CN115873981B

CN115873981B - 一种杧果品种特异性ssr分子标记引物及其应用

Info

Publication number: CN115873981B
Application number: CN202211418117.2A
Authority: CN
Inventors: 唐玉娟; 罗世杏; 黄国弟; 宋恩亮; 李日旺; 张宇; 赵英; 唐莹莹; 郭丽梅; 莫永龙; 覃昱茗; 彭鹏
Original assignee: Guangxi Subtropical Crops Research Institute
Current assignee: Guangxi Subtropical Crops Research Institute
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-11-14
Also published as: CN115873981A

Abstract

本发明涉及一种杧果品种特异性SSR分子标记引物，至少包含以下12对SSR引物之一：Mgi026、Mgi037、Mgi060、Mgi061、Mgi070、Mgi073、Mgi081、Mgi084、Mgi135、Mgi145、Mgi154、Mgi187；该引物可以应用于杧果种质资源遗传多样性分析和分子身份证构建，先收集待测植株健康叶片提取DNA，提取的DNA作为模板进行SSR分子标记PCR扩增，PCR扩增产物经过纯化后进行荧光检测，收集原始数据计算遗传多样性指标和多态性信息含量，将每对引物获得的等位基因数按从小到大顺序排列，获得每份种质特有的字符串，得到分子身份证。本发明利用接头引物M13与12对SSR引物合成TP‑M13‑SSR荧光引物，对145份杧果种质及其近缘野生种进行扩增，可以为杧果的亲缘关系分析及种质鉴定提供研究数据。

Description

一种杧果品种特异性SSR分子标记引物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及一种杧果品种特异性SSR分子标记引物及其应用。

背景技术

我国是世界第二大杧果(Mangifera indica L.)生产国，近年来，我国杧果产业快速发展，截至2020年，全国杧果种植面积达485万亩，产量约266万吨，产值达205.2亿元(农业农村部农垦局2021年统计数据)，杧果产业已成为我国热区主要农业支柱产业之一。丰富的种质资源是杧果新品种选育和产业发展的基础，据统计，目前我国保存有大约1000份杧果种质材料，保存量位居世界第二。面对如此庞大的种质数量，如何有效进行鉴定区分及合理利用是我们目前亟待解决的问题。

SSR标记作为一种有效的分子标记手段，具有操作简便、准确可靠，重复性好等优点，被国际植物新品种权保护联盟(UPOV)推选为DNA指纹图谱构建的首选标记之一。目前，SSR标记在国内已应用于苹果、梨、桃、荔枝等多种果树遗传育种研究的各个领域。国内较早地应用ISSR和SRAP分子标记分别绘制红麻与蓖麻DNA指纹图谱，并建立其分子身份证；在果树种质资源的分子身份证研究上，利用10对SSR引物构建了38份甜樱桃种质的指纹图谱，将分子指纹赋值后建立品种的分子身份证，而后在桃、葡萄和梨等果树上也进行过此类研究。

研究发现，基于SSR荧光标记的杧果种质遗传多样性分析和分子身份证构建研究较少，如能开发出杧果品种特异性SSR分子标记引物，对杧果品种及其近缘野生种扁桃进行遗传多样性分析，构建个体独特的分子身份证，有利于实现杧果种质资源的快速、准确区分，为杧果种质合理利用提供指导。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种杧果品种特异性SSR分子标记引物及其应用。

本发明所采用的技术方案:一种杧果品种特异性SSR分子标记引物，至少包含以下12对SSR引物之一：Mgi026、Mgi037、Mgi060、Mgi061、Mgi070、Mgi073、Mgi081、Mgi084、Mgi135、Mgi145、Mgi154、Mgi187；12对SSR引物序列信息如下：

(1)Mgi026引物序列：重复单元：(AT)4；

正向引物序列(5'-3')：GGTAAGTAATGTGAAGGGGAGGG；

反向引物序列(3'-5')：ATTAGAGAAATGTCAATGACCAATTCA；

(2)Mgi037引物序列：重复单元：(AC)7；

正向引物序列(5'-3')：CGTGAAAGCAAGAAGTTGTTATCT；

反向引物序列(3'-5')：GAGGAAAGGAGAAGAAACCAATTAA；

(3)Mgi060引物序列：重复单元：(TCT)10；

正向引物序列(5'-3')：GTCCCCCTCACCCATAAAGC；

反向引物序列(3'-5')：TCTCCTCAATAATGCTGCCCA；

(4)Mgi061引物序列：重复单元：(TA)11；

正向引物序列(5'-3')：GCTTGGCTCGGTTTGAATCC；

反向引物序列(3'-5')：TGAACTTGCCCTTTAACCGT；

(5)Mgi070引物序列：重复单元：(TTC)10；

正向引物序列(5'-3')：GCCGAAATAGCAGAGTCAGA；

反向引物序列(3'-5')：AGCTGCAGGATTCTGACAAGA；

(6)Mgi073引物序列：重复单元：(AAG)6；

正向引物序列(5'-3')：GGGGGCACTGCTTTACTCAA；

反向引物序列(3'-5')：ACACGATAACAGATCAGGCGT；

(7)Mgi081引物序列：重复单元：(CTT)7；

正向引物序列(5'-3')：CTGAGCCCATAACCAGAGGC；

反向引物序列(3'-5')：CCCTAGGTGGTCACATGAGG；

(8)Mgi084引物序列：重复单元：(TCT)5；

正向引物序列(5'-3')：CGTCCTTGCGTACTCGATCA；

反向引物序列(3'-5')：TTTGAAAACCACGCGCCAAT；

(9)Mgi135引物序列：重复单元：(TA)8；

正向引物序列(5'-3')：TCATGGGTCATTGGAGGAAAAGA；

反向引物序列(3'-5')：ACTGTCATTCATCGCATAACGT；

(10)Mgi145引物序列：重复单元：(AAT)7；

正向引物序列(5'-3')：GCACACACTTTCTGTTCTCCA；

反向引物序列(3'-5')：ACAATGGAAGTGCACCATGT；

(11)Mgi154引物序列：重复单元：(ATT)9；

正向引物序列(5'-3')：GCGGAAAATAGTCTTTTGGCCA；

反向引物序列(3'-5')：TGACTTTTTGTGCACGGATTT；

(12)Mgi187引物序列：重复单元：(AAT)6；

正向引物序列(5'-3')：CCGCCATGACCATGAAAACG；

反向引物序列(3'-5')：GCACTAATGTTCCCGCCAAC。

优选地，所述SSR引物与接头引物M13合成带荧光标记的TP-M13-SSR荧光引物。

优选地，所述的杧果品种特异性SSR分子标记引物在杧果种质资源遗传多样性分析和分子身份证构建的应用。

优选地，所述的杧果品种特异性SSR分子标记引物在杧果种质资源遗传多样性分析和分子身份证构建的应用，包括以下步骤：

步骤1)：收集待测植株健康叶片，提取DNA；

步骤2)：筛选出扩增条带清晰、重复性好的SSR引物；

步骤3)：以步骤1)提取的DNA作为模板进行SSR分子标记PCR扩增，PCR扩增产物经过纯化后进行荧光检测，收集原始数据；

步骤4)：根据步骤3)获得的数据计算遗传多样性指标和多态性信息含量，进行聚类并构建聚类图；

步骤5)：将每对引物获得的等位基因数按从小到大顺序排列，依次从阿拉伯数字1开始赋值，超过9的从英文字母A开始赋值，将每份种质在12个位点的等位基因按照赋值编码表赋值，获得每份种质特有的字符串，得到分子身份证。

优选地，在所述步骤3)中，PCR反应体系：模板DNA(20ng/μL)1μL、正向引物(10μmol/L)0.1μL、带荧光基团的接头引物M13(10μmol/L)0.4μL，反向引物(10μmol/L)0.4μL、2xTaq PCR Master Mix 5μL、ddH₂O 3.1μL，共10μL；

优选地，在所述步骤3)中，PCR反应程序:第一阶段95℃5min，第二阶段95℃30s，第三阶段62℃-52℃退火30s，第四阶段72℃30s，第二阶段到第四阶段10个循环，每个循环降1℃；第五阶段95℃30s，第六阶段52℃退火30s，第七阶段72℃30s，第五阶段到第七阶段25个循环，第八阶段72℃20min，4℃保存待用。

优选地，在所述步骤3)中，将SSR引物的正向5’端连接接头引物M13，合成5’端加接头引物M13的TP-M13-SSR荧光引物，接头引物M13的正向5’端连接荧光基团，所述的接头引物M13的正向引物序列为5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，所述的荧光基团为FAM、NED、VIC或PET。

本发明的有益效果：

1、本申请提供12对杧果品种特异性SSR分子标记引物，扩增条带清晰、重复性好、稳定性高，为利用SSR分子标记技术进行杧果种质资源遗传多样性分析和分子身份证构建提供技术依据。

2、本申请结合了SSR技术和荧光检测技术的特点，解决了传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测精度和效率低的问题，利用接头引物M13与12对SSR引物合成TP-M13-SSR荧光引物，对145份杧果种质及其近缘野生种进行扩增，引物多态性分析结果显示12对引物PIC分布范围在0.5036-0.7827之间，而PIC是衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC＞0.5时，该引物为高度多态基因座，本发明选取的12对荧光引物PIC值均高于0.5，所有引物为高度多态性位点，12对引物PIC平均值为0.6396，说明TP-M13-SSR荧光引物可以为杧果的亲缘关系分析及种质鉴定提供研究数据。

附图说明

图1为部分种质在荧光引物Mgi061中的毛细管电泳图；

图2为本发明利用SSR分子标记进行145份杧果种质资源的SSR扩增谱带的遗传聚类图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非特别说明，本发明实施例中采用的原料为本领域常规市购的原料，所使用的设备为本领域常规设备。

第一实施例

收集待测植株健康叶片，提取DNA

1、收集待测植株健康叶片

于2021年9月收集145份种质均取自国家杧果种质资源保护广西创新基地的样品，包括99份杧果，36份杧果近缘野生种扁桃，具体情况来源见表1。

表1. 145份种质编号和名称

2、基因组DNA的提取

基本步骤如下:

(1)先提前加热水浴锅到65℃，加入1.5ml 3％的CTAB抽提液和48ulβ-巯基乙醇，混匀后放入水浴锅中预热；

(2)称取0.5g嫩绿叶片，放入提前用液氮预冷过的研钵中，快速少量PVP，然后加入液氮快速研磨，直至样品呈粉末状；

(3)将磨好的样品快速倒入装有提前预热过的CTAB抽提液，上下颠倒摇匀，放入65℃的水浴锅中水浴1h，中间每隔5min轻轻摇匀1次，4℃，8000rpm离心6min，剩余步骤均在冰上进行；

(4)吸取1ml上清液小心地转入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀，在4℃条件下，1600rmp离心10min；

(5)吸取800ul上清液转入新的2ml离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，在4℃条件下，1600rmp离心10min；

(6)吸取600ul上清液转入新的2ml离心管中，加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，放到-6℃，2h以上(也可以过夜)，6000rmp离心3min收集沉淀；

(7)用70％的乙醇洗涤2-3次(洗一次要离心一次，再洗，再离)，风干30min，溶于50ul dd水(含10ng/ul RNaseA，用1000ul的dd水+2ul RNaseA配置)中，55℃水浴30min，离心，将沉淀转入1.5ml离心管中，-6℃保存备用。

其中，DNA提取液(CTAB抽提液)的配方为：分别称取6.0g十六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠放入烧杯中，然后加入40mL乙二胺四乙酸二钠盐溶液(pH8.0)、100mL 1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入800ml去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌6min，于4℃保存。

第二实施例

SSR引物筛选和PCR扩增

1、SSR引物筛选

对来自杧果基因组DNA的SSR引物供试筛选，最终筛选多态性高、条带清晰并重复性好的12对开发自杧果基因组DNA的SSR引物，具体信息如表2所示。

表2. 12对供试筛选的SSR引物信息

序号	引物编号	正向引物序列(5'-3')	反向引物序列(3'-5')	重复单元
					1	Mgi026	GGTAAGTAATGTGAAGGGGAGGG	ATTAGAGAAATGTCAATGACCAATTCA	(AT)4
2	Mgi037	CGTGAAAGCAAGAAGTTGTTATCT	GAGGAAAGGAGAAGAAACCAATTAA	(AC)7
					3	Mgi060	GTCCCCCTCACCCATAAAGC	TCTCCTCAATAATGCTGCCCA	(TCT)10
4	Mgi061	GCTTGGCTCGGTTTGAATCC	TGAACTTGCCCTTTAACCGT	(TA)11
					5	Mgi070	GCCGAAATAGCAGAGTCAGA	AGCTGCAGGATTCTGACAAGA	(TTC)10
6	Mgi073	GGGGGCACTGCTTTACTCAA	ACACGATAACAGATCAGGCGT	(AAG)6
					7	Mgi081	CTGAGCCCATAACCAGAGGC	CCCTAGGTGGTCACATGAGG	(CTT)7
8	Mgi084	CGTCCTTGCGTACTCGATCA	TTTGAAAACCACGCGCCAAT	(TCT)5
					9	Mgi135	TCATGGGTCATTGGAGGAAAAGA	ACTGTCATTCATCGCATAACGT	(TA)8
10	Mgi145	GCACACACTTTCTGTTCTCCA	ACAATGGAAGTGCACCATGT	(AAT)7
					11	Mgi154	GCGGAAAATAGTCTTTTGGCCA	TGACTTTTTGTGCACGGATTT	(ATT)9
12	Mgi187	CCGCCATGACCATGAAAACG	GCACTAATGTTCCCGCCAAC	(AAT)6

2、PCR扩增

利用SSR荧光标记检测技术TP-M13-SSR毛细管电泳荧光检测法对145个杧果种质资源进行研究。SSR正向引物5’端和携带荧光标记FAM、NED、VIC或PET的接头引物M13相连组成TP-M13-SSR荧光引物，其中，正向引物、反向引物以及带荧光基团的接头引物M13均由上海生工生物工程有限公司完成；PCR扩增反应体系为10μL的混合体系，具体如表3所示。

表3为PCR扩增反应体系

PCR扩增反应程序：

第一阶段(预变性)，温度为95℃，时间为5min；

第二阶段(变性)，温度为95℃，时间为30s；

第三阶段(退火)，温度为62℃-52℃，退火30s；

第四阶段(延伸)，温度为72℃，时间为30s；

第二阶段到第四阶段10个循环，每个循环降1℃；

第五阶段(变性)，温度为95℃，时间为30s；

第六阶段(退火)，温度为52℃，退火30s；

第七阶段(延伸)，温度为72℃，时间为30s；

第五阶段到第七阶段25个循环；

第八阶段(终延伸)，温度为72℃，时间为20min；

4℃保存待用。

PCR扩增产物经过纯化后在美国ABI3730基因测序仪上进行荧光检测，收集原始数据。

第三实施例

遗传多样性分析

1、获得的数据计算遗传多样性指标和多态性信息含量，进行聚类并构建聚类图

GeneMapper3.0分析ABI3730收集的数据，PopGen32和PowerMarker3.25计算遗传多样性指标和多态性信息含量，NTSYS 2.10软件UPGMA方法进行聚类并构建聚类图。

2、扩增结果多态性分析

利用12对荧光引物对145份杧果种质进行扩增，计算获得遗传多样性指标和多态性信息含量(表4)。12对引物的观测等位基因数在3-11之间，其中引物Mgi061和Mgi135最多为11，平均等位基因数为6.25；有效等位基因数在2.2263-5.2468之间，平均值为3.2838；观察杂合度(Ho)介于0.4122和0.6959，平均值为0.5858；期望杂合度(He)介于0.5527和0.8003，平均值为0.6725；shannon指数变异范围(I)介于0.9815-1.9269，平均值为1.3383；Nei基因多样性指数(Na)介于0.5740-0.8094，平均值为0.6702。多态信息含量PIC分布范围在0.5036-0.7827之间，平均值为0.6396，上述结果表明，本发明筛选的12对引物在145份种质中的多态性较高。图1展示了部分种质在荧光引物Mgi061中的毛细管电泳图。

表4. 12个SSR位点的等位基因数和多态性信息

3、杧果种质亲缘关系分析

基于SSR荧光标记扩增结果，用NTSYS2.10构建遗传聚类图(图2)。在遗传相似性系数为0.706时，供试145份材料分为2个类群，I类群包含109份杧果和20份扁桃，种质数量最多，占总数的88.9％；Ⅱ类群包括17份材料，全部为扁桃。在遗传相似性系数为0.733时，I类群分为5个亚群，I-1亚群为5个亚群中种质数量最多的一个，包含13份扁桃和51份杧果，杧果有来自美国的汤米阿琼斯、爱文、圣心、法斯希尔、海顿、红凯特，缅甸的水英达、阿某杧、新德隆、帕拉英达、马帅，印度的903、秋实1号，广西桂热系列和龙州泰国杧、农院8号、良余1号、白皮杧、小红象牙、象牙22号、象牙、桂青杧、秋实2号，云南的云热302、阳红1号、勐底红杧、胭脂杧、云南矮杧、红苹、三蜜杧、杨杧，越南的奶油香杧实生、三色杧、越南西贡引，中国台湾的台农1号、杉林1号，古巴的大娃杧，四川的安宁红杧，泰国的暹罗杧，海南的兴热1号。I-2亚群较小只有4份材料，即广西的桂热杧120号、四川的新红2号、古巴的太太杧、缅甸的马切苏；I-3亚群包括40份材料，其中扁桃6份，其余34份杧果分别是中国台湾蜜桃杧、台农2号、台牙杧、金煌杧、贵妃杧、贵妃杧、凤凰杧，泰国的泰引1号、3号、泰国14号、南逗迈4号、四季蜜杧、农桑，印度5号、6号、906号，广西的串杧、桂热杧08-10、四合象牙、本地红花杧、永乐1号，云南的虎豹牙、龙杧、菲杧、大青蜜杧、土杧，越南沙华绿、艾普、红杧，澳大利亚青杧、海南红玉、印尼海豹、巴基斯坦413、四川的桔橼杧。I-4亚群包括10份材料，来自四川的金龙、龙眼香杧、乳杧、云南的大头香杧、达三年杧1号、硕帅杧，广西的柳州吕宋、桂热4号，缅甸的秋杧，印度的椰香；I-5亚群包括10份种质，扁桃杧1份，美国bules、印度杧7号、澳大利亚肯盛顿、spooer、巴基斯坦44、泰国金水仙、云南小菲杧、海南黄玉、广西桂热杧07-2。

遗传相似性系数是反应种质亲缘关系远近的重要指标。本发明计算得到各种质间遗传相似性系数变化范围为0.5676-1.000，平均为0.7417。其中爱文与印度杧1号遗传相似性系数为1.000，说明在145份材料中爱文和印度杧1号之间亲缘关系最近，遗传差异很小；扁桃杧田阳20-2与大头香杧和硕帅杧、金煌与桂热杧10-1的遗传相似性系数最小，都为0.5676，说明在145份材料中扁桃杧田阳20-2与大头香杧和硕帅杧、金煌与桂热杧10-1之间亲缘关系最远，遗传差异相对较大。

第四实施例

分子身份证构建

1、杧果种质分子身份证构建

将每对引物获得的等位基因数按从小到大顺序排列，依次从阿拉伯数字1开始赋值，超过9的从英文字母A开始赋值，未获得等位基因位点的标记为0，将每份种质在12个位点获得的等位基因按照赋值编码表(表5)赋值，获得每份种质特有的字符串即分子身份证。例如荧光引物Mgi154在供试材料中共获得8个等位基因片段，其中最小片段为212bp标记为1，最大片段274bp标记为8，即可得到每份材料在引物Mgi154的字符串。以供试材料台农1号为例，在12个位点获得的等位基因为别119、124、158/167、177、113/131、216/219、152/155、216/222、293、233/239、253/274、296，其对应赋值为44、22、34、11、15、34、23、13、11、24、28、11，即台农1号的分子身份证为442234111534231311242811，各供试材料的分子身份证见表6。12对荧光引物可区分145份供试材料，鉴定率达到100％。

表5.等位基因赋值标准

表6. 145份种质分子身份证

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以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种杧果品种特异性SSR分子标记引物，其特征在于：由以下12对SSR引物组成：Mgi026、Mgi037、Mgi060、Mgi061、Mgi070、Mgi073、Mgi081、Mgi084、Mgi135、Mgi145、Mgi154、Mgi187；12对SSR引物序列信息如下：

（1）Mgi026引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GGTAAGTAATGTGAAGGGGAGGG；

反向引物序列 (3'-5')：ATTAGAGAAATGTCAATGACCAATTCA；

（2）Mgi037引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：CGTGAAAGCAAGAAGTTGTTATCT；

反向引物序列 (3'-5')：GAGGAAAGGAGAAGAAACCAATTAA；

（3）Mgi060引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GTCCCCCTCACCCATAAAGC；

反向引物序列 (3'-5')：TCTCCTCAATAATGCTGCCCA；

（4）Mgi061引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GCTTGGCTCGGTTTGAATCC；

反向引物序列 (3'-5')：TGAACTTGCCCTTTAACCGT；

（5）Mgi070引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GCCGAAATAGCAGAGTCAGA；

反向引物序列 (3'-5')：AGCTGCAGGATTCTGACAAGA；

（6）Mgi073引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GGGGGCACTGCTTTACTCAA；

反向引物序列 (3'-5')：ACACGATAACAGATCAGGCGT；

（7）Mgi081引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：CTGAGCCCATAACCAGAGGC；

反向引物序列 (3'-5')：CCCTAGGTGGTCACATGAGG；

（8）Mgi084引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：CGTCCTTGCGTACTCGATCA；

反向引物序列 (3'-5')：TTTGAAAACCACGCGCCAAT；

（9）Mgi135引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：TCATGGGTCATTGGAGGAAAAGA；

反向引物序列 (3'-5')：ACTGTCATTCATCGCATAACGT；

（10）Mgi145引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GCACACACTTTCTGTTCTCCA；

反向引物序列 (3'-5')：ACAATGGAAGTGCACCATGT；

（11）Mgi154引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：GCGGAAAATAGTCTTTTGGCCA；

反向引物序列 (3'-5')：TGACTTTTTGTGCACGGATTT；

（12）Mgi187 引物序列：

正向引物序列 (5'-3')：CCGCCATGACCATGAAAACG；

反向引物序列 (3'-5')：GCACTAATGTTCCCGCCAAC。

2.根据权利要求1所述的一种杧果品种特异性SSR分子标记引物，其特征在于：所述SSR引物与接头引物M13合成带荧光标记的TP-M13-SSR荧光引物。

3.根据权利要求1或2所述的杧果品种特异性SSR分子标记引物在杧果种质资源遗传多样性分析和分子身份证构建的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1）：收集待测植株健康叶片，提取DNA；

步骤2）：筛选出扩增条带清晰、重复性好的SSR引物；

步骤3）：以步骤1）提取的DNA作为模板进行SSR分子标记PCR扩增，PCR扩增产物经过纯化后进行荧光检测，收集原始数据；

步骤4）：根据步骤3）获得的数据计算遗传多样性指标和多态性信息含量，进行聚类并构建聚类图；

步骤5）：将每对引物获得的等位基因数按从小到大顺序排列，依次从阿拉伯数字1开始赋值，超过9的从英文字母A开始赋值，将每份种质在12个位点的等位基因按照赋值编码表赋值，获得每份种质特有的字符串，得到分子身份证。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在所述步骤3）中，PCR反应体系：模板DNA 1μL、正向引物 0.1μL、带荧光基团的接头引物M13 0.4μL，反向引物 0.4μL、2xTaq PCRMaster Mix 5μL、ddH₂O 3.1μL，共10μL。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在所述步骤3）中，PCR反应程序:第一阶段95℃ 5 min，第二阶段95℃ 30s，第三阶段62℃-52℃退火30s，第四阶段72℃ 30s，第二阶段到第四阶段10个循环，每个循环降1℃；第五阶段95℃ 30s，第六阶段52℃退火30s，第七阶段72℃ 30s，第五阶段到第七阶段25个循环，第八阶段72℃ 20min，4℃保存待用。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在所述步骤3）中，将SSR引物的正向5’端连接接头引物M13，合成5’端加接头引物M13的TP-M13-SSR荧光引物，接头引物M13的正向5’端连接荧光基团，所述的接头引物M13的正向引物序列为5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，所述的荧光基团为FAM、NED、VIC或PET。