CN118360284A - 一种强效组成型启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种强效组成型启动子及其应用，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该强效组成型启动子可以强效诱导目的基因表达的，与已知启动子相比，其能够强化5‑氨基咪唑‑4‑甲酰胺核苷酸合成酶的转录水平，从而促进5‑氨基咪唑‑4‑甲酰胺核苷酸合成酶在停滞棒杆菌的表达，进而可提高核苷酸类产品的代谢通量。此外，该启动子突变体SEQ ID NO:1还能够提高异源基因(如Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的α‑淀粉酶amyE基因)在停滞棒杆菌中的表达，因此，有望作为通用启动子，提高其工业应用性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种强效组成型启动子及其应用。
背景技术
微生物细胞工厂是生物制造的核心元件，广泛用于食品、医疗、饲料和化工等行业各种原料的生产；随着代谢工程和合成生物学的发展，相应的多种方法已被开发用于微生物高滴度生产目标产物。其中，启动子工程已成为调控基因表达并优化目标产物生物合成途径的关键技术，广泛应用于微生物的代谢工程改造，启动子是调控基因表达的重要元件，位于结构基因5’端上游非编码区，是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA片段。目前，获得高效的启动子是主要的挑战。
核苷酸(Nucleotide)是DNA和RNA合成的前体物质，在细胞的构成、能量的产生与消耗、机体代谢、功能调节等方面都发挥着举足轻重的作用；由于核苷酸的许多独特、重要的性质及功能，使得核苷酸的应用范围很广，广泛用于食品、农业、医疗、动物饲料和精细化工等行业。在使用微生物菌株发酵生产核苷酸类产品原料时，其代谢途径涉及多个关键酶的参与，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶(phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthetase，EC 6.3.2.6，PurC)作为其中一个关键酶，可通过提高其表达水平以增加核苷酸类终产物的滴度。
在棒状杆菌中，许多内源或异源启动子已被开发用于组成或诱导基因表达，但是可供选择的强效组成型启动子仍十分有限，其中Psod和Peftu是菌株开发中最常用的启动子；然而，由于编码区域5’端的序列也会显著影响基因的表达，同一个启动子后面连接不同的目的基因时，会呈现出不用的启动效果(Mutalik,V.K.et al.Nat.Methods10,354-360(2013))，所以仍需要开发与目的基因相适配的强效启动子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种强效组成型启动子及其应用，以提高目的基因在相关细菌中的表达活性，并应用于酶产品核苷酸产品的制备。
为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种强效组成型启动子，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供所述的启动子的构建方法，包括如下步骤：
步骤1，以质粒pEC-XK99E为模板扩增质粒骨架DNA片段，以及以PSenPutsfGFP为模板扩增sfGFP片段，将以上两个扩增片段进行重组连接，获得pEC-XK99E-sfGFP载体；
步骤2，以pEC-XK99E-sfGFP载体为模板扩增质粒骨架和超折叠绿色荧光蛋白基因的DNA片段，以及以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板扩增PpurC启动子及purC基因前180bp的DNA片段，将以上两个扩增片段进行重组连接，获得pEC-PpurC-sfGFP质粒；
步骤3，以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增启动子片段，以及以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增质粒骨架，将扩增启动子片段与扩增质粒骨架进行重组连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，之后提取质粒并电转化入Corynebacterium stationis ATCC 6872感受态细胞，得到所述启动子。
优选地，所述步骤1中，以质粒pEC-XK99E为模板扩增质粒骨架DNA片段采用的扩增引物为pEC-XK99E1-S和pEC-XK99E1-A，序列号分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和/或，以PSenPutsfGFP为模板扩增sfGFP片段采用的扩增引物为sfGFP-S和sfGFP-A，序列号分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；和/或，
所述步骤2中，以pEC-XK99E-sfGFP载体为模板扩增质粒骨架和超折叠绿色荧光蛋白基因的DNA片段采用的扩增引物为pEC-XK99E-S和pEC-XK99E-A，序列号分别为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8；和/或，以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板扩增PpurC启动子及purC基因前180bp的DNA片段采用的引物为purC-S和purC-A，序列号分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；和/或，
所述步骤3中，以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增启动子片段采用的引物为M-purC-S-1、M-purC-S-2、M-purC-S-3和M-promoter-A，序列号分别为SEQ ID NO.19～SEQ IDNO.22；和/或，以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增质粒骨架采用的引物为M-XK99E-S和M-XK99E-purC-A，序列号分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有所述的启动子和目的基因。
优选地，所述目的基因为编码目标产物生成途径的关键酶基因，更为优选地，所述目标产物为酶产品或核苷酸产品。
优选地，所述关键酶基因选自5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶或者α-淀粉酶的基因。
进一步优选地，所述关键酶基因为5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶purC基因或者α-淀粉酶amyE基因。
优选地，所述重组载体在停滞棒杆菌中表达，更为优选地，所述停滞棒杆菌选自停滞棒杆菌ATCC 6872或其衍生菌株。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的启动子或者所述的重组载体。
第五方面，本发明提供所述的启动子或者所述的重组载体或者所述的宿主细胞在生产酶产品和/或核苷酸产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备出可以强效诱导目的基因表达的新型启动子，与已知启动子相比，其能够强化5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶的转录水平，从而促进5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶在停滞棒杆菌的表达，进而可提高核苷酸类产品的代谢通量。此外，该启动子突变体SEQ ID NO:1还能够提高异源基因(如Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168来源的α-淀粉酶amyE基因)在停滞棒杆菌中的表达，因此，有望作为通用启动子，提高其工业应用性。
附图说明
图1为PpurC启动子文库的设计构思，其中，图A是原始启动子PpurC的序列；图B是PpurC启动子文库的构建策略。
图2为本发明的新型启动子、原始启动子和已知强启动子启动sfGFP的荧光强度对比图。
图3为停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurC-purC、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-purC和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurCmut-purC中5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因转录水平对比图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明一方面提供了一种可提高5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶表达水平的新型启动子，序列号为SEQ ID NO:1：
5’-AAGACTTCGCGGTAAGAGTCCAGAAGAATTTCCCGAAAGCGACGGGAGATTTCTCCCAGACTTGTTTGGGACGCGCGCATGCACTAACATGATACGC-3’(SEQ ID NO:1)。
如本发明所使用的，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译核酸序列，其包括RNA聚合酶识别和结合位点，并且具有启动将位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即聚合酶所识别结合的并启动基因转录的DNA结构域。
停滞棒杆菌ATCC 6872基因组中5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因上游的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2：
5’-AAGACTTCGCGGTAAGAGTCCAGAAGAATTTCCCGAAAGCGACGGGAGATTTCTCCCAGACACTAGCGGGACGCTGTGGGCGCATGCACTAACATTTAGTGC-3’(SEQ ID NO:2)
本发明将启动子SEQ ID NO:2简称为初始启动子或原始启动子，其是相对于突变后的新型启动子SEQ ID NO:1而言的；为表述方便，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别命名为PpurCmut和PpurC。
突变后的新型启动子SEQ ID NO:1与原始启动子SEQ ID NO:2的差别在于：SEQ IDNO:2在第62～67位替换成TTGTTT，第75～79位缺失，第96～100位替换成GATAC，即形成SEQID NO:1。
此外，本发明的启动子序列可通过常规已知的诱变进行修饰。因此，启动子可包括而不限于与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、甚至还更具体地98％或更高、并且最具体地99％或更高的同源性，并且具有相似启动子活性的任何核苷酸序列，其中部分序列被缺失、修饰、取代或插入的具有上述同源性的任何核苷酸序列应被理解为包括在本发明核酸分子的范围内，只要该序列具有启动子活性。
例如，在对应的SEQ ID NO:1的核苷酸序列的内部或末端添加无意义的序列，或在相应SEQ ID NO:1的核苷酸序列的内部或末端缺失部分序列的多核苷酸显然是也包括在本发明的范围内，只要其具有与多核苷酸相同或对应的活性即可。
本发明的启动子是针对适配5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因而筛选的，其亦可用于表达其它目的基因，可用作通用启动子。
本发明另一方面提供了一种5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因表达盒，其包含上述的启动子和位于其下游的5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因。
本发明另一方面提供了一种包含上述5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因表达盒的质粒，优选适合于在停滞棒杆菌中表达的质粒。
本发明另一方面提供了一种停滞棒杆菌工程菌，其包含上述的启动子或者上述5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因表达盒。
上述停滞棒杆菌工程菌的构建方法可以包括如下步骤：
通过基因编辑技术，将停滞棒杆菌基因组中位于5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因上游的启动子即5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因ATG上游102个碱基替换为如权利要求1所述的启动子，筛选阳性克隆株；
或者通过基因编辑技术，将上述的谷氨酰胺转氨酶基因表达盒整合入停滞棒杆菌的基因组中，筛选阳性克隆株；
或者将包含5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因表达盒的质粒转化入停滞棒杆菌感受态中，筛选阳性克隆株。
上述基因编辑技术可以采用Cre/loxp系统、CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cpf1系统等。
上述“转化”是指将包括编码目标蛋白的多核苷酸的载体导入宿主细胞，从而能够在宿主细胞中表达由蛋白质编码的多核苷酸的过程。转化方法可包括可以将核酸导入细胞中的任何方法，并且转化可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的适当标准技术进行。例如电穿孔等，但并不限于此。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明实施例中所用的停滞棒状杆菌均为ATCC 6872，GenBank登录号为GCA_001561975.1。购自美国ATCC公司。
实施例1：新型启动子的获得
本实施例采用的培养基如下：
1)LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％ NaCl，还含有Kan：50ug/ml，如果是LB固体培养基还需加2％琼脂；余量水，质量百分比。
2)BHISG培养基(g/L)：37脑心浸液，10g葡萄糖，9.1g山梨醇，还含有Kan：25ug/ml，如果是BHISG固体培养基还需加2％琼脂，质量百分比；
3)发酵培养基(g/L):glucose,20；urea,3；NH4Cl,2；KH2PO4,1；K2HPO4,3；asparagine,5；L-cysteine,0.04；MnSO4.H2O,0.001；ZnSO4.7H2O,0.001；CuSO4.2 H2O,2×10-4；calcium pantothenate,0.02；CaCl2,0.01；MgSO4,0.3；FeSO4.7 H2O,0.01；biotin,6×10-5；thiamine-HCl,0.01，还含有Kan：25ug/ml；
本发明中所有的引物合成和测序均委托于广州天一辉远基因科技有限公司，如表1所示。
表1引物名称及序列
1.1启动子强度表征质粒的构建
以大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pEC-XK99E(该质粒NCBI GenBank号为AY219683.1，由商业公司合成)为模板，pEC-XK99E1-S和pEC-XK99E1-A为引物扩增质粒骨架DNA片段；以PSenPutsfGFP(该质粒来自：Development of a Transcription Factor-BasedDiamine Biosensor in Corynebacterium glutamicum.Nanna Zhao,etc.ACSSynth.Biol.2021,10,11,3074-3083.)为模板，sfGFP-S和sfGFP-A为引物扩增sfGFP片段，以上两个片段通过一步重组克隆试剂盒(购自北京金沙生物科技有限公司，下同)连接，获得pEC-XK99E-sfGFP载体。
以pEC-XK99E-sfGFP为模板，pEC-XK99E-S和pEC-XK99E-A为引物扩增质粒骨架和超折叠绿色荧光蛋白基因的DNA片段；以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板，以purC-S和purC-A为引物，扩增PpurC启动子及purC基因前180bp的DNA片段，以上两个片段通过一步重组克隆试剂盒连接，获得pEC-PpurC-sfGFP质粒。
以pEC-PpurC-sfGFP为模板，pEC-XK99E2-A和pEC-XK99E-purC-S为引物扩增载体片段，将其与由Psod-S和Psod-purC-A、Peftu-S和Peftu-purC-A分别扩增出的Psod和Peftu片段进行一步重组克隆，获得pEC-Psod-sfGFP和pEC-Peftu-sfGFP质粒。
1.2转化菌株的制备
将1.1中制备的质粒pEC-PpurC-sfGFP、pEC-Psod-sfGFP和pEC-Peftu-sfGFP以及pEC-XK99E通过电转化法转入停滞棒杆菌ATCC 6872中，并在含卡那霉素(25μg/mL)的BHISG琼脂板中获得转化菌株；所获得的重组菌株分别命名为：停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurC-sfGFP、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-sfGFP、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Peftu-sfGFP和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-XK99E。
1.3启动子文库的构建与筛选
以pEC-PpurC-sfGFP为模板，以含突变碱基的M-purC-S-1、M-purC-S-2、M-purC-S-3和M-promoter-A为引物分别扩增启动子片段，以M-XK99E-S和M-XK99E-purC-A为引物扩增质粒骨架，以上启动子片段分别与质粒骨架通过的一步重组克隆试剂盒连接2～3管，每管10μL，分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10感受态细胞，各涂布于1块含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，收集总容量约为106个单克隆的菌体，提取质粒，获得PpurC启动子文库质粒。
约1μg文库质粒通过电转化转入Corynebacterium stationis ATCC 6872感受态细胞，涂布于约20块含25μg/mL卡那霉素的BHISG固体平板，每块平板约含有400-700个克隆，共获得约10000个克隆。用PBS缓冲液将平板上所有克隆洗下进行流式细胞分选(FACS)，分选出荧光增强的克隆涂布于含25μg/mL卡那霉素的BHISG固体平板上。启动子文库的构建策略如图1所示。
1.4启动子文库的强度表征
将1.3由流式细胞仪筛选获得的荧光强度增强的菌株和上述1.2构建的重组菌株分别接种至48深孔板中，每孔为800μL含25μg/mL卡那霉素的发酵液体培养基，30℃、800r/min培养24h后转接至48深孔板中，每孔为900μL含25μg/mL卡那霉素的发酵培养基，每个样品3个平行，30℃、800r/min培养24h后测定OD600和荧光值，激发波长为488nm，发射波长为520nm，荧光强度为测定的荧光值/OD600，即GFU/OD600。其中GFU/OD600值最高的菌株命名为ATCC 6872/pEC-PpurCmut-sfGFP，其展现出野生型ATCC 6872/pEC-PpurC-sfGFP的至少121倍荧光强度，且PpurC还显示出比已知为强启动子Psod和Peftu更高的荧光灵敏度，结果如表2和图2所示。
表2停滞棒杆菌的荧光强度
| 菌株 | 荧光强度(GFU/OD600) |
| ATCC 6872/pEC-XK99E | 804.4 |
| ATCC 6872/pEC-PpurC-sfGFP | 902.0 |
| ATCC 6872/pEC-Psod-sfGFP | 1905.6 |
| ATCC 6872/pEC-Peftu-sfGFP | 2234.1 |
| ATCC 6872/pEC-PpurCmut-sfGFP | 12645.3 |
使用引物Promoter-CX-S和Promoter-CX-A对ATCC 6872/pEC-PpurCmut-sfGFP单菌落进行PCR，将PCR出的片段测序，结果显示PpurCmut序列为SEQ ID NO:1，其与原始启动子SEQ ID NO:2的差别在于：SEQ ID NO:2在第62～67位替换成TTGTTT，第75～79位缺失，第96～100位替换成GATAC。
实施例2：启动子突变体功效的验证
2.1重组菌株的构建
以停滞棒杆菌ATCC 6872自身的5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶基因(purC，SEQ ID NO.37)为报告蛋白构建重组载体pEC-PpurC-purC、pEC-Psod-purC和pEC-PpurCmut-purC，具体包括：以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板，以C-S和C-A为引物，扩增purC基因片段；以pEC-PpurC-sfGFP为模板，以C-XK-A和C-XK-S为引物，扩增载体片段；以pEC-Psod-sfGFP为模板，以Psod-C-A和C-XK-S为引物，扩增载体片段；以pEC-PpurCmut-sfGFP为模板，以Cmut-XK-A和C-XK-S为引物，扩增载体片段；；将三个载体片段分别与purC基因片段通过一步重组克隆试剂盒连接，获得pEC-PpurC-purC、pEC-Psod-purC和pEC-PpurCmut-purC重组载体。
将上述重组载体电转入ATCC 6872感受态中，构建相应重组菌株，分别命名为:停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurC-purC、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-purC和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurCmut-purC。
2.2总RNA的提取
将原始菌株ATCC 6872/pEC-PpurC-purC、ATCC 6872/pEC-Psod-purC和ATCC6872/pEC-PpurCmut-purC接种至种子培养基，30℃，250rpm条件下培养20h，控制起始OD600为1，将种子液转接至基本培养基中，培养8h后，分别取各个培养菌株的发酵液4ml，6000rpm/min，离心3min弃上清，收集菌体，往各菌体中加入1.2ml混匀的AES-酚-氯仿混合液充分重悬菌体，剧烈振荡，65℃处理15min，期间振荡3min，静止3min；冰浴5min，4℃，12000g离心10min，小心吸取上层水相至装有600μL氯仿的离心管中，混匀，4℃，12000g离心10min，小心吸取上层水相至干净的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10的3MNaAc，离心管上下颠倒2～3次，置于-20℃沉淀30min；4℃，12000g离心15min，弃上清，用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心5min，弃上清，短暂离心，吸净离心管中残留的液体，在超净工作台放置2～3min
加入20μL的RNase-free水，溶解RNA沉淀，取1μL RNA溶液用Nanodrop(Thermo)检测RNA溶液的浓度，记录A260/A280值，该值介于1.8-2.0之间则认为RNA质量合格，可于-80℃保存并进行后续实验。
2.3去除RNA样品中的DNA及反转录
由于总RNA的提取可能会有基因组DNA的污染，因此要去除RNA中的基因组DNA。去除gDNA的体系如下表3：
表3去除gDNA的体系
将上述10μL体系置于PCR仪中进行反应；
反应程序为：42℃2min，4℃∞。
将上述反应完的体系进行反转录反应，反转录PCR的体系如下表4：
表4反转录PCR的体系
将上述20μL体系置于PCR仪中进行反应；
反应程序为：37℃15min，85℃5sec，4℃∞。
2.4荧光定量PCR
将去除DNA及反转录的RNA样品进行荧光定量PCR，选择16S rRNA作为内参基因，使用ABI的Q1荧光定量PCR仪，艾科瑞生物的SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(含示踪染料，含Rox)。
荧光定量PCR反应体系如下表5：
表5荧光定量PCR反应体系
注：采用Primer F和Primer R表示表7中的引物。
将上述20μL体系加入96孔板内置于荧光定量PCR仪中进行反应；
PCR反应程序如下表6：
表6 PCR反应程序
荧光定量PCR所使用的引物如下表7：当配制16S rRNA的体系时，所用引物为16S-F和16S-R；当配制purC基因的体系时，所用引物为C-RT-S和C-RT-A；
表7荧光定量PCR所使用的引物
选择16S rRNA作为内参基因，purC基因的转录水平采用2-△△Ct方法计算，荧光定量PCR结果如图3所示，在发酵24h时，停滞棒杆菌工程菌ATCC 6872/pEC-PpurCmut-purC的purC基因的转录水平比原始菌株ATCC 6872/pEC-PpurC-purC大大提高了约4～5倍。证明启动子突变体能显著提高停滞棒杆菌中5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶purC基因的转录水平，从而促进5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶在停滞棒杆菌的表达，进而可提高核苷酸类产品的代谢通量。
实施例3：评价启动子突变体表达异源α-淀粉酶基因的能力
3.1重组菌株的构建
以α-淀粉酶amyE基因(来源Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168，SEQID NO.42)为报告蛋白构建重组载体pEC-PpurC-amyE、pEC-Psod-amyE和pEC-PpurCmut-amyE，具体包括：以Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168基因组为模板，以amyE-S和amyE-A为引物，扩增amyE基因片段；以pEC-PpurC-sfGFP为模板，以C-amyE-A和C-amyE-S为引物扩增载体片段；以pEC-Psod-sfGFP为模板，以Psod-amyE-A和C-amyE-S为引物扩增载体片段；以pEC-PpurCmut-sfGFP为模板，以Cmut-amyE-A和C-amyE-S为引物，扩增载体片段；将三个载体片段分别与amyE基因片段通过一步重组克隆试剂盒连接，获得pEC-PpurC-amyE、pEC-Psod-amyE和pEC-PpurCmut-amyE重组载体。
将pEC-PpurC-amyE、pEC-Psod-amyE和pEC-PpurCmut-amyE重组载体电转入ATCC6872感受态中，构建相应重组菌ATCC6872/pEC-PpurC-amyE、ATCC 6872/pEC-Psod-amyE和ATCC6872/pEC-PpurCmut-amyE
3.2α-淀粉酶活性检测
将重组菌株ATCC 6872/pEC-PpurC-amyE、ATCC 6872/pEC-Psod-amyE和ATCC6872/pEC-PpurCmut-amyE在种子液中培养20h，控制起始OD600＝0.1将其转接入发酵培养基中，发酵24h后收集菌体，将1ml发酵菌液收集于2ml离心管，7000rpm，离心3min，使用PBS缓冲液(pH 7.4)洗菌体3次，用1ml PBS缓冲液(pH 7.4)重悬菌体并转移至装有0.5g的氧化锆珠子的破碎管中，使用BeadRuptor 12(Omni International，Inc.，USA)仪器进行破碎。每次裂解30s，放置冰上1min，重复操作10个循环之后将样品在4℃，14,000rpm，离心3min，最后缓慢吸取上清用于后续蛋白浓度测定和α-淀粉酶活性测定；蛋白浓度测定采用Bradford法，淀粉酶活性使用北京盒子生工科技有限公司的α-淀粉酶(α-AL)活性检测试剂盒(试剂一和试剂二为该试剂盒中的产品)测定。
α-淀粉酶活性测定方法如下：
标准稀释液的制备：将10mg/mL葡萄糖标准液使用蒸馏水稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL即为标准稀释液。
淀粉酶原液的制备：取上述破碎后上清液稀释适当倍数获得；
灭活酶原液的制备：取适量淀粉酶原液沸水浴处理5min(密封以防止水分散失)，冷却至室温。
在离心管中依次加入下表8所示的试剂：
表8试剂组成及反应程序
吸光值测定：取反应液至96孔酶标板中，于酶标仪中测定540nm处吸光值，记为A测定、A对照、A标准和A空白；计算ΔA测定＝A测定-A对照，ΔA标准＝A标准-A空白。注：每个测定管均需设一个对照管，空白管只需测定1-2次。
标准曲线的建立：以0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL标准稀释液浓度为横坐标(x)，以其对应的ΔA标准为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到线性回归方程y＝kx+b，将ΔA测定带入公式中得到x(mg/mL)。
α-淀粉酶(α-AL)活性计算：单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1mg还原糖定义为一个酶活力单位；
V样：反应体系中加入酶液的体积，0.25mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，5min。
将各重组菌测得的x和Cpr代入上述酶活计算公式，计算得到的酶活如下表9：
表9 ATCC 6872各重组菌中的α-淀粉酶活性
如上表9所示，证实了在停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)中可异源表达Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的α-淀粉酶amyE基因，与停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurC-amyE和ATCC 6872/pEC-Psod-amyE几乎没有太高α-淀粉酶活性相比，停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurCmut-amyE展现出显著增加的α-淀粉酶活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种强效组成型启动子，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的启动子的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，以质粒pEC-XK99E为模板扩增质粒骨架DNA片段，以及以PSenPutsfGFP为模板扩增sfGFP片段，将以上两个扩增片段进行重组连接，获得pEC-XK99E-sfGFP载体；
步骤2，以pEC-XK99E-sfGFP载体为模板扩增质粒骨架和超折叠绿色荧光蛋白基因的DNA片段，以及以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板扩增PpurC启动子及purC基因前180bp的DNA片段，将以上两个扩增片段进行重组连接，获得pEC-PpurC-sfGFP质粒；
步骤3，以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增启动子片段，以及以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增质粒骨架，将扩增启动子片段与扩增质粒骨架进行重组连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，之后提取质粒并电转化入Corynebacterium stationis ATCC 6872感受态细胞，得到所述启动子。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，以质粒pEC-XK99E为模板扩增质粒骨架DNA片段采用的扩增引物为pEC-XK99E1-S和pEC-XK99E1-A，序列号分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和/或，以PSenPutsfGFP为模板扩增sfGFP片段采用的扩增引物为sfGFP-S和sfGFP-A，序列号分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；和/或，
所述步骤2中，以pEC-XK99E-sfGFP载体为模板扩增质粒骨架和超折叠绿色荧光蛋白基因的DNA片段采用的扩增引物为pEC-XK99E-S和pEC-XK99E-A，序列号分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；和/或，以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板扩增PpurC启动子及purC基因前180bp的DNA片段采用的引物为purC-S和purC-A，序列号分别为SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10；和/或，
所述步骤3中，以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增启动子片段采用的引物为M-purC-S-1、M-purC-S-2、M-purC-S-3和M-promoter-A，序列号分别为SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.22；和/或，以pEC-PpurC-sfGFP为模板扩增质粒骨架采用的引物为M-XK99E-S和M-XK99E-purC-A，序列号分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的启动子和目的基因。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因为编码目标产物生成途径的关键酶基因，优选地，所述目标产物为酶产品或核苷酸产品。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述关键酶基因选自5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶或者α-淀粉酶的基因。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述关键酶基因为5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸合成酶purC基因或者α-淀粉酶amyE基因。
8.根据权利要求4～7任一项所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体在停滞棒杆菌中表达，优选地，所述停滞棒杆菌选自停滞棒杆菌ATCC 6872或其衍生菌株。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1所述的启动子或者权利要求4～8任一项所述的重组载体。
10.权利要求1所述的启动子或者权利要求4～8任一项所述的重组载体或者权利要求9所述的宿主细胞在生产酶产品和/或核苷酸产品中的应用。
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