CN117844810A - 一种提高甘氨酰胺核苷酸合成酶表达水平的启动子及其应用 - Google Patents
一种提高甘氨酰胺核苷酸合成酶表达水平的启动子及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高甘氨酰胺核苷酸合成酶表达水平的启动子及其应用，属于合成生物学领域。本发明以Corynebacterium stationis ATCC 6872中甘氨酰胺核苷酸合成酶基因的原始启动子PpurD为模板构建启动子文库，以sfGFP为报告蛋白，在sfGFP前通过GGGGS linker加上甘氨酰胺核苷酸合成酶基因5’端180bp的序列，筛选出显著增加甘氨酰胺核苷酸合成酶基因的表达的启动子PpurDmut，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。与原始启动子PpurD和已知强效启动子Psod相比，本发明提供的启动子PpurDmut能够强化甘氨酰胺核苷酸合成酶的转录水平，从而促进甘氨酰胺核苷酸合成酶在停滞棒杆菌的表达，进而可提高核苷酸类产品的代谢通量，此外，该启动子还能提高异源基因在停滞棒杆菌中的表达，可作为通用启动子，具有较强的工业应用性。
Description
技术领域
本公开属于合成生物学领域，涉及一种启动子及其应用，具体涉及一种用于在停滞棒杆菌中提高甘氨酰胺核苷酸合成酶基因转录水平的启动子及其应用。
背景技术
核苷酸(Nucleotide)是DNA和RNA合成的前体物质，在细胞的构成、能量的产生与消耗、机体代谢、功能调节等方面都发挥着举足轻重的作用；由于核苷酸的许多独特、重要的性质及功能，使得核苷酸的应用范围很广，广泛用于食品、农业、医疗、动物饲料和精细化工等行业。微生物菌株发酵生产核苷酸的途径是利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位等简单物质为原料合成核苷酸的过程，即核苷酸的从头合成途径，该途径包括IMP(次黄嘌呤核苷酸)的合成；由IMP生成AMP(腺嘌呤核苷酸)和GMP(鸟嘌呤核苷酸)；一磷酸核苷磷酸化生成二磷酸核苷和三磷酸核苷。参阅图1，图1为核苷酸从头合成途径中IMP的合成途径，包括11步反应：(1)5-磷酸核糖的活化；(2)获得嘌呤的N9原子；(3)获得嘌呤C4、C5和N7原子；(4)获得嘌呤C8原子；(5)获得嘌呤的N3原子；(6)嘌呤咪唑环的形成；(7)获得嘌呤C6原子；(8)获得N1原子；(9)去除延胡索酸；(10)获得C2；(11)环化生成IMP，该合成途径涉及多个关键酶的参与。甘氨酰胺核苷酸合成酶(glycineamide ribonucleotide synthetase，EC 6.3.4.13，PurD)作为其中一个关键酶，可通过提高其表达水平以增加核苷酸类终产物的滴度。
随着代谢工程和合成生物学的发展，相应的多种方法已被开发用于微生物高滴度生产目标产物，其中启动子工程已成为调控基因表达并优化目标产物生物合成途径的关键技术，并广泛应用于微生物的代谢工程改造。启动子是调控基因表达的重要元件，其位于结构基因5’端上游非编码区，是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA片段。启动子的活性受到多种因素的影响，而在基因的异源表达中，常常需要根据实际需求选择不同活性的启动子。
棒状杆菌属微生物是一类重要的细菌属，很多的棒状杆菌作为工业生产模式菌株，用于实现多种蛋白、代谢物等的高效生产，其中停滞棒杆菌是目前工业上发酵生产核苷酸类产品的主要微生物菌株。在棒状杆菌中，许多内源或异源启动子已被开发用于组成或诱导基因表达，但是可供选择的强效组成型启动子仍十分有限。其中，Psod和Peftu是菌株开发中最常用的启动子，但其对目的基因的启动效果受到编码区域5’端的序列、及其连接的不同的目的基因的影响，当其应用于停滞棒杆菌中表达内源甘氨酰胺核苷酸合成酶时，其存在表达效率较低等问题，导致从头合成途径中核苷酸类终产物的滴度较低，所以仍需要开发与目的基因相适配的强效启动子。
发明内容
基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的启动子，将所述启动子与甘氨酰胺核苷酸合成酶基因可操控地连接，可实现甘氨酰胺核苷酸合成酶基因在停滞棒杆菌中的高效表达，从而增加终核苷酸类终产物滴度的滴度。
本发明提供一种启动子，其中，所述启动子选自如下(i)-(iii)中组成的组中的任一项：
(i)核苷酸序列为SEQ ID NO:1的多核苷酸；
(ii)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少80％，可选至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同源性，并且具有相似启动子活性的多核苷酸；
(iii)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明提供的启动子由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的原始启动子的第40、42、44～51和53～56位核苷酸从C、G、CGAGCGAA和AAGT突变为A、A、GCCCAATT和TCTG得到，本发明的启动子是针对适配甘氨酰胺核苷酸合成酶基因而筛选的，与原始启动子或已知强效启动子Psod相比，本发明的启动子能够强化甘氨酰胺核苷酸合成酶的转录水平，从而促进甘氨酰胺核苷酸合成酶在停滞棒杆菌的表达，进而可提高核苷酸类产品的代谢通量。此外，本发明的启动子能够提高异源基因(如Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的α-淀粉酶amyE基因)在停滞棒杆菌中的表达，实现了分别比原始启动子高2.30倍、比现有棒杆菌启动子高2.24倍的α-淀粉酶表达水平，因此本发明提供的启动子可作为通用启动子，具有较强的工业应用性。
进一步，本发明提供一种基因表达盒，包含所述启动子，以及与所述启动子可操作地连接的目的基因。
进一步，本发明提供一种重组载体，包含所述启动子，或所述基因表达盒。
进一步，本发明提供一种重组菌株，包含所述基因表达盒，或所述重组载体。
进一步，所述重组菌株为停滞棒杆菌。
进一步，所述停滞棒杆菌为停滞棒杆菌ATCC 6872或其衍生菌株。
进一步，本公开提供了一种停滞棒杆菌工程菌，所述停滞棒杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：
通过基因编辑技术，将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的停滞棒杆菌基因组中位于甘氨酰胺核苷酸合成酶基因上游的启动子即甘氨酰胺核苷酸合成酶基因ATG上游68个碱基替换为所述启动子，筛选阳性克隆株；
或通过基因编辑技术，将目的基因为谷氨酰胺转氨酶基因的基因表达盒整合入停滞棒杆菌的基因组中，筛选阳性克隆株；
或将包含所述目的基因为谷氨酰胺转氨酶基因的基因表达盒的质粒转化入停滞棒杆菌感受态中，筛选阳性克隆株。
进一步，本发明提供所述启动子在停滞棒杆菌中启动目的基因高效表达中的应用。
进一步，所述基因表达盒，或所述重组载体，或所述重组菌株在制备蛋白中的应用。
进一步，所述蛋白包括甘氨酰胺核苷酸合成酶。
进一步，本发明提供一种生产核苷酸类产品的方法，所述方法包括培养含所述启动子与甘氨酰胺核苷酸合成酶基因可操作的连接的重组菌株，并收集产生的核苷酸。
说明书附图
图1为核苷酸从头合成途径的第一阶段：IMP(次黄嘌呤核苷酸)的合成。
图2中(A)为原始启动子PpurD的序列；(B)为PpurD启动子文库的设计和构建策略。
图3为实施例1制备的启动子突变体与原始启动子和已知强启动子启动sfGFP的荧光强度对比图。
图4为实施例2中停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurD-purD、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-purD和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurDmut-purD中甘氨酰胺核苷酸合成酶基因转录水平对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。在核糖核酸(RNA)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。启动子的序列中，-35区是RNA聚合酶的识别位点，-10区是RNA聚合酶的结合位点。
本发明的启动子序列可通过常规已知的诱变进行修饰。因此，启动子可包括而不限于与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、甚至还更具体地98％或更高、并且最具体地99％或更高的同源性，并且具有相似启动子活性的任何核苷酸序列，其中部分序列被缺失、修饰、取代或插入的具有上述同源性的任何核苷酸序列应被理解为包括在本公开核酸分子的范围内，只要该序列具有启动子活性。例如，在对应的SEQ ID NO:1的核苷酸序列的内部或末端添加无意义的序列，或在相应SEQ ID NO:1的核苷酸序列的内部或末端缺失部分序列的多核苷酸显然是也包括在本公开的范围内，只要其具有与多核苷酸相同或对应的活性即可。
本文中将启动子SEQ ID NO:2简称为初始启动子或者原始启动子，其实相对于突变的启动子SEQ ID NO:1而言的。为了表述方便起见，在本文中可以将初始型启动子SEQ IDNO:2与其突变体比如SEQ ID NO:1统称为“启动子”。
本发明中的术语“基因表达盒”是指含有启动子、目的基因或目的基因克隆位点和终止子、且其中的基因能正常进行转录和翻译的序列。所述目的基因可为蛋白编码基因。
本发明中的术语“载体”是指把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞)所需要的运载工具。基因工程上所用的载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
本发明中的术语“衍生菌株”是指通过任何转化衍生的菌株，例如通过一次或多次杂交和/或通过突变和/或通过遗传转化。
本发明中基因编辑技术可以采用Cre/loxp系统、CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cpf1系统等。
本发明中的术语“转化”是指将包括编码目标蛋白的多核苷酸的载体导入宿主细胞，从而能够在宿主细胞中表达由蛋白质编码的多核苷酸的过程。转化方法可包括可以将核酸导入细胞中的任何方法，并且转化可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的适当标准技术进行。例如电穿孔等，但并不限于此。
本发明实施例中所有的引物合成和测序均委托于广州天一辉远基因科技有限公司。
本发明实施例所用试剂如下：
LB种子培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％ NaCl。
LB固体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％ NaCl，50ug/mL卡那霉素，2％琼脂糖。
发酵培养基：20g/L葡萄糖；3g/L尿素，2g/L NH4Cl，1g/L KH2PO4，3g/L K2HPO4，5g/L天冬酰胺，0.04g/L L-cysteine(半胱氨酸)，0.001g/L MnSO4·H2O，0.001g/L ZnSO4·7H2O，2×10-4g/L CuSO4·2H2O，0.02g/L泛酸钙，0.01g/L CaCl2，0.3g/L MgSO4，0.01g/LFeSO4·7H2O，6×10-5g/L biotin(生物素)，0.01g/L thiamine-HCl(维生素B1盐酸盐)。
质粒pEC-XK99E：公众可根据NCBI GenBank号为AY219683.1(update：05-SEP-2003)的序列交商业公司合成。
pSenPutsfGFP：为实验室保存的包含超折叠绿色荧光蛋白sfGFP基因的质粒。
Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组的GenBank登录号为GCA_001561975.1。
甘氨酰胺核苷酸合成酶(glycineamide ribonucleotide synthetase，EC6.3.4.13，PurD)的GenBank号为AW169_RS11355。
本发明实施例中所使用其他材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
发酵法生产核苷酸类产品过程中，提高代谢途径即核苷酸从头合成途径中关键酶的基因表达量是提高终产物滴度的重要方法之一，其中甘氨酰胺核苷酸合成酶(purD基因)是从头合成途径的第二个关键酶，可通过启动子工程提高其表达量。目前工业上发酵生产核苷酸类产品主要使用的工业菌株是停滞棒杆菌，但停滞棒杆菌中可用的强效组成型启动子十分有限，因此本发明通过构建启动子文库从中筛选出较强的启动子。参阅图2，为提高启动子与甘氨酰胺核苷酸合成酶基因的适配性，本发明以甘氨酰胺核苷酸合成酶基因基因组中原始启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，命名为PpurD)为模板构建启动子文库，以sfGFP为报告蛋白，在报告蛋白sfGFP前通过GGGGS linker加上甘氨酰胺核苷酸合成酶基因5’端180bp的序列，以这种方式筛选出的强效启动子理论上可显著增加甘氨酰胺核苷酸合成酶基因的表达。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：启动子突变体的制备
(1)启动子强度表征质粒的构建
以大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pEC-XK99E为模板，设计引物pEC-XK99E1-S和pEC-XK99E1-A为引物扩增质粒骨架DNA片段；以pSenPutsfGFP为模板，sfGFP-S和sfGFP-A为引物扩增sfGFP片段；将上述扩增的质粒骨架DNA片段和sfGFP片段通过一步重组克隆试剂盒连接，获得pEC-XK99E-sfGFP重组质粒。以重组质粒pEC-XK99E-sfGFP为模板，pEC-XK99E-S和pEC-XK99E-A为引物扩增质粒骨架和超折叠绿色荧光蛋白基因的DNA片段；以Corynebacterium stationis ATCC 6872基因组为模板，以purD-S和purD-A为引物，扩增PpurD启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)及purD基因前180bp的DNA片段；将上述两个片段通过一步重组克隆试剂盒连接，获得pEC-PpurD-sfGFP重组质粒。
以重组质粒pEC-PpurD-sfGFP为模板，pEC-XK99E2-A和pEC-XK99E-purD-S为引物扩增载体片段，将其分别与由Psod-S和Psod-purD-A扩增出的Psod片段、由Peftu-S和Peftu-purD-A扩增出的Peftu片段进行一步重组克隆，获得重组质粒pEC-Psod-sfGFP和pEC-Peftu-sfGFP。上述引物的引物序列见表1。
表1引物序列表
(2)转化菌株的制备
将步骤(1)中制备的质粒(载体)pEC-PpurD-sfGFP、pEC-Psod-sfGFP和pEC-Peftu-sfGFP以及pEC-XK99E通过电转化法转入停滞棒杆菌ATCC 6872感受态细胞(Corynebacterium stationis ATCC 6872)中，并在含25μg/mL卡那霉素的BHISG固体平板中获得以下重组菌株：停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurD-sfGFP、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-sfGFP、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Peftu-sfGFP和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-XK99E。
(3)启动子文库的构建与筛选
以步骤(1)制备的重组质粒pEC-PpurD-sfGFP为模板，以表2所示含突变碱基的M-purD-S-1、M-purD-S-2、M-purD-S-3和M-promoter-A为引物分别扩增启动子片段，以M-XK99E-S和M-XK99E-purD-A为引物扩增质粒骨架，将上述启动子片段分别与质粒骨架通过的一步重组克隆试剂盒连接2～3管，每管10μL，获得重组质粒并分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10感受态细胞，将细胞涂布于1块含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，收集总容量约为106个单克隆的菌体，提取重组质粒，获得PpurD启动子文库质粒。
约1μg文库质粒通过电转化转入停滞棒杆菌ATCC 6872感受态细胞，将细胞涂布于约20块含25μg/mL卡那霉素的BHISG固体平板上，每块平板约含有400-700个克隆，共获得约10000个克隆。用PBS缓冲液将平板上所有克隆洗下进行流式细胞分选(FACS)，分选出荧光增强的克隆并涂布于含25μg/mL卡那霉素的BHISG固体平板上，获得荧光强度增强的重组菌株。
表2引物序列表
(4)启动子文库的强度表征
将步骤(3)中筛选获得的荧光强度增强的重组菌株和步骤(2)构建的重组菌株接种至48深孔板中，每孔含800μL含25μg/mL卡那霉素的发酵培养基，30℃、800r/min培养24h后转接至新的48深孔板中，每孔含900μL含25μg/mL卡那霉素的发酵培养基，每个样品3个平行，30℃、800r/min培养24h后测定OD600和荧光值(激发波长为488nm，发射波长为520nm)，荧光强度为测定的荧光值/OD600，即GFU/OD600。
参阅表3和图3，GFU/OD600值最高的启动子突变体命名为PpurDmut，其对应的重组菌株命名为ATCC 6872/pEC-PpurDmut-sfGFP，该重组菌株展现出ATCC 6872/pEC-PpurD-sfGFP(即原始启动子的重组菌株)的至少33倍荧光强度，且启动子突变体PpurDmut还显示出比已知为强效启动子的Psod和Peftu更高的荧光灵敏度。
表3停滞棒杆菌的荧光强度
使用表4所示引物Promoter-CX-S和Promoter-CX-A对ATCC 6872/pEC-PpurDmut-sfGFP单菌落进行PCR扩增，并对扩增的PCR片段进行测序。结果显示PpurDmut的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其与原始启动子PpurD的差别在于：PpurDmut(SEQ ID NO:1所示序列)的第40、42、44～51和53～56位的核苷酸由PpurD(SEQ ID NO:2所示序列)相应位置的C、G、CGAGCGAA和AAGT突变为A、A、GCCCAATT和TCTG。
表4引物序列表
实施例2：启动子突变体功效的验证
(1)重组菌株的构建
以停滞棒杆菌ATCC 6872自身的甘氨酰胺核苷酸合成酶基因(purD)为报告蛋白构建重组载体pEC-PpurD-purD、pEC-Psod-purD和pEC-PpurDmut-purD，将上述重组载体电转入停滞棒杆菌ATCC 6872感受态中，构建相应重组菌株：停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurD-purD、停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-purD和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-PpurDmut-purD。
(2)总RNA的提取
将重组菌株ATCC 6872/pEC-PpurD-purD、ATCC 6872/pEC-Psod-purD和ATCC6872/pEC-PpurDmut-purD接种至LB种子培养基，30℃，250rpm条件下培养20h，获得种子液。控制起始OD600为1，将种子液转接至基本培养基中培养8h，分别取4mL各菌株的发酵液于6000rpm/min，离心3min，弃上清收集菌体。
往各菌体中加入1.2mL混匀的AES-酚-氯仿混合液充分重悬菌体，剧烈振荡，65℃处理15min，期间每振荡3min、静止3min。然后冰浴5min，于4℃、12000g离心10min，小心吸取上层水相转移至装有600μL氯仿的离心管中，混匀，4℃、12000g离心10min，小心吸取上层水相至干净的1.5mL离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10的3M NaAc，离心管上下颠倒2～3次，置于-20℃沉淀30min。于4℃、12000g离心15min，弃上清，用1mL 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃、12000g离心5min，弃上清，短暂离心并吸净离心管中残留的液体。将沉淀在超净工作台放置2～3min，加入20μL的RNase-free水溶解RNA沉淀，取1μL RNA溶液用Nanodrop(Thermo)检测RNA溶液的浓度，记录A260/A280值，该值介于1.8-2.0之间则认为RNA质量合格，于-80℃保存RNA并用于后续实验。
(3)去除RNA样品中的DNA及反转录
总RNA的提取可能会有基因组DNA的污染，因此在反转录前先去除RNA中的基因组DNA。将表5所示去除gDNA的体系置于PCR仪中进行反应，反应程序为：42℃，2min，于4℃保温。
表5去除gDNA的体系
上述反应完的体系进行反转录反应：按表6所示反转录PCR的体系置于PCR仪中进行反应；反应程序为：37℃加热15min，85℃加热5sec，于4℃保温。
表6反转录PCR的体系
(4)荧光定量PCR
荧光定量PCR使用ABI的Q1荧光定量PCR仪，艾科瑞生物的SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(含示踪染料，含Rox)。将20μL荧光定量PCR反应体系加入96孔板内置于荧光定量PCR仪中进行反应，PCR反应体系如表7所示，PCR反应程序如表8所示，PCR所使用的引物如表9所示。
表7荧光定量PCR反应体系
表8PCR反应程序
表9荧光定量PCR引物序列表
选择16S rRNA作为内参基因，其它相关基因的转录水平采用2-△△Ct方法计算。
荧光定量PCR结果如图4所示，发酵24h时，与原始启动子的重组菌株ATCC 6872/pEC-PpurD-purD相比，重组菌株ATCC 6872/pEC-PpurDmut-purD中purD基因的转录水平显著提高，证明启动子突变体PpurDmut能显著提高停滞棒杆菌中purD基因的转录水平，进而提高甘氨酰胺核苷酸合成酶的表达，甘氨酰胺核苷酸合成酶作为核苷酸合成代谢途径的一个关键酶，其表达增加可提高核苷酸类产品的代谢通量，进而提高核苷酸的产率。
实施例3：评价启动子突变体表达异源α-淀粉酶基因的能力
(1)重组菌株的构建
以α-淀粉酶amyE基因(来源Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)为报告蛋白构建重组载体pEC-PpurD-amyE、pEC-Psod-amyE和pEC-PpurDmut-amyE，将pEC-PpurD-amyE、pEC-Psod-amyE和pEC-PpurDmut-amyE重组载体电转入停滞棒杆菌ATCC 6872感受态中，构建相应的重组菌株ATCC 6872/pEC-PpurD-amyE、ATCC 6872/pEC-Psod-amyE和ATCC 6872/pEC-PpurDmut-amyE。
(2)α-淀粉酶活性诱导表达
将重组菌株ATCC 6872/pEC-PpurD-amyE、ATCC 6872/pEC-Psod-amyE和ATCC6872/pEC-PpurDmut-amyE在种子液中培养20h，控制起始OD600＝0.1将其转接入发酵培养基中，发酵24h后收集菌体，将1mL发酵菌液收集于2mL离心管，7000rpm，离心3min，使用PBS缓冲液(pH 7.4)洗菌体3次，用1mL PBS缓冲液(pH 7.4)重悬菌体并转移至装有0.5g的氧化锆珠子的破碎管中，使用Bead Ruptor 12(Omni International，Inc.，USA)仪器进行破碎。每次裂解30s，放置冰上1min，重复操作10个循环之后将样品在4℃，14000rpm，离心3min，最后缓慢吸取上清用于后续蛋白浓度测定和α-淀粉酶活性测定。
(3)α-淀粉酶活性检测
采用Bradford法测定蛋白浓度，使用北京盒子生工科技有限公司的α-淀粉酶(α-AL)活性检测试剂盒测定淀粉酶活性，其测定方法如下：
将10mg/mL葡萄糖标准液使用蒸馏水稀释至0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.00625mg/mL，得到标准稀释液。取步骤(2)中上清液稀释适当倍数获得淀粉酶原液。取适量淀粉酶原液沸水浴处理5min(密封以防止水分散失)，冷却至室温，制得灭活酶原液。
测定体系参见表10，分别在测定管、对照管、标准管和空白管中加入250μL淀粉酶原液、250μL灭活酶原液、250μL标准稀释液和250μL蒸馏水，然后将各体系充分混匀，置于70℃处理15min，冷却至室温，然后在测定管中加入250μL试剂二，将各体系充分混匀，于40℃准确反应5min。然后在测定管内加入500μL试剂一，同时在对照管、标准管和空白管中各加入500μL试剂一和250μL试剂二，将各体系混合均匀，沸水浴处理10min后冷却至室温，取反应液至96孔酶标板中，于酶标仪中测定540nm处吸光值，记为A测定、A对照、A标准和A空白；计算ΔA测定＝A测定-A对照，ΔA标准＝A标准-A空白。其中，每个测定管均需设一个对照管。
表10α-淀粉酶活性测定体系
以0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.00625mg/mL的标准稀释液浓度为横坐标(x)，以其对应的ΔA标准为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到线性回归方程y＝kx+b，将ΔA测定带入公式中得到x(mg/mL)。
α-淀粉酶(α-AL)的酶活力单位定义为：每mg组织蛋白每分钟催化生成1mg还原糖定义为一个酶活力单位。
α-淀粉酶(α-AL)酶活的计算公式为：其中V样为反应体系中加入酶液的体积，即0.25mL；Cpr(mg/mL)为样本蛋白浓度；T为反应时间，即5min。
将各重组菌测得的x和Cpr代入上述酶活计算公式，计算得到的酶活见表11。
表11ATCC 6872各重组菌中的α-淀粉酶活性
参阅表11，在停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)中可异源表达Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168来源的α-淀粉酶amyE基因，并且与停滞棒杆菌ATCC6872/pEC-PpurD-amyE和停滞棒杆菌ATCC 6872/pEC-Psod-amyE相比，停滞棒杆菌ATCC6872/pEC-PpurDmut-amyE展现出显著增加的α-淀粉酶活性，说明PpurDmut是一种通用型强效启动子。
综上，与原始启动子PpurD、现有强启动子Psod相比，本发明提供的启动子突变体PpurDmut能够强化甘氨酰胺核苷酸合成酶的转录水平，从而促进甘氨酰胺核苷酸合成酶在停滞棒杆菌的表达，进而可提高核苷酸类产品的代谢通量。此外，本发明的启动子能够提高异源基因(如Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的α-淀粉酶amyE基因)在停滞棒杆菌中的表达，实现了分别比原始启动子PpurD高2.30倍、比现有强启动子Psod高2.24倍的α-淀粉酶酶活，因此本发明提供的启动子可作为通用启动子，具有较强的工业应用性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种基因表达盒，其特征在于，包含如权利要求1所述启动子，以及与所述启动子可操作地连接的目的基因。
3.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求1所述启动子，或如权利要求2所述基因表达盒。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含如权利要求2所述基因表达盒，或如权利要求3所述重组载体。
5.如权利要求4所述重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的宿主细胞为停滞棒杆菌。
6.如权利要求5所述重组菌株，其特征在于，所述停滞棒杆菌为停滞棒杆菌ATCC 6872或其衍生菌株。
7.如权利要求1所述启动子在停滞棒杆菌中启动目的基因高效表达中的应用。
8.如权利要求2所述基因表达盒，或权利要求3所述重组载体，或权利要求4～6任一所述重组菌株在制备蛋白中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述蛋白包括甘氨酰胺核苷酸合成酶。
10.一种生产核苷酸类产品的方法，其特征在于，所述方法包括培养含权利要求1所述启动子与甘氨酰胺核苷酸合成酶基因可操作地连接的重组菌株，并收集产生的核苷酸。
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