PT85565B - Processo para a preparacao de polipeptideos, de adn que codifica para esses polipeptideos, de vectores contendo esse adn e processos de fermentacao usando esses polipeptideos, adn ou vectores nomeadamente para a producao de cerveja - Google Patents

Description

MEMÕRIA DESCRITIVA

As espécies da levedura do género Sçhwanniomyces provocam a hidrólise do amido para a glucose como resulta do da produção de enzimas extracelulares, nomeadamente a amilase (K-l,4-glucano-4-glucano-hidrolase E.C.3.2.1.1.) e a gluco-amila se (sin. amiloglucosidase) (o<-l,4~glu.canoglu.co-hidrolase, E.C.3. 2.1.3. com actividade de eliminação das ramificações E.C.3.2.1.

9.).

— 1 —

Os sistemas amilolíticos de Schwanniomyces castellii e de Schwanniomyces alluvius estão bem documentados (Oteng-Gyang et al., 1981$ Sills et al., 1982, 1984a, 1984b;

Wilson et al., 1982).

Ê proveitoso trabalhar com espécies Schwanniomyces porque a <-amilase tem uma actividade liquefacadora e a glucoamilase tem uma actividade de eliminação das ramificações, e também porque 0 sistema amilolítico é sensível às condi ções de pasteurisação normalmente empregues na produção de cerveja (Sills et al., 1984a e b).

A levedura Saccharomyces, não tendo qualquer das actividades referidas da levedura Schwanniomyces, é 0 organisi mo mais utilisado na produção de cerveja, processos de panificação e na indústria da fermentação do etanol. Nos processos da fermentação, é habitual 0 uso do amido como matéria prima. Uma vez que, no entanto, como já anteriormente mencionado, 0 Schwanniomyces cervisiae não é capaz de provocar a hidrólise do amido, a conversão tradicional do amido em etanol e COg por Saccharomyces cerevisiae requere dois processos de degradação enzimática antes da actividade de fermentação efectuada por Saccharomyces cervisiae, nomeadamente, a liquefacação, levada a cabo por junção da<C~amilase e a sacarificação levada a cabo pela adição da glucoamilase com actividade de eliminação das ramificações (Fogarty et al., 1979).

No pedido de patente Europeia nrs O 125 615, foi já descrito 0 uso da levedura do género Schwanniomyces para a produção de cervejas de baixo teor calórico. Usando a levedura do género Schwanniomyces consegue-se um organismo nos proces sos de fermentação que é capaz de produzir enzimas amilolíticas, e por essa razão, as enzimas mencionadas não tem que ser previamente adicionadas ao processo de fermentação.

Todavia, a levedura Schwanniomyces não é de maneira alguma tão eficiente e adaptável como a Saccharomyces cerevisiae na indústria cervejeira e na produção industrial do — 2 —

etanol. Por essa razão, foi proposto no pedido de patente Europeia em cima mencionado o uso de Schwanniomyces em adição ao gé nero Saccharomyces, que é mais eficiente, sendo ainda este últi mo o organismo essencial para a fermentação de hidratos de carbono degradados em etanol e as enzimas que degradam o amido sen do provenientes de Schwanniomyces. As enzimas são contudo juntas separadamente, como é habitual de acordo com o estado da técnica.

Vários genes que codificam para enzimas ami lolíticas podem ser clonados e expressos em Saccharomyces cerevisiae, nomeadamente, o gene da <-amilase do rato (Thomsen, 1983) e do trigo (Rothstein et al,, 1984) e 0 gene da glucoamilase de Saccharomyces diastaticus (Yamashita and Pukui, 1983), de Aspergillus niger (Nunnberg et al., 1984; Innis et al.,1985), Candida albicans (Cohen et al., 1985) e Rhizopus oryzae (Pedido de patente Europeia nr2 85 115 910.3)·

As enzimas amilolíticas produzidas pelos or ganíamos dadores acima mencionados não são, contudo, úteis para os objectivos da presente invenção. Para 0 uso de Saccharomyces cerevisiae manipulada geneticamente na produção de cerveja e nos processos de panificação e na produção industrial do etanol, é muito desejável clonar os respectivos genes derivados de organis mos muito intimamente relacionados, uma vez que a produção e aplicação das enzimas expressas é muito melhor aceite para a indústria alimentareque estas têm as propriedades enzimológicas e químicas requeridas para processos industriais. Por essa razão as enzimas amilolíticas do microorganismo Schwanniomyces, que podem ser produzidas pela tecnologia de ADN recombinante em vários microorganismos hospedeiros, são mais apropriadas para um certo número de aplicações devido ao relacionamento íntimo entre 0 microorganismo Schwanniomyces e os microorganismos hospedeiros usados, e devido ao facto de terem uma temperatura óptima mais baixa e uma menor sensibilidade à temperatura e devido à grande estabilidade das enzimas amilolíticas produzidas pela Schwanniomyces.

»*««·» .

gene de oC-amilase da Schwanniomyc es e o primeiro gene de cC-amilase clonado de uma espécie de levedura e, sendo um gene proveniente de um organismo de levedura estreitamente relacionado, é mais compatível com os processos de fermen tação necessários na indústria alimentar, por exemplo na produção da cerveja e em processos de panificação.

Além do mais, comparando com outras eC-amilases, a cC-amilase de Schwanniomyces tem uma actividade enzimática mais favorável a uma temperatura baixa de cerca de 37°C, o que permite a aplicação na fermentação ou em processo a temperaturas mais baixas. Além do mais, a oG-amilase de Schwanniomyces pode ser inactivada à temperatura de 50°C.

A glucoamilase de Sch.wanniomyces tem uma especial actividade de eliminação das ramificações e é por essa ra zão capaz de hidrolisar o amido virtualmente de forma completa em glucose, ao passo que a glucoamilase de Candida albicans ou de Saccharomyces diastaticus não tem actividade de eliminação das ramificações, e por essa razão não é capaz de hidrolisar amido completamente em glucose. A glucoamilase de Schwanniomyces, para além das suas propriedades enzimológicas e químicas específicas, incluindo o pH e a temperatura Óptimos, tem vantagens adicionais sobre as glucoamilases codificadas por outros genes já clonados, que consistem em que esta enzima é proveniente de uma espécie de levedura e pode ser inactivada pelo calor em con dições de pasteurisação (Sill et al., 1983) que são normalmente empregues no processo da produção de cerveja.

Por esta razão seria muito mais vantajoso para o processo da produção de cerveja, para a produção de etanol industrial e de biomassa de levedura, dispor de culturas de Saccharomyces cerevisiae com a respectiva produção de COg eleva da, a sua boa eficiência de fermentação, a sua elevada tolerância em relação ao etanol, mas também com a capacidade de hidrolisar o amido completamente por síntese e secreção de «C-amilase e de glucoamilase. Também para a produção de COg na panificação, a produção de variedades de enzimas amilolíticas pode vir a ser

altamente vantajosa.

Era consequência disso foi um objectivo da presente invenção proporcionar um microorganismo apropriado para os processos de produção de cerveja e de panificação, para a produção de etanol industrial e de biomassa tendo a capacidade para hidrolisar o amido inteiramente se desejado por ser capaz de sintetizar e segregar οζ-amilase e glucoamilase.

Os microorganismos pretendidos podem ser con seguidos através da manipulação genética dos microorganismos usados por tecnologia de ADN recombinante. A tecnologia de ADN recombinante é usada para clonar os genes comercialmente interessantes que codificam para a tQ-amilase β para a glucoamilase, por clonagem dos fragmentos de ADN que contêm os genes da K-ami lase e/ou da glucoamilase de uma levedura do género Schwanniomyces. Depois da transformação de um microorganismo hospedeiro, os genes clonados que codificam para enzimas amilolíticas são expressos num microorganismo hospedeiro, por exemplo, em Saccharomyces cerevisiae, e os produtos dos genes são segregados para o meio. O pretratamento enzimático do amido e/ou das dextrinas não fermentáveis, que era necessário para proporcionar aos microorganismos de fermentação o açúcar fermentável, pode por essa razão ser evitado, com todas as vantagens com respeito a um processo de fermentação mais económico e mais simples, por exemplo, nos campos de produção de cerveja, produção de etanol industrial e produção de biomassa. Para o processo de panificação, a levedura amilolítica pode ser de grande vantagem para a preparação de certos tipos de massa.

Uma das vantagens de conseguir um microorga nismo de fermentação, por exemplo Sac charomyc e s c erevi si ae, ten do a capacidade de produzir a <£-amilase e/ou glucoamilase é baseada no facto de que o amido pode ser degradado contínua e quantitativamente, e a biomassa ou o etanol são simultaneamente produzidos pela conversão aeróbica ou anaeróbica dos hidratos de carbono de baixo teor molecular resultantes da degradação do amido. No caso dos processos da produção de cerveja acima meneio

nados, o resultado desta completa degradação do amido é a obten ção de uma cerveja de baixo teor calórico, uma vez que os hidra i tos de carbono de baixo peso molecular daí resultantes são facil mente fermentados pelos microorganismos geneticamente manipulados em etanol e COg,

Um exemplo adicional para o uso de estirpes amilolíticas de Saccharomyces cerevisiae na produção de cerveja na indústria cervejeira é a produção de cervejas especiais, como é o caso de uma cerveja com baixo teor de hidratos de carbono, de uma carveja de dieta e de uma cerveja de sabor especial. Além disso estas estirpes permitem um alargamento da gama de matérias primas contendo amido para a produção de cerveja na indústria cervejeira.

Embora a ideia geral da presente invenção a cima descrita consista no uso de vários microorganismos hospedeiros que são adequados para um dos processos de fermentação ou na produção da biomassa anteriormente mencionados, descreve-se na presente memória descritiva um exemplo preferível da construção de um microorganismo como sendo capaz de expressar e segregar enzimas amilolíticas.

Para a construção de uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, foi desenvolvido um sistema de transformação com uma marca particular, proporcionando não só a regu lação dos genes da amilase como também a superprodução do produ to dos seus genes nas células da levedura.

De acordo com a presente invenção, foi ainda construído um vector cosmídeo lançadeira que pode ser usado como um vector lançadeira para a transformação de Schwanniomyces, Saccharomyces, Escherichia coli e de Schizosaochromyces pombe.

De acordo com um modo de concretização da presente invenção, a levedura da espécie Schwanniomyces castellài actua como uma dadora para a elonagem dos genes de oC-amilase e/ ou de glucoamilase. A levedura Saccharomyces cerevisiae actua

como uma levedura hospedeira que é capaz de expressar os genes mencionados para as enzimas amilolíticas depois de ter recebido os genes clonados adaptados para expressão por processos de transformação e que também é capaz de segregar os produtos dos genes.

Como resultado da manipulação genética é pos sível adicionalmente uma superprodução das enzimas amilolíticas na levedura Schwanniomyces alluvius. Esta superprodução de enzi mas amilolíticas em estirpes de Schwanniomyces é de grande vantagem para a produção de enzimas como estas, que, depois da sua recuperação de modo conhecido, podem ainda ser usadas como ante riormente descrito em processos de fermentação nos quais é ainda necessário adicionar separadamente as enzimas amilolíticas.

Os novos vectores de Schwanniomyces regulam a função de replicação e de manutenção em Schwanniomyc es. Esta sequência de replicação (SwARSl) isolada de ADN cromossomal de Schwanniomyces é responsável pela replicação autónuma em Schwannimyces e pela transformação desta levedura. 0 elemento SwARSl é também funcional em Saccharomyces cerevisiae e por essa razão provoca uma transformação de alta frequência de mutantes de Saccharomyces cerevisiae com o plasmídeo SwARSl.

Um representante adequado de vectores de Schwanniomyces é o vector pCJD5-l, um plasmídeo híbrido composto pela sequência cos (coesiva) do bacteriéfagoX , pela sequên cia pBR322 e pelo gene TRP5 de Saccharomyces cerevisiae, usado como uma marca selectiva.

Este plasmídeo é um novo vector cosmídeo lançadeira de Saccharomyces cerevisiae - Schwanniomyces alluvius - Escherichia coli com sítios de clonagem adequados para a cons trução de bancos de ADN genémico.

A presente invenção proporciona além disso, um novo processo de transformação simples e rápido para as leve duras Schwanniomyces alluvius, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Kluyveromyces lactis.

Usando o vector e o sistema de transformação acima referido é possível conseguir uma nova variedade de levedura geneticamente modificada da espécie Saccharomyces cerevisiae que é capaz de sintetizar amilases em cultura para produção em massa.

Uma consequência desta produção em massa es tá no uso desta estirpe modificada de Saccharomyces cerevisiae em processos de converção aeróbicos e anaerébicos do amido para a produção de biomassa de levedura, etanol e COg.

Em conformidade com esta invenção sao consje guidas novas sequências de ÂJ)N que levam à expressão e à secreção de proteínas em Saccharomyces cerevisiae, Schwanniomyces alluvius, Schizosaccharomyees pombe e em Kluyveromyces lactis, uma vez que as novas sequências de ADN contêm novos sinais de secreção que permitem a secreção nas leveduras referidas.

Além disso proporcionam-se sequências pelas novas sequências de ADN que permitem regular a expressão de genes.

Outro objectivo da presente invenção consis te na preparação de um vector sem qualquer sequência de E, coli para a integração dos genes da amilase no genoma de Saccharomyces cerevisiae.

Descrição Detalhada da Presente invenção

Seguidamente, é dada uma descrição mais detalhada de todos os aspectos da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1:

As Alinhamento do plasmideo pYcl-αζ derivado pela inserção de um fragmento de 5 kb de ADN de S. castellii que con têm o gene de oC-amilase, no cosmídeo pYcl.

Bs Mapa de restrição do fragmento clonado de EcoRI de S. castellii.

C: Os fragmentos (1, 2 e 3) subclonados no plasmideo pJDB2O7 não conduzem a uma expressão funcional do gene de ^-amilase em transformantes de S. cerevisiae GRF18

D; Estratégia de sequenciação:

Para a sequenciação de acordo com Maxam e Gilbert (1980) os fragmentos EcoRl/Sall foram marcados em 3’ com ^J P-dTTP. A orientação e a extenção da sequência estão indicadas por flechas.

Figura 2:

A sequência de nucleótidos da extremidade 5' do gene estrutural de «C-amilase e da respectiva região de flanco 5’.

Figura .3;

Sequência de ácidos aminados de 5 peptideos isolados por tripsina da glucoamilase.

Figura 4:

Actividade segregada da oc-amilase dos trans formantes em diferentes fases de crescimento.

As células foram cultivadas de um dia para 0 outro em pré-culturas com 0,67$ de YNB e 4$ de glucose. Depois de lavar as células com 0 meio de diferentes culturas prin cipais, as culturas principais foram inoculadas até uma Ε.Ο.^θθ do 0,2. As culturas principais (1 litro de meio YNB com as fontes de carbono dadas em balães Fembach) de transformantes de

S. alluvius NGA23 foram tamponizados com tampão de fosfato de sódio 0,2 M a pH 6,2 e os transformantes de S. cerevisiae MC34 com tampão de citrato 0,1 M a pH 6,2, As culturas foram incubadas à temperatura de 30°C agitando constantemente (2 Hertz) num agitador longitudinal. As medidas da actividade da cfc-amilase e da concentração da glucose no sobrenadante da cultura foram determinadas como descrito. Para mais informações, ver especifica ção,

Figura 5:

Cromatografia por permuta de iões FPLC numa coluna de Mono Q para a separação da proteína da eÇ-amilase a par tir do meio concentrado extracelular de S. cerevisiae MC34 trans formada com pYcl-K.

Usando um tampão de Tris-Cl 10 mM a pH 7,5, a «C-amilase foi purificada por um gradiente de NaCl aumentado até aproximadamente 300 mM NaCl.

as A₂ij4 nm b: % de tampão B

Tampão A: Tris-Cl 10 mM, pH 7,5

Tampão B: Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, 2M NaCl

Figura 6:

Análise da proteína da ct-amilase purificada do meio extracelular de S. cerevisiae MC34 transformada com o plasmídeo pYcl-<por SDS-PAGE.

Pista a:<-amilase purificada

Pista b: proteínas de peso molecular padrão miosina de músculo de coelho (205 kd); β-galactosidase de E. coli (116 kd); fosforilase b de músculo de coelho (97 kd); albumina de bovi no (66 kd); albumina de ovo (45 kd); anidra se carbónica de eritróeitos de bovino (29 kd).

Figura 7:

Cromatografia de camada fina dos produtos da hidrólise do amido.

- 10 A actividade da «ζ-amilase de sobrenadantes de culturas em amido solúvel depois de 2 horas a 40° C foi carac terizada adicionalmente e determinada por cromatografia em camada fina dos produtos de reacção usando Kieselgel 60 da Merck. A cromatografia foi feita com um sistema de solventes acetona - i sopropanol - ácido láctico 0,1 M 2:2íl. 0 cromatograma foi reve lado usando naftorresorcinol como descrito por Touchstone e Dobbins (1978).

Figura 8:

Construção de plasmídeos de S. alluvius A aj 0 plasmídeo YRp7HIS4, que foi isolado de um banco genámico Sau3A de ADN de S. castellii no pias mídeo YRp7 (Struhl et al., 1979) pela complementação da mutação his4-519 de S. cerevisiae AH22, foi digerido com BamHl e Ciai e ligado de novo. Um dos plasmídeos resultantes (YpRHIS4) contém um fragmento de 1,5 kb BamHl/Clal proveniente da região his4 de S, oastellii em YRp7.

b; A supressão do fragmento de 1,45 kb ARS1-TRP1-EcoRI do plasmídeo YpRHIS4.

c: A inserção do fragmento de 5 kb AMY-EcoRI no plasmídeo pBRSWARSl.

dí 0 isolamento do fragmento de 3,2 kb TRP5-NamHI do plasmídeo pYASl por electroforese em gel preparativa.

e: A inserção de fragmento de 3,2 kb TRP5-BamHIBamHI nos plasmídeos YpRHIS4, pBRSwARSl e pBRSwARSl-vC .

B Os plasmídeos YRp7TRP5-A e B foram construídos por inserção dos fragmentos de 3,2 kb TRP5-BamHI em YRp7· Foram obtidos plasmídeos com as duas orientações (-A e -B) do fragmento.

C Os plasmídeos pEK2TRP5-A e -B foram construídos por inserção do fragmento de 3,2 kb TRP5-BamHI de pYASl no vector pEK2 de K. lactis nas duas orientações possíveis (-A e -B).

Figura 9

deo YRpJD2 em

A

B

C

D

Pistas aPistas dFigura 10?

plasmideos em

A

A estimativa do número de cópias do plasmíS. alluvius NGA23 e em S. cerevisiae X3656 2D.

plasmídeo corado com brometo de etídeo e o ADN de levedura minilisado separados num gel de agarose a 0,7%.

Autorradiograma após análise de mancha de Southem e da hibridaçao com translação de posição de encaixe do ADN de YRpJDl (48 horas de exposi ção a -70°C).

Autorradiograma das pistas j-q depois de 312 horas de exposição a -70 C.

Mapa da hibridação da sonda YRpJDl (linha fina: pBR322; caixas abertas, ADN de S. cerevisiae; caixa preta, ADN de S. castellii).

•c, plasmideos de comparação; a: YRpJDl EcoRI b? YRpJDl não cortado e? YRpJD2 não cortado •g, ADN de levedura minilisado; d-f, ADN de S. alluvius NGA23: trans formantes YRpJD2; d e f, cortados com EcoRI; e e g, não cortados; hei, NGA23s ADN de NGA23 cortado com EcoRI (h) e não cortado (i); j e k, ADN de NGA23 não transformado cortado com EcoRI (j) e não cortado (k);

e m, ADN de um transformante de S. cerevisiae X3Ó56 2D cortado com EcoRI (1) e não cortado (m); n-q, ADN de X3656 2D não transformado cortado com EcoRI (n e p) e não cortado (o e q)·

Estimativa do número de cópias diferentes S, alluvius NGA23.

Fragmentos de plasmideos de comparação EcoRI e de ADN de levedura minilisado corados com brome

_ to de etídeo depois de separação num gel de agarose a 0,7%.

B Autorradiograma depois de análise de mancha de

Southem e a hibridação com translação de posição de encaixe de ADN de YRp7HIS4 (15 horas de exposição a -70°C).

C Autorradiograma após 6 horas (pistas a-d) e após

125 horas (pistas e-p) de exposição a -70°C respectivamente (bandas débeis nas pistas j e m e a posição das bandas dos locais HIS4 dos cromossomas está indicada por flexas).

i

D Esquema das homologias de YRpJDl e da região dos cromossomas de Schwanniomyces HIS4 para a hibridação da sonda YRp7HIS4.

Pistas a-e, plasmídeos de comparação: a, pEK2TRp5-A; b, YRp7TRP5-A; c, pYASl; d, YRpJDl; pista e, ADN de S. alluvius NGA23 não transformada; pista f, ADN de S. castellii 26076 não transformada; pistas g-p, ADN de S. alluvius NGA23 transformada com : g, YRpJDl; h e j, YRp7TRP5-A; K e l,YRp7TRP5-B; m, PEK2TRP5-A; n, pEK2TRP5-B; o e p, pYASl (o ADN na pista o não está cortado).

| Figura 11:

Comparação do número de cópias de plasmídeos SWARS1 e ARS1 em S. alluvius e em S. cerevisiae.

A Fragmentos EcoRI dos plasmídeos de comparação e do ADN de levedura minilisado corados com brome to de etídio depois de separação num gel de agarose a 0,7%.

B Autorradiograma depois de análise por mancha de

Southem e hibridação com translação de posição de encaixe de ADN de YRpJD2-c<. A posição da ban da de 2,0 kb do local cromossomal de S, cerevi- • siae TRP5 está indicada por uma flexa.

• pistas a-d, plasmídeos de comparação: a, pCJD5-l, b, YRpJDl; d,

YRp7TRP5-A;

pistas e-h, ADN de S. alluvius NJD1; e, f ei, não transformados; g, transformado com pCJD5-l; h, transformado com YRpJD2;

pistas n-r, ADN de S, cerevisiae X3656 2D, transformado com: n, YRpJDa-cC; o, YRpJDl; p, YRpJDl; q, YRp7TRP5-A; pista r, não transformado.

Figura 12:

Marcação in vivo de proteínas extracelulares de transformantes de S. alluvius NGA23.

Os transformantes foram cultivados sob condições de repressão e de indução (ver Figuras 4a, b e c) numa 35 cultura de 1 ml depois da adição de 100 μΰί de S-metionina (800 Ci/mmol). Depois de incubação a 30°C durante diversos períodos (18, 22, 28, 43 e 90 horas) analizaram-se 30 jil do sobre nadante isento de células por SDS-PAGE e por autorradiografia.

a, NGA23:YRpJD2 em YNB, 2% de glucose (reprimida);

b, NGA23:YRpJD2 em YNB, 2% de maltose (induzida);

c, NGA23:YRpJD2-c<em YNB, 2% de glucose (reprimida);

d, NGA23:YRpJD2-«Qem YNB, 2% de maltose (induzida).

As posições das proteínas de peso molecular padrão (ver Figura 6) estão indicadas por flexas.

Figura 13:

Mapa de restrição e análises de restrição dos cosmídeos pCJD5-l e pCJD-2.

A Mapa de restrição

B Fragmentos de restrição separados num gel de agarose a 0,7% pista a, ADN lambda cortado com EcoRI e HindIII; pista q, ADN lambda cortado com HindIII;

da direita para a esquerda:

plasmideos YRpJD2, pCJD5-l e pCJD5-2: pistas b, c, d, cortados com EcoRI;

pistas h, i, J, cortados com BamHI;

pistas n, o, p, cortados com PvuII.

Figura 14:

Mapa de restrição do plasmídeo pKARS2-< · fragmento de 5 kb AMY-EcoRI do plasmídeo pYcl-<s(,foi inserido no sítio singular EcoRI do plasmídeo pKARS2-d.

Figura 15:

A

B

Figura 16:

peraturas.

Mapa de restrição de dois fragmentos subclonados que contêm o gene funcional da glucoamilase (AMG).

Os fragmentos AMG foram subclonados no vector de S. alluvius - S. cerevisiae pOJD5-l resultando em pCJD5-AMGl e pCJD5~AMG2, no vector de S, cerevisiae - S. pombe pJDB207 resultando em pJDB207-AMG1 e pJDB207-AMG2, e no vector de K. lactis pEK2, resultando em pEK2-AMG2.

Inactivação da glucoamilase a diferentes tem

Figura 17:

A sequência de nucleótidos do gene estrutural da glucoamilase e regiões de flanco.

Quadro I

Comparação da utilização preferida de codães em S. cerevisiae e Schwanniomyces castellii.

ácido aminado	codães preferidos em S. cerevisiae	codães preferidos em S. cestellii
ala	GCU,	GCC	GCU, GCG
ser	UCU,	UCC	UCA, UCC, AGC, UCU, AGU (não e xiste preferência nitidáj
thr	ACU,	ACC	ACU, ACC, ACA
vai	GUU,	GUC	GUU; GUA, GUC, GUG
ile	AUU, GAC	AUC	AUU; AUC, AUA, AAU (não gxiste, preferência nítida )
asp		GAU, GAC
phe	UUC		UUC, UUU (não existe, preferên-. cia nítida )
tyr	UAC		UAU, UAC
cys	UGU		UGU
asn	AAC		AAU, AAC
his	CAC		CAU, CAC
giu	GAA		GAA, GAG
giy	GGU		GGU, GGA
gin	CAA		CAA
lys	AAG		AAA
pro	CCA		CCA, CCU
leu	UUG		UUG, UUA, CUU
arg	AGA		AGA

Quadro II

Frequência de transformação obtidas com o método modificado para estirpes de diferentes géneros de levedura.

Espécie	Estirpe	Plasmídeo	Replicador	Transforman- Marcador tes por de ADN
S. alluvius	NGA19	YRpJDl	SwARSl	TRP5	300 -	1000
S. alluvius	NGA23	YRpJDl	SwARSl	TRP5	300 -	1000
S. alluvius	HTE36	YRpJDl	SwARSl	TRP5	300 -	1000
S. cerevisiae	AH22	YRp7HIS4	ARS1	HIS4	500 -	2000
S. cerevisiae	X3656	YRpJDl	ARS1	TRP5	500 -	2000
S. cerevisiae	X3656	pYASl	2pm	TRP5	1000 -	10000
S. cerevisiae	GRF18	pYcl	2pm	HIS3	200 -	1000
K. lactis	SD11	pEK2	KARS2	TRP1	500 -	1000
H. polymorpha	LR9	pHARSl	HARS1	URA3	500 -	1500
S. pombe	leul-32	PJDB207	2pm	LEU 2	1 -	10

Quadro III

Frequências de transformação, estabilidades mitóticas e números de cópias 'gll S¹» O «H d •r4 ri ® ri o do ft σΉ o m d 04 d H Ri <5 -rl S d ri fc RiH SEM

I I k®\O

S O o ri ® ri O ft d rd to p d id

Ο ® ri d ® â o ... . '8 -rl d*· SCJ RiO ®oln s áHH ® σ*ο .ia o 8

I o φ !BH Φ Φ ’

«Φ c , . _ _ .. ο'η rf tog-p ®*o|g$i d Η Φ o σ’ o+ ® ο ΛΗ ri ® em m m d o o . d ri -rl !> ο ·Η Φ Φ Ti

Ώ d â 2Í s® c . ___ ο'ρ a a >

I Sm ri o w O &'§-s o poíná <Η H *rl O EM ® s ri tiffl d Mrl si» m o

.. S rl Orl Φ O

S ω ri ® EM -P

Φ rçá £ „ o Φ·Η c .. fyOrd •rlftO ri φ?ω O k O» o Φ >d

d rd

PM

	o	O	CM
CO	rd	H	m	tn	d-	H
1	1	1	1	1	1	1
CO	CM	H	CM	CM	CM	O

CM			m	in
•	rd		•	•		O
O	1	rd	o	o		rd
1	CM	1	1	1	1	|
rd	•	CM	CM	CM	CM	in
•	O	•	•	•
O		O	o	o
O	. rd	rd	rd	rd	O	O
					rd	CM
					1	1
					m	O
						rd

CO	O	O	cn	H	O	in
	rd	CM		H	CH	σ»
		1			|	1
		o			in	tn
		rd			b-	00

CM
•	o	O
o	CM	CM
	1	1
H	ITl	IÍ3
•
o

O

CJ

I m

o

CM

I !Λ

O O rd

I o in o o rd

I o

co

rd
			CM	CM		ra
			OT	in		M
			M	M
	rd	id	<í	<j	ri
I	OT	ra	M	M	3	ra
		tó	•t		CM	*
	«s		rd	rd		rd
			ra	CQ		ra
				W		ffi
			<ç	«>5		<5
m
1	<5	pq	*4	pq
H	1	|	I	1
Z—>	in	m	in	in
in	g	&	g	g
&	EM	EM	EM	EM		rd
•P	1	1	1	1	rd	P
	O	b-	CM	CM	M	•3)
Φ	Ri	Ri	M	W		Rl
H		Pm	w			ti
Ri	£	Fm	Ri	Ri	Ri

Quadro IV

Frequências de transformação, estabilidades mitóticas e número médio de cópias dos plasmideos YRp7-TRp5, YRpJDl e YRpJD2 em S. alluvius NGA23 e S. cerevisiae Σ3656.

Plasmídeo Origem Transformantes Perda de plaspor ug de ADN mídeos depois de 15 gerações em meio não se lectivo

S·all· S·c er· S·all· S·cer· NGA23 Σ3656 NGA23 Σ3656

Número médio de cópias por célula

S · all · S · c er .

NGA23 Σ3656

YRp7-TEE5-A ARS1 5-10 500-2000 99 $ 80-90 %

YEpJDl

YEpJD2 _Aísi 3QO-1000500-2000 80-90% 80-90 % SwARSl

SwARSl 300-1000 500-2000 80-90$ 80-90 %

0.2-1

5-10

5-10

5-10

5-10

5-10

As estirpes de levedura usadas foram as seguintes;

Schwanniomyces oastellii ATCC 26076. (DSM 3794)

Schwanniomyces alluvius NGA23 e NGS1. (DSM 3792 e 3793)

Kluyveromyces lactis SD11. (DSM 3795)

Schizosaccharomyces pombe leul-32, his5-3O3. (DSM 3796)

Saocharomyces cerevisiae GEF18 leu2-3, leu2-112, his3-ll» his3-15.

(DSM 3797)

Saccharomyces cerevisiae AH22a leu2-3, leu2-112, his4-519, canl.

(DSM 3820)

Saocharomyces cerevisiae X3656 2D a, ade, arg4-l, his6, leul, trp5.

(DSM 3798)

Saccharomyces cerevisiae his3 Mall⁺ (DSM 3799)

As estirpes de Escherichia coli usadas foram as seguintes:

Escherichia coli, HB101 , hsd S20, r-g” m-θ, recA13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Sm^r), xyl5, mtl-1, supE44,X~ (DSM 3788)

Escherichia coli JA221, recA-1, leuB6, trpE5, hsdR”, hsdM⁺, lacYl. (DSM 3789)

Escherichia coli BHB2688, N205 recA~ /imm^^, clts, b2, red^, Eam4, Sam7_7//L(DSM 3790)

Escherichia coli BHB2690, N2O5 recA /“imm^^, clts, b2, red^m, Daml5, Sam7_7/%(DSM 3791)

Os plasmídeos e cosmídeos usados sao os seguintes;

Cosmídeo pYCl.

Plasmídeo pEK2.

_ Plasmídeo YRP7. Plasmídeo pJDB2O7.

Sempre que sejam essenciais para levar a efeito a presente invenção, os microorganismos referidos foram depositados na Deutsche Sammlung fúr Mokroorganismen (DSM).

Um meio completo usado para estirpes de levedura foi o meio YEPD (bactopeptona a 2 %, extracto de levedura a 1 % e glucose a 2 0 meio mínimo continha 2 % de glucose e 0,6 % de base de azoto de levedura sem ácidos amonados (Difco) I suplamentado com os ácidos aminados apropriados.

As células de Schwanniomyces foram cultivadas em amido solúvel a 2 % em vez de glucose.

As estirpes de levedura que fermentam o ami do foram seleccionadas no que respeita à produção de ofe*amilase e à formação de halo em placas de meio mínimo YNB contendo 1 % de glucose, 1 % de amido solúvel e 2 % de agar. Os halos foram revelados por incubação das placas numa câmara saturada com iodo durante alguns segundos.

As células bacterianas foram cultivadas em | meio LB (extracto de levedura a 0,5 %, triptona a 1 % e NaCl a 1 %). Quando necessário, adicionou-se ampicilina até uma concen tração final de 150 pg por ml e tetraciclina até 20 p.g, respectivamente.

A transformação de bactérias foi efectuada como descrito por R. W. Davis et al. (1980).

As transformações de leveduras foram levadas a efeito de acordo com o procedimento descrito na presente memória descritiva.

Na presente memória descritiva é feita refe rência a várias publicações pelo nome do autor e pela data de ’ publicação entre parêntesis. As citações integrais destas refe21

F

rências pode ser encontrada no fim da memória descritiva sob a forma dum anexo contendo a lista destas sob ordem alfabética imediatamente antes das reivindicações. As descrições destas publicações são incorporadas sob forma integral por referência na presente especificação de modo a descrever completamente o estado da técnica tal como este é conhecido dos respectivos peritos à data da invenção aqui descrita e reivindicada.

ADN plasmídico foi purificado quer por centrifugação em gradientes de CsOl (Maniatis et al., 1982) ou por extracção rápida alcalina de ADN plasmídico como descrita por Bimboim e Doly (1979)·

Os extractos brutos de levedura foram prepa rados pelo método de Schatz (1979).

Os minilisados de levedura foram preparados pelo método de Sherman et al. (19θ3).

Os fragmentos de ADN foram isolados pelo pro cedimento de agarose de baixo ponto de fusão como definido por Gafner et al. (1983).

Métodos utilizados para levar a cabo a invenção

A sequência do ADN foi levada a cabo como descrito por Maxam e Gilbert (1980). 0 ADN foi submetido atrans lacçao de encaixa de acordo com Rigby et al. (1977).

A hibridação de Southern foi realizada como descrito por Souther (1975).

As endonucleases de restrição, a ligase de ADN T4, a polimerase I de E. coli e a polimerase de Klenow podem ser adquiridas a Boehringer (Manheim) e podem ser utilizadas como especificado pelos fornecedores. dNTPs e a (^^S)-metionina podem ser comprados, por exemplo, a Amersham. A zimoli— ase 5000 e a zimoliase 60 000 podem ser obtidos de Kirin Brew (Japão). Os filtros de nitrocelulose podem ser obtidos de Schlei cher e Schull.

Ο banco de cosmídeos de ADN de Schwanniomyces castellii foi construído no vector lançadeira do Saccharomyces cerevisiae pYcl (Hohn e Hinnen, 1980) e no vector lançadeira do Saccharomyces cerevisiae - Schwaniomyces alluvius - E. coli pCJD5-l, construído de acordo com a presente invenção como descrito por Ish Horowicz e Burke (1981).

A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford (1976) utilizando albumina de soro de bovino como padrão. A proteína foi separada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS de acordo com 0 procedimento de Laemmli (1970).

A actividade da amilase foi medida cinética mente com um teste enzimático de coloração, por exemplo, teste Mercko cfc-amilase, da Merck. A taxa de formação de 2-cloro-4-nitrofenol é determinada por fotometria a 405 nm a 37° C em 0,1 M de actividade de fosfato de potássio no material da amostra.

As unidades enzimáticas (U) sao definidas como a quantidade de enzimas que catalisam a formação de 1 pmol de 2-cloro-4-nitrofenol x min””·¹· a 37° 0.

A actividade de glucoamilase foi medida por um método de análise de paragem: Depois da incubação da amostra em amido solúvel a 10 $ em KHgPO^-NaOH 0,05 M (pH 5,0) a 50° C. A quantidade de glucose produzida é determinada pelo método de glucose-desidrogenase (sistema de glucose Merck). A quantidade de NADH formada é proporcional à concentração de glucose.

A unidade enzimãtica (U) é definida como a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 jomol de gluco se min*·¹· a 50° C.

A K-amilase isolada do sobrenadante de cultura de Schwanniomyces castellii forma um halo em placas de agai contendo amido solúvel depois de coradas com iodo. A partir des tas observações 0 esquema para clonar a^-amilase foi baseado na assumção de que células as de Saccharomyces cerevisiae, que não formam qualquer halo, podem ser convertidas em células que formam halo quando um vector de plasmideo contendo 0 gene para uma enzima de hidrólise de amido, nomeadamente a oc-amilase, está presente. Para clonar o gene da ®t-amilase foi construído um ban co de cosmídeos recombinantes a partir de ADN genómico de Schwanniomyces castellii ATCC 26076. Utilizando a técnica de clonagem de cosmídeos descrita acima pode ser gerado um banco genómi co de marca de 17 000 clones independentes no vactor pYcl (Hohn e Hinen, 1980). 0 banco de cosmídeos foi seleccionado em relação a inserções contendo o gene da oç-amilase por transformação de Saccharomyces cerevisiae GRF18 para prototrofia de histidina e verificação para a capacidade de degradação do amido.

Foram seleccionados aproximadamente 4 500 transformantes de GRF 18 com base na respectiva capacidade para formar halos após coloração com iodo em placas contendo leucina, glucose e amido solúvel. Foram obtidos 13 transformantes que for mam halos. Destes transformantes foi isolado o ADN total de levedura e utilizado para transformar células de E. coli JA221 com selecção com base na resistência à ampicilina. Foram obtidos dois cosmídeos recombinantes diferentes contendo um fragmento de 32 kb e um fragmento de 39 kb de ADN de Schwanniomyces castellii respectivamente. Estes cosmídeos recombinantes foram reintroduzi dos em GRF18. Os transformantes mostraram o fenótipo His* e de formação de halo. Num teste de estabilidade mitótica (Beggs, 1978) ambos os marcadores cosmídeos, 0 HIS3 e a função de formação de halo, foram segregados para 0 meio simultâneamente, in dicando que ambos os genes estavam presentes no cosmídeo.

cosmídeo mais pequeno contendo a inserção de 32 kb foi utilizado para identificar a região do ADN responsável pelo fenótipo de formação de halo. Para conseguir este re sultado, 0 cosmídeo foi digerido com EcoRI, religado e transfor mado em JA221. 0 ADN de células de E. coli resistentes à ampici lina foi utilizado para transformar GRF18 com selecção para pro totrofia da histidina.

A partir de cinco transformantes formadores de halo foi isolado 0 ADN total de levedura e utilizado para transformar JA221. 0 ADN plasmídico foi isolado ods transforman tes E. coli resistentes à ampicilina. Uma análise por enzimas

de restrição revelou que cada um desses plasmídeos contém um fragnento de ADN de 5 kb EcoRI de Schwanniomyces castellii no vector original pYcl. Este plasmídeo é denominado pYcl-oC (Fig. IA). O mapa de restrição do fragmento de EcoRI de 5 kb é apresentado na Figura IB.

Os fragmentos 1, 2 e 3 (Fig. IC), subclonados no vector p JDB2O7 (Beggs, 1981) e transformados em Saccharomyces cerevisiae GRF18 não resultaram em transformantes que segregam «C-amilase e portanto não contém o gene funcional. Por isso pode ser assumido que o gene de <-amilase funcional abrange os sítios HindIII, BglII.

Tendo em conta que o peso molecular da ct-amilase é aproximadamente de 61 000 daltons (Wilson et al.,1982), pode-se prever que um fragmento de ADN de aproximadamente 2 kb deverá conter o gene funcional.

Para verificar esta hipótese, foi realizada umaenálise de sequênciação do ADN de acordo com Maxam e Gilbert (1980). Para a sequênciação ambos os fragmentos EcoRI-SalI dos fragmentos EcoRI de 5 kb foram marcados por isótopos radioactivos no sítio Sall (Fig. 10). A análise de sequênciação de ADN revelou uma região não codificadora 5' seguida por um quadro de leitura livre abrangendo 0 sítio Sall, A sequência do ADN é apresentado na Fig. 2.

Julga-se que a caixa TATA (Gannon et al., 1979) normalmente localizada 25 a 32 pb a montante e a caixa CAAT (Beoist et al., 1980), que tinha sido encontrada 80 pb a montante do ponto de início de transcrição, são importantes para o início de transcrição. Enquanto a caixa TATA está presente em quase todos os genes examinados, a caixa CAAT não está sempre presente.

Na região de regulação do gene da Mramilase existe uma caixa TATA perfeita a -89 e uma caixa OAAT a -115.

Na região 5' do gene dafif-amilase existe uma sequência CAAG na posição -7. A utilização de codões dacC-amilase é dada na Tabela 1.

Expressão do gene da C-amilase de Schwanniomyces e secreção da proteína por Saccharomyces cerevisiae

Os transformantes GRF18:pYcl-d não estão aj> tos para crescer em amido solúvel como única fonte de carbono. Seria possível mostrar que esta circunstância é devida a um defeito na utilização da maltose. Por isso o plasmídeo pYCl-< foi utilizado para transformar Saccharomyces cerevisiae MC34 (his3), tendo um fenótipo Mal* com selecção para a degradação do amido. Todos os transformantes de fototrofia para a histidina estão ajo tos para crescer em amido como única fonte de carbono e podem formar halos cercando a colónia após coloração com iodo. Para determinações da actividade çfe-amilase, cultivaram-se transformantes MC34:pYcl-<£ com selecção para prototrofia da histidina em meio YNB contendo glucose.

Durante o crescimento de Saccharomyces cerevisiae em meio YNB sem tampão o pH baixa até aproximadamente 3,5.

A <C-amilase toma-se inactiva a um pH inferior a 4 e tem um pH óptimo a cerca de 6,2 (Sills e Stewart, 1984). Por isso 0 meio foi tamponizado com tampão citrato 0,1 M a pH 6,2.

Durante 0 crescimento de Μ034!ρΥο1-ος., o ex tracto bruto e 0 meio extracelular foram analisados para detecção de actividade c(-amilase.

A actividade de «(-amilase só pode ser deteçj tada no meio de cultura extracelular e não em extractos brutos, indicando que a cC-amilase é segregada. A actividade total no meio extracelular decresce no crescimento logarítmico tardio (Fig. 4D). Esta perda de actividade enzimática só pode ser explicada por degradação proteolítica da ot-amilase, porque as actividades proteolíticas acumulam-se durante a transição da fase de crescimento logarítmico para estacionário (Ferguson et al., 1973)· No entanto a estabilidade da o&-amilase não pode ser melhorada através da adição de inibidor de protease EMSF. só se pode então concluir que a inactivação não se deve a uma serina-protease.

A actividade total da ^-amilase no meio extracelular de células de crescimento estacionário MC34ípYClem meio YEPD completo foi significativamente mais alta em compa ração com células que cresceram em meio YNB. A explicação mais plausível é serem as actividades proteolíticas duas vezes mais altas quando se desenvolve Saccharomyces cerevisiae em ΎΝΒ em comparação com o crescimento em YEPD (Tsai et al., 1973).

Por vezes as enzimas podem ser estabilizados por adição de substrato (Katsunuma et al., 1972). Transformantes MC34:pYcl-®l que são cultivados em YNB contendo amido solúvel como fonte única de carbono não mostraram qualquer diferença no perfil da actividade da «C-amilase durante diferentes fases de crescimento em comparação com células cultivadas em glucose como fonte única de carbono, indicando que a cA-amilase não pode ser estabilizada no presente substrato.

No entanto foi observado que MC34spYcl-<A tinha um período de lactência na sua capacidade para fermentar amido devido quer a um período de indução no consumo de maltose ou provavelmente devido a acumulação dependente de tempo de οζ-a milase segregada para o meio.

A partir de investigações recentes foi possível demonstrar que o gene de ψ-amilase é também expresso e que o produto do gene segregado por Schizosaccharomyces pombe e por Kluyveromyces lactis. Para este fim Schizosaccharomyces pombe foi transformado com o plasmídeo pKARS2-d. (Fig. 14a). Os transformantes anteriores podiam formar halos em placas de amido após coloração com iodo. A quantificação do sistema de tf-ami lase através destas duas estirpes de leveduras transformadas é o objecto da presente investigação.

Além disso, o gene da tf-amilase foi clonado numa estirpe de levedura da cerveja de tipo selvagem de fermentação de fundo de Saccharomyces cerevisiae var. carlbergensis por transformação com o plasmídeo contendo o gene o(-amilase (pYCl-^) β selecção para actividade de <-amilase por formação de halo em placas contendo amido solúvel.

- 27 Γ

Isolamento e caracterização das enzimas^-amilase e glucoamilase de Schwanniomyces castellii

Ambas as enzimas foram isoladas do meio duma cultura contínua de Schwanniomyces castellii

Meio: YNB + 1% de amido; PO^ 20 mM; pH 6,3.

Condições: temp. = 30° C; P02 = 70 %; D = 0,15 h¹.

As células de levedura foram separados do meio por ultrafiltração (UF) e o filtrado foi concentrado com uma membrana de UF com uma dimensão de separação de 10 000 D. 0 filtrado concentrado foi carregado numa coluna de DEAE-Sephacel em tampão de fosfato 20 mM a pH 5,6.

A glucoamilase foi eluída da coluna entre 150 e 18o mM de NaCl e a oC-amilase foi eluída entre 180 e 250 mM de NaCl. As fracções contendo a actividade enzimática foram recolhidas, dialisadas contra tampão de acetato de amónia 100 mM a pH 6,5 e concentradas por filtração através de Amicon ΪΜ 10.

Melhorou-se a purificação de aliquotas de + 4 mg de cada proteína utilizando cromatografia de HPLC de per meação de gel numa coluna TSK 2000 SW utilizando tampão de acetato de amónio 100 mM a pH 6,5.

A homogeneidade das enzimas purificadas des ta maneira foi verificada por análise de SDS-PAGE, resultando numa banda de proteina simples para cada enzima.

Preparação de fracções de peptídeo de glucoamilase

Incubou-se glucoamilase (50 mg) com tripsina (1 mg) durante 24 h a 37° C em tampão de acetato de amónio 50 mM a pH 6,5, resultando em + 30 % de quebra de enzima. Os peptídeos foram separados por meio de HPLC numa coluna TSK 2000 SW e a purificação continuada por RPHPLC utilizando colunas C18 e C8. A eluição foi levada a cabo com um sistema de gradiente de acetonitrilo de 0 a 100 %. Determinou-se a sequência de ácidos aminados de 5 peptídeos (ver Fig. 3).

- 28 Caracterização da glucoamilase

P.M.

pH óptimo temp. óptima Km:

Pl glicosilado

120 000 D

5,0

50° C

1,0 - 1,5 % dextrina (Serva)

3,5 actividade reprimida por glucose temp. de inactivação - ver Fig. 16.

Caracterização da Ol-amilase

P.M.

pH óptimo temp. óptima Km:

000 D

6,0

37° C

0,004 - 0,07 % amido solúvel

Isolamento da ^-amilase segregada por Saccharomyces cerevisiae

A actividade máxima que foi possível medir de tf-amilase segregada por transformantes MC34ípYcl crescendo em meio YNB pode ser obtida de células da fase logarítmica precoce (Fig. 4D). Ê vantajoso isolar a «l-amilase de meio YNB extracelular em vez de meio complexo contendo extracto de levedura e bactopeptona, porque a actividade inicial específica (acti vidade de ^-amilase/índice de proteína) é significativamente mais alta em YNB do que em YEPD.

Além disso, uma vez que a quantidade de tfL-amilase está directamente relacionada com a quantidade de células de levedura em desenvolvimento activo, usou-se um crescimento gradual de MC34:pYcl-«( em YNB (selecção do plasmídeo), YEPD (condições óptimas de crescimento) e finalmente YNB (secre ção de of-amilase a partir de uma alta quantidade de células em crescimento activo) para o isolamento da «(-amilase segregada. Em pormenor, os transformantes foram desenvolvidos em meio YNB contendo glucose. Quando se atingiu uma densidade óptica de aproximadamente 4 a 600 nm (fase de crescimento logarítmico tar dio) as células foram separadas por centrifugação e ressuspen- 29 sas em YEPD pré-aquecido (30° C) até uma ODg_oo final de 7,5.

Após duas horas de crescimento a 30° 0, as células foram sedimentadas e ressuspensas no mesmo volume de YNB pré-aquecido (30° C) contendo glucose e tampão de citrato 0,1 M a pH 6,2. Após incubação de 4 horas a 30° 0 (a densidade óptica a 600 nm atingiu um valor de 17), a K-amilase foi purifi cada do meio extracelular concentrado por meio de cromatografia de permuta de iões FPLC usando uma coluna Mono Q (Pharmacia). A proteína tf-amilase foi eluída em Tris-Cl 10 mM a pH 7,5 e a 300 mM de NaCl utilizando um gradiente crescente de NaCl (Fig. 5).

A fracção de proteína activa foi concentrada por liofilização e analisada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (Fig. 6). A presença de uma só banda com um pe so molecular de cerca de 55 000 D mostrou que a proteína -amilase foi altamente purificada por este procedimento.

Para a caracterização das enzimas, foram analisados os produtos de degradação do amido pela pc-amilase iso lada através de cromatografia em camada fina (Fig. 7). Os produ tos da hidrólise do amido são maltose e quantidades maiores de maltotriose e oligosacarídeos superiores. A glucose não é produ zida em quantidades detectáveis. Isto está de acordo com a observação acima mencionada de que transformantes GRF18(Mal-): pYc-^não estão aptos para crescer em amido como fonte única de carbono.

Transformação de Schwanniomyces alluvius

Um dos pré-requisitos para o estabelecimento de um sistema de transformação é a disponibilidade de um mutante apropriado, o qual pode ser funcionalmente complementado por um gene clonado.

Foram analisados muitos mutantes de Schwanniomyces alluvius auxotróficos de triptofanos pelo seu defeito na via biossintética do Jj-trytofano. Os mutantes foram ensaiados para determinação de deficiência na última fase da biossitese do L-triptofano, nomeadamente a reacção de condensação de índole e L-serina, a qual no Saccharomyces cerevisiae e catalisada pela

triptofano-sintetase.

Um defeito nesta última fase conduz a uma a cumulação de indol (Manney et al., 1986). 0 mutante auxotrófico de triptofano NGA23 acumula indol quando cultivado em meio YNB. Além disso, quando comparado com outros auxotrofos de triptofano, o mutante NGA23 não pode crescer em YNB contendo indol. Con clui-se por isso que o mutante NGA23 tem uma mutação no gene sintetase de triptofano. NGA23 mostra uma baixa taxa de reversão —8 (10^- ) e é, portanto, apropriado para estudos complementares com o gene TRP5 de Saccharomyces cerevisiae clonado (Carbon et al., 1977) que codifica para a sintetase de triptofano (Walz et al., 197θί Zalkin et al., 1982). A intenção inicial era transformar NGA23 por integração.

A experiência de transformação foi baseada na hipótese de que não existe qualquer homologia extensiva entre o gene TRP5 de Saccharomyces cerevisiae e o gene de sinteta se de triptofano de Schwanniomyces alluvius mutado, como se verifica por hibridaçao de Southem de ADN de pYASl submetido a translacção de posição de encaixe (Strasser, 1982) para ADN cro mossomal de Schwanniomyces alluvius.

A partir de um banco parcial Sau3A de ADN de Schwanniomyces em YRP7, foi clonado um fragmento de ADN de kb, dando origem a um plasmídeo YRP7HIS4 complementando a mutação his4 da estirpe Saccharomyces cerevisiae AH22 (Fig. 8).

Assumiu-se que um fragmento BamHI-Clal de 1,5 kb desta região HISA do Schwanniomyces castellii deveria ter homologia suficiente para dirigir a integração para 0 geno ma de Schwanniomyces alluvius NGA23 por recombinação homóloga. Por esse motivo 0 plasmídeo YRpJD2 foi construído (Fig. 8) con tendo 0 gene Trp5 de Saccharomyces cerevisiae como um marcador seleccionável e o fragmento BamHI-Clal de 1,5 kb.

Foi usado YRpJD2 para transformar NGA23 pe método do protoplasto descrito por Beggs (1978) seleccionan do para prototrofia de triptofano em placas de meio YNB. Foram ' obtidos cinco transformantes por pg de ADN plasmídico.

Parecia improvável que esta surpreendente alta frequência de transformação fosse devida a acontecimentos de integração, tendo em conta que o plasmídeo não tinha sido li nearizado antes da transformação, o que teria aumentado a proba bilidade de integração (OrWeaver et al., 1981) e que a frequên cia de regeneração de Schwanniomyces usando 0 método do protoplasto era mais baixa que 0,1 %.

A transformação de NGA com YRpJD2 é baseado na replicação autónoma como se pode concluir pela instabilidade do fenótipo Trp+após crescimento dos transformantes sob condições não-selectivas em meio YEPD. Após 15 gerações, 80 a 90 % das células tinham perdido a capacidade de crescer em meio selectivo.

A replicação autónoma foi verificada através da transformação de células E. coli com minilisados de leve dura e nova transformação de Schwanniomyces NGA23. Além disso, as análises de Southem mostraram a presença de sequências YRpJD2 originais (Fig. 9) e assim excluíram a integração do gene TRP5 como a causa de prototrofia de triptofano.

Não foi possível obter quaisquer transforman tes, excepto alguns transformantes abortivos após transformação de NGA23 com pYe (trp5) 1-53 (Walz et al., 1978), 0 qual nao con tem 0 fragmento de 1,5 kb de Schwanniomyces castellii, indicando que este fragmento de ADN de Schwanniomyces contém uma sequên cia que permite replicação autónoma do plasmídeo YRpJD2 em Schwanniomyces alluvius NGA23.

Deste modo conclui-se que 0 fragmento de ADN de 1,5 kb de Schwanniomyces castellii no vector YRpJD2 contém uma sequência de replicação autónoma, nomeadamente SwARSl.

Procedimento da transformaçao

A regeneração de células de Schwanniomyces usando 0 método protoplasto (Beggs, 1978) para transformação é aproximadamente de 0,1 %. Uma vez que 0 ritmo de regeneração ou de formação de protoplasto está directamente relacionado com a frequência de transformação, foram feitas tentativas para mudar

as condições de formação de protoplasto usando diferentes concen trações de helicase ou de zimoliase e diferentes tempos de incubação para a transformação de YRpJD2 em NGA23.

Usando helicase não foi possível obter quais quer transformantes. Só utilizando zimoliase (1 mg/ml) durante 30 min a 37° C foi possível obter 5 transformantes por pg de ADN plasmídico de YRpJD2 com um ritmo de regeneração de 0,1 Uma incubação mais curta teve como resultado um aumento da frequência de regeneração para aproximadamente 0,5 % mas não se obtiveram quaisquer transformantes.

Estas descobertas demonstram que a formação de protoplastos (e não a frequência de regeneração e por isso a degradação enzimãtica da parede de células) constitui a fase crí tica na transformação de Schwanniomyces usando o método de pro to, plasto. Por esse motivo os procedimentos de transformação descri tos por Ito et al. (1983) e Klebe et al, (1983) foram experimentados.

Ambos os procedimentos não requerem a degradação enzimatica da parede de células. Com o método de sulfato de litio de Ito et al. (1983) foi possível transformar NGA23 com o plasmídeo YRpJD2 com bons resultados, dando origem a 50 a 100 transformantes reproductivelmente por ug de ADN plasmídico de YRpJD2.

Usando o método de Klebe et al. (1983), a le vedura na fase logarítmica (10 ml) foi lavada com 5 ml de meio SBEG (sorbitol 1 M), bicina 10 mM, pH 8,35, etilenoglicol a 3 %) por centrifugação a 1000 x g durante 3 min a 22° C. Todas as incubações subsequentes foram efectuadas a 30° C. 0 sólido foi novamente suspenso em 0,2 ml de meio SBEG e depois de 5 min adicio nou-se 1 a 20 pl de ADN plasmídico. Apôs 10 min colocou-se a pre paração num congelador a -70° C durante 10 min (ou mais tempo) e em seguida descongelou-se com agitação rápida num banho de água a 37° C. Adiciounou-se 1,5 ml de PEG 1000 a 40 % purificado (Kle be et al., 1983), e bicina 200 mM a pH 8,35 (conservada no congelador); após 1 h de incubação, as células foram lavadas com 2 ml de NaCl 0,15 mM e bicina 10 mM a pH 8,35. Após centrifuga- 33 -

_ ção, o sólido foi novamente suspenso em 1 ml de NaCl 0,15 mM e bicina 10 mM a pH 8,35 e cultivado em placas com meio selectivo. Usando as condições acima descritas, o ADN plasmídico é adicionado antes de congelar as células a -70° C. No entanto seria van tajosa a possibilidade de adicionar o ADN às células congeladas imediatamente antes de descongelar a fim de ter células competen tes em qualquer instante para a transformação com qualquer pias mídeo disponível.

As tentativas para adicionar ADN de YRpJD2 a células congeladas do mutante Sohwanniomyces alluvius NGA23 foram bem sucedidas no sentido de que se obtiveram as mesmas fre quências de transformação (50 a 100 transformantes por pg) em comparação com o procedimento original acima descrito.

Klebe et al. (1983) afirmam que o PEG usado é crítico para que se obtenham transformações reprodutíveis. Etn consequência Klebe et al. levaram a cabo uma demorada preparação do PEG 1000 para obter uma eficiência de transformação óptima.

A fim de ultrapassar este procedimento, estudou-se a influência de vários PEGs da companhia Serva and Roth. Até agora as melhores eficiências de transformação foram obtidas usando PEG 1000 da Companhia Roth. A substituição de sor bitol 1 M no meio SBEG por KC1 1,25 M, CaClg 30 mM provoca um ) aumento na frequência de transformação por um factor de 2, dando origem a 200 transformantes NGA23 por pg de ADN do plasmídeo YRpJD2.

Durante o congelamento das células de levedura, a membrana plasmídiea fica danificada, resultando numa mais alta permeabilidade; além disso o grau de dano da célula depende da velocidade do congelamento (Lepock et al., 1984). Com base nesta observação, experimentou-se a competência da transformação das células depois de congelar a -70° C num congelador (congelamento relativamente lento), com gelo seco e acetona a -78° C (congelamento rápido) e com azoto líquido a -196° C (con gelamento muito rápido).

•

Usando azoto líquido a frequência da trans- 34 -

formação decresceu de 40 %, enquanto que o uso de gelo seco com acetona aumentou o rendimento dos transformantes de 30 % em com paração com o congelamento no congelador a -70° C.

ADN foi adicionado às células congeladas (conservadas a -70° 0 de 10 min até 6 meses) e as células foram em seguida descongeladas com agitação rápida a 37° C. Em vez de agitaçao rápida em banho de água a 37° 0, usou-se um misturador de Eppendorf tipo 5432 a 37° 0. Esta condição de agitação rápida durante o descongelamento deu as melhores frequências de transformação reprodutíveis.

Com estas modificações foi obtida uma frequência de transformação de 300 a 1000 transformantes por jig de ADN plasmídico de YRpJD2 para mutantes de Schwanniomyces alluvius NGA23.

Com este procedimento simplificado de trans formação também foi possível obter altas frequências de transformação para Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, e Kluyveromyces lactis (Quadro II).

Estimativa do número de cópias de plasmídeos em transformantes de Schwanniomyces alluvius e de Saccharomyces cerevisiae

Transformou-se Sachwanniomyces alluvius

NGA23 com o nosso procedimento simplificado de transformação; pYe(trp5)1-53 - contendo pBR313 (Bolivar et al., 1977) e o gene TRP5 de Saccharomyces cerevisi ae pYASl - um derivado plí contendo ambos os genes

LEU 2 e TRP5 de Saccharomyces cerevisiae (Strasser, 1982)

YRP7TRP5 - contendo ARS1 e ambos os genes TRP1 e TRP5 de Saccharomyces cerevisiae

YRpJDl - contendo ambos os genes SwARSl e ARS1 e ambos os genes TRP1 e TRP5 de Saccharomyces cerevisiae

YRpJD2 - contendo SwARSl e o gene TRP5 de Saocha romyces cerevisiae

pEK2TRP5 - contendo ambos os genes KARS1 e ARS1 e o gene TRP5 de Sac charomyc es c ere vi si a e

Os plasmideos estão apresentados sumariamen te na Figura 8.

As frequências de transformação e as estabi lidades destes plasmideos em Schwanniomyces alluvius NGA23 estão apresentadas sumariamente no Quadro III. Os números de cópias dos diferentes plasmideos foram estimados por análise de mancha de Southem (Fig. 9 β 10).

local cromossomal HIS4 representando uma cópia por célula foi usado como modelo interno. Existem três fragmentos cromossomais EcoRI (0,9 kb, 6,0 kb e 8,0 kb), os quais hibridizam com ADN de YRpJD54 marcado com Ρ. A homologia entre o local cromossomal HIS4 e o plasmídeo YRpJDl para a sonda de hibridação YRP7HIS4 está representada na Figura 10D.

Para estimar o número de cópias dos plasmídeos pYSAl, YRP7Trp5, YRpJDl, (YRpJD2) e pEK2TRP5 foi comparada a intensidade da banda EcoRI de 5,3 kb com a da banda EcoRI de 6 kb do gene cromossomal HIS4.

A intensidade da coloração no autorradiogra ma revela que os plasmideos YRpJDl e YRpJD2 têm um número de có pias de cerca 5 a 10 cópias por célula (Fig. 9 e 10).

Ambos os plasmideos YRP7TRP5 e pEK2TRP5 têm perto do mesmo número médio de cópias por célula, o qual está na gama de cerca de 0,2 a 1, independentemente da orientação do fragmento TRP5, enquanto que o plasmídeo pYASl existe em cerca de 2 a 3 cópias por célula (Fig. 10).

As sequências de ADN ARS1 e 2 de Saccharomyces cerevisiae podem ser usadas para replicação autónoma em Schwanniomyces alluvius NGA23, se bem que com menor eficiência do que SwARSl. SwARSl comporta-se em Schwanniomyces alluvius como ARS1 em Saccharomyces cerevisiae, dando origem a 5 a 10 cópias por célula (Fig. 11, Quadro IV). 0 plasmídeo YRpJDl, que tem o elemento ARS1 além do elemento SwARSl, não apresentou um

UKJlMUMw número de cópias mais elevado em comparação com YRpJD2, que apenas tem o elemento SwARSl. O plasmídeo pEK2TRP5, que tem o _e lemento KARS2 além do elemento ARS1, tem o mesmo número de cópias que o plasmídeo YRp7TBP5, que apenas tem o elemento ARS1. Gonclui-se, em consequência, que o elemento KARS2 não deve poder servir como um elemento de replicação autónoma em Schwannio myces alluvius.

A transformação de Schanniomyces alluvius NGA23 com pYe(trp5)1-53 (Walz et al., 1978) pode ser explicada por um acontecimento de transformação abortiva relacionado com a alta instabilidade destes transformantes (Quadro III).

Regulação do gene da tá-amilase de Schwanniomyces castellii clonado e super-produçao da proteína em transformantes de Schwanniomyces alluvius

A produção de ^(-amilase nas espécies de levedura Sohwanniomyces está sujeita a repressão catabólica na presença de glucose (Sills et al., 1982).

A síntese de «t-amilase é induzida por dextrinas de amido solúvel e por maltose (sills et al., 1982). Verificou-se que a maltose, que é um dos produtos de degradação do amido, é um indutor mais forte do que 0 amido solúvel (Sills et al., 1984b). Parece que ê produzido constitutivamente um nível basal de amilase muito baixo. Este nível baixo de οζ-amilase pode hidrolisar amido, libertando açúcar de baixo peso molecular tal como a maltose, 0 qual pode penetrar na célula atwés da membrana e pode, por sua vez, induzir a síntese de «-amilase (Sills et al., 1984b).

A fim de estudar a regulação e a expressão do gene de <-amilase clonado em Schwanniomyces alluvius, inseriu-se 0 fragnento EcoRI de 5 kb contendo 0 gene de tf-amilase estrutural no plasmídeo YRpJD2 (Fig. 8), dando origem ao plasmídeo YRpJD2-cCe transformou-se Schwanniomyces alluvius NGA23 com este com selecção para prototrofia do triptofano em placas de YNB.

Tal como se mostra na Figura 5B, a activida

- 37 J

de total de oc-amilase dos transformantes NGA23:YRpJD2-oc cultivados sob condições de indução em meio de YNB com maltose aumen ta 4 a 5 vezes em comparação com os transformantes testemunhas NGA23íYRpJD2 que não contêm qualquer plasmídeo adicional que cç> difique para a ç<-amilase (Fig. 4A).

da actividade extracelular daoí-amilase por célula, em comparação com os transformantes testemunhas, correlaciona-se com o nú mero estimado de 5 a 10 cópias do plasmídeo SwARSl em Schwanniomyces alluvius.

Concluiu-se, em consequência, que o aumento da actividade de «»z-amilase é devido a um efeito de dosagem do ge ne.

Quando se cultivaram os transformantes

NGA23íYRpJDl e NGA23íYBpJD2 sob condições de repressão em meio YNB contendo 2 % de glucose, não foi possível medir qualquer ac tividade de cc-amilase no meio extracelular até que a concentração de glucose baixou até cerca de 0,2 mH (Fig. 4C e E). Deste modo a oc-amilase codificada por plasmídeos é regulada^- por repres são catabólica como o^amilase cromossomal.

Por construção do gene estrutural de Qí-amilase sob regulação dum promotor de expressão elevada, como por exemplo os dos genes PDC1 ou PGK, é possível obter estirpes de expressão elevada independente do estádio de crescimento e da fonte de carbono.

A superprodução da proteína cfamilase foi demonstrada por análise in vivo de proteínas marcadas do sobrenadante de culturas por fluorografia (Fig. 12). Foi possível me dir a actividade da ^-amilase no meio extracelular de transformantes MC34ípYCloc cultivados em meio YNB contendo 2 % e 4 % de glucose como única fonte de carbono, indicando que a ol-amilase codificada por plasmídeos não é regulada por repressão catabóli ca em Sacch.aromyces cerevisiae.

Isolamento de mutantes auxotróficos de Schwanniomyces alluvius — 38 —

Para continuação da clonagem do gene da glu coamilase escolheu-se a complementação funcional dum mutante de Schwanniomyces alluvius.

Uma condição prévia consiste na disponibili dade dum mutante apropriado que possa ser complementado pelo ge ne clonado. Para este objectivo, analisou-se um mutante de Schwanniomyces alluvius NGS1 que não é capaz de crescer em maltose ou em amido solúvel como única fonte de carbono. Quando este mu tante foi cultivado em placas contendo 1$ de glucose e 1$ de amido solúvel foi possível observar-se a formação de halo depois de coloração com iodo, indicando que o mutante pode segregar ot-amilase. Não foi possível detectar actividade de glucoamilase em extractos brutos nem em sobrenadantes das culturas.

Como já referido, a oG-amilase pode hidrolisar o amido a dextrina, maltose e oligossacarídeos superiores (Fig. 7), enquanto que a glucoamilase pode usar estes produtos como substratos para hidrólise enzimática dando glucose. A caraç. terística interessante do mutante NGS1 é a incapacidade para crescer em glucose. O tipo selvagem de Schwanniomyces alluvius segrega gLucoamilase que hidrolisa maltose em glucose no meio extracelular e portanto, ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, não necessita de um sistema de utilização de maltose. Conclui-se portanto que o mutante NGS1 é um mutante oc-amilase⁺ e glucoamilase, devido ao facto de não possuir glucoamilase funcional nem por mutação pontual nem no gene estrutural ou na região do promotor.

Focámos a nossa atenção neste mutante de glucoamilase para clonar o gene da glucoamilase de Schwanniomyces castellii por complementação funcional.

Para a finalidade de clonagem, tomou-se ne cessário introduzir uma mutação adicional no mutante ct-amilase⁺ glucoamilase, de preferência uma mutação trp5 (provocando um defeito na reacção do indol a triptofano), porque a espécie Schwanniomyces alluvius pode ser transformada eficientemente usando o gene TRP5 de Saccharomyces cerevisiae como um marcador seleccionável em plasmideos contendo SwARSl, por exemplo YRpJDl

_ e YRpJD2. Além disso, estes mutantes podem ser identificados facilmente devido à propriedade que apresentam de acumular indol.

Para o isolamento de mutantes trp5 auxotróficos efectuaram-se todas as operações a 30° C. Cultivaram-se 10 ml de cultura NGS1 até se atingir uma ΟΒ^θθ= 0,6 em meio com plexo, lavou-se duas vezes com HgO e submeteu-se a exposição à luz UV (254 nm) durante 50 segundos (1 % de sobrevivência). As células resultantes da mutagénese foram em seguida incubadas durante 2 dias num meio complexo para segregação dos auxótrofos trp e cultivadas em placas YEPD para replicação em meio mínimo contendo triptofano e em placas de meio mínimo contendo todos os ácidos aminados excepto triptofano.

A partir de 2614 colónias NGS1 experimentadas foi possível obter 7 mutantes auxotróficos trp que crescem em meio mínimo contendo triptofano mas não em meio mínimo conten do todos os ácidos aminados excepto triptofano (taxa de reversão —7 —8 a 10 ). Dois destes sete mutantes puderam ser analisados constatando-se que eram deficientes na reacção de transformação de indol em triptofano visto que ambos acumulavam indol.

Estes mutantes trp5 06-amilase⁺glucose“ foram designados NJD1 e NJD2. Estas duas estirpes puderam ser transfor madas de modo eficiente com YRpJDl dando origem a aproximadamen| te 800 transformantes por pg de ADN, indicando que NJD1 e NJD2 estão realmente mutados no gene TRP5.

Outros prodedimentos adicionais de clonagem podem ser levados a efeito de modo análogo como com o gene de «(-amilase.

Construção dum vector cosmídeo lançadeira (vai-vem) de E. coli - Saccharomyces cerevisiae - Schwanniomyces alluvius para clonagem de genes em Schwanniomyces alluvius

Construiu-se um cosmídeo de clonagem em Schw anniomyces alluvius em analogia com o cosmídeo pYcl (2μ) e pYc2 (ARS) que foram construídos para genes de clonagem em Saccharo’ myces cerevisiae (Hohn e Hinnen, 1980).

Os cosmídeos são plasmídeos que contêm a re gião cos (sequência coesiva) do bacteriófago lambda (Collins e Hohn, 1978) bem como as sequências fundamentais para a clonagem (origens de replicação, um gene que seja um marcador seleccioná vel e sítios de clonagem adequados). A sequência cos contém a informação estrutural necessária para 0 acondicionamento do ADN a fim de produzir um bacteriófago lambda intacto (Hohn, 1975). Por consequência é possível acondicionar de modo eficiente ADN de cosmídeos oligiméricos de alto peso molecular por meio dum sistema de acondicionamento in vitro (Hohn, 1979), se as sequên cias cos estão separadas por quaisquer fragmentos de ADN de 37 a 52 kb correspondendo a cerca de 73 % a 105 % do genoma do fago lambda (Feiss et al,, 1977). A dimensão relativamente grande dos fragnentos clonáveis apresenta a possibilidade de que apenas cerca de 1200 clones de cosmídeos contendo fragmentos com uma dimensão média de cerca de 30 a 40 kb sejam necessários para abranger 0 genoma de Saccharomyces cerevisiae em mais do que 85 % (Hohn e Hinnen, 1980).

Para clonagem de grandes fragmentos de ADN, a vantagem de usar ADN de cosmídeos em vez de ADN plasmídico es tá em que é mais fácil obter ADN oligomerico de peso molecular relativamente alto por ligação de ADN altamente concentrado, en quanto que a eficiência para formar plasmídeos circulares trans portáveis por ligação de grandes fragmentos de ADN com vectores menores de ADN apresenta desvantagens devido à relação entre a dimensão dos fragmentos e a concentração efectiva das extremida des livres (Dugaiczyk et al., 1975). Além disso, 0 ADN acondicionado pode ser transduzido de modo eficiente por infecção de células de E. coli sensíveis ao fago lambda (Hohn e Hinnen, 1980).

Com base nestas observações construiu-se um vector cosmídeo lançadeira (vai-vem) de E. coli - Saccharomyces cerevisiae - Schwanniomyces alluvius por subclonagem do fragmen to BglII de 1,7 kb do plasmídeo pHC79 contendo a região cos (Hohn e Collins, 1981) num dos dois sítios BamHl de YRpJD2. Por conseguinte digeriu-se parcialmente YRpJD2 com BamHl (0,5 unida de ADN a 30° C) e o ADN linear resultante de maior dimen

são que tem origem num único corte por BamHI foi isolado por electroforese preparativa em gel e foi ligado com o fragmento BglII de 1,7 kb de pHC79, o qual também tinha sido isolado por electroforese preparativa em gel depois de digestão completa do ADN de pHC79. Esta mistura de ligação foi usada para transformar E. coli JA221, tendo-se efectuado uma selecção com base na resistência à ampicilina. Seleccionaram-se subclones por hibridação de colónias usando o fragmento BglII de 1,7 kb submetido a translacção de encaixe como uma sonda radioactiva.

A partir dos clones positivos foi possível isolar dois cosmídeos diferentes, nomeadamente pCJD5-l e pCJD5-2 (Fig. 13a), os quais foram analisados após digestão com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI e PvuII (Fig. 13b). A Figura 13b demonstra que no cosmídeo pCJD5-l a sequência cos está subclonada no sítio BamHI de YRpJD2 entre a sequência SwARSl e o gene TRP5· Bn pCJD5-2 a região cos foi inserida em repetição em série na mesma posição. A existência de dois elementos cos em série orientados deveria aumentar drasticamente a eficiência de acondicionamento em comparação com cosmídeos que apenas contêm um único elemento cos (Lindenmeier et al., 1982). Até agora não se experimentou se é este 0 caso em pCJD5-2.

Com os cosmídeos pCJD5-l e pCJD2 foram obtidos 500 a 1000 transformantes NJD1 por jzg de ADN de cosmídeo por selecção em triptofano, indicando que 0 elemento cos não influen cia a frequência de transformação. Ambos os cosmídeos contêm (a) a sequência SwARSl que actua como origem de repli cação em Schwanniomyces alluvius bem como em Saccharomyces cerevisiae (b) a origem de replicação de E. coli;

(c) 0 gene de resistência à ampicilina como marcador seleccionável em E. coli;

(d) o gene TRP5 de Saccharomyces cerevisiae como marcador seleccionável em Schwanniomyces alluvius bem como em mutantes trp5 de Saccharomyces cerevisiae; e

(e) e a região cos como condição necessária para a construção dum banco de cosmídeos.

Além disso, ambos os cosmídeos contêm sítios de clonagem apropriados, nomeadamente BamHI e Sall para clonagem de fragmentos Sau3A, BamHI, BglII, Sall e Xhol, e portanto, constituem uma nova classe de vectores cosmídeos para a cons trução de um banco de ADN genémico para clonar genes em E. coli, Saccharomyces cerevisiae e Schwanniomyces alluvius.

Clonagem do gene da glucoamilase de Schwanniomyces castellii

A clonagem do gene da glucoamilase foi iniciada a partir dum conjunto de cosmídeos de Schwanniomyces castellii ATCC 26076 que foi estabelecido por ligaçao de ADN genómico de Schwanniomyces castellii parcialmente digerido com BamHI no vector lançadeira pCJD5-l de E. coli - Saccharomyces cerevisiae - Schwanniomyoes alluvius usando a téncica de clonagem de cosmídeos descrita por Ish-Horowicz et al., 1981.

Depois de acondicionamento in vitro da mistura de ligação de ADN, infectou-se a estirpe E. coli HB101, ob tendo-se aproximadamente 15 000 colónias resistentes à ampicili na correspondendo a aproximadamente 30 dimensões equivalentes de Schwanniomyces castellii, admitindo uma dimensão de genoma de Schwanniomyces castellii semelhante à de Saccharomyces cerevisiae (aprox. 15 000 kb) e uma dimensão dos fragmentos de ADN clonado na gama de 30 a 40 kb. A partir destes transdutantes isolou-se o ADN dos cosmídeos e em seguida usou-se este para transformação de NJD1 («(-amilase⁺glucoamilase”trp5) com selecção para prototrofia de triptofano em meio mínimo contendo 2 % de glucose.

As frequências de transformação, usando quer o método de protoplastos (Beggs, 1978) quer o método simplificado de congelamento - descongelamento, foram relativamente baixas (1 a 10 transformantes /p.g de ADN de cosmídeo). Mesmo assim foi possível obter 3000 transformantes que foram seleccionados no que respeita à respectiva capacidade readquirida de crescer em amido solúvel como única fonte de carbono. Foi possível isolaa>- 43 ~

_ -se a partir de placas de amido um transformante NJD1 com o fenótipo Trp⁺ e glucoamilase⁺. Num teste de estabilidade motótica (Beggs, 1978) foram separadas as funções de fenotipia TRP5 e de complementação de glucoamilase, indicando simultaneamente que os dois genes foram integrados pelo cosmídeo. 0 cosmídeo foi resgatado por transformação de E. coli HB1O1 com minilisados de levedura e selecção com respeito à resistência à ampicilina. 0 ADN de cosmídeos foi isolado e foi usado paraislransformação em NJD1, a fim de se certificar que a função de complementação de glucoamilase ainda é transportada pelo ADN de cosmídeo isolado. Após corte do cosmídeo com BamHI, foi possível localizar dois sítios BamHI no fragmento clonado, dividindo-o em três fragmentos, dois dos quais tendo aprox. 10 kb a 12 kb.

A fim de diminuir a dimensão do cosmídeo de aproximadamente 40 kb, subclonaram-se fragmentos BamHI no único sítio BamHI do plasmídeo pCJD5-l. Para esse fim digeriu-se 0 ADN do cosmídeo com BamHI, religou-se e transformou-se em E. col. HB101. 0 ADN plasmídico de células resistentes à ampicilina foi usado para transformar NJD1 e para seleccionar as colónias resultantes em relação a crescimento em amido solúvel como única fonte de carbono. Resgatou-se 0 ADN plasmídico por transformação de HB101 com minilisados de levedura e selecção em relação a resistência à ampicilina. Isolou-se 0 ADN plasmídico por análise de restrição após digestão com a endonuclease BamHI.

A Figura 15 demonstra que a função de complementação da glucoamilase é transportada pelo fragmento BamHI de 12 kb subclonado em pCJD5-l. Este plasmídeo recebeu a designa ção de pCJD5-AMGl (Fig. 14). Uma vez que este plasmídeo contém 0 elemento SwARSl que actua tanto sobre Saccharomyces cerevisiae como sobre Schwanniomyces alluvius, 0 gene clonado em Saccharomyces cerevisiae foi analisado por transformação de Σ3656 selecj cionando para prototrofia de triptofano. Infelizmente, os trans formantes não tinham capacidade de usar amido solúvel como única fonte de carbono. A primeira explicação, de que as 5 a 10 có pias de pCJD5-AMGl em Saccharomyces cerevisiae não são em núme. ro suficiente para evitar uma possível degradação proteolítica, revelou não ser verdadeira, uma vez que, depois da subclonagem — 44 -

do fragmento BamHI de 12 kb no plasmídeo de alto número de cópias pJDB2O7 (Beggs, 1981) (Fig. 14), com um número de cópias de 50 a 100 por célula, e de transformação de células de GRF18 Saccharomyces cerevisiae, nenhum dos transformantes possuia a ca pacidade de crescer em amido solúvel como única fonte de carbono.

Embora tenha sido possível medir a actividade de gLucoamilase em transformantes NJDl:pCJDS5-AMG2, não se de tectou qualquer actividade tanto no extracto bruto como no filtrado de culturas de transformantes de Saccharomyces cerevisiae. Como Kãufer et al. (1985) mostraram recentemente que Schizosaccharomyces pombe tem sobre Saccharomyces cerevisiae a vantagem considerável de cortar com grande precisão uma sequência que intervenha numa transcrição dum gene de um eucarionte superior, fo ram feitas tentativas para expressar a glucoamilase nesta levedu ra de fissão. No entanto, não foi possível detectar expressão nem secreção de glucoamilase em Schizosaccharomyces pombe leul-32 (complementada com 1ΕΠ2 de Saccharomyces cerevisiae depois de transformação com o plasmídeo pJDB20' -AMG (Fig. 14). A trans: formação do gene em Kluyveromyces lactis SD11 (trpl) com pEK2-AMG2 (Fig. 14) não deu origem a transformantes que pudessem crescer em amido solúvel como única fonte de carbono, Concluiu-se portanto que se tinha clonado um gene de Schwanniomyces que não pode ser expresso funcionalmente em Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe nem em Kluyveromyces lactis devido às diferenças nas especificidades de união, no reconhecimento do promotor ou no processamento após transcrição específico de Schwanniomyc es.

Para uma análise mais aprofundada, levou-se a efeito uma subclonagem de fragmentos menores de ADN de 12 kb com o fim de encontrar o menor fragmento de ADN contendo ainda a propriedade de complementação funcional. 0 peso molecular da glucoamilase é aproximadamente de 117 000 d (Simões-Mendes,1984) correspondendo a um longo gene estrutural de cerca de 3 kb de comprimento.

Além disso, o gene pode ser sequenciado pa- 45 -

ra estabelecer a utilização de codões e a possibilidade de exis tência de intrões. Adicionalmente, a sequência guia 5’ não codi ficante do ADN de Schwanniomyces castellii pode ser trocada por um promotor bem caracterizado como seja o promotor ADH1 (Hitzman et al., I98I) ou 0 promotor PDC (Hollenberg et al., 1983), a fim de excluir a possível ineficiência de promotor de Schwanniomyces em outras espécies de leveduras.

A fim de caracterizar 0 gene, isolou-se glucoamilase para a produção de anticorpos específicos para glucoamilase para analisar os extractos brutos e 0 filtrado da cultura de NJD1 bem como de transformantes de Saccharomyces cerevisiae ou de Schizosaccharomyces pombe e de Kuyveromyces lactis por análise de Northern. Verificou-se ainda que não havia proteína detectável nos sobrenadantes e nos extractos brutos de transfor mantes de Saccharomyces cerevisiae usando um anticorpo específi co desenvolvido contra glucoamilase. Além disso, isolaram-se pejo tídeos de glucoamilase purificada para sequenciação de ácidos aminados a fim de sintetizar oligonucleótidos sintéticos para analisar 0 gene clonado.

A fim de excluir a clonagem de artefactos provenientes da construção do banco de cosmídeos de Schwanniomyces, levou-se a efeito uma selecçao directa a partir de um banco Charon 4A de Schwanniomyces castellii como descrito por Maniatis et al. 1982, contendo fragmentos de digestão parcial com EcoRI (10 a 30 kb) de ADN de Schwanniomyces castellii dando aproximadamente 150 000 inserções para 0 gene da glucoamilase.

banco Charon foi em seguida analisado por duas misturas diferentes de oligonucleótidos que foram deduzidas duma parte do peptideo 3 (ácidos aminados 11 a 18) e a partir do peptideo 4, respectivamente (ver Fig. 3). 0 menor fragmento de restrição que hibridiza com as duas misturas de oligonucleótidos marcadas em 5' foi um fragmento de ADN BglII de 3,7 kb. Por mapeamento SI revelou-se que neste fragmento se contém uma trans crição completa. Este fragmento foi sequenciado por Maxam e Gilburb (1980). A sequência de ADN é apresentada na Fig. 17.

Todas as 5 sequências peptídicas (Fig. 3) foram encontradas dentro do quadro de leitura livre de 2874 bases.

A expressão do gene da glucoamilase pode ser conseguida por troca de promotor. Uma região de promotor de Saccharomyces cerevisiae regula o início da transcrição e a regulação quando inserida 5' a montante da sequência de codificação do gene de glucoamilase. Não existem sítios de restrição adequados e seguir ao ponto de início da tradução do gene da glu coamilase que pode ser usado para fusões de promotores. Por con seguinte, introduzimos um sítio de restrição BamHI e Sall 5' em relação ao codão de início da tradução por mutagénese direccional para um sítio pelo método de ADN duplex com intervalos (Kra mer et al. (1984).

Fundiu-se um oligonucleótido sintético de 42 bases (5’ CTCATGAGTGTGTCGAGGGATCGAAGATGATTTTTGTGAAGC 3') ao ADN duplex com intervalos. Efectuou-se então o preenchimento das áreas de cadeia simples com polimerase de ADN (fragmento grande)· realizando-se em seguida ligação e transformação de E. coli e foi possível isolar um plasmídeo mutagenizado recombinante contendo um sítio BamHI na posição -9 e um sítio Sall na posição -15 com respeito à primeira base do codão de início de tradução.

A partir do plasmídeo recombinante resultante pode sub-clonar-se o gene estrutural sob a forma BamHl/SalI, BamHl/HindIII, Sall/Sall, BamHl/PstI, Sall/PstI, BamHl/Xbal e Sall/Xbal em vectores de expressão apropriados que fundem o gene com um dos sítios de restrição mencionados a diferentes promotores. Todos os outros sítios de restrição adequados podem ser introduzidos por um adaptador apropriado.

Foram construídos diferentes vectores usando diferentes promotores, diferentes marcadores seleccionáveis e diferentes origens de replicação (2μ, ARS e CEN) para leveduras.

Por exemplo, fundiu-se o gene com o promotor induzível de galactoquinase (GAL1) no plasmídeo pBM272 que é um derivado directo do vector pBM15O (Johnston e Davis 1984)

- 47 por introdução dum sítio HindIII imediatamente por trás do sítio BamHI. A sequência de ADN da fusão é a seguinte:

5' ......sítio de activação a montante ........................

....GATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCG GTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAAGAAAAAATTGTTAATATACC TCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACGCGGGATGCAAGATGATTTTTCTGAAGC....3’ fragmento contendo o gene de glucoamilase foi sub-clonado para o vector pBM272 como um fragmento BamHI/ Sall. 0 plasmídeo resultante foi transformado em Saccharomyces cerevisiae MZ4 ( gall, trpl, ura3, leu). Isto conduz a expressão inductível do gene de glucoamilase e à secreção da glucoamilase activa.

A quantidade de actividade no sobrenadante da cultura estava dentro da mesma gama de valores que tinha sido medida em sobrenadantes de cultura de Schwanniomyces alluvius desenvolvido sob condições induzidas.

A glucoamilase segregada pelo transformante de Saccharomyces cerevisiae tem a actividade máxima a 50° C e po de ser inactivada a 60° C como é o caso para glucoamilase de Schwanniomyces alluvius.

A expressão da glucoamilase e a secreção da proteína de glucoamilase pode também ser alcançada sob control do promotor de piruvato-descarboxilase (PDC) (Hollenberg et al., 19θ3), promotor de fosfoglicerato Kinase (PGK) (Dobson et al., I982), do promotor de gliceraldeído-3-fosfato-de-hidrogenase (GAPDH) do gene em pgap491 (Holland and Holland, 1979), do promotor de alcoolde-hidrogenase 1 (ADHI) (Hitzman et al., 1981), do promotor de cobre-quelatina (CUP1) (Karin et al., 1984, Butt et al., 1984) e do promotor de alcoolde-hidrogenase 2 (ADR2 ou ADH2) (Russel et al., 1983, Beir et al., 19θ5).

Pode-se realizar a superprodução de glucoamilase usando 0 promotor PDC e plasmídeo de alto número de cópi as (2p. com leu2d). A expressão do gene de gLocoamilase e a se ereção da proteína de glucoamilase pode também ser detectada em

Kluyveromyces lactis após fusão dos sinais transcripcionais do gene ^-galactosidase (Breunig et al,, 1984). A expressão do gene de glucoamilase e a secreção da proteína de glucoamilase pode também ser detectada em S chizosaccharomyces pombe após fusão dos sinais transcripcionais do gene de alcool-de-hidrogenase (ADHI) (Russell et al., 1983).

A expressão do gene de glucoamilase e a secreção da proteína de glucoamilase pode também ser detectada em Hansenula polymorpha após fusão dos sinais transcripcionais de di-hidroxiacetona-sintase (DHAS) (Janowicz et al., 1985) e meta nol oxidase (MOX) (ledeboe et al. 1985).

Além disso, a secreção de -amilase pode ser detectada após troca do promotor de Schwanniomyces pelo promotor MOX em Hansenula polymorpha.

gene de glucoamilase foi integrado no cromossoma de Saccharomyces cerevisiae sem as sequências de E. coli. Por isso as diferentes fusões de promotor de glucoamilase foram inseridas numa sequência de ADN de Saccharomyces cerevisiae ad.e quada, de preferência no gene de homotalismo (HO) ou numa sequên cia ARS. Um fragmento de ADN linear pode então ser gerado, o qual tem as extremidades dentro das sequências de Saccharomyces cerevisiae flanqueando o gene de glucoamilase funcional. Por co-transformação de Saccharomyces cerevisiae com YEP 36 (Butt et al., 1984), 0 gene pode ser integrado de forma estável. Os in tegrantes exibem actividade de glucoamilase no sobrenadante da cultura e tem as mesmas propriedades de fermentação e crescimento que o original. Os microorganismos geneticamente manipulados, de preferência leveduras, como descrito acima na presente especificação, são de grande vantagem em numerosos processos de fer mentação pela sua capacidade de hidrolisar hidratos de carbono de pesos moleculares elevados.

Um dos possíveis usos das estirpes de levedura geneticamente alteradas descritas acima é na produção de biomassa. Além da nova capacidade das estirpes de levedura para segregar 06-amilase e glucoamilase, estas possuem ainda capacida

- 49 de para outras fermentações e podem produzir biomassa de outros tipos com grande eficiência. Os métodos de produção das biomassas são os habituais tal como são conhecidos pelos especialistas da matéria.

Outro campo de uso de Saccharomyces cerevisiae possuindo a nova capacidade de produzir «<-amilase e glucoamilase é a produção de fermento de padeiro e de pão utilizando o fermento de padeiro.

A levedura produzida de acordo com o proces so da presente invenção pode ser usada como fermento em bloco, por exemplo, preparado pelos processos de secagem em tambor con vencionais ou pode ser preparado sob a forma de fermento em pó, por exemplo, tendo um tamanho de partícula de 1,7 mm ou menos. A fabricação de fermento em pó compreende a secagem por pulveri zação de uma composição de fermento líquido em ar, seguido de u ma secagem adicional como conhecido no estado actual da técnica. A levedura da presente invenção, por exemplo, pode ser preparada sob a forma de fermento como descrito em GB-PS 1 459 407, GB-PS 1 459 085 ou GB-PS 1 230 205. Também são apropriados quais quer outros métodos conhecidos na técnica da produção de levedura de padeiro ou da produção de produtos de panificação pela utilização da nova levedura da presente invenção.

As estirpes de levedura geneticamente manipu ladas proporcionadas de acordo com a presente invenção são ainda altamente apropriadas para a produção de etanol. 0 organismo pre ferido para a produção de etanol por fermentação e a levedura Saccharomyces cerevisiae e o hidrato de carbono preferido utilizado na produção de etanol e vim iniciador. Portanto sendo a levedura Saccharomyces cerevisiae apta para fermentar quantitativamente o amido e altamente vantajoso na produção de etanol. A produção de bebidas alcoólicas ou de etanol industrial pelo uso de estirpes de levedura geneticamente manipuladas de acordo com a presente invenção podem ser levadas a cabo de maneira conheci da em si. As estirpes de levedura da presente invenção têm capa cidade de fermentar soluções concentradas de hidratos de carbono, são tolerantes ao etanol e têm capacidade para produzir ele

_ vadas concentrações de etanol com uma alta viabilidade de células para reciclagem repetida e têm tolerância à temperatura.

Possivelmente o mais importante campo de uso da nova levedura Saccharomyces cerevisiae apta para produzir «é-amilase e glucoamilase é a produção de cervejas especiais, pre ferivelmente cervejas de baixo teor em hidratos de carbono. Como já foi descrito anteriormente na presente especificação, uma te£ nica para produzir cervejas de baixo teor em hidratos de carbono consiste em adicionar algumas enzimas aminolíticas ao mosto durante a fermentação. Uma vez que 70 % a 75 % das dextrinas no mosto são do tipo ramificado, é essencial uma enzima desmembrad£ ra de ramificações para a hidrólise total das dextrinas do mosto para açúcares fermentáveis. A glucoamilase produzida pela nova levedura Saccharomyces cerevisiae geneticamente manipulada possuí actividade de desmembramento de ramificações e assim pode hidrolisar as dextrinas completamente. Uma característica importante das enzimas aminolíticas produzidas pela nova levedura Saccharomyces cerevisiae é a sua sensibilidade ao ciclo de pasteurização normal empregado na indústria cervejeira.

método de preparação de cerveja tem uma se rie de estágios, começando com a maltagem, onde a cevada é macerada em água e deixada germinar, e durante esta fase é libertada amilase, que converte o amido do cereal em açúcar. Durante a fase seguinte os grãos são removidos por filtração e o mosto líqui do resultante é tratado com lúpulo. 0 lúpulo dá à cerveja o sabor amargo e durante esta fase a conversão enzimática do amido em açúcar pára. A seguir o mosto é arrefecido e filtrado para re mover as proteínas precipitadas. Então e adicionado fermento ao mosto para converter os açúcares em álcool e dióxido de carbono num processo de fermentação, após o qual a mistura é armazenada, a levedura é decantada, a cerveja é filtrada outra vez, engarrafada ou enlatada e pasteurizada.

Para se produzir uma cerveja de baixo nível de calorias é desejável consumir o máximo de hidratos de carbono possível no processo de fermentação. Para esse fim a nova levedu . ra Saccharomyces cerevisiae, estando apta para produzir bf-amila

se e glucoamilase, é altamente apropriada.

Um método para preparar a cerveja de baixo nível de calorias pode ser levado a cabo geralmente como descrito no pedido de Patente Europeia 0 163 135 com a excepção de que não se toma necessário adicionar quaisquer enzimas aminolíticas durante o processo de preparação. As fases normais de preparação da cerveja descritas acima podem ser levadas a cabo sem qualquer adição de enzimas aminolíticas demorada ou pouco económica. A realização do processo de preparação de cerveja como conhecido da técnica, utilizando a nova levedura Saccharomyces cerevisiae geneticamente manipulada de acordo com a invenção dá origem a uma cerveja especial, de preferência uma cerveja de baixo nível de hidratos de carbono ou uma cerveja de baixo nível de calorias dependendo do grau de fermentação do açúcar. 0 processo de preparação da cerveja utilizando Saccharomyces cerevisiae da pre sente invenção demora menos tempo devido a uma diminuição mais rápida em ES no fim do processo de fermentação.

Utilizando Saccharomyces cerevisiae da presente invenção, o processo de manufactura pode ser adaptado para a produção de uma cerveja de mosto de alta densidade, podendo o nível de hidratos de carbono ser regulado por um tempo de fermen tação predeterminado e por diluição posterior. Além disso o processo de fabricação poderá ser adaptado para a fermentação de substratos constituídos em parte considerável por hidratos de carbono em suspensão. 0 Saccharomyces cerevisiae produzido por engenharia genética pode ser posto em contacto com o mosto fermentado em seguida à fermentação principal mas antes do condicio namento.

Uma descrição mais detalhada da produção de cerveja de baixo nível de calorias é apresentado em seguida nos seguintes exemplos.

Exemplo I mosto de cerveja foi preparado usando técnicas cervejeiras tradicionais de tal modo que 80 % do extracto no mosto foi derivado de malte de cerveja e 20 % derivado de ce- 52 vada triturada. Este mosto tem uma densidade original de 11,7°P. Encheram-se balões de 3 litros com 2,5 litros de mosto arejado e inocularam-se com levedura húmida a 1,5 g/1 de uma estirpe cerve jeira lager Saccharomyces cerevisiae manipulada geneticamente, que recebeu por transformação os genefe) de d-amilase e/ou de glu coamilase de Schwanniomyces castellii. Ambas as enzimas foram s_e cretadas pelas estirpes de levedura transformadas. Usou-se como controle a estirpe lager de produção original de Saccharomyces cerevisiae.Deixou-se a fermentação prosseguir à temperatura con trolada de 9° C sob condições anaeróbicas e com agitação mecâni ca devido ao pequeno volume da fermentação. No fim da fermentação, a cerveja foi arrefecida a 0^o C, separou-se a levedura da cerveja e analisou-se no que diz respeito ao extracto residual e % de etanol. Fez-se também um cromatograma de gás típico da cerveja verde para determinar a quantidade de ésteres e de álcois superiores.

Análise da cerveja verde fermentada com a estirpe cervejeira lager original (A), e com a estirpe lager cer vejeira manipulada geneticamente que segrega«C-amilase (B) ou glucoamilase (C) ou ambas as enzimas &í-amilase e glucoamilase

(D).	A	B	C	D
densidade original °P	11.70	11.53	11.60	11.57
etanol % p/p	3.99	4.02	4.72	4.74
extracto aparente °P	2.14	1.88	0.30	0.22
grau aparente de
fermentação	81.7	83.7	97.4	98.1
extracto real °P	3.96	3.71	2.43	2.36
grau real de
fermentação %	66.2	67.8	79.0	79.6

Análise por cromatografia gasosa

Acetaldeído	mg/L	2.0	2.1	3.1	3.9
Acetona	mg/1	0.29	0.37	0.38	0.38
Formiato de etilo	mg/1	0.05	0.18	0.19	0.14
Acetato de etilo	mg/1	20.6	21.7	33.0	39.9
Propionato de etilo	mg/1	0.07	0.06	0.06	0.07

Acetato de Isoamilo	mg/1	2.45	2.21	2.95	2.9
Metanol	mg/1	2.0	2.5	2.3	2.6
N-propanol	mg/1	17.5	16.3	21.0	17.7
Isobutanol	mg/1	14.2	12.6	14.7	15.3
Álcool amílico opt.act.	mg/1	21.5	19.0	21.8	20.4
Álcool isoamílico	mg/1	62.5	54.2	57.6	55.1
Álcoois superiores totais	mg/1	115.7	102.1	115.1	108.5

Exemplo II processo de fermentação foi o mesmo do E xemplo I excepto a temperatura de fermentação que foi 13,5° 0. Depois de 7 dias de fermentação a cerveja foi arrefecida a 0° G.

Análise da cerveja verde fermentada com a estirpe cervejeira lager original (A), e com a estirpe lager cervejeira manipulada geneticamente que segrega o(-amilase (B)

ou glucoamilase (C).
densidade original °P	A 11.8	C 11.8
etanol % p/p	4.10	4.60
extracto aparente °P	2.00	0.85
grau aparente de
fermentação %	83.1	92.8
extracto real °P	3.90	2.90
grau real de
fermentação %	67.0	75.4
A análise das	cervejas	fermentadas com uma

estirpe cervejeira lager manipulada geneticamente que segrega βύ-amilase (B) e pouco diferente do controle.

Exemplo III processo de fermentação foi o mesmo do E xemplo I excepto que o mosto preparado tinha uma densidade ori ginal de 15°D. Depois de 9 dias de fermentação a cerveja foi arrefecida a 0° C.

Análise da cerveja verde fermentada com a estirpe cervejeira lager original (A), e com a estirpe lager

- 54 cervejeira manipulada geneticamente que segrega «(-amilase (B) ou glucoamilase (C).

AC densidade original °P 15.015.0 etanol % p/p 4.575.22 extracto aparente °P 4-302.76 grau aparente de fermentação % 71.481.6 extracto real °P 6.315.06 grau real de fermentação % 58,066.3

A análise das cervejas fermentadas com uma estirpe cervejeira lager manipulada geneticamente que segrega ot-amilase (B) é pouco diferente do controle.

Exemplo IV

O processo de fermentação foi o mesmo como para o Exemplo I excepto que o mosto preparado tinha uma densidade original de 8,23°P e o perfil do tempo/temperatura de fermentação foi o seguinte:

dias 9,5°C, 3 dias 13,5°C.

Análise da cerveja verde fermentada com a estirpe cervejeira lager original (A), e com a estirpe lager cer vejeira manipulada geneticamente que segrega oC-amilase (B) ou

glucoamilase (C).
	A	0
densidade original °P	8,23	8.23
etanol % p/p	2.88	3.60
extracto aparente °P	1.16	-0.56
grau aparente de
fermentação %	85.9	107.0
extracto real °P	2.48	1.14
grau real de
fermentação %	69.9	86.7
A análise das	cervejas	fermentadas com uma

estirpe cervejeira lager manipulada geneticamente que segrega

oí-amilase era pouco diferente do controle.

Exemplo V processo de fermentação foi o mesmo como no Exemplo I excepto que o mosto preparado consistia em mosto de cerveja padrão a 66,7% como descrito no Exemplo I e amido hl dratado suspenso a 33,3% (12% p/v).

Análise da cerveja verde fermentada com a estirpe cervejeira lager original (A), e com a estirpe lager cervejeira manipulada geneticamente que segrega «C-amilase (B) ou glucoamilase (C) ou ambas as enzimas «C-amilase e glucoamilase (D).

		A	B	C	D
densidade original °P		12.01	12.14	12.13	12.22
etanol % p/p		2.86	4.03	4.19	4.96
extracto aparente °P		5.15	2.49	1.63	0.37
grau aparente de
fermentação %		57.1	79.5	86.6	96.9
extracto real °P		6.47	4.32	3.62	2.61
grau real de
fermentação %		46.2	64.4	70.2	78.6
Análise por cromatografia	gasosa
Acetaldeido	mg/1	3.9	3.4	8.4	11.6
Acetona	mg/1	0.24	0.20	0.17	0.23
Formiato de etilo	mg/1	0.07	0.13	0.22	0.25
Acetato de etilo	mg/1	8.7	20.5	39.6	43.3
Propionato de etilo	mg/1	-	0.02	0.01	0.01
Acetato de isoamilo	mg/1	0.62	1.25	1.62	1.70
Metanol	mg/1	-	-	-	-
N-propanol	mg/1	13.6	14.9	18.3	19.7
Isobutanol	mg/1	13.0	11.5	14.7	16.5
Álcool amílico opt. act.	mg/1	10.4	12.5	20.1	18.2
Álcool isoamílico	mg/1	50.9	57.1	67.5	79.2
Álcoois superiores totais	mg/1	87.9	96.0	120.5	133.6

Exemplo VI

Grãos moídos de trigo e milho foram suspensos num tampão apropriado, fervido para gelatinizar o amido e foram liquefeitos por tratamento com uma preparação de enzima U- amilase comercial.

Este caldo tinha uma densidade original de 18,9°P e foi fermentado em fermentadores de 2,5 litros a uma temperatura de 30°C durante 72 horas. A estirpe de levedura uti lizada foi a estirpe de destilação Saccharomyces cerevisiae que tinha recebido por transformação o gene de glucoamilase de Schwanniomyces castellii. A glucoamilase foi segregada pela estirpe de levedura transformada. Como controle, a mesma fermenta ção foi realizada com a estirpe de destilação não transformada. Depois de 72 horas o caldo foi filtrado e determinou-se a concentração de etanol.

Levedura etanol (% p/p) estirpe de destilação não transformada 8,9 estirpe de destilação transformada 9,6.

REFERENCIAS

BEIER, D.B., SLEDZIWSKI, A., YOUNG, E.T. (1985) Mol. Cell. Biol. 2, 1743-1749.

BENOIST, C., O’HARA, K., BREATHNACH, R. and

CHAMON; P. (1980):Nuc.Acid.Res. 8, 127-142.

BEGGS, J.D. (1978): Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid.

Nature 275, 104-108.

BEGGS, J.D. (1981): In Molecular Geneties in Yeast, Alfred Benzon Symposium 16, 383-395.

BIRNBOIM, H.C. and DOLY, S. (1979): A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA

Nuc. Acid. Res. 7, 1513-1523.

BOLÍVAR, S., RODRIGUEZ, R.L., BETLACH, M.C. and BOYER,

H.W. (1977): Construotion and characterisation of new cloning vehicles.

I ampicillin-resistant derivates of the plasmid pMB9.

Gene 2, 75-93·

BRADFORD, M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding.

Anal. Biochem. 77, 248-254.

BRECNIG, K.D., DAHLEMS, U., DAS S., and HOLLENBERG, C. P. (1984)

Nucl. Acids Res. 12, 2327-2341.

BUTT, T.R., STERNBERG; E.J., GORMAN, J.A., CLARK; P., HAMER, D.,ROSENBERG, M., and CROOKE, S.T. (1984) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 81, 3332-3336.

CARBON, J., RATZKIN, B., CLARKE, L. and RICHARDSON, D. (1977): The expression of cloned eucaryotic DNA in procaryotes.

Brookhaven Symp. Biol. 29, 277-296.

_ COHEN, J., GORMAN, J., KOLTIN, Y. and DE WILDE, M. (I985): Molecular cloning of a glucoamylase gene of Candida albicans; Expression and secretion in Saccharomyces cerevisiae

Cold Spring Harbour Symp. Molec. Biol. of Yeasts, 345. COLLINS, J. and HOHN, B. (1978); Cosmids: A type of plasmid genecloning vector that is packageable in vitro in bacteriophahe Lambda heads.

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75, 4242-4246;

DAS, S. and HOLLENBERG, C.P. (1982): A high-frequency

I transformation system for the yeast Kluyveromyces lactis Curr.Genet. 6, 123-128.

DAS, S., KELLERMANN, E. and HOLLENBERG, C.P. (1984); Transformation of Kluyveromyces fragilis.

J.Bacteriol. 158, 1165-1167.

DAVIS, R.W., BOTSTEIN, D. and ROTH, J.F. (1980); Advanced bacterial genetics. A manual for genetic engineering.

Cold Spring Harbour Laboratory.

DoBSON, M.J., TUITE, M.F., ROBERTS, N.A., KINGSMAN, A.J., KINGSMAN, S.M., PEREINS; R.E., CONROY, S.C., DUNBAR, B.

I and FOTHERGILL, L.A. (1982) Nucleic Acids Research 10, 2625-2637.

DUGAICZYK, A., BOYER, H.W. and GOODMAN, H.M. (1975): Ligation of EcoRI endunuclease generated fragnents into linear and circular structures.

J.Mol.Biol. $6, 171-184.

FEISS, M., FISHER, R.A., GRAYTON, M.A. and EGNER, C. (1977): Packaging of the bacteriophage Lambda chromosome: Effect of chromosome length.

Virology 77, 281-293.

FERGUSON, A.R., KATSUNUMA, T., BETZ, H. and HOLZER, H. ’ (1973): Purification and properties of an inhibitor of . the tryptophane-synthetase-inactivating enzymes in yeast ^— Eur.J.Biochem.32, 444-450.

FOGARTY, W.M. and KELLY, C.T. (1979): Starch degrading enzymes of microbial origin.

In: BULL, M.J., (ed): Progress in industrial microbiology. Elsevier Scientific Publishing Company, New York, 15., 87-150.

GAFNER, J., DE ROBERTIS; E.M. and PHILIPPSEN, P. (1983). EMBO J. 2, 583-591.

GANNON, F., 0'HARA, K., PERRIN, F., LE PENNEC, J.P.,

BENOIST, C., COCHET, M., BREATHNACH, R., ROYAL, A., GARAPIN, A. and CHAMBON, P. (1979):

Nature 278, 248-434.

HITZEKAN, R.A., HAGIE, F.E., LEVINE, H.L., GOEDEL, D.V., AMMERER, G. and HALL, B.D. (1981): Expression of a human Nature 294, 717-722.

HOHN, B. (1975)5 DNA as substrate for packaging into bacteriophage lambda in vitro.

J.Mol.Biol. 98, 93-106.

HOHN, B. (1979): In vitro packaging of Lambda and cosmid DNA. In WH, R. (ed): Recombinant DNA, Kethods in Enzymology.

Academic Press, New York 68, 299-309.

HOHN, B. and COLLINS, J. (1980): A small cosmid for effieient cloning of large DNA-Fragments.

Gene 11, 291-298.

HOHN, B. and HINNEN, A. (1980): Cloning with cosmids in E. coli and yeast.

In SETLOW, J.K. and HOLLAENDER, A. (ed.): Genetic engineering - principies and methods.

Plenum Press, New York & London .2, 169-183«

HOLLAND, J.P. and HOLLAND; M.J. (1979) J.Biol. Chem. 254, 5466-5474.

_ HSIAO, C.L. and CARBON, J. (1981 b); Gharacterisation of a yeast replication origin (ars2) and construction of stable mini chromo somes containing cloned centromere DNA (CEN3).

Gene 15, 157-166.

INNIS, M.A., HOLLAND, M.J., Mc GABE, P.C., GOLE, G.E., WITTMAN, V.P., TAL, R., WATT, K.W.K., GELFAND, D.H., HOLAND, J.P. and MEADE, J.H. (1985): Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae.

Science 228, 21-26.

ISH-HOROWICZ, D. and BURKE, J.P. (1981)? Rapid and efficient cosmid vector cloning.

Nuc. Acids. Res. 2989-2998.

ITO, H., FUKUDA, Y., MURATA, K. and KIMURA, A. (1983): Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.

J.Bacteriol. 153, 163-168.

JANOWICZ, Z.A., ECKART, M.R., DREWKE, C., ROGGENKAMP, R.O., HOLLENBERG, C.P., MAAT, J., LEDEBOER, A.M., VISSER; C. and VERRIPS, C.T. (1985)

Nucleic Acids Res. 9, 3043-3062.

JOHNSTON, M. and DAVIS, R.W. (1984)

Mol. Cell.Biol. 4, 1440-1448.

KARIN, M., NAJARIAN, R., HASLINGER, A., VALENZUELA, P., WELCH, J. and FOGEL, S. (1984)

Proc. Natl.Acad.Sci. USA 81, 337-341.

KATSUNUMA, T., SGIÍOTT, E., ELSASSER, S. and HOLZER, M. (1972):

Eur.J.Biochem. 27, 520-526.

OUFER, N.F., SIMANIS, V. and NURSE; P. (1985): Fission yeast Schizosaccharomyces pombe exises a mammalian RNA . transcrip intervening sequence.

• Nature 318, 78-80.

_ KLEBE, R.J., HARRISS, J.V., SHARP, Z.D. and DOUGLAS, M.G. (1983): A general method for polyethylene-glycolinduced genetic transformation of bactéria andyeast. Gene 25, 333-341.

KRAMER, W., DRUTSA, V., JANSEN, H.-W., KRAMER, B., PFLUGFELDER, M. and FRITZ, H.-J. (1984)

Nucl. Acids.Res. 12, 9441-9456.

LAEMMLI, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature227, 680-685.

LEDEBOER. A.M., MAAT, J., VISSER, C., BOS, J.W.,

VERRIPS, C.T., JANOWICZ, Z., ECKART, M., DREWKE, C., ROGGENKAMP, R. and HOLLENBERG, C.P., (1985)

Nucl. Acids. Res. 3063-3082.

LEPOOK, J.R., KEITH, A.D. and KRUUV, J. (1984): Permeability changes in yeast after freeze, thaw damage; comparison to reproductive survival.

Cryo-Letts. 5, 277-280.

LINDENMAIER, V/., HAUSER, H., GREISER DE WILKE, I., and SCHUTZ, G., (1982): Gene shuttling; moving of cloned DNA into and out of eucaryotic cells.

Nucl. Acids. Res. 10, 1243-1256.

MANIATIS, T., FRITSCH, E.F. and SAMBROCK, J. (1982);

Molecular cloning, a laboratory manual.

Gold Spring Harbour Laboratory, New York.

MaNNEY, T.R., DUNTZE, W., JANASKO, N. and SALAZAR, J. (1969): Genetic and biochemical studies of partially active tryptophane-synthetase mutants of Saccharomyces cerevisiae.

J. Bacteriol. 99, 590-596.

MAXAM, S.M. and GILBERT, W. (1980); Sequencing end . Iabelled DNA with base specific chemical cleavages.

Methods Eazymol. 65, 499-561.

NUNBERG, J.H., MEADE, J.H., COLE, G., LAWYER, F.C., McCABE, P., SCHWEICKART, V., TAL, R., WITTMAN, V.P., FLATGAABD, J.E. and INNIS, M.A. (1984): Molecular cloning and characterisation of a glucoamylase gene of Aspergillus awamori.

Mol.Cell.Biol. 4, 2306-2315.

ORR-WEAVER, ,T.L., SZOSTAK, J.W. and ROTHSTEIN, S.J. (1981): Yeast transformation: A model system for the study of recombination.

Proc. Natl.Acad. Sei. USA 78, 6354-6358.

OTENG-GYANG, K., MOULIN, G., GALZY, P. (1981): Zeitschrift allg. Mikrobiol. 21, 537-544.

RIGBY, P.W.J., DIEKMANN; M., RHODES, C. and BERG, P. (1977)í Labelling desoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNApolymerase I.

J. Mol. Biol. 113, 237-251.

ROTHSTEIN, S.J., LAZARUS, C.M., SMITH, W.E., BAULCOMBE,

D. C. and GATENBY, A.A. (1984): Secretion of a wheat alpha-amylase expressed in yeast.

Nature 308, 662-665

RUSSELL, D.W. and HALL, B.D., (1983)

J.Biol.Chem. 258, 143-149.

RUSSELL, D.W., SMITH, M., WILLIAMSON, V.M. and YOUNG,

E. T. (1983)

J.Biol.Chem. 258, 2674-2682.

SCHATZ, G. (1979):

Meth.Enzymol.L VI, 40-50.

SHERMAN, P., FINK, G.R. and HICKS, J.B. (1983):

Methods in yeast geneties.

In C.S.H. Laboratory, C.S.H., New York, 119.

SILLS, A.M. and STEWART, G.G. (1982): Production of amylolytic enzymes by several yeast species.

J.Inst. Brew. 88, 313-316.

SILLS, A.M., PANCHAL, C.J., RUSELL, I. and STEWART,

G.G. (1983 a): Genetic manipulation of amylolytic enzyme production of yeast. Gene Expression in Yeast. Proceedings of the Alko Yeast Symposim Helsinki 1983, ed.by M. Korhola and E. Vaisãnen.

Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research. 1, 209-228.

SILLS, A.M., RUSELL, I. and STEWART, G.G. (1983 b): The production of yeast amylases in the brewing low carbohydrate beer.

EBO Congress, 377-384.

SILLS, A.K., SAUDER, M.E. and STEWART, G.G. (1984 a): Isolation and characterisation of the amylolytic system of Schwanniomyces castellii.

J.Inst.Brew. 90, 311-314.

SILLS, A.M., ZYGORA, P.S.J. and STEWART, G.G. (1984· b): Characterisation of Schwanniomyces castellii mutants with increased productivity of amylases.

Appl. Microbiol. Biotechnol. 20, 124-128.

SIMOES-MENDES, B. (1984): Purification and characterisation of the extracellular amylases of the yeast Schwanniomyces alluvius.

Can.J.Microbiol. 30, 1163-1170.

SOUTHERN, E.M. (1975): Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol. Biol. 98, 503-517.

STRASSER, A.W.M. (1982): Biochemische und biophysikalische Studien an der in Hefe úberproduzierten Hefe Tryptophan-synthetase.

- 64 Dissertation, Universitãt Basel.

STRUHL, K., STINCHCOMB, D.T., SCHERER, S. and DAVIES R.W. (1979)5 High-frequency transf ormation of yeast: Autonomous replication of hybrid DNA molecules. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76, 1035-1039.

THOMSEN, K.K. (1983): Mouse -amylase synthesised by Saccharomyces cerevisiae is released into the culture médium.

Carlsberg Res. Commun.'48, 5, 545-555.

TOUCHSTONE, J.C. and DOBBINS, M.F., (1978): Praçtice of thin layer chromatography.

A.Wiley-Interscience publication. John Wiley & Sons.

TSAI, H., TSAI, J.H.J. and YU, P.H. (1973): Effects of yeast proteinase and its inhibitors on the inacitvation of tryptophane synthetase from Saccharomyces cerevisiae and Neurospora crassa.

Eur.J.Biochem. 40, 225-232.

WALZ, A., RATZKIN, B. And CARBON, J. (1978): Control of expression cloned yeast (Saccharomyces cerevisiae) gene TRP5 by a bacterial insertion element (IS2).

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 6172-6176.

WILSON, J.J. and INGLEDEW, W.M. (1982): Isolation and characterisation of Schwanniomyces alluvius amylolytic enzymes.

Appl.Environ. Microbiol. 44, 301-307.

YAMASHITA; I. and FUKUI,S. (1983): Molecular cloning of glucoamylase-producing gene in the yeast Saccharomyces.

Agric. Biol. Chem. 47, 2689-2692.

ZALKIN, H. and YANOFSKY, C. (1982): Yeast gene TRP5: Structure, function, regulation.

J.Biol. Chem. 257, 1491-1500.

Claims (1)

1. - ia -

   Processo para a preparação de polipeptídeos, de preferência enzimas amilolíticas, por cultura de um microorganismo hospedeiro sob condições adequadas seguida de recuperação dos referidos polipeptídeos caraeterizado por o microorganismo ser um produto de tecnologia de ADN recombinante tendo recebido sequências de ADN de uma levedura dadora contendo sequências de codificação para os referidos polipeptídeos e dotado de capacidade de expressar os referidos polipeptídeos.

   - 2â -

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptideo ser ©C-amilase e/ou glucoamilase.

   - 3ã -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   1 ou 2 caraeterizado por o microorganismo hospedeiro ser escolhi do num grupo constituído por leveduras dos géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces ou Kluyveromyces, ou por bactérias do género Zymononas ou fungos do género Aspergillus.

   - 4a _

   Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a levedura ser Saccharomyces cerevisiae.

   - 5â —

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   1 a 4 caracterizado por a levedura dadora ser seleccionada de entre um grupo constituído pelos géneros Saccharamycopsis, Dipomyces, Pichia, Schwanniomyo es, Deharyomyces ou Sacoharomyces.

   -gaProcesso de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a levedura dadora ser Schwanniomyces castellii ATCC 26076.

   - 7â _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   1 a 6 caracterizado por a transferência das sequências de ADN da levedura dadora para o microorganismo hospedeiro ser levada a efeito por transformação.

   — 8— —

   Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a transformação ser levada a efeito por um vector, de preferência por um fragmento de ADN, por um plasmídeo ou por um cosmídeo.

   - 9- -

   Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o vector conter ADN homlólogo, de preferência derivado de Schwanniomyces, levando à integração no genoma do hospedeiro.

   - 10 a -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   8 ou 9, caracterizado por o vector conter uma ou várias sequências de ADN que controlam a função de replicação e manutenção em células de Schwanniomyces, de preferência as sequências ARS de replicação autónoma de ADN, de preferência dum modo especial se- 67 - quências SWARS de ADN originárias em Sohwanniomyces.

   - llâ -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   8 a 10 caracterizado por o vector ser pCJD5-AMGl e/ou YRpJD2-cG

   - 12â -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   7 a 11, caracterizado por as células de levedura hospedeiras serem submetidas, antes da transformação, a congelamento rápido, o qual é levado a efeito com gelo seco em acetona a temperaturas entre cerca de -70° e -80°C.

   - 13â -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   7 a 12, caracterizado por a transformação ser levada a efeito durante o descongelamento com agitação rápida das células de levedura congeladas.

   - 14a -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a levedura hospedeira glicosilar especificamente 0 polipeptideo segregado.

   - 15^ -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a produção de <-amilase ser usada como marcação em Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae e Schizo saccharomyces pombe para transformação sob condições não selectivas.

   - 16â - anteriores, caracterizado por o polipeptídeo obtido ser umaoC-amilase.

   - 17â -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado por a oC-amilase obtida ter o seu óptimo de temperatura a cerca de 37°0 e ser inactivada a cerca de 60°C.

   - 18ê -

   Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a oC-amilase obtida ser codificada pela sequência apre sentada na Figura 2 e por todas as modificações do ADN referido que conservam a função da oÇ-amilase codificada.

   - 19§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15 caracterizado por 0 polipeptídeo obtido ser uma glucoamilase .

   - 20a -

   Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a glucoamilase obtida ter 0 seu óptimo de temperatura a cerca de 50°C, ser inactivada a cerca de 60°G e ter a capacidade de hidrolisar amido de cevada completamente em glucose.

   - 21ã Processo para a transformação dum microorganismo, de preferência um microorganismo útil para um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, dotado de capacidade de expressar uma <-amilas e de acordo com qualquer das reivindicações 16 a 18 e/ou uma glucoamilase de acordo com qualquer das reivindicações 19 ou. 20 caracterizado por se integrarem sequências de ADN provenientes de uma levedura dadora contendo sequências de codificação para a referida «£-amilase e/ou glucoamilase por meio de tecnologia de ADN recombinante.

   - 22â -

   Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteri zado por o microorganismo ser seleccionado de entre o grupo cons tituido por leveduras dos géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces ou Kluyveromyces ou por bactérias do gênero Zymomonas ou fungos do género Aspergillus.

   -23^ -

   Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri^ zado por a levedura ser Sacoharomyces cerevisiae.

   Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteri_ zado por a levedura ser do gênero Schwanniomyces, de preferência da espécie Schwanniomyces alluvius.

   -25^ -

   Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri zado por a levedura ter utilização na produção de cerveja, em processos de panificação, na industria alimentar e em processos de fermentação.

   - 26ã Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri zado por a levedura ter utilização na fermentação completa de amido para obtenção de etanol

   - 70 - 27^â Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri zado por a levedura ter de preferência utilização na produção de cerveja especial mediante a capacidade de fermentar dextrinas.

   - 28ê -

   Processo para a preparação de um vector caracterizado por se integrarem sequências de ADN que codificam para um polipeptídeo que é uma enzima amilolítica, de preferência oc-amilase e/ou glucoamilase, tendo o referido vector de preferência utilização num processo de acordo com as reivindicações 1 a 15.

   - 29^â -

   Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o vector obtido poder ser usado como vector lançadeira para Escherichia coli - Saccharomyces cerevisiae - Schwanniomyces alluvius - Schizosaccharomyces pombe.

   - 30a -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 28 ou 29, caracterizado por o vector ser pCJD5-AMGl ou YRpJD2-DC.

   - 31® -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 28 ou 29, caracterizado por o vector ser seleccionado de entre um grupo constituído pelos plasmideos YRpJD2, pCJD5-l ou pCJD5-2.

   - 32- -

   Processo para a preparação de uma sequência de ADN que codifica para um polipeptideo, de preferência uma enzima amilolítica, de preferência dum modo especial uma oC-amilase e/ou glucoamilase, e que é dotado de capacidade de expressar o referido polipeptideo num microorganismo hospedeiro apropriado, de preferência um microorganismo obtido de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 27 e de preferência um microorganismo com utilização num processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15 caracterizado por se utilizar tecnologia de ADN recombinante a partir de ADN natural e/ou cADN e/ou ADN sintético.

   - 33^ -

   Processo de acordo com a reivindicação 32 caracterizado por o ADN ter a sequência apresentada na Figura 2.

   - 34 â -

   Processo de acordo com a reivindicação 32, caracteri zado por o ADN ter a sequência apresentada na Figura 17.

   - 35S -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 32 ou 33, caracterizado por a sequência de ADN obtida codificar para uma oC-amilase de acordo com qualquer das reivindicações 16 a 18.

   - 36- -

   Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por a sequência de ADN obtida, conter a sequência de ADN apresentada na Figura 2, que codifica para a cC-amilase com a sequência de ácidos aminados apresentada na Figura 2.

   - 37a Processo de acordo com qualquer das reivindicações — 32 ou 34, caracterizado por a sequência de ADN obtida codificar para uma glucoamilase de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 20.

   - 38â -

   Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a sequência de ADN obtida, conter a sequência de ADN apresentada na Figura 17, que codifica para a glucoamilase com a sequência de ácidos aminados apresentada na Figura 17.

   I - 39a _

   Processo para a preparação de uma sequência ADN caracterizado por se combinarem sequências de ADN compreendendo um gene estrutural que codifica para uma enzima amilolítica e uma ou várias sequências de ADN com capacidade de regulação da expre ssão do gene estrutural num micro organismo, de preferência num microorganismo obtido de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 27.

   - 40â - . Processo de acordo com a reivindicação 39, caracteri zado por a combinação de ADN obtida conter um gene estrutural que codifica para uma enzima amilolítica duma levedura.

   - 41â -

   Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por 0 gene estrutural codificar para enzimas amilolíticas do género Schwanniomyces, de preferência da espécie Schwanniomyces castellii.

   - 42â Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   39 a 41, caracterizado por o gene estrutural que codifica para uma enzima amiolítica codificar para uma ot-amilase.

   - 43a _

   Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por 0 gene estrutural ter a sequência de ADN apresentada na Figura 2 e codificar para um polipeptideo com a sequência de ácidos aminados apresentada na Figura 2.

   - 44â -

   Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por 0 gene estrutural ter a sequência de ADN apresentada na Figura 17 e codificar para um polipeptideo com a sequência cLe ácidos aminados apresentada na Figura 17.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 39 a 44, caracterizado por a combinação de ADN obtida conter sequências com todas as modificações das sequências de ADN conservando a respectiva função de codificação para uma enzima amilolitica.

   - 46- —

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 39 a 45, caracterizado por 0 gene estrutural conter sequências de ADN derivadas do gene estrutural que codifica para <£-amilase ou glucoamilase que modificam 0 referido produto proteico retendo as respectivas funções de tal modo que 0 referido produto pro teico é segregado através da parede celular no meio de cultura,

   - 47a -

   Processo de acordo com a reivindicação 46, caracte- ~ rizado por a combinação de ADN estar contida num micro organismo hospedeiro de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 27, sendo o referido microorganismo adequado num processo de preparação dum polipeptídeo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15.

   - 48* -

   Processo para a produção de cerveja, caracterizado por se usar uma levedura que recebeu por tecnologias de ADN recombinante sequências de ADN duma levedura dadora que codificam para enzimas amilolíticas, de preferência para oC-amilase e/ou glucoamilase, sendo a levedura usada de preferência Saccharomyces cerevisiae.

   - 49a -

   Processo para a produção de cerveja de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por se usar uma levedura com capacidade de expressão de cC-amilase e/ou uma levedura com capacidade de expressão de ct-amilase e de glucoamilase.

   - 50a -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   48 ou 49, caracterizado por 0 processo de produção ser adaptado à produção de cerveja especial, de preferência cerveja de baixo conteúdo em hidratos de carbono, cerveja de baixo conteúdo calórico ou cerveja de dieta.

   - 51ê Processo de acordo com qualquer das reivindicações

   48 a 50, caracterizado por 0 processo de produção ser adaptado à produção de cerveja contendo níveis de componentes de aroma comparáveis aos de cervejas obtidas por fermentação de mostos . com alto conteúdo de glucose.

   - 52â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 48 a 51, caracterizado por 0 processo ser de duração reduzida devido a uma redução mais rápida no extracto aparente (Extrakt scheinbar = Es) no fim do processo da fermentação.

   - 53- -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 48 a 52, caracterizado por 0 processo de produção ser adaptado à produção de cerveja a partir de mosto denso cujo nível de hidratos de carbono pode ser regulado por uma duração pré-determinada de fermentação e subsequente diluição.

   - 54a -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 48 a 53, caracterizado por 0 processo de produção ser adaptado à fermentação de substratos cujos constituintes estão, numa parte considerável, hidratos de carbono em suspensão.

   - 55a -

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 48 a 54, caracterizado por a levedura obtida por engenharia genética ser posta em contacto com 0 mosto fermentado subsequentemente à fermentação principal mas antes do condicionamento.

   - 56- _

   Processo para a produção de etanol, caracterizado por se usar uma levedura que recebeu por tecnologias de ADN recombinante sequências de ADN duma levedura dadora que codificam para enzimas amilolíticas, de preferência para oC-amilase e/ou glucoamilase, sendo a levedura usada de preferência Saccharomyces cerevisiae.

   - 57a -

   Processo de fermentação caracterizado por se usar uma levedura que recebeu por tecnologias de ADN recombinante sequências de ADN duma levedura dadora que codificam para enzimas amilolíticas, de preferência para oc-amilase e/ou glucoamilase, sendo a levedura usada de preferência Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 23, e sendo o referido processo de fermentação adequado à produção de bebidas produzidas a partir de substratos fermentados ou destilados contendo amido hidratado em suspensão.

   - 58a -

   Processo para a preparação de levedura de padeiro caracterizado por se usar uma levedura que recebeu por tecnologias de ADN recombinante sequências de ADN duma levedura dadora que codificam para enzimas amilolíticas, de preferência para oc-amilase e/ou glucoamilase, sendo a levedura usada de preferên cia Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 23.

   - 59& -

   Processo para a preparação de pão de modo conhecido em si caracterizado por se usar uma levedura de acordo com a hei vindicação 58.

   - 60a -

   Processo para a produção de biomassa, caracterizado por se usar uma levedura que recebeu por tecnologias de ADN recombinante sequências de ADN duma levedura dadora que codificam para enzimas amilolíticas, de preferência para ct-amilase e/ou glucoamilase, sendo a levedura usada de preferência Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 23·

   - 61* -

   - 77 Processo de transformação para a transferência de sequências de ADN de um microorganismo dador para um microorganismo hospedeiro caracterizado por o microorganismo hospedeiro ser submetido a congelamento rápido antes da adição do ADN, sen do de preferência o congelamento rápido levado a efeito com gelo seco em acetona a temperaturas entre cerca de -70°C e -80°C.

   A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na Patente Europeia em 21 de Agosto de 1986 e em 17 de Julho de 1987, sob os n2s.86 111 586.3 e 87 110 370.1, respectivamente.