAS) (Janowitz et ai., t * < 1 , 1985) metanolioksidaasin (MOX) (Ledeboer et ai., 1985) 35 transkriptiosignaalien fuusioinnin jälkeen.
48 1 12091
Lisäksi voitiin todeta myös a-amylaasin eritystä vaihtamalla Schwanniomyces -promoottori MOX-promoottoriin Hansenula polymophassa.
Glukoamylaasigeeni integroitiin Saccharomyces ce-5 revisiae -kromosomiin ilman E. coli -sekvenssejä. Siksi eri promoottori-glukoamylaasifuusiot insertoitiin sopivaan Saccharomyces cerevisiae DNA-sekvenssiin, edullisesti ho-motalismigeeniin (HO) tai ARS-sekvenssiin. Näin voitiin luoda lineaarinen DNA-fragmentti, jonka päät ovat Saccha-10 romyces cerevisiae -sekvensseissä, jotka sivuavat toiminnallista glukoamylaasigeeniä. Saccharomyces cerevisiaen kontransformoinnilla YEP36:lla (Butt et ai., 1984) geeni saatiin stabiilisti integroiduksi. Integranteilla esiintyy glukoamylaasiaktiivisuutta viljelysupernatanteissa ja 15 niillä on samat fermentointi- ja kasvuominaisuudet kuin villityypillä.
Geenimanipuloidusta mikro-organismeista, ensisijaisesti hiivoista, kuten kuvattu edellä tässä patenttijulkaisussa, on runsaasti hyötyä useissa käymisprosesseis-20 sa niiden kyvyn hydrolysoitua korkeahkon molekyylipainon omaavia hiilihydraatteja ansiosta.
• '*· Eräs edellä kuvattujen geneettisesti muunneltujen • hiivakantojen käyttömahdollisuuksista on käyttö biomasso- : jen tuotannossa. Hiivakantojen omatessa uuden kyvyn erit- ·*·'. 25 tää a-amylaasi ja glukoamylaasia niiden muiden hyvien fer- !\ mentointiominaisuuksien ollessa ennallaan biomassoja voi- daan tuottaa erittäin tehokkaasti käyttämällä keksinnön hiivakantoja. Biomassojen tuotantomenetelmät ovat alalla . tavanomaisia, sen ammattimiesten tuntemia.
• · * 30 Samoin Saccharomycers cerevisiaen uusi käyttöalue
• I
"···* sen kyetessä nyt tuottamaan a-amylaasia ja glukoamylaasia :Y: on käyttö leipomohiivan ja tätä käyttäen leivän valmistuk- sessa.
‘ , Keksinnön hiivaa voidaan käyttää esimerkiksi pel- » # > * > 35 lettihiivana, joka on valmistettu perinteisillä rumpukui-
* * I t I
vausmenetelmillä, tai esimerkiksi hiivajauheena, jolloin 112091 49 partikkelikoko on 1,7 mm tai vähemmän. Hiivajauheen valmistus käsittää nestemäisen hiivakokoonpanon spray-kui-vauksen ilmassa, mitä seuraa lisäkuivatus, kuten alan am-mattimiehille tuttua. Keksinnön hiiva voidaan valmistaa 5 esimerkiksi kuivahiivana kuten kuvattu GB-PS nro:ssa 1 459 407, GB-PS nro:ssa 1 459 085 tai GB-PS nro:ssa 1 230 205. Mitkä tahansa muut alalla tunnetut leipomohii-van valmistusmenetelmät tai leipomotuotteiden valmistusmenetelmät tämän keksinnön uutta hiivaa käyttäen soveltuvat 10 myös käytettäviksi.
Tämän keksinnön mukaan saadut geenimanipuloidut hiivakannat soveltuvat edelleen erittäin hyvin etanolin tuotantoon. Edullinen organismi etanolin tuottamiseksi fermentaatiolla on Saccharomyces cerevisiae -hiiva ja 15 edullinen etanolin tuotannossa käytetty hiilihydraatti on tärkkelys. Täten Saccharomyces cerevisiae, joka pystyy kvantitatiivisesti fermentoimaan tärkkelystä on erittäin edullinen etanolin tuotannossa. Nautittavaksi tarkoitetun alkoholin tai teollisen etanolin tuotanto käyttämällä ky-20 seisen keksinnön geenimanipuloitua hiivakantaa voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla. Keksinnön hiivakan- • '·. nalla on kyky fermentoida konsentroituja hiilihydraatti- : ‘ liuoksia, se sietää etanolia ja sillä on kyky tuottaa kor- ; keitä etanolipitoisuuksia, sen solujen elinkelpoisuus on I » IV. 25 hyvä toistuvaan uudelleenkierrätykseen ja se ei ole herkkä 4 f ;·. lämpötilan vaihteluille.
Mahdollisesti tärkein käyttöalue uudelle Saccharo- * · i myces cerevisiaelle sen kyetessä tuottamaan a-amylaasia ja , glukoamylaasia on erikoisoluiden, erityisesti alhaisen *(i; 30 hiilihydraattipitoisuuden omaavien oluiden, valmistukses- '··*' sa. Kuten edellä patenttijulkaisussa jo on kuvattu, eräs tapa valmistaa alhaisen hiilihydraattipitoisuuden omaavia • * oluita oli lisätä amylaaseja vierteeseen fermentoinnin ai-' , kana. Koska 70 - 75 % vierteen dekstriineistä on haarautu- tilit 35 neen ketjun omaavaa tyyppiä, haarautumiskohdista ketjua pilkkova entsyymi on välttämätön vierredekstriinien hydro- 112091 50 lysoimiseksi kokonaisuudessaan käyviksi sokereiksi. Uuden geenimanipuloidun Saccharomyces cerevisiaen tuottamalla glukoamylaasilla on ketjua haarautumiskohdista pilkkovaa aktiivisuutta ja se kykenee siksi hydrolysoimaan dekstrii-5 nit täydellisesti. Tärkeä uuden Saccharomyces cerevisiae -hiivan tuottamien amylaasien ominaisuus on niiden herkkyys panimoteollisuudessa käytetylle tavanomaiselle pastö-rointisyklille.
Oluen valmistus käsittää joukon vaiheita alkaen 10 mallastuksesta, jossa ohra liotetaan vedessä ja annetaan sen itää, jolloin tämän vaiheen aikana vapautuu amylaasia, joka muuttaa jyvien tärkkelyksen sokeriksi. Seuraavassa vaiheessa jyvät poistetaan suodattamalla ja saatua nestemäistä vierrettä käytetään humalan kanssa. Humalat antavat 15 oluelle sen kitkerän maun ja tämän vaiheen aikana tärkkelyksen entsymaattinen konversio sokeriksi pysäytetään. Sitten vierre jäähdytetään ja suodatetaan saostuneiden proteiinien poistamiseksi. Sitten vierteeseen lisätään hiiva konvertoimaan sokerit alkoholiksi ja hiilidioksidik-20 si käymisprosessissa, minkä jälkeen seosta varastoidaan ja hiiva laskeutuu, olut suodatetaan toisen kerran sekä pul-; '·· lotetaan tai purkitetaan ja pastöroidaan.
. Alhaisen kaloripitoisuuden omaavan oluen valmista- miseksi on toivottavaa kuluttaa hiilihydraateista niin : 25 suuri osuus kuin mahdollista käymisprosessissa. Tähän tar koitukseen uusi Saccharomyces cerevisiae kyetessään tuot-, ,·, tamaan u-amylaasia ja glukoamylaasia on erittäin sopiva.
Alhaisen kaloripitoisuuden omaavaa olutta voidaan , yleensä ottaen valmistaa EP-hakemusjulkaisussa 0 163 135 fi; 30 kuvatulla menetelmällä sillä poikkeuksella, ettei käymis- prosessin aikana tarvitse lisätä amylaaseja. Edellä kuva-: ; : tut tavanomaiset oluenpanon vaiheet voidaan suorittaa il- man aikaa vieviä ja kalliita amylaasilisäyksiä. Oluenpanon ‘ , suoritus alalla tunnettuun tapaan käyttäen tämän keksinnön ’ 35 mukaista uutta geenimanipuloitua Saccharomyces cere- * » i * » visiaetä tuottaa erikoisolutta, edullisesti alhaisen hii- 112091 51 lihydraatti- tai kaloripitoisuuden omaavaa olutta riippuen sokerin käymisasteesta. Oluenpanoprosessi tämän keksinnön Saccharomyces cerevisiaetä käytettäessä nopeutuu johtuen nopeammasta Es-laskusta käymisprosessin lopussa.
5 Käyttämällä tämän keksinnön Saccharomyces cere visiaetä valmistukseen, jolloin tuotteen hiilihydraattipi-toisuutta voidaan säädellä ennalta määritetyllä fermen-tointiajalla ja laimentamisella fermentoinnin jälkeen. Lisäksi valmistusprosessia voidaan muuntaa soveltumaan sello laisten substraattien fermentointiin, jotka koostuvat huomattavassa määrin suspendoituneista hydratoiduista hiilihydraateista. Geenimanipuloitu Saccharomyces cerevisiae voidaan tuoda fermentoituun vierteeseen pääkäyttämisen jälkeen mutta ennen vakiointia.
15 Seuraavissa esimerkeissä annetaan nyt yksityiskoh taisempi kuvaus alhaisen kaloripitoisuuden omaavan oluen valmistuksesta.
Esimerkki 1
Olutvierrettä valmistettiin tavanomaisilla panimo-20 menetelmillä sillä tavalla, että 80 % vierteen uutteesta oli peräisin olutmaltaista ja 20 % maissiryyneistä. Tämän ; · vierteen alkuperäinen ominaispaino oli 11,7 °P. 3 litran J : käymisastiat täytettiin 2,5 litralla ilmastettua vierrettä ; ja niihin lisättiin hiivaksi 1,5 g/1 märkää geenimanipu- • 25 loitua Saccharomyces cerevisiae varasto-olutkantaa, joka oli transf ormoinnissa saanut Schwanniomyces castellii a-amylaasi- ja/tai glukoamylaasigeenin. Transformoidut hii- * » · vakannat erittivät kumpaakin entsyymiä. Kontrollina käy-,, . tettiin alkuperäistä Saccharomyces cerevisiae varasto- 30 oluttuotantokantaa.
Käymisen annettiin edetä 9 °C: een kontrolloidussa : : : lämpötilassa anaerobisissa olosuhteissa ja mekaanisesti sekoittaen fermentaation pienestä tilavuudesta johtuen.
’ . Fermentoinnin päätyttyä olut jäähdytettiin 0 °C:een, hiiva
»»(II
\ 35 erotettiin oluesta, josta analysoitiin jäännösuute ja eta- noli-%. Nuoresta oluesta ajettiin myös tyypillinen kaasu- 112091 52 kromatogrammi esterien ja korkeampien alkoholien määrän määrittämiseksi.
Seuraavassa taulukossa esitetään analyysit alkuperäisellä varasto-olutkannalla (A) käytetylle nuorelle 5 oluelle ja geenimanipuloidulla a-amylaasia erittävällä (B) tai glukoamylaasia erittävällä (C) tai kumpaakin entsyymiä erittävällä (D) lager-olutkannalla käytetylle oluelle.
A B C D
alkuperäinen ominaispaino °P 11,70 11,53 11,60 11,57 etanolia, % w/w 3,99 4,02 4,72 4,74 näennäinen uute °P 2,14 1,8 8 0,3 0 0,22 näennäinen fermentaatioaste % 81,7 83,7 97,4 98,1 todellinen uute °P 3,96 3,71 2,43 2,36 todellinen fermentaatioaste % 66,2 67,8 79,0 79,6
Kaasukromatografinen analyysi: asetaldehydi mg/1 2,0 2,1 3,1 3,9 asetoni mg/1 0,29 0,37 0,38 0,38 etyyliformiaatti mg/1 0,05 0,18 0,19 0,14 etyyliasetaatti mg/1 20,6 21,7 33,0 39,9 ' ; etyylipropionaatti mg/1 0,07 0,06 0,06 0,07 ; ; isoamyyliasetaatti mg/1 2,45 2,21 2,95 2,92 metanoli mg/1 2,0 2,5 2,3 2,6 :·, _ n-propanoli mg/1 17,5 16,3 21,0 17,7
Isobutanoli mg/1 14,2 12,6 14,7 15,3 opt. akt. amyyli alkoholi mg/1 21,5 19,0 21,8 20,4 isoamyylialkoholi mg/1 62,5 54,2 57,6 55,1 I i » kokonais (korkeammat mg/1 115,7 102,1 115,1 108,5 '···' alkoholit) 53 112091
Esimerkki 2 Käymisprosessi oli samanlainen kuin esimerkissä 1, paitsi, että käymislämpötila oli 13,5 °C. 7 päivän fermen-toinnin jälkeen olut jäähdytettiin 0 °C:een.
5 Alkuperäisellä olutkannalla käytetyn (A) ja geeni- manipuloidulla a-amylaasia (B) tai glukoamylaasia (C) erittävällä olutkannalla käytetyn nuoren oluen analyysi:
A B
alkuperäinen ominaispaino °P 11,8 11,8 etanolia, % w/w 4,10 4,60 näennäinen uute °P 2,00 0,85 näennäinen fermentaatioaste % 83,1 92,8 todellinen uute °P 3,90 2,90 todellinen fermentaatioaste % 67,0 75,4 10 Geenimanipuloidulla a-amylaasia erittävällä (B) olutkannalla käytettyjen oluiden analyysit eivät juurikaan eronneet kontrollista.
Esimerkki 3 Käymisprosessi oli sama kuin esimerkissä 1, paitsi ; '· 15 että valmistetun vierteen alkuperäinen ominaispaino oli 15 * ' t'· °P:tä. 9 päivän f ermentoinnin jälkeen olut jäähdytettiin 0 : : ,1 °C : een .
Alkuperäisellä olutkannalla (A) ja geenimanipu-loidulla a-amylaasia (B) tai glukoamylaasia (C) erittäväl-20 lä geenimanipuloidulla olutkannalla käytetyn nuoren oluen analyysi: • » »
• I I
• » I i I I t
* I I
• I
» 1 · 54 112091
A B
alkuperäinen ominaispaino °P 15,0 15,0 etanolia, % w/w 4,57 5,22 näennäinen uute °P 4,30 2,76 näennäinen fermentaatioaste % 71,4 81,6 todellinen uute °P 6,31 5,06 todellinen fermentaatioaste % 58,0 66,3
Geenimanipuloidulla a-amylaasia (B) erittävällä olutkan-nalla käytettyjen oluiden analyysit eivät juurikaan eron-5 neet kontrollista.
Esimerkki IV
Käymisprosessi oli sama kuin esimerkissä I, paitsi että valmistetun vierteen alkuperäinen ominaispaino oli 8,23 °P ja fermentointiaika/lämpötilaprofiili oli seuraa-10 va: 4 päivää 9,5 °C, 3 päivää 13,5 °C.
Alkuperäisellä olutkannalla (A) ja geenimanipuloidulla a-amylaasia (B) tai glukoamylaasia (C) erittävällä olutkannalla käytetyn nuoren oluen analyysi: i *·· 15 | ab ; ; I alkuperäinen ominaispaino °P 8,23 8,23 ; etanolia, % w/w 2,88 3,60 näennäinen uute °P 1,16 -0,56 näennäinen f ermentaatioaste % 85,9 107,0 todellinen uute °P 2,48 1,14 . todellinen fermentaatioaste % 69,9 86,7
Geenimanipuloidulla a-amylaasia (B) erittävällä : : : olutkannalla käytettyjen oluiden analyysit eivät juurikaan poikenneet kontrollista.
55 112 0 91
Esimerkki V
Käymisprosessi oli sama kuin esimerkissä I, paitsi että valmistettu vierre koostui 66,7 %:sta esimerkissä I kuvattua standardiolutvierrettä ja 33,3 %:sta suspendoi-5 tunuttta hydratoitua tärkkelystä (12 % w/v).
Alkuperäisellä olutkannalla (A) ja geenimanipu-loidulla α-amylaasia (B), glukoamylaasia (C) tai molempia entsyymejä (D) erittävällä olutkannalla käytetyn nuoren oluen analyysi: 10
A B C D
alkuperäinen ominaispaino °P 12,01 12,14 12,13 12,22 etanolia, % w/w 2,86 4,03 4,19 4,96 näennäinen uute °P 5,15 2,49 1,63 0,37 näennäinen fermentaatioaste % 57,1 79,5 86,6 96,9 todellinen uute °P 6,47 4,32 3,62 2,61 todellinen fermentaatioaste % 46,2 64,4 70,2 78,6
Kaasukromatografinen analyysi: asetaldehydi mg/1 3,9 3,4 8,4 11,6 i ’·· asetoni mg/1 0,24 0,20 0,17 0,23 | etyyliformiaatti mg/1 0,07 0,13 0,22 0,25 : etyyliasetaatti mg/1 8,7 20,5 39,6 43,3 *·*: etyylipropionaatti mg/1 - 0,02 0,01 0,01 isoamyyliasetaatti mg/1 0,62 1,25 1,62 1,70 metanoli mg/1 - n-propanoli mg/1 13,6 14,9 18,3 19,7 . Isobutanoli mg/1 13,0 11,5 14,7 16,5 *.,* opt. akt. amyylialkoholi mg/1 10,4 12,5 20,1 18,2 *·;·’ isoamyylialkoholi mg/1 50,9 57,1 67,5 79,2 : kokonais (korkeammat mg/1 87,9 96,0 120,5 133,6 alkoholit) * · * t > 56 1 1209 1
Esimerkki VI
Rouhittuja vehnä- ja maissijyviä suspendoitiin sopivaan puskuriin, keitettiin tärkkelyksen gelatinoimiseksi ja nesteytettiin käsittelyllä kaupallisella a-amylaasient-5 syymi-valmisteella.
Tämän käymislietteen alkuperäinen ominaispaino oli 18,9 °P ja sitä fermentoitiin 2,5 litran fermentoreissa 30 °C:een lämpötilassa 72 tunnin ajan. Käytetty hiivakanta oli Saccharomyces cerevisisea -tislauskanta, johon oli 10 transformoinnissa siirretty Schwanniomyces castelliin glu- koamylaasigeeni. Transformoitu hiivakanta eritti glukoamy-laasia. Kontrollina sama fermentaatio suoritettiin alkuperäisellä transformoimattomalla tislauskannalla. 72 tunnin kuluttua liete suodatettiin ja määritettiin etanolipitoi-15 suus.
hiiva etanolia, % w/w transformoimaton tislauskanta 8,9 transformoitu tislauskanta 9,6 • * » * i » ( « * I · t » · • » » * *
MIU
57 112091
Viitteet: BEIER, D.B.,SLEDZIEWSKI, A., YOUNG, E.T.(1985) Mol.Cell. Biol. 5, 1743-1749.
BENOIST, C., O'HARA, K., BREATHNACH, R. ja 5 CHAMON; P. ( 1980):Nuc.Acid.Res. 8, 127- 142.
BEGGS, J.D. (1978): Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid.
Nature 275, 104-108.
BEGGS, J.D. (1981): In Molecular Genetics in Yeast, 10 Alfred Benzon Symposium J_6, 383-395 .
BIRNBOIM, H.C. ja DOLY, S. (1979): A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA
Nuc. Acid. Res. 7, 1513-1523.
15 BOLIVAR, S., RODRIGUEZ, R.L., BETLACH, M.C.ja BOYER, H.W. (1977): Construction and characterisation of new cloning vehicles.
I ampicillin-resistant derivates of the plasmid pMB9. Gene 2, 75-93.
BRADFORD, M. (1976): A rapid and sensitive method for 20 the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 7_7, 248-254.
BREUN1G, K.D., DAHLEMS, U., DAS S., ja HOLLENBERG, C. P. ( 1984 )
Nucl.Acids Res. V2, 2327-2341.
; *·· 25 BUTT, T.R., STERNBERG; E.J., GORMAN, J.A., CLARK; P., : ’ HAMER, D..ROSENBERG, K., ja CROOKE, S.T. (1984) Proc.
: Natl. Acad. Sc i. USA 8J, 3332-3336.
f\: CARBON, J., RATZKIN, B., CLARKE, L. ja RICHARDSON, D.
( 1 977 ): The expression of cloned eucaryotic DNA in : ” 30 procaryotes.
:Y: Brookhaven Symp. Biol. 29, 277-296.
» COHEN, J., GORMAN, J., KOLTIN, Y. ja DE WILDE, M.
( 1985 ): Molecular cloning of a glucoamylase gene of :,,f Candida albicans: Expression and secretion in Saccharo- : _ myces cerevisiae.
35 Cold Spring Harbour Symp.Mo 1ec.Bio 1 . of Yeasts, 345.
» I I
COLLINS, J. ja HOHN, B. ( 1978): Cosmids: A type of plasmid genecloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage Lambda heads.
Proc.Natl .Acad.Sci. USA 75, 4242-4246: 58 112091 DAS, S. ja HOLLENBERG, C.P. (1982): A high-frequency transformation system for the yeast K1uyveromyces lactis Curr.Genet. <5, 123-128.
DAS, S., KELLERMANN, E.ja HOLLENBERG, C.P. (1984): Transformation of K1uyveromyces fragilis.
5 J.Bacteriol. 158, 1155-1167.
DAVIS, R.W., BOTSTEIN, D. ja ROTH, J.F. (1980):
Advanced bacterial genetics. A manual for genetic engineering.
Cold Spring Harbour Laboratory.
10 DOBSON, M.J., TUITE, M.F., ROBERTS, N.A., KINGSMAN, A.J., KINGSMAN, S.M., PERKINS; R.E.. CONROY. S.C.. DUNBAR. B. ja F0THERG1LL , L.A. (1982)
Nucleic Acids Research J_0, 2625-2637.
DUGAICZYK, A., BOYER, H.W. ja GOODMAN, H.M. (1975): Ligation of EcoRI endonuclease generated fragments into 15 linear and circular structures.
J.Mol.Biol. 96, 171-184.
FEISS, M., FISHER, R.A., CRAYTON, M.A. ja EGNER, C. (1977): Packaging of the bacteriophage Lambda chromosome: Effect of chromosome length.
Virology 77, 281-293.
20 FERGUSON, A.R., KATSUNUMA, T., BETZ, H. ja HOLZER, H. (1973): Purification and properties of an inhibitor of the tryptophane-synthetase-inactivating enzymes in yeast. Eur.J.Biochem.22, 444-450.
FOGARTY, W.M. ja KELLY, C.T. (1979): Starch degrading ” enzymes of microbial origin, j 25 In: BULL, M.J., (ed): Progress in industrial • microbiology. Elsevier Scientific Publishing Company,
New York, _1_5, 87-150.
• I t :. ·’ GAFNER, J., DE ROBERT IS; E.K. ja PHILIPPSEN, P. ( 1983 ).
’·· EKBO J. 2, 583-59 1 .
:·ν 30 GANNON, F., O'HARA, K., PERRIN, F., LE PENNEC, J.P., BENOIST, C., COCHET, M., BREATHNACH, R., ROYAL, A., GARAPIN, A. ja CHAMBON, P. (1979): : V Nature 2_78, 248-434.
» t HITZEKAN, R.A. , HAGIE, F.E., LEVINE, H.L., GOEDEL, D.V., AMMERER, G. ja HALL, B.D. (1981): Expression of a human v·’ 35 gene for interferon in yeast.
Nature 294, 717-722.
I M M
112091 59 HOHN, B. (1975): DNA as substrate for packaging into bacteriophage lambda in vitro.
J.Mol.Biol . 98, 93-106.
HOHN, B. (1979): In vitro packaging of Lambda and cosmid DNA. In WU, R. (ed): Recombinant DNA, Methods 5 in Enzymology.
Academic Press, New York 68, 299-309.
HOHN, B. ja COLLINS, J. (1980): A small cosmid for efficient cloning of large DNA-fragments.
Gene U_, 291 -298.
10 HOHN, B. ja HINNEN, A. (1980): Cloning with cosmids in E.coli and yeast.
In SETLOW, J.K. ja HOLLAENDER, A. (ed.): Genetic engineering - principles and methods.
Plenum Press, New York & London 2, 169-183.
HOLLAND, J.P. ja HOLLAND; M.J. (1979) J.Biol. Chem.
15 2^1’ 5466-5474.
HSIAO, C.L. ja CARBON, J. (1981 b): Characterisation of a yeast replication origin (ars2) and construction of stable minichromosomes containing cloned centromere DNA (CEN3).
Gene 15, 157-166.
20 INNIS, M.A., HOLLAND, M.J., Mc CABE, P.C., COLE, G.E., WITTMAN, V.P., TAL, R. , WATT, K.W.K., GELFAND, D.H., H0LAND, J.P. ja MEADE, J.H. (1985): Expression, g 1 ycosy1 ation and secretion of an Aspergillus gluco-amylase by Saccharomyces cerevisiae.
Science 228, 21-26.
25 ISH-H0R0WIC-Z, D. ja BURKE, J.F. (1981) : Rapid and , efficient cosmid vector cloning, j Nuc. Acids. Res. j)» 2989-2998.
’f’ ΙΤ0, H., FUKUDA, Y., MURATA, K.ja KIMURA, A. ( 1983 ):
Transformation of intact yeast cells treated with a 1 ka 1 i cat i ons.
: 30 J.Bacterid. 153, 163-168.
JAN0WICZ, Z. A., ECKART, M.R., DREWKE,C., ROGGENKAMP, R.O., HOLLENBERG, C.P., MAAT, J., LEDEBOER, A.M., VISSER; C. ja VERRIPS, C.T. ( 1985 ) :t;’ Nucleic Acids Res. j), 3043-3062.
35 JOHNSTON, M. ja DAVIS, R.W. ( 1984 )
Mol. Cell.Biol. 4, 1440- 1448.
• » KARIN, M., NAJARI AN , R., HASLINGER, A., VALENZUELA, P..WELCH , J. ja FOGEL, S. ( 1984 )
Proc. Natl .Acad.Sci. USA ΣΠ, 337-341 .
KATSUNUMA, T., SCHÖTT, E., ELSÄSSER, S.ja HOLZER, M.
(1972):
Eur.J.Biochem. ,27, 520-526.
6° 112091 KAUFER, N.F., SIMANI S , V. ja NURSE; P. ( 1985): Fission yeast Schizosaccharomyces pombe exises a mammalian RNA transcript intervening sequence.
Nature 318, 78-80.
KLEBE, R.J., HARRISS, J.V., SHARP, Z.D. ja DOUGLAS, M.G.
5 (1983): A general method for polyethylene-glycol- induced genetic transformation of bacteria and yeast.
Gene 2_5, 333-341 .
KRAMER, W., DRUTSA, V., JANSEN, H.-W., KRAMER, B., PFLUGFELDER , M. ja FRITZ, H.-J. (1984)
Nuc 1. Ac i ds . Res . _1_2, 9441 -9456.
10 LAEMMLI, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature222, 680-685.
LEDEBOER, A.M., MAAT, J., V1SSER, C., BCS, J.W., VERR1PS, C.T. .JANOWICZ, Z., ECKART, M. , DREWKE, C., ROGGENKAMP, R. ja HOLLENBERG, C.P., (19^5) 15 Nucl.Acids.Res. 9, 3063-3082.
LEPOCK, J.R., KEITH, A.D.ja KRUUV, J. (1984):
Permeability changes in yeast after freeze, thaw damage; comparison to reproductive survival.
Cryo-Letts. 277-280.
LINDENMAIER, W., HAUSER, H., GREISER DE WILKE, I., ja 20 SCHOTZ, G., (1982): Gene shuttling; moving of cloned DNA intoand out of eucary'otic cells.
Nucl. Acids·. Res. _1_0- 1243-1256.
j’ ; MAN I AT IS, T., FRITSCH, E.F.ja SAMBROCK, J. ( 1982 ): * Molecular cloning, a laboratory manual.
V Cold Spring Harbour Laboratory, New York.
·: 25 MANNEY, T.R. , DUNTZE, W. , JANASKO, N. ja SALAZAR, J.
( 1 969 ): Genetic and biochemical studies of partially active tryptophane-synthetase mutants of Seccharomyces v. c e r e v i s i a e.
J. Becteriol. 99, 590-596.
fV MAXAM, S.M. ja GILBERT, W. ( 1960): Sequencing end .···. 30 labelled DNA with base specific chemical cleavages.
Methods Enzymol. 6^. 499-561.
* > :.V NUNEERG, J.H., MEADE, J.H., COLE, G., LAWYER, F.C., ·*”; McCABE, P., SCHWE1CKART , V. , TAL , R., WITTMAN, V.P., T FLATGAARD, J.E. ja INNIS, M.A. ( 1984 ): Molecular ·;*· cloning and characterisation of a glucoamylase gene of Aspergillus awamori.
35 Mol .Cel 1 .Biol. 4, 2306-2315.
61 1 12091 ORR-WEAVER, T.L., SZOSTAK, J.W. ja ROTHSTEIN, S.J.
(1981): Yeast transformation: A model system for the study of recombination.
Proc. Natl, Acad. Sci. USA 78, 6354-6358.
OTENG-GYANG, K., MOULIN, G., GALZY, P. (1981): 5 Zeitschrift allg. Mikrobiol. 2J_, 537-544.
RIGBY, P.W.J., DIEKMANN; M., RHODES, C. ja BERG, P.
(1977): Labelling desoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA-polymerase I.
J. Mol. Biol. ^13, 237-251.
10 ROTHSTEIN, S.J., LAZARUS, C.M., SMITH, W.E., BAULCOMBE, D. C. ja GATENBY, A.A. (1984): Secretion of a wheat alpha-amylase expressed in yeast.
Nature 308, 662-665.
RUSSELL,D.W. ja HALL, B.D., (1983) 15 J.Biol.Chem. 258, 143-149.
RUSSELL,D.W., SMITH, M., WILLIAMSON, V.M. ja YOUNG, E. T. (1983) J.Biol.Chem. 258, 2674-2682 .
SCHATZ, G. (1979): 20 Meth.Enzymol.LJ/_I, 40-50.
SHERMAN, F., FINK, G.R. ja HICKS, J.B. (1983):
Methods in yeast genetics.
In C.S.H. Laboratory, C.S.H., New York, 119, :, SILLS, A.M. ja STEWART, G.G. (1982): Production of '· " 25 amylolytic enzymes by several yeast species.
J.Inst. Brew. 88, 313-316.
: 0 SILLS, A.M., PANCHAL, C.J., RUSELL, I . ja STEWART, : G.G. ( 1983 a): Genetic manipulation of amylolytic ;_ ·* enzyme production of yeast. Gene Expression in Yeast.
Γ\, Proceedings of the Alko Yeast Symposir Helsinki 1983, ’ 30 ed.by M. Korhola ja E.Väisänen.
Foundation for Biotechnical ja Industrial Fermentation Research _1_, 20S-228.
j’V SILLS, A.M., RUSELL, I. ja STEWART, G.G. ( 1 983 b): The .···, production of yeast amylases in the brewing low *···’ carbohydrate beer.
,v, 35 EBC Congress, 377-384.
• · * I t SILLS; A.K., SAUDER, M.E. ja STEWART, G.G. (1984 a): '1* Isolation and characterisation of the amylolytic system *:·· of Schwanniomyces castellii.
J.Inst. Brew. 9JD, 311-314.
• « *ϊ 112091 SILLS, A.H., ZYGORA, P.S.J. ja STEWART, G.G. (1984 b):
Characterisation of Schwanniomyces castellii mutants with increased productivity of amylases.
Appi. Microbiol. Biotechnol. 2_0, 124-128.
SIMOES-MENDES, B. (1984 ): Pur ification and characteri-5 sation of the extracellular amylases of the yeast Schwanniomyces alluvius.
Can.J.Microbiol. 30, 1 163-1 170.
SOUTHERN, E.M. (1975): Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol. Biol. 98, 503-517.
10 STRASSER, A.W.M. (1982): Biochemische und biophysi-kalische Studien an der in Hefe Oberproduzierten Hefe Tryptophan-synthetase.
Dissertation, Universität Basel.
STRUHL, K., STINCHCOMB, D.T., SCHERER, S. ja DAVIES R.W. (1979): High-frequency transformation of yeast: 15 Autonomous replication of hybrid DNA molecules.
Proc. Natl .Acad. Sci. USA 76^, 1035-1039.
THOMSEN, K.K. (1983): Mousey-amylase synthesised by Saccharomyces cerevisiae is released into the culture medium.
Carlsberg Res. Commun.'48, 5, 545-555.
20 TOUCHSTONE, J.C. ja DOBBINS, M.F., (1978): Practice of thin layer chromatography.
A.Wiley-1nterscience publication. John Wiley & Sons.
:. " TSAI, H., TSAI, J.H.J. ja YU, P.H. (1973): Effects • ' : of yeast proteinase and its inhibitors on the in- , ,, acitvation of tryptophane synthetase from Saccharomyces 1 ' 25 cerevisiae ja Neurospore crassa.
: Eur. J. Biochem. 4_0, 225-232.
: ’· WALZ , A. , RAT ZK1N, B. ja CARBON, J. ( 1978): Control of expression cloned yeast (Saccharomyces cerevisiae) gene • ’ TRP5 bv a bacterial insertion element (IS2).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 6172-6176.
30 : ·’ WILSON, J.J. ja INGLEDEW, W.M. (1982): Isolation ja characterisation of Schwanniomyces alluvius amylolytic enzymes.
Appi . En v i ron . Microbiol. 4_4, 301 -307.
t * 63 112091 YAMASHITA; I. ja FUKUI.S. (1983): Molecular cloning of g 1 ucoamy1 ase-producing gene in the yeast Saccharo-myces.
Agric. Biol. Chem. £7, 2689-2692.
ZALKIN, H. ja YANOFSKY, C. ( 1982): Yeast gene TRP5: 5 Structure, function, regulation.
J.Biol. Chem. 257, 1491-1500.
• # 1 • · 1 • 1 1 * · * » » * 1 1 » » » · 1 • 1 • · • 1 • · • 1 »

Claims (20)

64 112091
1. Hiivasolu, joka kykenee ilmentämään termola-biileja amylolyyttisiä entsyymejä sen johdosta, että se on 5 yhdistelmä-DNA-tekniikalla vastaanottanut DNA-sekvenssejä luovuttajahiivalta, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään organismin Schwanniomyces οί-amylaasia ja gluko-amylaasia sen johdosta, että se on Schwanniomyces-luovutta-jahiivalta vastaanottanut DNA-sekvenssejä, jotka käsittävät 10 mainittua a-amylaasia ja glukoamylaasia koodaavat sekvenssit .
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että se on valittu suvuista Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces ja Kluyveromyces.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen hiivasolu, tun nettu siitä, että se on Saccharomyces cerevisiae.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että se on Schwanniomyces alluvius.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen 20 hiivasolu, tunnettu siitä, että luovuttaj ahiiva on Schwanniomyces castellii.
: 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen hiivasolu, tun- • V nettu siitä, että luovuttaj ahiiva on Schwanniomyces castellii ATCC 26076. i**’; 25
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen hii- ‘*4i vasolu, tunnettu siitä, että sen ilmentämän cx-amylaasin V, lämpötilaoptimi on noin 37 °C ja se inaktivoituu noin 60 °C:ssa.
. . 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen hii- 30 vasolu, tunnettu siitä, että sen ilmentämää cx-amylaasia > t *; koodaa kuviossa 2 esitetty DNA-sekvenssi tai sen modifi- ! ! *. kaatio, joka säilyttää koodatun cx-amylaasin aktiivisuuden.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen hii- • i t ‘ . vasolu, tunnettu siitä, että sen ilmentämän glukoamy- , 3 5 laasin lämpötilaoptimi on noin 50 °C, se inaktivoituu noin 65 112091 60 °C:ssa ja se kykenee hydrolysoimaan ohratärkkelystä täydellisesti glukoosiksi.
10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että sen ilmentämää gluko- 5 amylaasia koodaa kuviossa 17 esitetty DNA-sekvenssi tai sen modifikaatio, joka säilyttää koodatun glukoamylaasin aktiivisuuden.
11. Hiivasolu, joka kykenee ilmentämään termolabii-lia amylolyyttistä entsyymiä sen johdosta, että se on yh- 10 distelmä-DNA-tekniikalla vastaanottanut DNA-sekvenssin luo-vuttajahiivalta, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään organismin Schwanniomyces a-amylaasia sen johdosta, että se on Schwanniomyces-luovuttajahiivalta vastaanottanut DNA-sekvenssin, joka käsittää α-amylaasia, jolla on kuvios- 15 sa 2 esitetty aminohapposekvenssi, koodaavan nukleotidi-sekvenssin tai sen modifikaation, joka säilyttää koodatun a-amylaasin aktiivisuuden.
12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että se on käyttökelpoinen 20 elintarviketeollisuudessa ja/tai käymisprosesseissa, kuten panimoprosessissa oluen valmistamiseksi, menetelmässä eri-j koisoluen valmistamiseksi dekstriinikäymisen avulla, leipo- moprosesseissa tai menetelmissä etanolin valmistamiseksi ; tärkkelyksen käymisen avulla. .25
13. Yhdistelmä-DNA, tunnettu siitä, että se si- ;·, sältää Schwanniomyces-a.-amylaasia ja -glukoamylaasia koo- *. . daavat sekvenssit. » » ·
14. Yhdistelmä-DNA, tunnettu siitä, että se sisältää kuviossa 2 esitetyn DNA-sekvenssin, joka koodaa : ·* 30 Schwanniomyces-a-amylaasia, jolla on kuviossa 2 esitetty aminohapposekvenssi.
15. Menetelmä termolabiilin a-amylaasin valmistami- ,···, seksi, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuk- • ( sista 1-12 mukainen hiivasolu kasvatetaan sopivassa kas- liiti 35 vatusalustassa ja α-amylaasi otetaan talteen mainitusta ’ ' kasvualustasta. 112091 66
16. Menetelmä sellaisen fermentaatioprosessin suorittamiseksi, jossa käytetään tärkkelystä raaka-aineena, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksista 1 -12 mukaista hiivasolua käytetään mainitussa fermentaatio- 5 prosessissa tai patenttivaatimuksen 15 mukaisessa menetelmässä a-amylaasin valmistamiseksi, jota sitten otetaan talteen ja käytetään fermentaatioprosessissa.
17. Menetelmä biomassan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 16 mu- 10 kaista fermentaatioprosessia.
18. Menetelmä oluen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 16 mukaista fermentaatioprosessia .
19. Menetelmä leivän valmistamiseksi, tunnettu 15 siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 16 mukaista fer mentaatioprosessia .
20. Menetelmä etanolin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 16 mukaista fermentaatioprosessia. I * t · * I * · 1 t I ί · nm 67 112 0 91
FI873637A 1986-08-21 1987-08-21 DNA-rekombinaatiotekniikalla rakennetut amylaaseja tuottavat mikro-organismit ja niiden käyttö käymisprosesseissa FI112091B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP86111586 1986-08-21
EP86111586A EP0257115A1 (en) 1986-08-21 1986-08-21 Amylolytic enzyme producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology, and their use in fermentation processes
EP87110370 1987-07-17
EP87110370A EP0260404B1 (en) 1986-08-21 1987-07-17 Amylolytic enzymes producing microorganisms constructed by recombinant DNA technology and their use for fermentation processes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI873637A0 FI873637A0 (fi) 1987-08-21
FI873637A FI873637A (fi) 1988-02-22
FI112091B true FI112091B (fi) 2003-10-31

Family

ID=26102431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI873637A FI112091B (fi) 1986-08-21 1987-08-21 DNA-rekombinaatiotekniikalla rakennetut amylaaseja tuottavat mikro-organismit ja niiden käyttö käymisprosesseissa

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0260404B1 (fi)
JP (3) JP2873003B2 (fi)
AU (1) AU621810B2 (fi)
CA (1) CA1340101C (fi)
DK (1) DK434987A (fi)
FI (1) FI112091B (fi)
IE (1) IE69658B1 (fi)
NO (1) NO304192B1 (fi)
NZ (1) NZ221529A (fi)
PT (1) PT85565B (fi)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5151354A (en) * 1986-08-21 1992-09-29 Cornelius Hollenberg Fermentation processes using amylolytic enzyme producing microorganisms
DE394538T1 (de) * 1989-04-28 1991-04-11 Rhein Biotech Ges. Fuer Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh, 4000 Duesseldorf, De Hefezellen der schwanniomyces-gattung.
US5665585A (en) * 1992-09-03 1997-09-09 Alko-Yhiot Oy Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
DE4425058C2 (de) * 1994-07-15 1999-02-18 Inst Pflanzengenetik & Kultur Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Glukoamylase
GB9526613D0 (en) * 1995-12-28 1996-02-28 Scottish Crop Research Inst Sequence
US6900305B2 (en) * 2000-08-04 2005-05-31 Battelle Memorial Institute Isolated yeast promoter sequence and a method of regulated heterologous expression
CN1957080A (zh) * 2004-05-21 2007-05-02 日本札幌啤酒株式会社 不使用大麦、小麦及麦芽的发泡性酿造酒的制造方法及由该制造方法制造的发泡性酿造酒
JP4690959B2 (ja) * 2005-07-25 2011-06-01 サントリーホールディングス株式会社 加水分取酵母を用いた発酵飲料の製造方法
JP5141133B2 (ja) * 2007-08-10 2013-02-13 東レ株式会社 連続発酵によるタンパク質の製造方法
HUE050997T2 (hu) * 2008-05-06 2021-03-01 Archer Daniels Midland Co Keményítõ- és xilánbontó enzimek expresszálásával keményítõ és xilán alkoholos fermentációjára képes hõtûrõ Hansenula polymorpha élesztõtörzsek kifejlesztése
JP5303046B2 (ja) * 2012-02-29 2013-10-02 サントリーホールディングス株式会社 良好な醸造香を有する低糖質発酵飲料の製造方法
JP6170206B1 (ja) * 2016-05-26 2017-07-26 アサヒビール株式会社 ビールテイスト飲料及びその製造方法
JP7206031B2 (ja) * 2016-07-12 2023-01-17 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料の香味向上方法
US11274310B2 (en) 2017-09-29 2022-03-15 Dsm Ip Assets B.V. Yeast cells for glycerol free ethanol production
KR102529251B1 (ko) * 2022-10-21 2023-05-12 주식회사 바이오크래프트 향미관련 관능성이 우수한 고에스터 함유 수제 맥주 제조에 활용 가능한 신규한 토종 발효 효모 사카로마이세스 세레비지애 bc-4900

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE42338T1 (de) * 1982-05-19 1989-05-15 Unilever Nv Hefe des genus kluyveromyces, modifiziert zur expression von preprothaumatin oder seinen verschiedenen allelischen und modifizierten formen oder maturationsformen.
NO840200L (no) * 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
CA1203765A (en) * 1983-05-11 1986-04-29 Alexander M. Sills Schwanniomyces castellii strains and brewing process
IL75210A0 (en) * 1984-05-22 1985-09-29 Bioteknika International Yeast vector
JPS60262593A (ja) * 1984-06-08 1985-12-25 Mitsui Toatsu Chem Inc 酵母グルコアミラ−ゼ遺伝子
IL76190A0 (en) * 1984-08-31 1985-12-31 Smithkline Beckman Corp Recombinant saccharomyces
JPS61141890A (ja) * 1984-12-15 1986-06-28 Suntory Ltd アルコ−ルの製造法
GB8432483D0 (en) * 1984-12-21 1985-02-06 Tubb R S Enzymes
AU5954486A (en) * 1985-05-21 1986-12-24 Biotechnica International Inc. Yeast expressing gluocoamylase

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000308493A (ja) 2000-11-07
IE872233L (en) 1988-02-21
FI873637A0 (fi) 1987-08-21
JPH1118783A (ja) 1999-01-26
PT85565B (pt) 1990-05-31
NO873525L (no) 1988-02-22
CA1340101C (en) 1998-10-27
JP3065987B2 (ja) 2000-07-17
DK434987A (da) 1988-02-22
AU7685087A (en) 1988-06-16
DK434987D0 (da) 1987-08-20
NZ221529A (en) 1992-11-25
PT85565A (en) 1987-09-01
EP0260404B1 (en) 1995-05-31
NO304192B1 (no) 1998-11-09
NO873525D0 (no) 1987-08-20
EP0260404A3 (en) 1988-07-06
EP0260404A2 (en) 1988-03-23
FI873637A (fi) 1988-02-22
JPS63133984A (ja) 1988-06-06
JP3162043B2 (ja) 2001-04-25
IE69658B1 (en) 1996-10-02
AU621810B2 (en) 1992-03-26
JP2873003B2 (ja) 1999-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112091B (fi) DNA-rekombinaatiotekniikalla rakennetut amylaaseja tuottavat mikro-organismit ja niiden käyttö käymisprosesseissa
FI111549B (fi) Rekombinantti-DNA-materiaali, joka koodaa ksylanaasin kypsyvää muotoa, ja isäntäsolu
EP0383779B2 (en) PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN PRODUCTS IN $i(ASPERGILLUS) AND PROMOTERS FOR USE IN $i(ASPERGILLUS)
Kitano et al. Specific expression and temperature-dependent expression of the acid protease-encoding gene (pepA) in Aspergillus oryzae in solid-state culture (Rice-Koji)
Ishida et al. Regulation of the glucoamylase-encoding gene (glaB), expressed in solid-state culture (koji) of Aspergillus oryzae
US5252726A (en) Promoters for use in aspergillus
US5665585A (en) Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
NO840200L (no) Glukoamylase cdna.
US5100794A (en) Amylolytic enzymes producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology and their use for permentation processes
US5705358A (en) Process for producing/secreting a protein by a transformed mould using expression/secretion regulating regions derived from a aspergillus endoxylanase II gene
WO1986007091A1 (en) Yeast expressing glucoamylase
EP0228009B1 (en) Dna strand coding for alpha-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the dna strand
US5151354A (en) Fermentation processes using amylolytic enzyme producing microorganisms
JPH09507742A (ja) Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａから得られるグルコアミラーゼプロモーターおよび異種ポリペプチドの生産におけるその使用
Janse et al. Expression of the Klebsiella pneumoniae pullulanase-encoding gene in Saccharomyces cerevisiae
US6214577B1 (en) Yeast vectors conferring antibiotic resistance
JP5507062B2 (ja) 高発現プロモーター
Ashikari et al. Alcohol Production fey Genetically Improved Yeast
Nagashima et al. Functional role of Aspergillus oryzae glucoamylase C-terminal domain investigated using its cDNA
FI89724B (fi) Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar
CA1316472C (en) Yeast expressing glucoamylase
CA1296276C (en) DNA STRAND CODING FOR .alpha.-ACETOLACTATE DECARBOXYLASE AND YEAST TRANSFORMED WITH THE DNA STRAND
Bajszár et al. Properties and Engineering of a Mutant STA Promoter of Saccharomyces diastaticus
DK165640B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af rekombinant humicola lipase og rekombinante humicola lipaser, der kan fremstilles ved fremgangsmaaden.
FR2599755A1 (fr) Bloc d&#39;expression d&#39;une amyloglucosidase dans une levure, levure transformee et procede de preparation d&#39;enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: HEINEKEN TECHNICAL SERVICES B.V.

MA Patent expired