CN102731637A - 植物耐逆相关蛋白TaMYB19及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物耐逆相关蛋白TaMYB19及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的方法对植物耐逆分子机制的研究，植物耐逆品种的选育及植物耐逆性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐逆性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物耐逆相关蛋白TaMYB19及其编码基因和应用。
背景技术
水资源短缺和土壤盐渍化是全球农业生产面临的严峻事实。由于旱灾频繁，我国年平均受旱面积达3.27亿亩，随着全球气候变暖，旱灾将日趋严重，受旱灾威胁农田面积可能超过7亿亩。据估算，干旱、低温和盐碱等非生物胁迫对作物产量的影响达40%，我国北方主要粮食产区每年因缺水造成减产700－800亿公斤；季节性干旱在降水量丰富的南方也频繁发生，如广东每年受旱面积超过750万亩；四川省2006年作物受旱面积达2100万亩，占播种面积的35%，绝收397万亩，造成直接经济损失达61亿元。
水稻作为我国重要的粮食作物，用水量占农业用水量的70%，因此水资源匮乏及干旱、低温和盐碱等非生物胁迫已成为影响水稻高产稳产的重要限制因子。
植物抗逆机制十分复杂，传统的育种手段对于作物的抗逆性改良虽有一定效果，但离人们期望的目标还有很大距离。通过生物技术培育耐逆水稻品种是充分利用我国盐碱地、缓解水资源短缺、保证水稻高产稳产最经济和有效的途径，对保障农业可持续发展具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐逆相关蛋白TaMYB19及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来自中国春小麦，命名为TaMYB19蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述TaMYB19蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列2自5’末端第58至798位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表的序列2自5’末端第56至805位核苷酸所示的DNA分子；
3）序列表的序列2所示的DNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
5）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选。
所述重组表达载体可为将所述基因插入pLEELA载体得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pLEELA载体的重组位点（供外源DNA插入的位点）得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为将所述基因插入pLEELA载体的attR1和attR2重组位点之间得到的重组质粒。
所述重组表达载体可为将入门质粒（entry plasmid）和pLEELA载体进行LR反应得到的重组质粒；所述入门质粒具体可为将所述基因插入入门载体pDONRTM201的attP1和attP2重组位点之间得到的重组质粒。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的生物中。携带有所述基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。
所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，优选为哥伦比亚生态型拟南芥。
所述耐逆性可为耐旱和/或耐盐和/或耐低温。所述低温具体可为-8℃。
本发明的方法为提高植物的耐逆性提供了一条经济、快速、有效的途径，对植物耐逆分子机制的研究，植物耐逆品种的选育及植物耐逆性分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
附图说明
图1为TaMYB19基因在各种胁迫条件下的表达模式。
图2为各个转基因株系的T3代植株的2%琼脂糖凝胶电泳图。
图3为转基因植物的耐盐胁迫鉴定结果。
图4为转基因植物的耐干旱胁迫鉴定结果。
图5为转基因植物的耐低温胁迫鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PEG即聚乙二醇。ABA即脱落酸。
入门载体pDONRTM201（pDONRTM201载体）：Life Technologies,11798014。BPClonaseTMⅡEnzyme Mix：Life Technologies,11789020。大肠杆菌TOP10感受态细胞:全式金公司。LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix：Life Technologies,11791020。
中国春小麦（Chinese Spring）：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：P.Sourdille,T.Cadalen,H.Guyomarc'h,J.Snape,M.Perretant,G.Charmet,C.Boeuf,S.Bernard and M.Bernard.(2003)An update of the Courtot×Chinese Spring intervarietal molecular marker linkage map for the QTLdetection of agronomic traits in wheat.Theoretical and Applied Genetics 106(3):530-538.。
目标载体pLEELA（pLEELA载体）：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：YongxiuLiu,Maarten Koornneef and Wim J.J.SoppeThe.(2007)Absence of Histone H2B Monoubiquitination in the Arabidopsis hub1(rdo4)MutantReveals a Role for Chromatin Remodeling in Seed Dormancy.The Plant Cell19:433-444.。
农杆菌GV3101-pM90RK（又称农杆菌GV3101pM90RK）：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：YongxiuLiu,Maarten Koornneef and Wim J.J.SoppeThe.(2007)Absence of Histone H2B Monoubiquitination in the Arabidopsishub1(rdo4)Mutant Reveals a Role for Chromatin Remodeling in Seed Dormancy.The Plant Cell19:433-444.。
哥伦比亚生态型拟南芥（Col）：ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)。
实施例1、TaMYB19蛋白及其编码基因的发现
为了研究小麦MYB基因在植物抗逆方面的功能，通过生物信息学的方法，从实验室已经测序的30000条非冗余的小麦全长cDNA序列中筛选出60个编码小麦MYB蛋白的基因。通过半定量PCR的方法，对该60个小麦MYB基因在逆境条件下的表达模式进行研究，筛选出受逆境诱导表达的基因。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为TaMYB19蛋白，由247个氨基酸残基组成。将TaMYB19蛋白的编码基因命名为TaMYB19基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第58至798位核苷酸所示（741bp）。
实施例2、TaMYB19基因在胁迫条件下的表达模式
将两叶一心期的中国春小麦进行低温胁迫处理和脱落酸胁迫处理。将两叶一心期的茶淀红小麦进行盐胁迫处理。将两叶一心期的旱选10号小麦进行干旱胁迫处理。
盐胁迫处理：用250mM NaCl水溶液处理；
干旱胁迫处理：用16.1%PEG水溶液处理；
脱落酸胁迫处理：用200uM ABA水溶液处理；
低温胁迫处理：在4℃条件下处理。
分别于处理前（0h）、处理后1小时、处理后3小时、处理后7小时、处理后12小时和处理后24小时取叶片；提取叶片的总RNA，通过RT-PCR检测TaMYB19基因的表达量，RT-PCR的目的片段为324bp，所采用的引物如下：
上游引物：5’-CCTCGGCAACAAGTGGTCTC-3’；
下游引物：5’-GACAGGTCGAGGTTCAGGTC-3’。
TaMYB19基因在各种胁迫条件下的表达模式见图1。结果表明：TaMYB19基因受高盐、PEG、低温及ABA诱导表达。
实施例3、转基因植物的获得和耐逆性鉴定
一、利用Gateway技术构建过表达载体
1、attB引物设计
利用Primer Primer5.0软件设计扩增TaMYB19基因编码区的引物，根据Gateway技术构建表达载体的需要，在上游引物(F1)和下游引物(R1)的5'端分别加入attB1和attB2重组位点。设计的引物序列如下：
F1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGATGGGGAGGTCGCCGTG-3’；
R1：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTCTCATATGTACTGGCCTTCC-3’。
上游引物中,下划线标注attB1重组位点。下游引物中，下划线标注attB2重组位点。
2、提取中国春小麦的总RNA，反转录为cDNA。
3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1设计的引物进行PCR扩增，采用百泰克DNA回收纯化试剂盒回收纯化PCR扩增产物。
PCR扩增体系（25.0μl）：2×Pfu PCR MasterMix（天根公司，含pfutaq酶）12.5μl、上游引物(2μM)3.0μl、下游引物(2μM)3.0μl、cDNA2.0μl、DMSO1.5μl，加ddH2O至25.0μl。
PCR扩增程序：95℃5min；94℃30sec（变性）、60℃30sec（退火）、72℃1.5min（延伸），35个循环；72℃5min。
4、BP反应
BP反应体系：步骤3的PCR扩增产物25ng、入门载体pDONRTM20140ng、BP ClonaseTMⅡEnzymeMix0.3μl，加灭菌ddH2O至2.5μl。
BP反应程序：25℃、10h。
5、将2.5μl步骤4的BP反应产物加入30μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，冰浴15min，42℃热激90sec，然后迅速置于冰上2min；加入500μl SOC培养基，37℃、225rpm/min复苏50min；复苏液均匀涂布于LB固体培养基（含50μg/ml卡那霉素）表面，37℃倒置培养过夜；pDONRTM201载体自身带有致死基因，不能在培养基上生存，通过BP重组反应目标基因片段会取代致死基因，所以在培养基上生存的克隆即为含有目标基因片段的入门克隆（entry clone）。
6、将入门克隆提取质粒进行双向测序验证，测序验证所用引物为pDONRTM201通用引物，序列如下:
201F:5′-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3′；
201R:5′GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3′。
测序结果表明，得到的质粒为在入门载体pDONRTM201的attP1和attP2重组位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第56至805位核苷酸所示的DNA分子，将该质粒命名为入门质粒（entry plasmid）。
7、LR反应
LR反应体系：入门质粒25ng、目标载体pLEELA40ng、LR ClonaseTMⅡEnzymeMix0.3μl，加灭菌ddH2O至2.5μl。
LR反应程序：25℃、10h。
8、将2.5μl步骤7的LR反应产物加入30μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，冰浴15min，42℃热激90sec，然后迅速置于冰上2min；加入500μl SOC培养基，37℃、225rpm/min复苏50min；复苏液均匀涂布于LB固体培养基（含100μg/ml羧卞青霉素）表面，37℃倒置培养过夜；pLEELA载体自身带有致死基因，不能在培养基上生存，通过LR重组反应目标基因片段会取代致死基因，所以在培养基上生存的克隆即为含有目标基因片段的目标克隆（Destianti on clone）。
9、将目标克隆提取质粒进行双向测序验证，测序验证所用引物为pLEELA载体插入片段两端35S启动子区及终止区引物，序列如下：
35S-P:5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′；
35S-T:5′-GCTCAACACATGAGCGAAAC-3′。
测序结果表明，得到的质粒为在目标载体pLEELA的attR1和attR2重组位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第56至805位核苷酸所示的DNA分子，将该质粒命名为目标质粒。
二、转基因植物的获得
1、将步骤一构建的目标质粒导入农杆菌PGV3101-pM90RK，得到重组农杆菌。
2、转基因植物的获得
（1）拟南芥的培养
将哥伦比亚生态型拟南芥的种子用70%乙醇消毒5min，再用无水乙醇洗5min，待种子晾干后均匀撒播在MS培养基平板上（无菌操作），4℃春化3d，然后置于22℃光照培养箱培养一周；待小苗长出四片真叶后移栽至营养钵中培养，20-22℃保湿培养2-3d；当拟南芥植株生长至大部分花蕾处于即将开花状态时，进行农杆菌侵染。
（2）农杆菌侵染（采用沾花法对拟南芥进行侵染）
①取1ml重组农杆菌菌液，均匀涂布于选择培养基（以YEB固体培养基为基础，含有如下浓度的各种抗生素：利福平50μg/ml、卡那霉素50μg/ml和羧卞青霉素50μg/ml）表面，28℃倒置培养36h，在培养基表面会长满农杆菌，形成菌层；用40mlYEB液体培养基重悬菌层，调整为OD600值在2-3之间的菌悬液；取30ml菌悬液，加入120ml5%蔗糖水溶液。
②将步骤（1）的拟南芥倒置，尽量保证所有花蕾都侵入到步骤①得到的菌液之中，侵染时间为30s；将侵染过的拟南芥平放于托盘中，保湿，20-22℃暗培养24h，然后置于正常的生长环境下培养。
（3）转基因植物的获得
收集步骤（2）中的拟南芥的种子（T0代种子），于37℃烘箱中烘干，然后4℃春化3d；将种子撒播在营养钵中，22℃保湿培养1周；待小苗长出4片真叶后，通过喷洒除草剂（basta）进行转基因植株筛选，为了将非转基因苗彻底除净，连续喷洒3次，每次间隔2d，两周后还存活的植株即为T0代植株。T0代转基因植株自交产生T1代种子。T1代转基因植株自交产生T2代种子。T2代转基因植株自交产生T3代种子。
分别取T1代植株和T2代植株进行分子鉴定。分子鉴定的方法：提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA作为模板用F2和R2组成的引物对组成的引物对进行PCR鉴定（F2：5’-CCTCGGCAACAAGTGGTCTC-3’；R2：5’-GACAGGTCGAGGTTCAGGTC-3’；靶序列为约324bp的条带），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T1代植株，如果其T2代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个纯合的转基因株系。
各个转基因株系的T3代植株的2%琼脂糖凝胶电泳图见图2（L1至L10依次代表不同转基因株系，WT代表哥伦比亚生态型拟南芥）。
三、转空载体对照植株的获得
将目标载体pLEELA代替步骤一构建的目标质粒进行步骤二，得到转空载体对照植株。
四、转基因植物的抗逆性鉴定
随机取3个转基因株系（L6株系、L7株系和L8株系）进行试验。
（1）抗盐性鉴定
将L6株系的T3代植株、L3株系的T3代植株、L8株系的T3代植株、转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥（WT）分别进行盐胁迫试验，具体步骤如下（进行三次重复实验，结果取平均值）：
第一组（每个株系100株）：将四周龄的幼苗在22℃、每天12小时光照的条件下培育14天，培育过程中每天用水进行浇灌，分别在培育第7天和培育第14天拍照，并于培育第14天进行存活率统计。
第二组（每个株系100株）：将四周龄的幼苗在22℃、每天12小时光照的条件下培育14天，培育过程中每天用100mM NaCl水溶液进行浇灌，分别在培育第7天和培育第14天拍照，并于培育第14天进行存活率统计。
第三组（每个株系100株）：将四周龄的幼苗在22℃、每天12小时光照的条件下培育14天，培育过程中每天用200mM NaCl水溶液进行浇灌，分别在培育第7天和培育第14天拍照，并于培育第14天进行存活率统计。
第四组（每个株系100株）：将四周龄的幼苗在22℃、每天12小时光照的条件下培育14天，培育过程中每天用300mM NaCl水溶液进行浇灌，分别在培育第7天和培育第14天拍照，并于培育第14天进行存活率统计。
第四组的照片见图3。在盐胁迫处理前，各个株系植株的生长情况一致。在盐胁迫的条件下，各个转基因株系植株的生长情况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥。在盐胁迫的条件下，转空载体对照植株的生长情况与哥伦比亚生态型拟南芥一致。
第一组试验中，各个株系拟南芥的存活率均为100%。
第二组试验中，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的存活率均为60%，L6株系的存活率为91%，L7株系的存活率为92%，L8株系的存活率为90%。
第三组试验中，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的存活率均为0%，L6株系的存活率为40%，L7株系的存活率为42%，L8株系的存活率为37%。
（2）抗旱性鉴定
将L6株系的T3代植株、L3株系的T3代植株、L8株系的T3代植株、转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥（WT）分别进行干旱胁迫试验，具体步骤如下（每个株系100株；进行三次重复实验，结果取平均值）：
将四周龄的幼苗在22℃、每天12小时光照的条件下培育30天，培育过程中不进行任何浇灌，第31天开始恢复用水进行浇灌（复水），分别在培育第30天和复水第3天拍照，并于复水第3天进行存活率统计。
照片见图4。在干旱胁迫的条件下，各个转基因株系植株的生长情况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体对照植株的生长情况与哥伦比亚生态型拟南芥一致。
哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的存活率均为0%，L6株系的存活率为62%，L7株系的存活率为65%，L8株系的存活率为60%。
（3）抗冻害鉴定
将L6株系的T3代植株、L3株系的T3代植株、L8株系的T3代植株、转空载体对照植株的T3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥（WT）分别进行干旱胁迫试验，具体步骤如下（每个株系100株；进行三次重复实验，结果取平均值）：
将四周龄的幼苗由正常条件（22℃）转移至低温条件（-8℃）6个小时，然后再转移回正常条件（22℃）正常培养4天，拍照并计算存活率。
照片见图5。在低温胁迫的条件下，各个转基因株系植株的生长情况显著优于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体对照植株的生长情况与哥伦比亚生态型拟南芥一致。
哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体对照植株的存活率均为3%，L6株系的存活率为73%，L7株系的存活率为72%，L8株系的存活率为70%。
Claims (10)
1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列2自5’末端第58至798位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表的序列2自5’末端第56至805位核苷酸所示的DNA分子；
3）序列表的序列2所示的DNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
5）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pLEELA载体得到的重组质粒。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。
10.如权利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱和/或耐盐和/或耐低温。
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