MXPA03010220A - Genes tyra y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion pertenece al campo de la genetica vegetal y la bioquimica; mas especificamente, la invencion se refiere a genes asociados con la ruta de biosintesis del tocoferol; la presente invencion provee e incluye moleculas de acido nucleico, proteinas y anticuerpos asociados con los genes de la ruta de biosintesis del tocoferol; la presente invencion tambien provee metodos para utilizar dichos agentes, por ejemplo en aislamiento de genes, analisis de genes y produccion de plantas transgenicas; ademas, la presente invencion incluye plantas transgenicas modificadas para expresar proteinas asociadas con la ruta del tocoferol; ademas, la presente invencion incluye metodos para la produccion de productos de la ruta de biosintesis del tocoferol.

Description

GENES tyrA Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención pertenece al campo de la genética vegetal y la bioquímica. Más específicamente, la invención se refiere a genes asociados con la ruta de biosíntesis del tocoferol. La presente invención provee e incluye moléculas de ácido nucleico, proteínas y anticuerpos asociados con los genes de la ruta de biosíntesis del tocoferol. La presente invención también provee métodos para utilizar dichos agentes, por ejemplo en aislamiento de genes, análisis de genes y producción de plantas transgénicas. Además, la presente invención incluye plantas transgénicas modificadas para expresar proteínas asociadas con la ruta del tocoferol. Además, la presente invención incluye métodos para la producción de productos de la ruta de biosíntesis del tocoferol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los tocoferoles son un componente esencial de las dietas de los mamíferos. Evidencia epidemiológica indica que el uso de complementos de tocoferol puede reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular y cáncer, puede ayudar a la función inmune, y está asociado con prevención o retardo de varios procesos patológicos degenerativos en humanos (Traber y Sies, Annu. Rev. Nutr. 16:321-347 (1996)). El tocoferol funciona en parte estabilizando la bicapa lipídica de las membranas biológicas (Skrypin y Kagan, Biochim. Biophys. Acta 815:209 (1995); Kagan, N. Y. Acad. Sci. p 121 , (1989); Gomez-Fernandez y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci. p 109 (1989)), reduciendo los radicales libres de ácidos grasos polünsaturados (PUFA) generados por oxidación de lípidos (Fukuzawa y otros, Lipids 17: 5 1-513 (1982)), y barriendo radicales libres de oxígeno, radicales peroxi de lípidos y especies de oxígeno singulares (Diplock y otros, Ann. N Y Acad. Sci. 570: 72 (1989); Fryer, Plant Cell Environ. 5(4):381 -392 (1992)). El a-tocoferol, referido frecuentemente como vitamina E, pertenece a la clase de antioxidantes solubles en lípido que incluyen los tocoferoles a, ß, ? y d, y los tocotrienoles , ß, ? y d. Aunque los tocoferoles a, ß, ? y d y los tocotrienoles , ß, ? y d son referidos algunas veces colectivamente como "vitamina E", es más apropiado definir químicamente la vitamina E como a-tocoferol. El a-tocoferol es significativo para la salud humana, en parte porque es absorbido y retenido en el cuerpo fácilmente, y tiene un grado de bioactividad más alto que otras especies de tocoferol (Traber y Sies, Annu. Rev. Nutr. 16:321-347 (1996)). Sin embargo, otros tocoferoles como los tocoferoles ß, ? y d también tienen beneficios significativos nutricionales y en la salud. Los tocoferoles son sintetizados primariamente solo por plantas y algunos otros organismos fotosintéticos, incluyendo cianobacterias. Como resultado, los tocoferoles alimenticios de los mamíferos son obtenidos casi exclusivamente de estas fuentes. El contenido total de tocoferol y la composición de tocoferol de los tejidos vegetales varían considerablemente, siendo el a-tocoferol la especie predominante de tocoferol encontrada en los tejidos de plantas fotosintéticas verdes. El tejido de hoja puede contener de 10-50 pg de tocoferoles totales por gramo de peso fresco, pero la mayoría de los cultivos comerciales principales (por ejemplo arroz, maíz, trigo, papa) producen niveles de tocoferol de bajos a muy bajos, de los cuales solo un porcentaje muy bajo es a-tocoferol (Hess, Vitamina E, -tocoferol, en "Antioxidants in Higher Plants", R. Alscher y J. Hess, eds., CRC Press, Boca Ratón, p. 111-134 (1993)). Los cultivos de oleaginosas generalmente contienen niveles mucho más altos de tocoferoles pero el -tocoferol está presente solo como un componente menor (Taylor y Barnes, Chemy Ind., Oct: 722-726 (1981 )). La ingestión alimenticia diaria recomendada de 15-30 mg de vitamina E es muy difícil de conseguir con la dieta americana promedio (E.U.A.). Por ejemplo, llevaría más de 750 mg de hojas de espinaca, en las cuales el a-tocoferol comprende 60% del tocoferol total, o 200-400 gramos de aceite de soya, para satisfacer esta ingestión diaria recomendada de vitamina E. Aunque es posible aumentar la dieta con complementos, la mayoría de estos complementos contiene principalmente vitamina E sintética que tiene seis estereoisómeros, mientras que la vitamina E natural está compuesta predominantemente por un solo isómero. Además, los complementos tienden a ser relativamente caros y la población en general no está dispuesta a tomar complementos de vitaminas en una base regular. Por lo tanto existe la necesidad en la técnica de composiciones y métodos que aumenten la producción de tocoferol total, o que aumenten el porcentaje relativo de a-tocoferol producido por las plantas. Además de los beneficios de salud de los tocoferoles, el aumento de los niveles de -tocoferol en los cultivos ha sido asociado con una mayor estabilidad y duración en almacenamiento de los productos vegetales (Peterson, Cereal-Chem. 72(1 ):21-24 (1995); Ball, "Fat-soluble vitamin assays ¡n food analysis. A comprehensive review", Londres, Elsevier Science Publishers Ltd. (1988)). Además, se ha visto que el uso de complementos de tocoferol en forrajes para cerdos, reses y aves aumenta significativamente la calidad de la carne y prolonga la duración en almacenamiento de productos cárnicos después de su procesamiento, retardando la oxidación de lípidos posterior al procesamiento que contribuye al desarrollo de componentes de sabor indeseados (Sante y Lacourt, J. Sci. Food Agrie. 65(4):503-507 (1994); Buckley y otros, J. of Animal Science 73:3122-3130 (1995)).

Biosíntesis de tocoferol Los plástidos de plantas superiores exhiben rutas bioquímicas ¡nterconectadas que conducen a metabolitos secundarios que incluyen tocoferoles. La ruta biosintética de tocoferol en plantas superiores incluye la condensación de fitilpirofosfato de ácido homogentísico para formar 2-metil-6-fitilplastoquinol (Fiedler y otros, Planta 155: 51 1-515 (1982); Solí y otros, Arch.

Biochem. Biophys. 204: 544-550 (1980); Marshall y otros, Phytochem. 24: 1705-1711 (1985)). Esta ruta del tocoferol en plantas se puede dividir en cuatro partes: 1 ) síntesis de ácido homogentísico, que contribuye al anillo aromático del tocoferol; 2) síntesis de fitilpirofosfato, que contribuye a la cadena lateral de tocoferol; 3) ciclización, que tiene una función en la quiralidad y subestructura de cromanol de la familia de la vitamina E; 4) y metilación de un anillo aromático dependiente de S-adenosil-metionina, que afecta la abundancia relativa de cada una de las especies de tocoferol.

Síntesis de ácido homogentísico El ácido homogentísico es el precursor común de tocoferoles y plastoquinonas. Se ha reportado que por lo menos en algunas bacterias, la síntesis de ácido homogentésico ocurre mediante la conversión de corismato a prefenato y después a p-hidroxifenil-piruvato mediante prefenato deshidrogenasa bifuncional. Ejemplos de enzimas bifuncionales bacterianas de prefenato deshidrogenasa incluyen las proteínas codificadas por los genes tyrA de Erwinia herbicola y Escheríchla coli. El producto del gen tyrA cataliza la producción de prefenato a partir de corismato, así como también la deshidrogenación subsiguiente de prefenato para formar p-hidroxifenilpiruvato (p-HPP), el precursor inmediato de ácido homogentísico. Después, el p-HPP es convertido a ácido homogentísico por hidroxifenil-piruvato dioxigenasa (HPPD). En contraste, se cree que las plantas carecen de actividad de prefenato deshidrogenasa y generalmente se considera que la síntesis de ácido homogentésico a partir de corismato ocurre mediante la síntesis y conversión del intermediario arogenato. Algunas rutas involucradas en la síntesis del ácido homogentésico también son responsables de la formación de tirosina; cualquier alteración en estas rutas puede alterar la síntesis de tirosina y la síntesis de otros aminoácidos aromáticos.

Síntesis de fitilpirofosfato Los tocoferoles son un miembro de la clase de compuestos referidos como isoprenoides. Otros ¡soprenoides incluyen carotenoides, giberelinas, terpenos, clorofila y ácido abscísico. Un intermediario central en la producción de isoprenoides es el difosfato de isopentenilo (IPP). Se han reportado rutas citoplásmicas y basadas en plástido para generar IPP. La ruta citoplásmica involucra las enzimas acetoacetil-CoA tiolasa, HMGCoA sintetasa, HMGCoA reductasa, mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa y mevalonato pirofosfato descarboxilasa. Recientemente ha surgido evidencia de la existencia de una ruta biosintética isoprenoide alternativa, basada en plásmido, de estudios en los grupos de investigación de Rohmer y Arigoni (Eisenreich y otros, Chem. Bio., 5.-R221-R233 (1998); Rohmer, Prog. Drug. Res., 50:135-154 (1998); Rohmer, "Comprehensive Natural Products Chemistry", Vol. 2, p. 45-68, Barton y Nakanishi (eds.), Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)), que encontraron que los patrones de marcación de isótopo observados en estudios de algunos terpenoides eubacterianos y vegetales no podrían ser explicados en términos de la ruta de mevalonato. Arigoni y colaboradores mostraron posteriormente que la 1-desoxixilulosa, o un derivado de la misma, sirve como un intermediario de la ruta novedosa, ahora referida como la ruta MEP (Rohmer y otros, Biochem. J., 295:517-524 (1993); Schwarz, tesis para Ph. D., Eidgenossiche Technische Hochschule, Zurich, Suiza (1994)). Estudios recientes mostraron la formación de 5-fosfato de 1-desoxixilulosa (Broers, tesis para Ph. D. (Eidgenossiche Technische Hochschule, Zurich, Suiza) (1994)) a partir de una molécula de 3-fosfato de gliceraldehído (Rohmer, "Comprehensive Natural Products Chemistry", Vol. 2, p. 45-68, Barton y Nakanishi, eds., Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)) y piruvato (Eisenreich y otros, Chem. Biol., 5:R223-R233 (1998); Schwarz arriba citado; Rohmer y otros, J. Am. Chem. Soc, 1 18:2564-2566 (1996); y Sprenger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:12857- 2862 (1997)), por medio de una enzima codificada por el gen dxs (Lois y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:2105-2110 (1997); y Lange y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:2100-2104 (1998)). El 5-fosfato de 1-desoxixilulosa puede ser convertido además en 4-fosfato de 2-C-metileritritol (Arigoni y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:10600-10605 (1997)) por una reductoisomerasa catalizada por el gen dxr (Bouvier y otros, Plant Physiol, 1 17:1421-1431 (1998); y Rohdich y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96:11758-1 1763 (1999)). Los genes reportados en la ruta MEP también incluyen ygbP, que cataliza la conversión de 4-fosfato de 2-C-metileritritol en su respectivo derivado de pirofosfato de citidilo, y ygbB, que cataliza la conversión de 4- fosfoc¡t¡d¡l-2C-metil-D-er¡tritol a 3,4-ciclofosfato de 2C-met¡l-D-er¡tritol. Estos genes están estrechamente enlazados en el genoma de E. coli (Herz y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 97(6):2485-2490 (2000)). Una vez que el IPP es formado por la ruta de MEP, es convertido en GGDP por medio de la GGDP sintetasa, y después en fitilpirofosfato, que es el constituyente central de la cadena lateral de tocoferol.

Combinación y ciclización El ácido homogentísico se combina con fitil-pirofosfato o solanil-pirofosfato por medio de fitil/prenil transferasa, formando 2-metil-6-fitil-plastoquinol o 2-metil-6-solanil-plastoquinol, respectivamente. El 2-metil-6-solanil-plastoquinol es un precursor en la biosíntesis de plastoquinonas, mientras que el 2-meti!-6-fitil-plastoquinol es convertido finalmente a tocoferol.

Metilación del anillo aromático La principal diferencia estructural entre cada uno de los subtipos de tocoferol es la posición de los grupos metilo alrededor del anillo de fenilo. Tanto 2-metil-6-fitil-plastoquinol como 2-metil-6-solanil-plastoquinol sirven como substratos para 2-metil-6-fitilplastoquinol/2-metil-6-solanilplastoqu¡nol-9-metiltransferasa (metiltransferasa I o T1), que cataliza la formación de plastoquinol 9 y ?-tocoferol, respectivamente, por metilación de la posición 7. La metilación subsiguiente en la posición 5 de ?-tocoferol por medio de ?-metil-transferasa genera el -tocoferol biológicamente activo. La tocoferol metiltransferasa 2 (TMT2) muestra actividad similar a MT1.

Existe la necesidad en la técnica de moléculas de ácido nucleico que codifiquen enzimas involucradas en la biosíntesis de tocoferol, así como enzimas relacionadas y anticuerpos para incrementar o alterar la producción del tocoferol en las plantas. También existe la necesidad de organismos transgénicos que expresen tales moléculas de ácido nucleico involucradas en la biosíntesis del tocoferol, que sean capaces de mejorar nutricionalmente las fuentes de alimento y forraje.

ID de gen Nombre de la enzima tyrA Prefenato deshidrogenasa slr1736 Fitilprenil transferasa de Synechocystis ATPT2 Fitilprenil transferasa de Arabidopsis thaliana DXS 1 -Desoxixilulosa-5-fosfato sintetasa DXR 1 -Desoxixilulosa-5-fosfato reductoisomerasa GGPPS Geranilgeranil pirofosfato sintetasa HPPD p-Hidroxifenilpiruvato dioxigenasa AANT1 Transportador de adenilato slr1737 Tocoferol ciclasa IDI Isopentenil difosfato isomerasa GGH Geranilgeranil reductasa MT1 Metil transferasa 1 tMT2 Tocoferol metil transferasa 2 GMT Gamma-Metil Transferasa Como se usa aquí, homogentisato fitil transferasa (HPT), fitilprenil transferasa (PPT), slr1736 y ATPT2, cada una se refiere a las proteínas o a los genes que codifican proteínas con la misma actividad enzimática.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención incluye y provee una molécula de ácido nucleico sustancialmente puro que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, o un fragmento de la misma de por lo menos 20 aminoácidos contiguos de dicha enzima. La presente invención incluye y provee una molécula de ácido nucleico sustancialmente puro que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y fragmentos de las mismas de por lo menos 20 aminoácidos contiguos. La presente invención incluye y provee una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo con una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa. La presente invención incluye y provee una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo con una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4. La presente invención incluye y provee una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4, o fragmentos de las mismas que codifican por lo menos 20 aminoácidos contiguos, y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la molécula de ARNm. La presente invención incluye y provee una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor exógeno que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; que está ligada a (B), una molécula de ácido nucleico transcrito con una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y fragmentos de las mismas que comprenden por lo menos 20 aminoácidos contiguos. La presente invención incluye y provee un método para producir una planta que tiene niveles de tocoferol aumentados, que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una región de promotor, en donde dicha región de promotor está enlazada a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4; y desarrollar dicha planta. La presente invención incluye y provee un método para reducir los niveles de tocoferol en una planta, que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende como componentes enlazados operativamente una región de promotor exógeno que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una molécula de ARNm, una molécula de ácido nucleico transcrito que tiene una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3; y en donde dicha molécula de ácido nucleico transcrito está ligada a una secuencia 3' no traducida que funciona en las células vegetales para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la secuencia de ARNm; y (B) desarrollar dicha planta transformada. La presente invención incluye y provee un método para examinar los niveles aumentados de tocoferol en una planta, que comprende examinar el ADN genómico buscando la presencia de una molécula marcadora que híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3, y complementos de las mismas; y detectar la presencia o ausencia de dicho marcador. La presente invención incluye y provee un método para determinar un polimorfismo genómico en una planta que es predictivo de un nivel de tocoferol aumentado, que comprende los pasos: (A) incubar una molécula de ácido nucleico marcador y una molécula de ácido nucleico complementario obtenida de dicha planta bajo condiciones que permiten la hibridación de ácidos nucleicos, en donde dicha molécula de ácido nucleico marcador híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de la misma; (B) permitir la hibridación entre dicha molécula de ácido nucleico marcador y dicha molécula de ácido nucleico complementario obtenida de dicha planta; y (C) detectar la presencia de dicho polimorfismo. La presente invención incluye y provee un método para determinar un nivel o patrón de expresión de una proteína en una célula vegetal o tejido vegetal, que comprende: (A) incubar bajo condiciones que permiten la hibridación de ácido nucleico: una molécula de ácido nucleico marcador, dicha molécula de ácido nucleico marcador teniendo una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, complementos de cualquiera de ellas o fragmentos que comprenden por lo menos alrededor de 20 nucleótidos de dichas secuencias, con una molécula de ácido nucleico complementario obtenida de una célula vegetal o tejido vegetal, (B) permitir la hibridación entre dicha molécula de ácido nucleico marcador y dicha molécula de ácido nucleico complementario obtenida de dicha célula vegetal o tejido vegetal; y (C) detectar dicho nivel o patrón de dicho ácido nucleico complementario, en donde la detección del ácido nucleico complementario es predictiva del nivel o patrón de expresión de dicha proteína. La presente invención incluye y provee un método para determinar un nivel o patrón de expresión de una proteína en una célula vegetal o tejido vegetal bajo evaluación, que comprende: analizar una concentración de una molécula indicadora en dicha célula vegetal o tejido vegetal bajo evaluación, en donde dicha concentración de dicha molécula indicadora depende de la expresión de un gen, y en donde dicho gen híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de la misma; y comparar dicha concentración de dicha molécula indicadora con las concentraciones conocidas de dicha molécula indicadora que ocurren en las células vegetales o tejidos vegetales con niveles o patrones conocidos de expresión de dicha proteína. La presente invención incluye y provee una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo, en donde dicha molécula de ácido nucleico heterólogo codifica una enzima con actividad de corismato mutasa y prefenato deshídrogenasa, o un fragmento de dicha molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos 20 aminoácidos contiguos. La presente invención incluye y provee un aceite derivado de una semilla de una planta transformada, que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4; y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la molécula de ARNm. La presente invención incluye y provee un método para preparar tocoferoles, que comprende: transformar una planta con un ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4, y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la molécula de ARNm; y desarrollar dicha planta. La presente invención incluye y provee un método para preparar ácido homogentésico, que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4, y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la molécula de ARNm. La presente invención incluye y provee un método para preparar plastoquinonas, que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4, o un fragmento de la misma, y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la molécula de ARNm. La presente invención incluye y provee materias primas que comprenden una planta transformada o parte de la misma, en donde dicha planta transformada tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3. La presente invención incluye y provee un alimento que comprende material vegetal fabricado a partir de una planta transformada, en donde dicha planta transformada contiene una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia seleccionada del grupo de las SEQ ID NOs: 1 y 3. La presente invención incluye y provee una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4. La presente invención incluye y provee una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 3. La presente invención incluye y provee un método para producir una planta que tiene semillas con un nivel aumentado de tocoferol, que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa; y (B) desarrollar dicha planta transformada. La presente invención incluye y provee un método para producir una planta que tiene semillas con un nivel aumentado de tocoferol, que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4; y (B) desarrollar dicha planta transformada. La presente invención incluye y provee una semilla derivada de una planta transformada, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, en donde dicha semilla tiene un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno.

La presente invención incluye y provee una semilla derivada de una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 4, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee un aceite derivado de una semilla de una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno, que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee un aceite derivado de una semilla de una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno.

La presente invención incluye y provee materias primas que comprenden una planta transformada, o una parte de la misma, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee materias primas que comprenden una planta transformada, o una parte de la misma, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee materias primas que comprenden una planta transformada, o una parte de la misma, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee un alimento que comprende material vegetal fabricado a partir de una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee un alimento que comprende material vegetal fabricado a partir de una planta transformada, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee un alimento que comprende material vegetal fabricado a partir de una planta transformada, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee un alimento que comprende material vegetal fabricado a partir de una planta transformada, que tiene una molécula de ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4, en donde dicha planta transformada tiene una semilla con un nivel aumentado de tocoferol con respecto a las semillas de una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de la molécula de ácido nucleico exógeno. La presente invención incluye y provee construcciones de ácido nucleico, así como también plantas y organismos que contienen estas construcciones, que tienen combinaciones de dos o más genes involucrados en la biosíntesis de tocoferol y tocotrienol. Se prefiere cualquier combinación de los siguientes genes con tyrA: slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. En una modalidad particularmente preferida, tyrA se combina con HPPD y slr1736 o ATPT2.

DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO Y AMINOACIDOS SEQ ID NO: 1 describe una secuencia de ácido nucleico de molécula de ADN que codifica una prefenato deshidrogenasa bifuncional de Erwinia herbicola. SEQ ID NO: 2 describe una secuencia de aminoácidos derivada de una prefenato deshidrogenasa bifuncional de Erwinia herbicola.

SEQ ID NO: 3 describe una secuencia de ácido nucleico de molécula de ADN que codifica una prefenato deshidrogenasa bifuncional de Escherichia coli. SEQ ID NO: 4 describe una secuencia de aminoácidos derivada de una prefenato deshidrogenasa bifuncional de Escherichia coli. SEQ ID NO: 5 describe un iniciador 5' usado para la amplificación de una secuencia tyrA de Erwinia herbicola. SEQ ID NO: 6 describe un iniciador 3' usado para la amplificación de una secuencia de tyrA de Erwinia herbicola. SEQ ID NO: 7 describe un iniciador 5' usado para la amplificación de una secuencia tyrA de Escherichia coli. SEQ ID NO: 8 describe un iniciador 3' usado para la amplificación de una secuencia tyrA de Escherichia coli. SEQ ID NO: 9 describe una secuencia de iniciador. SEQ ID NO: 10 describe una secuencia de iniciador. SEQ ID NO: 11 describe una secuencia de iniciador. SEQ ID NO: 12 describe una secuencia de iniciador.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es una gráfica que compara los niveles de tocoferol total en semilla de líneas de Arabidopsis thaliana que alojan una construcción de expresión de tyrA de Erwinia herbicola con una secuencia objetivo plastídica, una planta de tipo silvestre, y una planta con un vector de control. La figura 2 es un esquema de la construcción pMON26588. La figura 3 es un esquema de la construcción pMON26589. La figura 4 es un esquema de la construcción pMON26591. La figura 5 es un esquema de la construcción pMON26590. La figura 6 es un esquema de la construcción pMON36510. La figura 7 es un esquema de la construcción pMON36512. La figura 8 es un esquema de la construcción pMON36511. La figura 9 es un esquema de la construcción pMON36520. La figura 10 es un esquema de la construcción pCGN10822. La figura 1 1 es un esquema de la construcción pMON36528. La figura 12 es un esquema de la construcción p ON69907. La figura 13 es un esquema de la construcción pMON69909. La figura 14 representa el contenido total de tocoferol y tocotrienol de semillas de Arabidopsis de plantas silvestres y varias líneas de plantas transformadas con el vector plasmídico pMON69907. La figura 5 representa el contenido total de tocoferol de semillas de Arabidopsis de plantas silvestres y varias líneas de plantas transformadas con el vector plasmídico pMON69907. La figura 16 representa el contenido total de tocoferol y tocotrienol de semillas de Arabidopsis thaliana de plantas silvestres y varias líneas de plantas transformadas con los vectores plasmídicos pCGN10822, pMON36528, pMON69907 y pMON69909.

La figura 17 representa un análisis detallado del contenido de tocoferol y tocotrienol de semillas de Arabidopsis de líneas de plantas transformadas con el vector p ON69909 con respecto a semillas de planta silvestre. Las figuras 18a y 18b muestran construcciones ejemplares para transformación en plantas. La figura 19 es una construcción esquemática de pMON36582. La figura 20 es un ejemplo de un vector transportador (pMON36586) que aloja un cassette de expresión de la homogentisato fitiltransferasa (HPT) de Arabidopsis como un cassette Bsp120l/Not I. El promotor de napin y el terminador de napin están fusionados a los extremos 5' y 3', respectivamente, para manejar la expresión específica en semilla. La figura 21 representa varios cassettes de expresión de gen mostrados en un vector transportador (A) o en un vector binario (B). La figura 22 es un esquema de la construcción pMON36596. La figura 23 es un esquema de la construcción pMON36597. La figura 24 es un esquema de la construcción p ON77601. La figura 25 es un esquema de la construcción pMON77602. La figura 26 es un esquema de la construcción pMON66657. La figura 27 es un esquema de la construcción pMON66659. La figura 28 es un esquema de la construcción p ON26541. La figura 29 es un esquema de la construcción p ON26543. La figura 30 es un esquema de la construcción pMON36176.

La figura 31 es una gráfica estándar de LC/MS. La figura 32 es una gráfica de LC/MS. La figura 33 es un cromatograma de HPLC. La figura 34 es un cromatograma de HPLC. La figura 35 es un esquema de la construcción pMON69915. La figura 36 es un esquema de la construcción pMON69919. La figura 37 es un esquema de la construcción pMON 0098. La figura 38 es un esquema de la construcción pMON36520. La figura 39 es un esquema de la construcción pMON43853. La figura 40 es un esquema de la construcción pMON36525. La figura 41 es un esquema de la construcción pMON43861. La figura 42 es un esquema de la construcción pCGN7770. La figura 43 es un esquema de la construcción pMON69911. La figura 44 es un esquema de la construcción pCGN11301. La figura 45 es un esquema de la construcción pCGN3223. La figura 46 es un esquema de la construcción pMON36575. La figura 47 es un esquema de la construcción pMON38207R La figura 48 es un esquema de la construcción pMON36571. La figura 49 es un esquema de la construcción pMON365576. La figura 50 es un esquema de la construcción pMON69924. La figura 51 es un esquema de la construcción pMON69943. La figura 52 es un esquema de la construcción pMON69929. La figura 53 es un esquema de la construcción pMON69936.

La figura 54 es un esquema de la construcción pMON36592. La figura 55 es un esquema de la construcción pMON69945. La figura 56 es un esquema de la construcción p ON 16602. La figura 57 es un esquema de la construcción pMON36525. La figura 58 es un esquema de la construcción pMON58171. La figura 59 es un esquema de la construcción pMON58172. La figura 60 es un esquema de la construcción pMON58170. La figura 61 es un esquema de la construcción pMON36591. La figura 62 es un esquema de la construcción pMON36588. La figura 63 es un esquema de la construcción pMON36592. La figura 64 es un esquema de la construcción p ON58182. La figura 65 es un esquema de la construcción pMON58176. La figura 66 es un esquema de la construcción pMON58 83. La figura 67 es un esquema de la construcción pMON58185. La figura 68 es un esquema de la construcción pMON36593. La figura 69 es un esquema de la construcción p ON36589. La figura 70 es un esquema de la construcción pMON36590. La figura 71 es un esquema de la construcción pMON67162. La figura 72 es un esquema de la construcción pMON58178. La figura 73 es un esquema de la construcción pMON58186. La figura 74 es un esquema de la construcción pMON58188. La figura 75 muestra los niveles de tocoferoi, tocotrienol también de HGA en líneas seleccionadas.

La figura 76 muestra los niveles de tocotrienol y 2M6PPQ en líneas seleccionadas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que se revelan aquí puede ser fomentada o sobreexpresada en una variedad de organismos tales como plantas, lo que puede producir niveles más altos de precursores de tocoferol, tales como ácido homogentísico (HGA), y finalmente niveles más altos de tocoferol en dichos organismos. Además, la expresión fomentada o sobreexpresión de las proteínas que aquí se describen también puede producir niveles más altos de plastoquinonas. Más aún, la presente invención provee varios agentes, por ejemplo moléculas de ácido nucleico y proteínas, asociados con la producción de tocoferoles, y provee usos de dichos agentes. La presente invención incluye y provee construcciones de ácido nucleico para la expresión de prefenato deshidrogenasas bifuncionales en organismos en los cuales se desea aumentar el rendimiento de ácido homogentésico, plastoquinonas o tocoferoles. Tales construcciones de ácido nucleico se pueden usar en organismos en los que es deseable un aumento del nivel de la actividad de prefenato deshidrogenasa. La invención también incluye y provee construcciones de ácido nucleico para la expresión de fitil preniitransferasas en organismos en los que es deseable aumentar la producción de plastoquinonas o tocoferoles, y el uso de construcciones que producen ácidos nucleicos de antisentido contra fitil preniltransferasas en organismos en los que es deseable aumentar la producción de ácido homogentésico.

Agentes Los agentes de la invención serán de preferencia "biológicamente activos" con respecto a un atributo estructural, como la capacidad de un ácido nucleico para hibridar con otra molécula de ácido nucleico, o la susceptibilidad de una proteína para ser enlazada por un anticuerpo (o para competir con otra molécula por dicha unión). Alternativamente, dicho atributo puede ser catalítico e incluir así la capacidad del agente para mediar una reacción o respuesta química. Los agentes serán, de preferencia, "sustancialmente puros". El término "sustancialmente puro", como se usa aquí, se refiere a una molécula separada sustancialmente de toda otra molécula asociada normalmente con la misma en su estado natural. Muy de preferencia, una molécula sustancialmente pura es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula sustancialmente pura puede estar más de 60% libre, de preferencia 75% libre, de preferencia 90% libre, y muy de preferencia 95% libre de otras moléculas presentes en la mezcla natural (excluyendo el solvente). Se considera que el término "sustancialmente puro" no abarca moléculas presentes en su estado natural. Los agentes de la invención también pueden ser recombinantes. Como se usa aquí, el término recombinante significa cualquier agente (por ejemplo ADN, péptido, etc.) que sea resultado de la manipulación humana de una molécula de ácido nucleico. Se entiende que los agentes de la invención se pueden marcar con reactivos que facilitan la detección del agente (por ejemplo, marcas fluorescentes, Prober y otros, Science 238:336-340 (1987); Albarella y otros, EP 144914; marcas químicas, Sheldon y otros, patente de E.U.A. No. 4,582,789; Albarella y otros, patente de E.U.A. No. 4,563,417; bases modificadas, iyoshi y otros, EP 19448).

Moléculas de ácido nucleico Los agentes de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican una prefenato deshidrogenasa bifuncional que tiene actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa. En un aspecto preferido de la presente invención, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un homólogo bacteriano de una prefenato deshidrogenasa bifuncional. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene las SEQ ID NOs: 1 o 3. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico es un fragmento de cualquier secuencia de ácido nucleico aquí revelada que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de prefenato deshidrogenasa. En otro aspecto preferido de la presente invención, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas y fragmentos de cualquiera de ellas. En un aspecto adicional de la presente invención, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2 y 4, y fragmentos de las mismas. En otro aspecto preferido .de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico comprenden tanto una secuencia de ácido nucleico que codifica una prefenato deshidrogenasa bifuncional como un cassette de expresión para la expresión de fitil preniltransferasa. En un aspecto adicional de la presente invención se pueden emplear construcciones de ácido nucleico que codifican separadamente una prefenato deshidrogenasa bifuncional y una fitil preniltransferasa. En otro aspecto preferido de la presente invención, una molécula de ácido nucleico comprende secuencias de nucleótidos que codifican un péptido de tránsito a plástido, fusionado operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína o fragmento de la presente invención. Se entiende que, en un aspecto adicional de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención, los ácidos nucleicos pueden codificar una proteína que difiere de cualquiera de las proteínas en que se han suprimido, sustituido o añadido uno o más aminoácidos sin alterar su función. Por ejemplo, se entiende que los codones capaces de codificar para tales sustituciones conservativas de aminoácidos son conocidos en la técnica. Un subgrupo de las moléculas de ácido nucleico de la invención es el de los fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos pueden consistir de una o más porciones significativas de las moléculas de ácido nucleico de la invención, o en realidad de la mayor parte de las mismas, como las que se revelan específicamente. Alternativamente, los fragmentos pueden . comprender oligonucleótidos más pequeños (que tienen aproximadamente de 15 a 400 residuos de nucleotido y de preferencia aproximadamente de 15 a 30 residuos de nucleotido, o aproximadamente de 50 a 100 residuos de nucleotido, o aproximadamente de 100 a 200 residuos de nucleotido, o aproximadamente de 200 a 400 residuos de nucleotido, o aproximadamente de 275 a 350 residuos de nucleotido). Un fragmento de una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención puede ser una sonda y específicamente una sonda de PCR. Una sonda de PCR es una molécula de ácido nucleico capaz de iniciar una actividad de polimerasa mientras se encuentra en una estructura de doble cadena con otro ácido nucleico. Existen en el campo varios métodos para determinar la estructura de las sondas de PCR y técnicas de PCR. Para identificar posibles iniciadores de PCR se pueden usar, por ejemplo, búsquedas generadas en computadora usando programas tales como Primer3 (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi), STSPipeline (www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline), o GeneUp (Pesóle y otros, BioTechniques 25:1 12-123 (1998)). Otro subgrupo de las moléculas de ácido nucleico de la invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína o un fragmento de la misma. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención o sus fragmentos son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen las que hibridan específicamente con moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3, y complementos de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también incluyen aquellas que hibridan específicamente con moléculas de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs: 2, 4, complementos de las mismas, y fragmentos de cualquiera de ellas. Como se usa aquí, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente una con otra, si ambas son capaces de formar una estructura antiparalela de ácido nucleico de doble cadena. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si ambas exhiben una complementariedad total. Como se usa aquí, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad total" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Se dice que las dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar entre sí con estabilidad suficiente para permitirles permanecer apareadas una con otra bajo por lo menos condiciones convencionales de "baja severidad". Similarmente, se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridar entre sí con estabilidad suficiente para permitirles permanecer apareadas una con otra bajo condiciones convencionales de "alta severidad". Las condiciones convencionales de severidad son descritas por Sambrook y otros, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), y por Haymes y otros, "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach", IRL Press, Washington, D.C. (1985). Por lo tanto, las desviaciones de la complementariedad total son admisibles siempre que dichas desviaciones no obstruyan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena. De esta manera, para que una molécula de ácido nucleico sirva como un iniciador o una sonda, solo es necesario que su secuencia sea suficientemente complementaria para ser capaz de formar una estructura estable de doble cadena bajo las condiciones empleadas de solvente y concentración de sal. Las condiciones apropiadas de severidad que promueven la hibridación de ADN son, por ejemplo, cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6.0 X, a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de SSC 2.0 X a 20-25°C; son conocidas para el experto en la materia, o se pueden encontrar en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado se puede seleccionar de una severidad baja de aproximadamente SSC 2.0 X a 50°C, a una severidad alta de aproximadamente SSC 0.2X a 65°C. Además, la temperatura en el paso de lavado se puede aumentar de las condiciones de severidad baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de severidad alta a aproximadamente 65°C. Se puede variar tanto la temperatura como la concentración de sal, o se puede mantener constante una de las dos variables mientras que se cambia la otra. En una modalidad preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de las mismas, bajo condiciones moderadamente severas, por ejemplo SSC aproximadamente 2.0 X y a aproximadamente 65°C. En una modalidad particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención incluirá las moléculas de ácido nucleico que hibridan específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de las mismas, bajo condiciones de severidad alta tales como SSC 0.2X y aproximadamente 65°C. En un aspecto de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención tienen una o más de las secuencias de ácido nucleico que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de las mismas. En otro aspecto de la presente invención, una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención comparten entre 100% y 90% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias dé ácido nucleico que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de las mismas y fragmentos de cualquiera de ellas. En un aspecto adicional de la presente invención, una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención comparten entre 100% y 95% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de ácido nucleico que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas, y fragmentos de cualquiera de ellas. En un aspecto más preferido de la presente invención, una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención comparten entre 100% y 98% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de ácido nucleico que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas y fragmentos de cualquiera de ellas. En un aspecto más preferido de la presente invención, una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención comparten entre 100% y 99% de identidad de secuencia con una o más de las secuencias que se describen en las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas y fragmentos de cualquiera de ellas. En una modalidad preferida, los cálculos de porcentaje de identidad se realizan usando el programa Megalign de la serie de computación de bioinformática LASERGENE (parámetros por omisión, DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin). Una molécula de ácido nucleico de la invención también puede codificar una proteína homologa. Como se usa aquí, una molécula de proteína homologa o un fragmento de la misma es una molécula de proteína que es la contraparte en una segunda especie, o un fragmento de la misma (por ejemplo la subunidad pequeña de Rubisco de maíz es un homólogo de la subunidad pequeña de Rubisco de Arabidopsis). Un homólogo también puede ser generado por evolución molecular o por técnicas de desordenamiento de ADN, de modo que la molécula retiene por lo menos una característica funcional o estructural de la proteína original (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,81 1 ,238). En otra modalidad, el homólogo se selecciona del grupo que consiste de alfalfa, Arabidopsis, cebada, Brassica campestrís, Brassica napus, brócoli, col, cañóla, Citrus, algodón, ajo, avena, cebolla, lino, una planta de ornato, cacahuate, pimienta, papa, arroz, centeno, sorgo, fresa, caña de azúcar, remolacha, tomate, trigo, álamo, pino, abeto, eucalipto, manzano, lechuga, lenteja, uva, plátano, te, pasto, girasol, soya, maíz, Phaseolus, col de abisinia, mostaza, ricino, ajonjolí, algodón, linaza, cártamo, y palma de aceite. Más particularmente, los homólogos preferidos se seleccionan de cañóla, maiz, Arabidopsis, Brassica campestrís, Brassica napus, soya, col de abisinia, mostaza, ricino, cacahuate, ajonjolí, algodón, lino, cártamo, palma de aceite, lino y girasol. En una modalidad muy preferida, el homólogo se selecciona del grupo que consiste de cañóla, maíz, Arabidopsis, Brassica campestrís, Brassica napus, soya, girasol, cártamo, palma de aceite y cacahuate. En una modalidad preferida el homólogo es soya. En otra modalidad preferida el homólogo es cañóla. En otra modalidad preferida el homólogo es Brassica napus. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico que tienen las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas y sus fragmentos; o muy preferiblemente las SEQ ID NOs: 1 y 3 y sus complementos, se pueden utilizar para obtener tales homólogos.

En otro aspecto adicional de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender secuencias que difieren de las que codifican una proteína o un fragmento de la misma en las SEQ ID NOs: 2 y 4, debido al hecho de que una proteína puede tener uno o más cambios conservativos de aminoácido, y por lo tanto las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína pueden tener diferencias de secuencia. Se entiende que los codones capaces de codificar para tales sustituciones conservativas de aminoácidos son conocidos en la técnica. Es conocido en la técnica que se pueden sustituir uno o más aminoácidos nativos con otros aminoácidos cuya carga y polaridad son similares a las del aminoácido nativo, esto es, una sustitución conservativa de aminoácidos. Los sustitutos conservativos para un aminoácido dentro de la secuencia de polipéptido nativo se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Los aminoácidos se pueden dividir en los siguientes cuatro grupos: (1 ) aminoácidos ácidos, (2) aminoácidos básicos, (3) aminoácidos neutros polares, y (4) aminoácidos neutros no polares. Aminoácidos representativos dentro de estos varios grupos incluyen, sin limitación, (1 ) aminoácidos ácidos (cargados negativamente) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (cargados positivamente) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos neutros polares tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; y (4) aminoácidos neutros no polares (hidrofóbicos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. La sustitución conservativa de aminoácidos dentro de la secuencia de polipéptido nativa se puede hacer remplazando un aminoácido de uno de estos grupos con otro aminoácido del mismo grupo. En un aspecto preferido, los equivalentes biológicamente funcionales de las proteínas o fragmentos de la presente invención pueden tener diez o menos cambios conservativos de aminoácido, de preferencia siete o menos cambios conservativos de aminoácido, y preferiblemente cinco o menos cambios cambios conservativos de aminoácido. La secuencia de nucleótidos codificadora tendrá así sustituciones de base correspondientes, que le permiten codificar formas equivalentes biológicamente funcionales de las proteínas o fragmentos de la presente invención. Se entiende que en una estructura de proteína se pueden remplazar algunos aminoácidos con otros aminoácidos, sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como por ejemplo regiones de unión de antígeno de anticuerpos o sitios de unión sobre moléculas substratos. Como la capacidad y naturaleza interactiva de una proteína es la que define su actividad funcional biológica, en una secuencia de proteína se pueden hacer algunas sustituciones de secuencia de aminoácidos, y desde luego su secuencia de ADN codificadora fundamental, y no obstante, obtener aún así una proteína con propiedades similares. De esta manera, los inventores contemplan que se pueden hacer varios cambios en las secuencias peptídicas de las proteínas o fragmentos de la presente invención, o las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Se entiende que los codones capaces de codificar dichos cambios de aminoácido son conocidos en la técnica. Para hacer estos cambios se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína es entendida generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)). Es aceptado que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y sus características de carga (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)); estos son isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+3.8), fenilalanina (+2.8), cisteína/cistina (+2.5), metionina (+1.9), alanina (+1.8), glicina (-0.4), treonina (-0.7), serina (-0.8), triptofano (-0.9), tirosina (-1.3), prolina (-1.6), histidina (-3.2), glutamato (-3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), asparagina (-3.5), lisina (-3.9), y arginina (-4.5). Al hacer estos cambios se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2; particularmente los que están dentro de ±1 , y es más preferida la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±0.5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer eficazmente en base a su hidrofilicidad. La patente de E.U.A. No. 5,554,101 afirma que la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se menciona detalladamente en la patente de E.U.A. No. 4,554,101 , se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácido: arginina (+3.0), Usina (+3.0), aspartato (+3.0+1 ), glutamato (+3.0±1 ), serina (+0.3), asparagina (+0.2), glutamina (+0.2), glicina (0), treonina (-0.4), prolina (-0.5±1), alanina (-0.5), histidina (-0.5), cisteína (- 1.0), metionina (-1.3), valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (- 2.3), fenilalanina (-2.5), y triptofano (-3.4). Al efectuar dichos cambios se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +2, particularmente dentro de ±1 , y preferiblemente dentro de ±0.5. En un aspecto adicional de la presente invención, una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención difieren en su secuencia de aquellas para las cuales se provee aquí una secuencia específica, porque uno o más codones han sido remplazados con un codón que codifica una sustitución conservativa del aminoácido codificado originalmente. Los agentes de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican una región de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos de una proteína de la presente invención, de preferencia una región de por lo menos aproximadamente 25, 40, 50, 100 o 25 aminoácidos contiguos de una proteína de la presente invención. En una modalidad preferida, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede estar ligada operativamente a una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm, en donde la molécula de ácido nucleico que está enlazada al promotor es heteróloga con respecto a ese promotor. Como se usa aquí, "heterólogo" significa que no ocurren juntas naturalmente.

Moléculas de proteína y péptido Una clase de agentes incluye una o más de las proteínas o sus fragmentos o moléculas de péptido, codificadas por un agente de ácido nucleico de la invención. Una clase particular preferida de proteínas es aquella que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4 y fragmentos de las mismas. Los agentes de péptido o proteína pueden tener extensiones de secuencia de aminoácido C-terminales o N-terminales. Una clase de extensiones N-terminales empleadas en una modalidad preferida son los péptidos de tránsito a plástido. Cuando se emplean, los péptidos de tránsito a plástido se pueden enlazar operativamente a la secuencia N-terminal, permitiendo así la localización del agente péptido o proteína en los plástidos. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección a plástido es una secuencia CTP1. En otra modalidad la secuencia es una secuencia CTP2. Como se usa aquí, el término "proteína" o "molécula de proteína" incluye cualquier molécula que comprende cinco aminoácidos o más. Es bien conocido en la técnica que las proteínas pueden sufrir modificación, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción, tales como por ejemplo, sin limitación, formación de enlace disulfuro, glicosilación, fosforilación u oligomerización. De esta manera, como se usa aquí, el término "proteína" o "molécula de péptido" incluye cualquier proteína que es modificada por cualquier proceso biológico o no biológico. Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-aminoácidos naturales. Esta definición incluye norleucina, norvalina, ornitina, homocisteína y homoserina. Una o más de las proteínas o sus fragmentos o moléculas de péptido pueden ser producidas mediante síntesis química, o muy preferiblemente por expresión en un hospedero bacteriano o eucariótico adecuado. Los métodos de expresión adecuados los describen Sambrook y otros en "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) o textos similares. Un "fragmento de proteína" es una molécula de péptido o polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende un subgrupo de la secuencia de aminoácidos de esa proteína. Una proteína o un fragmento de la misma que comprende una o más regiones de péptido adicionales no derivadas de esa proteína es una proteína de "fusión". De estas moléculas se pueden hacer derivados que contienen carbohidratos u otras entidades (tales como la hemocianina de lapa). Las moléculas de proteína o péptido de fusión de la invención se producen preferiblemente por medios recombinantes. Otra clase de agentes comprende moléculas de proteína o péptido, o fragmentos o fusiones de las mismas, que comprenden las SEQ ID NOs: 2 y 4 y fragmentos de las mismas, en las cuales se han añadido, remplazado o suprimido residuos de aminoácido conservativos, no esenciales o no relevantes. Se conocen en la técnica medios computarizados para diseñar modificaciones en la estructura de la proteína (Dahiyat y Mayo, Science 278:82-87 (1997)). Una proteína de la invención también puede ser una proteína homologa. Como se usa aquí, una proteína homologa o fragmento de la misma es una proteína o fragmento contraparte en una segunda especie. Un homólogo también puede ser generado por evolución molecular o técnicas de desordenamiento de ADN, de modo que la molécula retiene por lo menos una característica funcional o estructural de la original (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,811 ,238). En otra modalidad, el homólogo se selecciona del grupo que consiste de alfalfa, Arabidopsis, cebada, brócoli, col, cañóla, Citrus, algodón, ajo, avena, cebolla, lino, una planta de ornato, cacahuate, pimienta, papa, arroz, centeno, sorgo, fresa, caña de azúcar, remolacha, tomate, trigo, álamo, pino, abeto, eucalipto, manzano, lechuga, lenteja, uva, plátano, te, pasto, girasol, soya, maíz y Phaseolus. Más particularmente, los homólogos preferidos se seleccionan de cañóla, maíz, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soya, col de abisinia, mostaza, ricino, cacahuate, ajonjolí, algodón, linaza, cártamo, palma de aceite, lino y girasol. En una modalidad muy preferida, el homólogo se selecciona del grupo que consiste de cañóla, maíz, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soya, girasol, cártamo, palma de aceite y cacahuate. En una modalidad preferida el homólogo es soya. En otra modalidad preferida el homólogo es cañóla. En otra modalidad preferida el homólogo es Brassica napus. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, o sus complementos y fragmentos, se pueden utilizar para obtener tales homólogos. Los agentes de la invención incluyen proteínas y fragmentos de las mismas que comprenden una región de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, de preferencia por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, de preferencia por lo menos aproximadamente 25, 35, 50, 75 o 100 aminoácidos contiguos de una proteína de la presente invención. En otra modalidad preferida, las proteínas de la presente invención incluyen una región de entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos contiguos, de preferencia entre aproximadamente 20 y 50 aminoácidos contiguos, y es muy preferida una región de entre aproximadamente 40 y 80 aminoácidos contiguos.

Construcciones de planta y transformantes de planta Una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar en la transformación o transfección de plantas. Se puede transferir material genético exógeno a una célula vegetal y la célula vegetal puede ser regenerada en una planta completa, fértil o estéril. El material genético exógeno es cualquier material genético de cualquier fuente, ya sea natural o no, que sea susceptible de ser insertado en cualquier organismo. En una modalidad preferida, el material genético exógeno codifica una prefenato deshidrogenasa bifuncional o fragmentos de la misma, muy preferiblemente una prefenato deshidrogenasa bifuncional de un organismo procariótico, y más preferiblemente una prefenato deshidrogenasa bifuncional de Erwinia herbicola o Escheríchia coli. En una modalidad preferida, el material genético exógeno incluye una molécula de ácido nucleico de la presente invención, y preferiblemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas y fragmentos de cualquiera de ellas. En otra modalidad, el material genético exógeno incluye una molécula de ácido nucleico de la presente invención, preferiblemente un ácido nucleico que codifica una proteína o fragmento de la misma que tiene actividad de fitil preniltransferasa. En una modalidad de la presente invención, el material genético exógeno que comprende un homólogo de TyrA o fragmento del mismo es introducido en una planta con uno o más genes adicionales. En una modalidad, las combinaciones preferidas de genes incluyen dos o más de los siguientes genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa (Krindl y otros, Seed Sci. Res. 1 :209:219 (1991 ); Keegstra, Cell 56(2):247-53 (1989); Nawrath, y otros, Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A. 91 :12760-12764 (1994); Xia y otros, J. Gen. Microbio!. 138:1309-1316 (1992); Cyanobase en Internet en www.kazusa.or jp/cyanobase; Lois y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95 (5):2105-2110 (1998); Takahashi y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95 (17), 9879-9884 (1998); Norris y otros, Plant Physiol. 1 17:1317-1323 (1998); Bartley y Scolnik, Plant Physiol. 104:1469-1470 (1994), Smith y otros, Plant J. 1 1 : 83-92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily y otros, Plant Physiol., 00(2):1069-1071 (1992); Sato y otros, J. DNA Res. 7 (1 ):31-63 (2000)). En una combinación preferida, la construcción o construcciones de ácido nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. En tales combinaciones, uno o más de los productos de gen pueden ser dirigidos a plástidos usando una secuencia de dirección a plástido. Alternativamente, uno o más de los productos de gen pueden ser localizados en el citoplasma. Tales genes pueden ser introducidos, por ejemplo con el homólogo de TyrA o un fragmento del mismo sobre una sola construcción, introducidos en diferentes construcciones pero en el mismo evento de transformación, o introducidos en plantas separadas, seguido por una o más cruzas para generar la combinación deseada de genes. En dichas combinaciones, un promotor preferido es un promotor de napina, y una secuencia de dirección a plástido preferida es una secuencia CTP1. Este material genético puede ser transferido en monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo sin limitación cañóla, maíz, soya, Arabidopsis phaseolus, cacahuate, alfalfa, trigo, arroz, avena, sorgo, centeno, tritordeo, mijo, cañuela, ballico perenne, caña de azúcar, arándano agrio, papayo, plátano, cártamo, palma de aceite, lino, melón, manzano, pepino, dendrobrio, gladiola, crisantemo, liliáceas, algodón, eucalipto, girasol, Brassica campestrís, Brassica napus, pasto, caña de azúcar, café y dioscorea (Christou, en "Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit", Academic Press, San Diego, California (1996)), siendo preferidos cañóla, maíz, Arabidopsis, Brassica campestrís, Brassica napus, soya, girasol, cártamo, palma de aceite, y cacahuate. En una modalidad más preferida el material genético es transferido a cañóla. En otra modalidad preferida el material genético es transferido a Brassica napus. En otra modalidad muy preferida el material genético es transferido a soya. La transferencia de un ácido nucleico que codifica una proteína puede dar como resultado la expresión o sobreexpresión de esa proteína en una célula transformada o planta transgénica. Una o más de las proteínas o fragmentos de las mismas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser sobreexpresadas en una célula transformada o una planta transformada. Tal expresión o sobreexpresión puede ser el resultado de transferencia transitoria o estable del material genético exógeno. En una modalidad preferida, la expresión o sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta un nivel de tocotrienoles aumentado con respecto a una planta no transformada con una base genética similar. En una modalidad preferida, la expresión o sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta un nivel de tocoferoles aumentado con respecto a una planta no transformada con una base genética similar. En una modalidad preferida, la expresión o sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta un nivel de cc-tocoferol aumentado con respecto a una planta no transformada con una base genética similar. En una modalidad preferida, la expresión o sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta un nivel de ?-tocoferol aumentado con respecto a una planta no transformada con una base genética similar. En una modalidad preferida, la expresión o sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta un nivel de ácido homogentísico aumentado con respecto a una planta no transformada con una base genética similar. En una modalidad preferida, la expresión o sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta un nivel de plastoquinoles o plastoquinonas aumentado con respecto a una planta no transformada con una base genética similar. En algunas modalidades, los niveles de uno o más productos de la ruta de la biosíntesis del tocoferol, incluyendo cualesquiera de uno o más tocotrienoles, tocoferoles, a-tocoferol, ?-tocoferol, plastoquinoles, plastoquinonas o ácido homogentésico, son aumentados en 10%, o muy preferiblemente 25%, 50%, 100%, 200%, 250%, 1 ,000%, 2,000% o 2,500%. Los niveles de los productos pueden ser aumentados en todo un organismo tal como una planta, o pueden ser localizados en uno o más órganos o tejidos específicos del organismo. Por ejemplo, los niveles de los productos pueden ser incrementados en uno o más de los tejidos y órganos de una planta, incluidos sin limitación, raíces, tubérculos, tallos, hojas, pedúnculos, frutos, bayas, nueces, corteza, vainas, semillas y flores. En otra modalidad, la sobreexpresión en una planta de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma, provee en esa planta o en un tejido de esa planta un nivel de proteína prefenato deshidrogenasa aumentado con respecto a una planta o tejido no transformado, con una base genética similar. En otra modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una planta transformada, puede proveer tolerancia a una variedad de esfuerzos, por ejemplo tolerancia al esfuerzo oxidativo tal como oxígeno u ozono, tolerancia a luz UV, tolerancia al frío o tolerancia a patógenos fúngicos/microbianos. Como se usa aquí en un aspecto preferido, una tolerancia o resistencia al esfuerzo es determinada por la capacidad de una planta para producir una planta que cuando es sometida a un esfuerzo tal como frío tiene un rendimiento más alto que una planta sin dicha tolerancia o resistencia al esfuerzo. En un aspecto particularmente preferido de la presente invención, la tolerancia o resistencia al esfuerzo se mide con respecto a una planta con una base genética similar a la de la planta tolerante o resistente, pero la planta expresa o sobreexpresa una proteina de la presente invención o un fragmento de la misma. El material genético exógeno puede ser transferido a una célula hospedera usando un vector o construcción de ADN diseñado para tal propósito. El diseño de dicho vector forma parte del conocimiento genera! en la técnica (véase "Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual", Clark (ed.), Springer, New York (1997)). En algunas modalidades de esta invención puede ser transferida a la planta objetivo deseada una secuencia de un solo gen seleccionada del grupo que consiste de tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. En una combinación preferida, la construcción o construcciones de ácido nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. Las plantas objetivo que expresan la actividad deseada de la secuencia de gen transferida pueden ser sometidas a una o más cruzas con plantas que han sido transformadas con una o más de otras secuencias de gen seleccionadas del grupo que consiste de tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, y una construcción de antisentido para ácido omogentísico dioxigenasa, para obtener plantas que expresan dos o más de las actividades deseadas de la secuencia de gen transferida. En una combinación preferida, la construcción o construcciones de ácido nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. En otra modalidad, las construcciones de vector de ADN pueden ser construcciones de genes múltiples que comprenden dos o más secuencias de gen seleccionadas del grupo que consiste de tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa, de tal manera que la transformación con una sola construcción de vector de ADN dará como resultado la expresión de las dos o más secuencias de gen. En una combinación preferida, la construcción o construcciones de ácido nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. Una construcción o vector puede incluir un promotor vegetal para expresar la proteína o fragmento de proteína de elección. En una modalidad preferida, cualquier molécula de ácido nucleico aquí descrita se puede enlazar operativamente a una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm. Por ejemplo, se puede usar sin limitación cualquier promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm, como los promotores que aquí se describen. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor vegetal.

Se han descrito en la literatura varios promotores que son activos en células vegetales. Estos incluyen el promotor de nopalina sintetasa (NOS, Ebert y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5745-5749 (1987)), el promotor de octopina sintetasa (OCS, que está contenido en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de caulimovirus tales como el promotor 19S del virus de mosaico de coliflor (Ca V, Lawton y otros, Plañí Mol. Biol. 9:315-324 (1987)) y el promotor 35S de CaMV (Odell y otros, Nature 313:810-812 (1985)), el promotor 35S del virus de mosaico de escrofularia, el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO), el promotor Adh (Walker y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:6624-6628 (1987)), el promotor de sacarosa sintetasa (Yang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:4144-4148 (1990)), el promotor complejo del gen R (Chandler y otros, The Plant Cell 1 :1175-1 183 (1989)) y el promotor del gen de la proteína de unión de clorofila a/b, etc. Estos promotores han sido usados para crear construcciones de ADN que han sido expresadas en plantas; véase, por ejemplo, la publicación de PCT WO 84/02913. Los promotores 35S de CaMV son preferidos para usar en plantas. En la invención se pueden usar promotores que se sepa o se encuentre que ocasionan la transcripción de ADN en células vegetales. Para una expresión en los tejidos de fuente de la planta tales como la hoja, semilla, raíz o tallo, se prefiere que los promotores utilizados tengan una expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. La expresión específica de tejido de una proteína de la presente invención es una modalidad particularmente preferida. Para este fin, se puede elegir de entre varios promotores de genes con expresión específica o incrementada de tejido o célula. Ejemplos de dichos promotores reportados en la literatura incluyen el promotor de glutamina sintetasa GS2 de cloropiasto de chícharo (Edwards y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:3459-3463 (1990)), el promotor de fructosa-1 ,6-bifosfatasa (FBPasa) de cloropiasto de trigo (Lloyd y otros, Mol. Gen. Genet. 225:209-216 (1991 )), el promotor fotosintético nuclear ST-LS1 de papa (Stockhaus y otros, EMBO J. 8:2445-2451 (1989)), el promotor de serina/treonina cinasa (PAL) y el promotor de glucoamilasa (CHS) de Arabidopsis thaliana. También se reporta que son activos en tejidos fotosintéticamente activos el promotor de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa (RbcS) de alerece del este (Larix laricina), el promotor del gen cab, cab6, de pino (Yamamoto y otros, Plant Cell Physiol. 35:773-778 (1994)), el promotor del gen Cab-1 de trigo (Fejes y otros, Plant Mol. Biol. 15:921 -932 (1990)), el promotor del gen CAB-1 de espinaca (Lubberstedt y otros, Plant Physiol. 104:997-1006 (1994)), el promotor del gen IR de arroz (Luán y otros, Plant Cell. 4:971-981 (1992)), el promotor de piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) de maíz (Matsuoka y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 90: 9586-9590 (1993)), el promotor del gen Lhcb1*2 de tabaco (Cerdan y otros, Plant Mol. Biol. 33:245-255 (1997)), el promotor de sacarosa-H+symporter SUC2 de Arabidopsis thaliana (Truernit y otros, Planta. 196:564-570 (1995)) y el promotor de las proteínas de membrana de tilacoide de espinaca (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). También se pueden utilizar en la invención otros promotores de las proteínas de unión a clorofila a/b, tales como los promotores del gen LhcB y el gen PsbP de mostaza blanca (Sinapis alba; Kretsch y otros, Plant Mol. Biol. 28:219-229 (1995)). Para una expresión en los tejidos de depósito de la planta, tales como el tubérculo de la planta de papa, el fruto del tomate o la semilla de maíz, trigo, arroz y cebada, se prefiere que los promotores utilizados en la invención tengan una expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. Se conocen varios promotores de genes con expresión específica de tubérculo o incrementada en tubérculo, que incluyen el promotor de patatina clase l (Bevan y otros, EMBO J. 8:1899-1906 (1986); Jefferson y otros, Plant Mol. Biol. 14:995-1006 (1990)), el promotor de los genes ADPGPP de tubérculo de papa, tanto la subunidad grande como pequeña, el promotor de sacarosa sintetasa (Salanoubat y Belliard, Gene 60:47-56 (1987), Salanoubat y Belliard, Gene 84:181-185 (1989)), el promotor de las proteínas mayores de tubérculo incluyendo los complejos de proteína de 22 kD e inhibidores de proteasa (Hannapel, Plant Physiol. 101 :703-704 (1993)), el promotor del gen de almidón sintetasa ligada a granulo (GBSS) (Visser y otros, Plant Mol. Biol. 17:691-699 (1991 )), y otros promotores de patatinas de clase I y II (Koster-Topfer y otros, Mol. Gen. Genet. 219:390-396 (1989); Mignery y otros, Gene. 62:27-44 (1988)). También se pueden usar otros promotores para expresar una proteína o fragmento de la misma en tejidos específicos tales como semillas o frutos. En realidad, en una modalidad preferida, el promotor usado es un promotor específico de semilla. Ejemplos de tales promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de genes tales como napin (Krindl y otros, Seed Sci. Res. 1 :209:219 (1991 )), faseolin (Bustos y otros, Plant Cell, 1 (9):839-853 (1989)), inhibidor de tripsina de soya (Riggs, y otros, Plant Cell 1 (6):609-621 (1989)), ACP (Baerson y otros, Plant Mol. Biol., 22(2):255-267 (1993)), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe y otros, Plant Physiol. 104(4):167-176 (1994)), la subunidad a' de b-conglicinina de soya (soy 7s, Chen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986))), y oleosina (véase, por ejemplo, Hong y otros, Plant Mol. Biol., 34(3):549-555 (1997)). Ejemplos adicionales incluyen el promotor de ß-conglicinina (Chen y otros, Dev. Genet. 10: 112-122 (1989)). También se incluyen las zeínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en el endosperma de maíz. Se han aislado clonas genómicas de genes de zeína (Pedersen y otros, Cell 29:1015-1026 (1982), y Russell y otros, Transgenic Res. 6(2): 157-168) y también se podrían usar los promotores de estas clonas, incluidos los de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD y los genes. Otros promotores que se sabe que funcionan en el maíz, por ejemplo, incluyen los promotores de los siguientes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas de ramificación I y II, almidón sintetasas, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas y sacarosa sintetasas. Un promotor particularmente preferido para la expresión en endosperma de maíz es el promotor del gen de glutelina de arroz, muy particularmente el promotor Osgt-1 (Zheng y otros, Mol Cell Biol. 13:5829-5842 (1993)). Ejemplos de promotores adecuados para expresión en el trigo incluyen los promotores de las subunidades de ADP-glucosa pirosintetasa (ADPGPP), la almidón sintetasa ligada a gránulo y otras almidón sintetasas, las enzimas ramificadora y desramificadora, las proteínas abundantes en embriogénesis, las gliadinas y las gluteninas. Ejemplos de estos promotores en arroz incluyen los promotores de las subunidades ADPGPP, la almidón sintetasa ligada a gránulo y otras almidón sintetasas, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, sacarosa sintetasas y las glutelinas. Un promotor particularmente preferido es el promotor de glutelina de arroz, Osgt-1. Ejemplos de tales promotores para cebada incluyen los de: las subunidades ADPGPP, la almidón sintetasa ligada a gránulo y otras almidón sintetasas, las enzimas ramificadoras, las enzimas desramificadoras, sacarosa sintetasas, las hordeinas, las embrioglobulinas y las proteínas específicas de aleurona. Un promotor preferido para la expresión en la semilla es un promotor de napin. También se pueden usar promotores específicos de raíz. Un ejemplo de tales promotores es el promotor del gen de quitinasa ácida (Samac y otros, Plant Mol. Biol. 25:587-596 (1994)). La expresión en tejido de raíz también se puede llevar a cabo utilizando los subdominios específicos de raíz del promotor CaMV35S que han sido identificados (Lam y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:7890-7894 (1989)). Otros promotores específicos de células de raíz incluyen los reportados por Conkling y otros, (Conkling y otros, Plant Physiol. 93:1203- 211 (1990)).

Promotores adicionales que se pueden utilizar se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,378,619; 5,391 ,725; 5,428,147; 5,447,858; 5,608,144; 5,608,144; 5,614,399; 5,633,441 ; 5,633,435; y 4,633,436. Además, se puede usar un favorecedor específico de tejido (Fromm y otros, The Plant Cell 1 :977-984 (1989)). Las construcciones o vectores pueden incluir también, con la región codificadora de interés, una secuencia de ácido nucleico que actúa total o parcialmente para terminar la transcripción de esa región. Se han aislado varias de tales secuencias, incluyendo la secuencia Tr7 3' y la secuencia NOS 3' (Ingelbrecht y otros, The Plant Cell 1 :671-680 (1989); Bevan y otros, Nucleic Acids Res. 1 1 :369-385 (1983)). También se pueden proveer regiones reguladoras de terminación de transcripción en las construcciones de expresión de planta de esta invención. Las regiones de terminación de transcripción pueden ser provistas por la secuencia de ADN que codifica el gen de interés o una región de terminación de transcripción conveniente derivada de una fuente genética diferente, por ejemplo, la región de terminación de transcripción que está asociada naturalmente con la región de iniciación de transcripción. El técnico experto reconocerá que en las construcciones de la presente invención se puede emplear cualquier región de terminación de transcripción conveniente que sea capaz de terminar la transcripción en una célula vegetal. Un vector o construcción también puede incluir elementos reguladores. Ejemplos de estos incluyen el intrón 1 de Adh (Callis y otros, Genes and Develop. 1 :1 183-1200 (1987)), el ¡ntrón de sacarosa sintetasa (Vasil y otros, Plant Physiol. 91 :1575-1579 (1989)) y el elemento TMV omega (Gallie y otros, The Plant Cell 1 :301-31 1 (1989)). Estos y otros elementos reguladores pueden ser incluidos cuando sea apropiado. Un vector o construcción también puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionares también se pueden usar para seleccionar plantas o células de planta que contienen el material genético exógeno. Ejemplos de estos incluyen, sin limitación: un gen neo (Potrykus y otros, Mol. Gen. Genet. 199:183-188 (1985)), que codifica para resistencia a kanamicina y puede ser seleccionado usando kanamicina, Rptll, G418, hpt etc.; un gen bar que codifica para resistencia a bialafos; un gen muíante de EPSP sintetasa (Hinchee y otros, Bio/Technology 6:915-922 (1988); Reynaerts y otros, "Selectable and Screenable Markers" en "Gelvin and Schilperoort Plant Molecular Biology Manual", Kluwer, Dordrecht (1988); Reynaerts y otros, "Selectable and screenable markers" en Gelvin and Schilperoort Plant Molecular Biology Manual", Kluwer, Dordrecht (1988)), aadA (Jones y otros, Mol. Gen. Genet. (1987)), que codifica resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinil (Stalker y otros, J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (1988)); un gen muíante de acetolactato siníeíasa (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona o sulfonilurea (solicitud de pateníe Europea 154,204 (11 de sep. de 1985)), ALS (D'HalIuin y oíros, Bio/Technology 10: 309-314 (1992)), y un gen DHFR resisíeníe a metotrexaíe (Thilleí y oíros, J. Biol. Chem. 263:12500-12508 (1988)). Un vecíor o construcción también puede incluir un péptido de tránsito. También se puede incorporar un péptido adecuado de tránsito en cloroplasto (publicación de la solicitud de patente Europea No. 0218571 ). También se pueden incorporar favorecedores de traducción como parte del vector de ADN. Las construcciones de ADN podrían contener una o más secuencias guía 5' no traducidas que pueden servir para favorecer la expresión de los productos de gen a partir de los transcritos resultantes de ARNm. Estas secuencias pueden ser derivadas del promotor seleccionado para expresar el gen o pueden ser modificadas específicamente para incrementar la traducción del ARNm. Estas regiones también se pueden obtener de ARNs virales, de genes eucarióticos adecuados, o de una secuencia genética sintética. Para un análisis de la optimización de la expresión de transgenes véase a Koziel y otros, Plant Mol. Biol. 32:393-405 (1996). Un péptido de tránsito preferido es CTP1. En otra modalidad, el péptido de tránsito es una secuencia CTP2. Un vector o construcción también puede incluir un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionares se pueden usar para monitorear la expresión. Marcadores seleccionabas ejemplares incluyen: un gen de ß-glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la cual se conocen varios substratos cromogénicos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5:387-405 (1987); Jefferson y otros, EMBO J. 6:3901-3907 (1987)); un gen de locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y otros, Stadler Symposium 1 1 :263-282 (1988)); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 75:3737-3741 (1978)), un gen que codifica una enzima para la cual se conocen varios substratos cromogénicos (por ejemplo PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow y otros, Science 234:856-859 (1986)); un gen xyE (Zukowsky y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:1101-1105 (1983)), que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikatu y otros, Bio/Technol. 8:241-242 (1990)); un gen de tirosinasa (Katz y otros, J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714 (1983)), que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona, que a su vez se condensa a melanina; una a-galactosidasa, que transformará un substrato cromogénico de a-galactosa. En el término "genes marcadores seleccionares" también se incluyen genes que codifican un marcador secretable cuya secreción puede ser detectada como un medio de identificación o selección de células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que puede ser identificado por interacción con anticuerpo, o incluso enzimas secretables que pueden ser detectadas catalíticamente. Las proteínas secretables se clasifican en varias clases que incluyen proteínas pequeñas difundibles que son detectables (por ejemplo por medio de ELISA), enzimas pequeñas activas que son detectables en solución extracelular (por ejemplo a-amilasa, ß-lactamasa, fosfinotricina transferasa), o proteínas que son insertadas o atrapadas en la pared celular (como las proteínas que incluyen una secuencia guía como la encontrada en la unidad de expresión de la extensión de tabaco PR-S). Otros posibles genes marcadores seleccionables serán evidentes para el experto en la materia. Existen muchos métodos para introducir moléculas de ácido nucleico transformantes en células vegetales. Se considera que los métodos adecuados incluyen virtualmente cualquier método mediante el cual se pueden introducir moléculas de ácido nucleico en una célula, tales como infección de Agrobacterium o suministro directo de las moléculas de ácido nucleico por ejemplo por medio de transformación mediada por PEG, por electroporación o por aceleración de partículas recubiertas con ADN, etc. (Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225 (1991 ); Vasil, Plant Mol. Biol. 25:925-937 (1994)). Por ejemplo, se ha usado electroporación para transformar protoplastos de maíz (Fromm y otros, Nature 312:791-793 (1986)). Otros sistemas de vector adecuados para introducir ADN transformante en una célula de planta hospedera incluyen, sin limitación, los vectores binarios de cromosoma artificial (BIBAC) (Hamilton y otros, Gene 200:107-1 16 (1997)); y transfeccíón con vectores virales de ARN (Della-Cioppa y otros, Ann. N. Y. Acad. Sci. (1996), 792 ("Engineering Plants for Commercial Products and Applications"), 57-61 ). Sistemas de vectores adicionales también incluyen los vectores de YAC seleccionables en planta como los que describen Mullen y otros, Molecular Breeding 4:449-457 ( 988). La tecnología para introducir ADN en las células es bien conocida para el experto en la materia. Se han descrito cuatro métodos generales para suministrar un gen a las células: (1 ) métodos químicos (Graham y van der Eb, Virology 54:536-539 (1973)); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell 22:479-488 (1980)), electroporación (Wong y Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-587 (1982); Fromm y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A) 82:5824-5828 (1985); patente de E.U.A. No. 5,384,253); la pistola de genes (Johnston y Tang, Methods Cell Biol. 43:353-365 (1994)); e infiltración al vacío (Bechtold y otros, C.R. Acad. Sci. París, Life Sci. 316:1 194-1199. (1993)); (3) vectores virales (Clapp, Clin. Perinatol. 20:155- 68 (1993); Lu y otros, J. Exp. Med. 78:2089-2096 (1993); Eglitis y Anderson, Biotechniques 6:608-614 (1988)); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel y otros, Hum. Gen. Ther. 3:147-154 (1992), Wagner y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 89:6099-6103 (1992)). Los métodos de aceleración que se pueden usar incluyen, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles y similares. Un ejemplo de un método para suministrar moléculas de ácido nucleico transformante en células vegetales es el bombardeo de microproyectiles. Este método ha sido revisado por Yang y Christou (eds.), "Particle Bombardment Technology for Gene Transfer", Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas no biológicas (microproyectiles) que se pueden recubrir con ácidos nucleicos y suministrarse a las células por una fuerza impulsora. Las partículas ejemplares incluyen las comprendidas de tungsteno, oro, platino y similares. Una ventaja particular del bombardeo con microproyectiles, además de ser un medio eficaz para transformar reproduciblemente monocotiledóneas, es que no se requiere ni aislamiento de protoplastos (Cristou y otros, Plant Physiol. 87:671-674 (1988)) ni susceptibilidad a infección por Agrobacterium. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN a células de maíz por aceleración es un sistema biolístico de suministro de partículas , que puede ser usado para impulsar partículas recubiertas con ADN a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o tamiz de Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de maíz cultivadas en suspensión. Gordon-Kamm y otros describen el procedimiento básico para recubrir partículas de tungsteno con ADN (Gordon-Kamm y otros, Plant Cell 2:603-618 (1990)). El tamiz dispersa las partículas de tungsteno y ácido nucleico de tal manera que no son suministradas a las células receptoras en agregados grandes. Un sistema de suministro de partículas adecuado para usar con la invención es la pistola de aceleración de helio PDS-1000/He, que está disponible de Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad, Hercules, California) (Sanford y otros, Technique 3:3-16 (1991 )). Para el bombardeo, las células en suspensión se pueden concentrar sobre filtros. Los filtros que contienen las células a bombardear se colocan a una distancia apropiada debajo de la placa de detención del microproyectil. Si se desea, también se colocan uno o más tamices entre la pistola y las células por bombardear. Alternativamente se pueden disponer embriones inmaduros u otras células objetivo sobre un medio de cultivo sólido. Las células a bombardear se colocan a una distancia apropiada debajo de la placa de detención del microproyectil. Si se desea, también se colocan uno o más tamices entre el dispositivo de aceleración y las células a bombardear. Usando las técnicas aquí señaladas se pueden obtener 1000 locus o más de células que expresan transitoriamente un gen marcador. El número de células en un foco que expresan el producto del gen exógeno 48 horas después del bombardeo varía frecuentemente de uno a diez, y en promedio de uno a tres. En la transformación de bombardeo se pueden optimizar las condiciones de cultivo previas al bombardeo y los parámetros de bombardeo para producir el número máximo de transformantes estables. En esta tecnología son importantes tanto los parámetros físicos como biológicos del bombardeo. Los factores físicos son aquellos que involucran la manipulación del precipitado ADN/microproyectil o los que afectan el vuelo y la velocidad de los macro o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todos los pasos involucrados en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células objetivo para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo, y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos superenrollados intactos. Se considera que las manipulaciones previas al bombardeo son especialmente importantes para una transformación exitosa de embriones inmaduros. En otra modalidad alternativa se pueden transformar establemente los plástidos. Los métodos revelados para transformar plástidos en plantas superiores Incluyen el suministro con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable, y la dirección del ADN al genoma del plástido mediante recombinación homologa (Svab y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:8526-8530 (1990); Svab y Maliga, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:913-917 (1993); Staub y Maliga, EMBO J. 12:601 -606 (1993); patentes de E.U.A. Nos. 5,451 ,513 y 5,545,818). Por consiguiente, se contempla que se puede buscar el ajuste de varios de los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Particularmente se pueden ajustar los parámetros físicos tales como distancia de huecos, distancia de vuelo, distancia de tejido y presión de helio. También se pueden optimizar los factores de reducción de trauma modificando las condiciones que afectan el estado fisiológico de las células receptoras y que por lo tanto pueden afectar las eficiencias de transformación e integración. Por ejemplo, se pueden ajustar el estado osmótico, la hidratación de tejido y la etapa de subcultivo o ciclo celular de las células receptoras para una transformación óptima. La ejecución de otros ajustes de rutina será conocida para los expertos en la materia a la luz de la presente exposición. La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales porque el ADN puede ser introducido en tejidos de planta completa, eliminando así la necesidad de regenerar una planta intacta a partir de un protoplasto. El uso de vectores de integración de planta mediada por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en la técnica. Véase por ejemplo los métodos descritos por Fraley y otros, Bio/Technology 3:629-635 (1985), y Rogers y otros, Methods Enzymol. 153:253-277 (1987). Además, la integración del ADN-Ti es un proceso relativamente preciso que da como resultado unas cuantas transposiciones. La región de ADN a ser transferida es definida por las secuencias de margen y el ADN interventor usualmente es insertado en el genoma de la planta como se describe (Spielmann y otros, Mol. Gen. Genet. 205:34 (1986)). Los vectores modernos de transformación por Agrobacteríum son capaces de replicarse en E. coli y Agrobacteríum, permitiendo manipulaciones convenientes como se describe (Klee y otros en "Plant DNA Infectious Agents", Hohn y Schell (eds.), Springer-Verlag, New York, p. 179-203 (1985)). Además, los avances tecnológicos en los vectores para transferencia de genes mediada por Agrobacteríum han mejorado el arreglo de genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar varios genes que codifican polipéptido. Los vectores descritos tienen regiones multienlazadoras convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para dirigir la expresión de genes que codifican polipéptido, y son adecuados para los presentes fines (Rogers y otros, Methods Enzymol. 153:253-277 (1987)). Además, para las transformaciones se puede usar Agrobacteríum que contiene genes Ti tanto armados como desarmados. Es el método de elección en aquellas especies de plantas en las que la transformación mediada por Agrobacteríum es eficiente, debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia genética. Típicamente, una planta transgénica formada usando métodos de transformación por Agrobacteríum contiene un solo gen en un cromosoma. Estas plantas transgénicas pueden ser referidas como heterocigóticas para el gen añadido. Es muy preferida una planta transgénica que es homocigótica para el gen estructural añadido, esto es, una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica se puede obtener apareando sexualmente (autofecundación) una planta transgénica segregante independiente que contiene un solo gen añadido, haciendo germinar algunas de las semillas producidas y analizando el gen de interés en las plantas resultantes producidas. También se entiende que también puede aparearse a dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contiene dos genes exógenos independientemente segregantes. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos que codifican un polipéptido de interés. También se contempla retrocruzamiento con una planta progenitora y cruzamiento externo con una planta no transgénica, como la propagación vegetativa. La transformación de protoplastos vegetales se puede lograr usando métodos basados en precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de estos tratamientos (véanse, por ejemplo, Potrykus y otros, Mol. Gen. Genet. 205:193-200 (1986); Lorz y otros, Mol. Gen. Genet. 199:178 (1985); Fromm y otros, Nature 319:791 (1986); Uchimiya y otros, Mol. Gen. Genet. 204:204 (1986); Marcotte y otros, Nature 335:454-457 (1988)). La aplicación de estos sistemas a diferentes especies de plantas depende de la capacidad de regeneración de esa especie de planta particular a partir de los protoplastos. Se describen en la literatura métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (Fujimura y otros, Plant Tissue Culture Letters 2:74 (1985); Toriyama y otros, Theor. Appl. Genet. 205:34 (1986); Yamada y otros, Plant Cell Rep. 4:85 ( 986); Abdullah y otros, Biotechnology 4:1087 (1986)). Para transformar especies de plantas que no pueden ser regeneradas exitosamente a partir de protoplastos se pueden utilizar otras formas para introducir ADN en células o tejidos intactos. Por ejemplo, se puede realizar regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o explantes como se describe (Vasil, Biotechnology 6:397 (1988)). Además, se puede utilizar tecnología de "pistola de partículas" o microproyectiles de alta velocidad (Vasil y otros, Bio/Technology 10:667 (1992)). Usando esta última tecnología, el ADN es acarreado a través de la pared celular y hacia el citoplasma sobre la superficie de pequeñas partículas de metal (Klein y otros, Nature 328:70 (1987); Klein y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:8502-8505 (1988); McCabe y otros, Bio/Technology 6:923 (1988)). Las partículas de metal penetran a través de varias capas de células y así permiten la transformación de células dentro de explantes de tejido. También se pueden usar otros métodos de transformación de células e incluyen, sin limitación, la introducción de ADN en plantas por transferencia directa de ADN en el polen (Hess y otros, Intern Rev. Cytol. 107:367 (1987); Luo y otros, Plant Mol. Biol. Repórter 6:165 (1988)), por inyección directa de ADN en los órganos reproductivos de una planta (Pena y otros, Nature 325:274 (1987)), o por inyección directa de ADN en las células de embriones maduros, seguida por la rehidratación de embriones desecados (Neuhaus y otros, Theor. Appl. Genet. 75:30 (1987)). La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de protoplastos transformantes individuales o de varios explantes transformados son bien conocidos en la técnica (Weissbach y Weissbach en "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, San Diego, California, (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye regularmente los pasos de selección de células transformadas, cultivo de las células individualizadas por medio de las etapas usuales de desarrollo embriónico hasta la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos son regenerados similarmente. Los vástagos enraizados transgénicos resultantes son plantados posteriormente en un medio de crecimiento de plantas apropiado tal como tierra. Es bien conocido el desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen ajeno, exógeno, que codifica una proteína de interés.

Preferiblemente, las plantas regeneradas son autopolinizadas para proveer plantas transgénicas homocigóticas. De otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas desarrolladas de semilla de líneas agronómicamente importantes. Recíprocamente, el polen de las plantas de estas líneas importantes es usado para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transgenica de la invención que contiene el polipéptido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos para un experto en la materia. Existe una variedad de métodos de regeneración de plantas a partir de tejido vegetal. El método particular de regeneración dependerá del tejido vegetal de partida y de la especie particular de planta a regenerar. Se han publicado métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente usando Agrobacterium tumefaciens y obteniendo plantas transgénicas, para algodón (patente de E.U.A. No. 5,004,863; patente de E.U.A. No. 5,159,135; patente de E.U.A. No. 5,518,908); soya (patente de E.U.A. No. 5,569,834; patente de E.U.A. No. 5,416,011 ; McCabe y otros, Biotechnoíogy 6:923 (1988); Christou y otros, Plant Physiol. 87:671 -674 (1988)); Brassica (patente de E.U.A. No. 5,463,174); cacahuate (Cheng y otros, Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996), McKently y otros, Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); papaya; chícharo (Grant y otros, Plant Cell Rep. 15:254-258 (1995)); y Arabldopsis thallana (Bechtold y otros, CR. Acad. Sci. París, Life Sci. 316:1194-1199 (1993)). Este último método para transformar Arabidopsis thaliana se denomina comúnmente "inmersión" o infiltración al vacío o transformación de germoplasma.

También se ha reportado transformación de monocotiledóneas usando electroporación, bombardeo de partículas y Agrobacterium. La transformación y regeneración de planta se ha logrado en espárrago (Bytebier y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 84:5354 (1987)); cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol 104:37 (1994)); maíz (Rhodes y otros, Science 240:204 (1988); Gordon-Kamm y otros, Plant Cell 2:603-618 (1990); Fromm y otros, Bio Technology 8:833 (1990); Koziel y otros, Bio/Technology 11 :194 (1993); Armstrong y otros, Crop Science 35:550-557 (1995)); avena (Somers y otros, Bio/Technology 10:1589 (1992)); pasto de huerta (Hom y otros, Plant Cell Rep. 7:469 (1988)); arroz (Toriyama y otros, Theor Appl. Genet. 205:34 (1986); Part y otros, Plant Mol. Biol. 32:1135-1148 (1996); Abedinia y otros, Aust. J. Plant Physiol. 24:133-141 (1997); Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835 ( 988); Zhang y otros, Plant Cell Rep. 7:379 (1988); Battraw y Hall, Plant Sci. 86:191-202 (1992); Christou y otros, Bio/Technology 9:957 (1991 )); centeno (De la Pena y otros, Nature 325:27 '4 (1987)); caña de azúcar (Bower y Birch, Plant J. 2:409 (1992)); cañuela (Wang y otros, Bio/Technology 10:691 (1992)) y trigo (Vasil y otros, Bio/Technology 0:667 (1992); patente de E.U.A. No. 5,631 ,152). Se han desarrollado pruebas de expresión de gen basadas en la expresión transitoria de construcciones de ácido nucleico clonadas, introduciendo las moléculas de ácido nucleico en células de planta por medio de tratamiento con polietilenglicol, electroporación o bombardeo de partículas (Marcotte y otros, Nature 335:454-457 (1988); Marcotte y otros, Plant Cell 1 :523-532 (1989); McCarty y otros, Cell 66:895-905 (1991 ); Hattori y otros, Genes Dev. 6:609-618 (1992); Goff y otros, EMBO J. 9:2517-2522 (1990)). Se pueden usar sistemas de expresión transitoria para cortar funcionalmente construcciones de gen (véase en general, Mailga y otros, "Methods in Plant Molecular Biology", Cold Spring Harbor Press (1995)). Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención puede ser introducida en una célula vegetal de una manera permanente o transitoria en combinación con otros elementos genéticos tales como vectores, promotores, favorecedores, etc. Además, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención puede ser introducida en una célula vegetal de una manera que permita la expresión o sobreexpresión de la proteína, o un fragmento de la misma, codificada por la molécula de ácido nucleico. La cosupresión es la reducción de los niveles de expresión, usualmente a nivel de ARN, de un gen endógeno particular o familia de genes por la expresión de una construcción de sentido homologa que es capaz de transcribir ARNm de la misma concatenación que el transcrito del gen endógeno (Napoli y otros, Plant Cell 2:279-289 (1990); van der Krol y otros, Plant Cell 2:291-299 (1990)). La cosupresión se puede producir por transformación estable con una molécula de ácido nucleico de una sola copia que es homologa a una secuencia de ácido nucleico encontrada con la célula (Prolls y Meyer, Plant J. 2:465-475 (1992)), o con múltiples copias de una molécula de ácido nucleico que es homologa a una secuencia de ácido nucleico encontrada con la célula (Mittlesten y otros, Mol. Gen. Genet. 244:325-330 (1994)). Los genes enlazados a promotores homólogos, aunque sean diferentes, pueden producir la cosupresión de los genes enlazados (Vauc eret, C.R. Acad. Sci. III 316:1471-1483 (1993); Flavell, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 91 :3490-3496 (1994)); van Blokland y otros, Plant J. 6:861 -877 (1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8:340-344 (1990); eins y Kunz, en "Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants", Paszkowski (ed.), p. 335-348, Kluwer Academic, Países Bajos (1994)). Se entiende que uno o más de los ácidos nucleicos de la invención puede ser introducido en una célula vegetal y transcrito usando un promotor apropiado, dicha transcripción produciendo la cosupresión de una proteína endógena. Los enfoques de antisentido son una manera de impedir o reducir la función de un gen al dirigir el material genético (Mol y otros, FEBS Lett. 268:427-430 (1990)). El objetivo del enfoque de antisentido es usar una secuencia complementaria del gen objetivo para bloquear su expresión y crear una línea de células mutantes o un organismo muíante en los que el nivel de una proteína única elegida está selectivamente reducido o suprimido. Las técnicas de antisentido tienen varias ventajas sobre otros enfoques de "genética inversa". El sitio de inactivación y su efecto de desarrollo pueden ser manipulados eligiendo un promotor para genes de antisentido o programando la aplicación o microinyección externa. La especificidad del antisentido se puede manipular seleccionando regiones únicas del gen objetivo o regiones en donde comparte homología con otros genes relacionados (Hiatt y otros, en "Genetic Engineering", Setlow (ed.), Vol. 1 1 , New York: Plenum 49-63 (1989)). Las técnicas de ARN de antisentido involucran la introducción de ARN que es complementario al ARNm objetivo en células, lo que ocasiona la formación de cadenas dobles de ARN:ARN específicas por apareamiento de bases entre el substrato de antisentido y el ARNm objetivo (Green y otros, Annu. Rev. Biochem. 55:569-597 (1986)). Bajo una modalidad, el proceso involucra la introducción y expresión de una secuencia de gen de antisentído. Tal secuencia es una en la que se colocan todas las secuencias normales del gen, o una parte de las mismas, bajo un promotor en orientación invertida, de modo que la cadena "errónea" o complementaria es transcrita a un ARN de antisentido no codificador que híbrida con el ARNm objetivo e impide su expresión (Takayama y Inouye, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25:155-184 (1990)). Un vector de antisentido se construye mediante procedimientos normales y se introduce a las células por transformación, transfección, electroporación, microinyección, infección, etc. El tipo de transformación y la elección del vector determinarán si la expresión es transitoria o estable. El promotor usado para el gen de antisentido puede afectar el nivel, tiempo, tejido, especificidad o inducibilidad de la inhibición de antisentido. Se entiende que la actividad de una proteína en una célula vegetal puede ser reducida o deprimida desarrollando una célula vegetal transformada que contiene una molécula de ácido nucleico cuya cadena no transcrita codifica una proteína o un fragmento de la misma. La silenciación génica postranscripcional (PTGS) puede dar como resultado inmunidad a virus o silenciación génica en plantas. La PTGS es inducida por ARNdc y es mediada por una ARN polimerasa ARN-dependiente presente en el citoplasma, que requiere un molde de ARNdc. El ARNdc es formado por hibridación de ARNm's complementarios de transgen o regiones complementarias del mismo transcrito. La formación de la cadena doble puede ser realizada usando transcritos de un gen de sentido y un gen de antisentido colocados en el genoma de una planta, un solo transcrito que tiene autocomplementariedad, o transcritos de sentido y antisentido de genes reunidos por cruzamiento. La ARN polimerasa ARNdc-dependiente hace una cadena complementaria del ARNm de transgen y las moléculas de ARNasa se unen a esta cadena complementaria (ARNc). Estas moléculas ARNc-ARNasa hibridan con el ARNm endógeno y cortan el ARN de una sola cadena adyacente al híbrido. Los ARNs de una sola cadena cortados son degradados ulteriormente por otras ARNasas del hospedero porque uno carecerá de un extremo 5' bloqueado y el otro carecerá de una cola de poli(A) (Waterhouse y otros, PNAS 95: 13959-13964 (1998)). Se entiende que uno o más de los ácidos nucleicos de la invención pueden ser introducidos en una célula vegetal y transcritos usando un promotor apropiado con dicha transcripción, dando como resultado la silenciación génica postranscripcional de un transcrito endógeno. Se han expresado anticuerpos en plantas (Hiatt y otros, Nature 342:76-78 (1989); Conrad y Fielder, Plant Mol. Biol. 26:1023-1030 (1994)). Se ha reportado que la expresión citoplásmica de un Fvsc (anticuerpo Fv de una sola cadena) retrasa la infección por virus de arrugas moteadas de alcachofa. Las plantas transgénicas que expresan anticuerpos dirigidos contra proteínas endógenas pueden exhibir un efecto fisiológico (Philips y otros, EMBO J. 16:4489-4496 (1997); Marion-Poll, Trends in Plant Science 2:447-448 (1997)). Por ejemplo, se ha reportado que los anticuerpos antí-abscísico expresados producen una perturbación general del desarrollo de semillas (Philips y otros, EMBO J. 16: 4489-4496 (1997)). Los anticuerpos que son catalíticos también pueden ser expresados en plantas (abzimas). El principio detrás de las abzimas es que puesto que los anticuerpos pueden ser desarrollados contra muchas moléculas, esta capacidad de reconocimiento puede ser dirigida hacia la generación de anticuerpos que enlazan estados de transición para forzar una reacción química hacia delante (Persidas, Nature Biotechnology 15:1313-1315 (1997); Baca y otros, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:461-493 (1997)). Las capacidades catalíticas de las abzimas pueden ser incrementadas por mutagénesis dirigida a sitio. Ejemplos de abzimas se dan por ejemplo en la patente de E.U.A. No. 5,658,753; patente de E.U.A. No. 5,632,990; patente de E.U.A. No. 5,631 ,137; patente de E.U.A. No. 5,602,015; patente de E.U.A. No. 5,559,538; patente de E.U.A. No. 5,576,174; patente de E.U.A. No. 5,500,358; patente de E.U.A. No. 5,318,897; patente de E.U.A. No. 5,298,409; patente de E.U.A. No. 5,258,289 y en la patente de E.U.A. No. 5,194,585.

Se entiende que cualquiera de los anticuerpos de la invención puede ser expresado en plantas y que dicha expresión puede producir un efecto fisiológico. También se entiende que cualquiera de los anticuerpos expresados puede ser catalítico. Las alteraciones de los fenotipos de planta de la presente invención pueden ser con respecto a una planta que tiene una base genética similar que carece del ácido nucleico introducido de interés. En un aspecto preferido, una base genética similar es una base en la que los organismos comparados comparten 50% o más de su material genético nuclear. En un aspecto más preferido, una base genética similar es una base en la que los organismos comparados comparten 75% o más, de preferencia 90% o más, de su material genético nuclear. En otro aspecto aún más preferido, una base genética similar es una base en la que los organismos comparados son plantas y las plantas son isogénicas excepto por cualquier material genético introducido originalmente usando técnicas de transformación de planta. La presente invención también provee partes de las plantas de la presente invención, particularmente las partes reproductivas o de almacenamiento. Las partes de las plantas incluyen, sin limitación, semilla, endosperma, óvulo y polen. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, la parte de la planta es una semilla. En una modalidad, la semilla es un constituyente de alimento para animales. En otra modalidad, la parte de la planta es un fruto, muy preferiblemente un fruto con duración prolongada en almacenamiento. En otra modalidad preferida, el fruto tiene niveles aumentados de un tocoferol. La presente invención también provee un recipiente de más de 10,000, de preferencia de 20,000 y muy preferiblemente de 40,000 semillas, en donde más del 10%, de preferencia 25%, de preferencia 50% y muy preferiblemente 75% o 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. La presente invención también provee un recipiente de más de 10 kg, de preferencia de 25 kg, y preferiblemente de 50 kg de semillas, en donde más del 10%, de preferencia 25%, de preferencia 50% y muy preferiblemente 75% o 90% de las semillas son semillas derivadas de una planta de la presente invención. Cualquiera de las plantas de la presente invención o partes de las mismas pueden ser procesadas para producir un alimento, comida, preparación de proteína o aceite. Una parte de planta particularmente preferida para este fin es una semilla. En una modalidad preferida, el alimento, comida o preparación de proteína o aceite está diseñado para animales rumiantes. Los métodos para producir alimento, comida, preparaciones de proteína y aceite son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.UA Nos. 4,957,748, 5,100,679, 5,219,596, 5,936,069, 6,005,076, 6,146,669, y 6,156,227. En una modalidad preferida, la preparación de proteína es una preparación de alto contenido de proteína. Esta preparación de preferencia tiene un contenido de proteína de mas de 5% p/v, de preferencia 10% p/v, y muy preferiblemente 15% p/v. En una preparación de aceite preferida, la preparación de aceite es una preparación de alto contenido de aceite con un contenido de aceite derivado de una planta de la presente invención o parte de la misma, de más de 5% p/v, de preferencia 10% p/v y es muy preferido 15% p/v. En una modalidad preferida, la preparación de aceite es un líquido de un volumen mayor de 1 , 5, 10 o 50 litros. La presente invención provee aceite producido de las plantas de la presente invención o generado por un método de la presente invención. Dicho aceite puede ser un componente menor o mayor de cualquier producto resultante. Además, dicho aceite se puede mezclar con otros aceites. En una modalidad preferida, el aceite producido de las plantas de la presente invención o generado por un método de la presente invención constituye más del 0.5%, 1 %, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% o 90% en volumen o peso del componente de aceite de cualquier producto. En otra modalidad, la preparación de aceite puede estar mezclada y puede constituir más del 10%, 25%, 35%, 50% o 75% de la mezcla en volumen. El aceite producido de una planta de la presente invención se puede mezclar con uno o más solventes orgánicos o destilados de petróleo. Las plantas de la presente invención pueden ser parte de un programa de reproducción o pueden ser generadas del mismo. La elección del método de reproducción depende del modo de reproducción de la planta, la herencia del rasgo o rasgos a mejorar y el tipo de cultivar usado comercialmente (por ejemplo cultivar híbrido F1 , cultivar de línea pura, etc.). Más abajo se dan enfoques seleccionados no limitativos para reproducir las plantas de la presente invención. Un programa de reproducción se puede mejorar usando selección asistida por marcador de la progenie de cualquier cruza. Se entiende además que se puede utilizar cualquier cultivar comercial y no comercial en un programa de reproducción. Por lo general, la elección será dictada por factores tales como por ejemplo vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia al esfuerzo, resistencia a enfermedad, ramificación, floración, forma de la semilla, tamaño de la semilla, densidad de la semilla, permanencia y susceptibilidad de trilla. Para rasgos muy heredables, una elección de plantas individuales superiores evaluadas en una sola localización será eficaz, mientras que para rasgos con baja heredabilidad, la selección se basaría en valores medios obtenidos de evaluaciones duplicadas de familias de plantas relacionadas. Los métodos populares de selección incluyen comúnmente selección de genealogía, selección de genealogía modificada, selección de masa y selección recurrente. En una modalidad preferida se realiza un programa de reproducción de retrocruza o recurrente. La complejidad de la herencia afecta la elección del método de reproducción. Se puede usar reproducción por retrocruza para transferir un gen o unos cuantos genes favorables para un rasgo muy heredable en un cultivar deseado. Este enfoque se ha usado extensamente para reproducir cultivares resistentes a enfermedad. Se usan varias técnicas de selección recurrente para mejorar rasgos heredados cuantitativamente controlados por muchos genes. El uso de selección recurrente en cultivos autopolinizantes depende de la facilidad de polinización, la frecuencia de híbridos exitosos de cada polinización y el número de descendencia híbrida de cada cruza exitosa. Las líneas de reproducción se pueden probar y comparar con estándares apropiados en medios representativos del área o áreas objetivo comerciales durante dos generaciones o más. Las mejores líneas son candidatos a nuevos cultivares comerciales; aquellas aún deficientes en los rasgos buscados se pueden usar como progenitores para producir poblaciones nuevas para selección ulterior. Un método para identificar una planta superior es observar su rendimiento con respecto a otras plantas experimentales y a un cultivar estándar ampliamente desarrollado. Si una sola observación no es concluyente, la repetición de observaciones puede dar una mejor estimación de su entidad genética. Un productor puede seleccionar y cruzar dos o más líneas progenitoras, seguido por autofecundación y selección repetidas, produciendo muchas combinaciones genéticas nuevas. El desarrollo de cultivares nuevos requiere el desarrollo y selección de variedades, el cruzamiento de estas variedades y la selección de cruzas híbridas superiores. La semilla híbrida puede ser producida por cruzas manuales entre progenitores machos fértiles seleccionados o usando sistemas machos de esterilidad. Se seleccionan híbridos para ciertos rasgos de un solo gen tal como color de la vaina, color de la flor, rendimiento de la semilla, color de pubescencia o resistencia a herbicida, que indican que la semilla es realmente un híbrido. Datos adicionales sobre las líneas progenitoras, así como también el fenotipo del híbrido, influyen en la decisión del productor para continuar con la cruza híbrida específica. Los métodos de reproducción por genealogía y de selección recurrente se pueden usar para desarrollar cultivares a partir de poblaciones en reproducción. Los programas de reproducción combinan rasgos deseables de dos o más cultivares o de varias fuentes de base amplia en reservónos de reproducción, a partir de los cuales se desarrollan cultivares por autofecundación y selección de los fenotipos deseados. Los nuevos cultivares se pueden evaluar para determinar cuales tienen potencial comercial. La reproducción por genealogía se usa comúnmente para el mejoramiento de cultivos autopolinizantes. Se cruza a dos progenitores que poseen rasgos favorables complementarios para producir una población Una población F2 es producida autofecundando una o varias F-i's. Se seleccionan los mejores individuos de las mejores familias. El análisis repetido de las familias puede comenzar en la generación F4 para mejorar la efectividad de selección de rasgos con baja heredabilidad. En una etapa avanzada de la endogamia (esto es Fe y F7), las mejores líneas o mezclas de líneas fenotípicamente similares se analizan para determinar su posible liberación como cultivares nuevos. La reproducción por retrocruzamiento se ha usado para transferir genes de un rasgo heredado simplemente, muy heredable, en un cultivar homocigótico deseado o línea endogámica, que es el progenitor recurrente. La fuente del rasgo a transferir de denomina el progenitor donador. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo el cultivar) y el rasgo deseado transferido desde el progenitor donador. Después de la cruza inicial, los individuos que poseen el fenotipo del progenitor donador son seleccionados y cruzados repetidamente con el progenitor recurrente (retrocruzamiento). Se espera que el progenitor resultante tenga los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo el cultivar) y el rasgo deseado transferido del progenitor donador. El procedimiento de descendencia de una sola semilla se refiere en un sentido estricto a sembrar una población segregante, cosechar una muestra de una semilla por planta, y usar una muestra de una semilla para sembrar la siguiente generación. Cuando la población ha avanzado desde la F2 hasta el nivel deseado de endogamia, las plantas de las cuales derivan las líneas serán rastreadas hasta diferentes individuos F2. El número de plantas en una población disminuye cada generación debido a que algunas semillas no germinan o algunas plantas no producen por lo menos una semilla. Como resultado, no todas las plantas F2 muestreadas originalmente en la población estarán representadas por una progenie cuando el avance de la generación se ha completado. En un procedimiento de semilla múltiple los productores comúnmente cultivan una o más vainas de cada planta en una población y las trillan juntas para formar una masa. Parte de la masa es usada para sembrar la siguiente generación y parte se deja en reserva. El procedimiento se ha referido como descendencia modificada de una sola semilla o la técnica de masa de vaina. El procedimiento de semilla múltiple se ha usado para ahorrar trabajo en el cultivo. Trillar las vainas con una máquina es considerablemente más rápido que remover a mano una semilla de cada vaina con el procedimiento de una sola semilla. El procedimiento de semilla múltiple también hace posible sembrar el mismo número de semillas de una población en cada generación de endogamia. En varios libros de referencia se pueden encontrar descripciones de otros métodos de reproducción que son usados comúnmente para diferentes rasgos y cultivos (por ejemplo, Fehr, Principies of Cultivar Development VoL 1 , p. 2-3 (1987))), Una planta transgénica de la presente invención también se puede reproducir usando apomixia. La apomixia es un método de reproducción en plantas controlado genéticamente, en donde el embrión se forma sin la unión de un huevo y un esperma. Existen tres tipos básicos de reproducción apomíctica: 1 ) aposporia, en donde el embrión se desarrolla de un huevo no reducido cromosómicamente en un saco embrionario derivado del núcleo, 2) diplosporia, en donde el embrión se desarrolla de un huevo no reducido en un saco embrionario derivado de la célula madre megaspora, y 3) de embrión adventicio, en donde el embrión se desarrolla directamente de una célula somática. En la mayoría de las formas de apomixia es necesaria la seudogamia o fertilización de los núcleos polares para producir endosperma para la viabilidad de las semillas. En la aposporia se puede usar un cultivar de nodriza como una fuente de polen para la formación de endosperma en semillas. El cultivar de nodriza no afecta la genética del cultivar apomíctico aposporoso puesto que el huevo no reducido del cultivar se desarrolla partenogénicamente, pero hace posible la producción de endosperma. La apomixia es económicamente importante, especialmente en plantas transgénicas, porque hace que cualquier genotipo se reproduzca en realidad, sin importar que tan heterocigótico sea. De esta manera, con la reproducción apomíctica, las plantas transgénicas heterocigóticas pueden mantener su fidelidad genética durante ciclos de vida repetidos. Los métodos para producir plantas apomícticas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,811 ,636.

Otros organismos Un ácido nucleico de la presente invención puede ser introducido en cualquier célula u organismo tal como una célula de mamífero, mamífero, célula de pez, pez, célula de ave, ave, célula de alga, alga, célula de hongo, hongo, o célula bacteriana. Una proteína de la presente invención puede ser producida en una célula u organismo apropiado. Los hospederos y transformantes preferidos incluyen: células de hongo tales como Aspergillus, levaduras, mamíferos, particularmente bovino y porcino, insectos, bacterias y algas. Los métodos para transformar dichas células u organismos son conocidos en la técnica (EP 0 238 023; Yelton y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 81 :1470-1474 (1984); Malardier y otros, Gene, 78:147-156 (1989); Becker y Guarente en "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Method Enzymol., Vol. 194, p. 182-187, Abelson and Simón (eds.), Academic Press, Inc., New York; Ito y otros, J. Bacteriology, 153:163 (1983) Hinnen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 75:1920 (1978); Bennett y LaSure (eds.), "More Gene Manipulations in fungí", Academic Press, CA (1991 )). Los métodos para producir las proteínas de la presente invención también son conocidos (Kudla y otros, EMBO, 9:1355-1364 (1990); Jarai y Buxton, Current Genetics, 26:2238-2244 (1994); Verdier, Yeast, 6:271-297 (1990); MacKenzie y otros, Journal of Gen. Microbio!., 139:2295-2307 (1993); Hartl y otros, TIBS, 19:20-25 (1994); Bergenron y otros, TIBS, 19:124-128 (1994); Demolder y otros, J. Biotechnology, 32:179-189 (1994); Craig, Science, 260:1902-1903 (1993); Gething y Sambrook, Nature, 355:33-45 (1992); Puig y Gilbert, J. Biol. Chem., 269:7764-7771 (1994); Wang y Tsou, FASEB Journal, 7:1515-1517 (1993); Robinson y otros, Bio/Technology, 1 :381-384 (1994); Enderlín y Ogrydziak, Yeasf, 10:67-79 (1994); Fuller y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 86:1434-1438 (1989); Julius y otros, Cell, 37:1075-1089 (1984); Julius y otros, Cell 32:839-852 (1983). En una modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una célula u organismo, provee en esa célula u organismo, con respecto a una célula u organismo con una base genética similar, un nivel aumentado de tocotrienoles. En una modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una célula u organismo provee en esa célula u organismo, con respecto a una célula u organismo con una base genética similar, un nivel aumentado de tocoferoles. En una modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una célula u organismo provee en esa célula u organismo, con respecto a una célula u organismo con una base genética similar, un nivel aumentado de o -tocoferoles. En una modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una célula u organismo provee en esa célula u organismo, con respecto a una célula u organismo con una base genética similar, un nivel aumentado de ?-tocoferoles. En una modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una célula u organismo provee en esa célula u organismo, con respecto a una célula u organismo con una base genética similar, un nivel aumentado de ácido homogentísico. En una modalidad preferida, la sobreexpresión de una proteína de la presente invención o un fragmento de la misma en una célula u organismo provee en esa célula u organismo, con respecto a una célula u organismo con una base genética similar, un nivel aumentado de plastoquinoles o plastoquinonas.

Anticuerpos Un aspecto de la invención se refiere a anticuerpos, moléculas de unión de antígeno de una sola cadena, u otras proteínas que se unen específicamente a una o más de las moléculas de proteína o péptido de la invención, y sus homólogos, fusiones o fragmentos. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se describe en las SEQ ID NOs: 2 y 4, o un fragmento de las mismas. En otra modalidad, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos que se describe en las SEQ ID NOs: 2 o 4, o un fragmento de las mismas. En otra modalidad, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos que se describe en las SEQ ID NOs: 2 o 4, o un fragmento de las mismas. Los anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar cuantitativa o cualitativamente las moléculas de proteína o péptido de la invención, o para detectar modificaciones de las proteínas posteriores a la traducción. Como se usa aquí, se dice que un anticuerpo o péptido "se une específicamente" a una molécula de proteína o péptido de la invención si dicha unión no es inhibida competitivamente por la presencia de moléculas no relacionadas. Las moléculas de ácido nucleico que codifican una parte o toda la proteína de la invención pueden ser expresadas por medios recombinantes para producir proteína o péptidos, que a su vez pueden ser usados para desarrollar anticuerpos capaces de unirse a la proteína o péptido expresado. Estos anticuerpos se pueden usar en inmunoensayos para esa proteína. Estas moléculas codificadoras de proteína o sus fragmentos pueden ser una molécula de "fusión" (esto es, parte de una molécula de ácido nucleico más grande), de tal manera que por expresión es producida una proteína de fusión. Se entiende que cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de esta invención puede ser expresada por medios recombinantes para producir proteínas o péptidos codificados por estas moléculas de ácido nucleico. Los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas y fragmentos de proteína de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden comprender inmunoglobulinas intactas o porciones de unión de antígeno de fragmentos de inmunoglobulinas (tales como F(ab'), F(ab')2), o inmunoglobulinas de una sola cadena producibles por ejemplo por medios recombinantes. Se entiende que los técnicos están familiarizados con los medios normales que describen condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de anticuerpos (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe en "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)). Como se expone más abajo, estas moléculas de anticuerpo o sus fragmentos se pueden usar para fines diagnósticos. Cuando los anticuerpos están destinados para fines diagnósticos, puede ser conveniente preparar derivados de los mismos, por ejemplo con un grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador detectable (tal como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima). La capacidad para producir anticuerpos que se unen a las moléculas de proteína o péptido de la invención permite la identificación de compuestos miméticos derivados de tales moléculas. Estos compuestos miméticos pueden contener un fragmento de la proteína o péptido o solamente una región estructuralmente similar, y no obstante exhibir la capacidad de unirse específicamente a los anticuerpos dirigidos contra ese compuesto.

Usos ejemplares Las moléculas de ácido nucleico de la invención y sus fragmentos se pueden emplear para obtener otras moléculas de ácido nucleico de la misma especie (moléculas de ácido nucleico de maíz se pueden utilizar para obtener otras moléculas de ácido nucleico de maíz). Estas moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia codificadora completa de una proteína y secuencias promotoras y flanqueadoras de tales moléculas. Además, tales moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para otras ¡sozimas o miembros de la familia del gen. Estas moléculas pueden ser obtenidas fácilmente usando las moléculas de ácido nucleico arriba descritas o fragmentos de las mismas, para examinar ADNc o colecciones genómicas. Los métodos para formar tales colecciones son bien conocidos en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención y sus fragmentos también se pueden emplear para obtener homólogos de ácido nucleico. Estos homólogos incluyen las moléculas de ácido nucleico de plantas y otros organismos, incluyendo bacterias y hongos, incluidas las moléculas de ácido nucleico que codifican parcial o totalmente homólogos de proteína de otras especies de planta u otros organismos, secuencias de elementos genéticos tales como promotores, y elementos reguladores transcripcionales. Estas moléculas se pueden obtener fácilmente usando las moléculas de ácido nucleico o sus fragmentos arriba descritas para examinar ADNc o colecciones genómicas obtenidas de tales especies de planta. Los métodos para formar tales colecciones son bien conocidos en la técnica. Estas moléculas homologas pueden diferir en sus secuencias de nucleótidos de las encontradas en una o más de las SEQ ID NOs: 1 y 3 y complementos de las mismas porque la complementariedad total no es necesaria para hibridación estable. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, por lo tanto, también incluyen moléculas que, aunque son capaces de hibridar específicamente con las moléculas de ácido nucleico, pueden carecer de "complementariedad total" Se puede usar cualquier método de una variedad de métodos para obtener una o más de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas (Zamechik y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 83:4143-4146 (1986); Goodchild y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A) 85:5507-5511 (1988); Wickstrom y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:1028-1032 (1988); Holt y otros, Molec. Cell. Biol. 8:963-973 (1988); Gerwirtz y otros, Science 242:1303-1306 (1988); Anfossi y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:3379-3383 (1989); Becker y otros, EMBO J. 8:3685-3691 (1989)). Para este fin se pueden emplear sintetizad ores automáticos de ácido nucleico. En lugar de esta síntesis, las moléculas de ácido nucleico reveladas se pueden usar para definir un par de iniciadores que se pueden usar con la reacción en cadena de polimerasa (Mullís y otros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263-273 (1986); Erlich y otros, patente Europea 50,424; patente Europea 84,796; patente Europea 258,017; patente Europea 237,362; Mullís, patente Europea 201 ,184; Mullís y otros, patente de E.U.A. No. 4,683,202; Erlich, patente de E.U.A. No. 4,582,788; y Saiki y otros, patente de E.U.A. No. 4,683,194), para amplificar y obtener cualquier molécula deseada de ácido nucleico o un fragmento de la misma. Las secuencias de promotor y otros elementos genéticos, incluyendo sin limitación secuencias flanqueadoras reguladoras de transcripción, asociadas con una o más de las secuencias de ácido nucleico reveladas, también se pueden obtener usando la secuencia de ácido nucleico revelada aquí provista. En una modalidad, tales secuencias se obtienen incubando moléculas de ácido nucleico de la presente invención con miembros de colecciones genómicas y recuperando clonas que hibridan con tales moléculas de ácido nucleico. En una segunda modalidad se pueden usar métodos de "caminata de cromosoma" o PCR inversa para obtener tales secuencias (Frohman y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:8998-9002 (1988); Ohara y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:5673-5677 (1989); Pang y otros, Biotechniques 22:1046-1048 (1977); Huang y otros, Methods Mol. Biol. 69:89-96 (1997); Huang y otros, Method Mol. Biol. 67:287-294 (1997); Benkel y otros, Genet. Anal. 13:123-127 (1996); HartI y otros, Methods Mol. Biol. 58:293-301 (1996)). El término "caminata de cromosoma" significa un proceso de extensión de un mapa genético mediante pasos de hibridación sucesivos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar para aislar promotores de perfiles de expresión evolutivamente o ambientalmente regulados, favorecidos en célula, específicos de célula, favorecidos en tejido, específicos de tejido. El aislamiento y análisis funcional de las secuencias promotoras flanqueadoras 5' de estos genes a partir de colecciones genómicas, por ejemplo usando métodos de selección genómica y técnicas de PCR, resultaría en el aislamiento de promotores y elementos reguladores de transcripción útiles. Estos métodos son conocidos para los expertos en la materia y ya se han descrito (véase, por ejemplo, Birren y otros, "Genome Analysis: Analyzing DNA", 1 , (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Los promotores obtenidos utilizando las moléculas de ácido nucleico de la invención también se podrían modificar para afectar sus características de control. Ejemplos de tales modificaciones incluirían, sin limitación, las secuencias favorecedoras. Estos elementos genéticos se podrían usar para favorecer la expresión de genes de rasgos nuevos y existentes para el mejoramiento de cultivos.

Otro subgrupo de las moléculas de ácido nucleico de la invención incluye moléculas de ácido nucleico que son marcadores. Los marcadores se pueden usar de varias maneras convencionales en el campo de la genética molecular. Estos marcadores incluyen moléculas de ácido nucleico de las SEQ ID NOs: 1 y 3, complementos de las mismas, y fragmentos de cualquiera de ellas, que pueden actuar como marcadores, y otras moléculas de ácido nucleico de la presente invención que pueden actuar como marcadores. Los marcadores genéticos de la invención incluyen marcadores "dominantes" o "codominantes". Los "marcadores codominantes" revelan la presencia de dos o más alelos (dos por diploide individual) en un locus. Los "marcadores dominantes" revelan la presencia de solo un alelo por locus. La presencia del fenotipo marcador dominante (por ejemplo una banda de ADN) es una indicación de que un alelo está en la condición homocigótica o heterocigótica. La ausencia del fenotipo marcador dominante (por ejemplo la ausencia de una banda de ADN) es solamente una evidencia de que está presente "algún otro alelo" no definido. En el caso de poblaciones en donde los individuos son predominantemente homocigóticos y los locus son predominantemente dimórficos, los marcadores dominantes y codominantes pueden ser igualmente valiosos. Conforme las poblaciones se hacen más heterocigóticas y multialélicas, los marcadores codominantes frecuentemente se hacen más informativos del genotipo que los marcadores dominantes. Las moléculas marcadoras pueden ser, por ejemplo, capaces de detectar polimorfismos tales como polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs). Los genomas de animales y plantas sufren naturalmente mutación espontánea en el curso de su evolución continua (Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55:831-854 (1986)). Un "polimorfismo" es una variación o diferencia en la secuencia del gen o sus regiones flanqueadoras que surge en algunos de los miembros de una especie. La secuencia variante y la secuencia "original" coexisten en la población de la especie. En algunos casos, esta coexistencia se encuentra en equilibrio estable o casi estable. Así, se dice que un polimorfismo es "alélico" porque, debido a la existencia del polimorfismo, algunos miembros de una población pueden tener la secuencia original (esto es, el "alelo" original), mientras que otros miembros pueden tener la secuencia variante (esto es, el "alelo" variante). En el caso más simple solo puede existir una secuencia variante y así, se dice que el polimorfismo es dialélico. En otros casos, la población de la especie puede contener alelos múltiples y el polimorfismo se llama trialélico, etc. Un solo gen puede tener múltiples polimorfismos diferentes no relacionados. Por ejemplo, puede tener un polimorfismo dialélico en un sitio y un polimorfismo multialélico en otro sitio. La variación que define el polimorfismo puede variar desde una variación de un solo nucleótido hasta la inserción o supresión de regiones extendidas dentro de un gen. En algunos casos, las variaciones de secuencia de ADN están en regiones del genoma que están caracterizadas por repeticiones cortas en tándem (STRs) que incluyen motivos de nucleótidos de di- o trinucleótidos repetidos en tándem. Los polimorfismos caracterizados por estas repeticiones en tándem son referidos como polimorfismos de "repetición en tándem de número variable" ("VNTR"). Las VNTRs se han usado en análisis de identidad (Weber, patente de E.U.A. No. 5,075,217; Armour y otros, FEBS Letí. 307:113-115 (1992); Jones y otros, Eur. J. Haematol. 39:144-147 (1987); Hom y otros, solicitud de patente de PCT WO91/14003; Jeffreys, solicitud de patente Europea 370,719; Jeffreys, patente de E.U.A. No. 5,175,082; Jeffreys y otros, Amer. J. Hum. Genet. 39:1 1-24 (1986); Jeffreys y otros, Nature 316:76-79 (1985); Gray y otros, Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243:241-253 (1991 ); Moore y otros, Genomics 10:654-660 (1991); Jeffreys y otros, Anim. Genet. 18:1-15 (1987); Hillel y otros, Anim. Genet. 20:145- 55 (1989); Hillel y otros, Genet. 24:783-789 ( 990)). La detección de sitios polimórficos en una muestra de ADN se puede facilitar usando métodos de amplificación de ácido nucleico. Dichos métodos aumentan específicamente la concentración de polinucleótidos que abarcan el sitio polimórfico, o que incluyen ese sitio y secuencias localizadas ya sea distantemente o cercanamente al mismo. Tales moléculas amplificadas pueden ser detectadas fácilmente por electroforesis en gel u otros medios. En una modalidad alternativa, los polimorfismos se pueden detectar usando una molécula de ácido nucleico marcador que está ligada físicamente a dicho polimorfismo (o polimorfismos). Para este fin, se pueden emplear moléculas de ácido nucleico marcador que comprenden una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido localizado en el espacio de 1 mb del polimorfismo (o los polimorfismos), y muy preferiblemente en el espacio de 100 kb del polimorfismo (o polimorfismos), y de preferencia en el espacio de 10 kb del polimorfismo (o polimorfismos). La identificación de un polimorfismo se puede hacer de varias formas. Correlacionando la presencia o ausencia del mismo en una planta con la presencia o ausencia de un fenotipo, es posible predecir el fenotipo de esa planta. Si un polimorfismo crea o destruye un sitio de corte de endonucleasa de restricción, o si origina la pérdida o inserción de ADN (por ejemplo un polimorfismo VNTR), alterará el tamaño o perfil de los fragmentos de ADN que son generados por digestión con esa endonucleasa de restricción. Por lo tanto, los organismos que poseen una secuencia variante se pueden distinguir de los que tienen la secuencia original mediante el análisis del fragmento de restricción. Los polimorfismos que se pueden identificar de esta manera se denominan "polimorfismos de longitud de fragmento de restricción" ("RFLPs") (Glassberg, solicitud de patente del Reino Unido 2135774; Skolnick y otros, Cytogen. Cell Genet. 32:58-67 (1982); Botstein y otros, Ann. J Hum. Genet. 32:314-331 (1980); Fischer y otros, (solicitud de PCT WO 90/13668; Uhlen, solicitud de PCT WO90/11369). Los polimorfismos también se pueden identificar por medio de análisis de conformación de polimorfismo de una sola cadena (SSCP) (Elles, "Methods ¡n Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases", Humana Press (1996)); Orita y otros, Genomics 5:874-879 (1989)). Se han descrito varios protocolos para SSCP incluyendo sin limitación los de Lee y otros, Anal. Biochem. 205:289-293 (1992); Suzuki y otros, Anal. Biochem. 192:82-84 (1991 ); Lo y otros, Nucleic Acids Research 20:1005-1009 (1992); Sarkar y otros, Genomics 13:441-443 (1992). Se entiende que uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar como marcadores o sondas para detectar polimorfismos por análisis de SSCP. Los polimorfismos también se pueden encontrar usando una técnica de dactiloscopia de ADN denominada polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP), que está basada en la amplificación selectiva de PCR de fragmentos de restricción de una digestión total de ADN genómico para recortar ese ADN (Vos y otros, Nucleic Acids Res. 23:4407-44 4 (1995)). Este método permite la coamplificación específica de altos números de fragmentos de restricción que pueden ser visualizados por PCR, sin conocer la secuencia del ácido nucleico. Se entiende que uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar como marcadores o sondas para detectar polimorfismos por análisis de AFLP o para dactiloscopia de ARN. Los polimorfismos también se pueden encontrar usando ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) (Williams y otros, Nucí. Acids Res. 18:6531-6535 (1990)) y secuencias polimórficas amplificadas cortabies (CAPS) (Lyamichev y otros, Science 260:778-783 (1993)). Se entiende que se puede utilizar una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención como marcadores o sondas para detectar polimorfismos mediante análisis de RAPD o CAPS.

Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) generalmente ocurren a mayor frecuencia que otros marcadores polimórficos y están espaciados en todo un genoma con una mayor uniformidad que otras formas reportadas de polimorfismo. La mayor frecuencia y uniformidad de SNPs significa que hay una mayor probabilidad de encontrar dicho polimorfismo en un locus genético de interés o cerca del mismo, de lo que sería para otros polimorfismos. Los SNPs están localizados en regiones codificadoras de proteína y regiones no codificadoras de un genoma. Algunos de estos SNPs pueden dar como resultado una expresión defectuosa o variante de proteína (por ejemplo como resultado de mutaciones o empalme defectuoso). El análisis (determinación de genotipo) de SNPs caracterizados puede requerir solo una prueba de más/menos en lugar de una medición prolongada, permitiendo una automatización más fácil. Los SNPs pueden ser caracterizados usando cualquier método de una variedad. Estos métodos incluyen la secuenciación directa o indirecta del sitio, el uso de enzimas de restricción (Botstein y otros, Am. J. Hum. Genet. 32:314-331 (1980); Konieczny y Ausubel, Plant J. 4:403-410 (1993)), pruebas enzimáticas y químicas de apareamiento erróneo (Myers y otros, Nature 313:495-498 (1985)), PCR específica de alelo (Newton y otros, Nucí. Acids Res. 17:2503-2516 (1989); Wu y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2757-2760 (1989)), reacción en cadena de ligasa (Barany, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991 )), análisis de polimorfismo de una sola cadena (Labrune y otros, Am. J. Hum. Genet. 48: 1 115-1120 (1991 )), extensión de iniciador de una sola base (Kuppuswamy y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1 143-1 147 (1991 ), Goelet, patente de E.UA No. 6,004,744; Goelet, patente de E.U.A. No. 5,888,819), pruebas de ligación de oligonucleótido basadas en ELISA en fase sólida (Nikiforov y otros, Nucí. Acids Res. 22:4167-4175 (1994), dactiloscopia didesoxi (Sarkar y otros, Genomics 13:441-443 (1992)), pruebas de inactivación de fluorescencia de oligonucleótido (Livak y otros, PCR Methods Appl. 4:357-362 (1995a)), prueba de hibridación específica de alelo de 5'-nucleasa TaqMan™ (Livak y otros, Nature Genet. 9:341-342 (1995)), prueba de incorporación de colóranteterminador dirigida por molde (TDI) (Chen y Kwok, Nucí. Acids Res. 25:347-353 (1997)), prueba de boya molecular específica de alelo (Tyagi y otros, Nature Biotech. 16: 49-53 (1998)), prueba PinPoint (Haff y Smimov, Genome Res. 7: 378-388 (1997)), análisis dCAPS (Neff y otros, Plant J. 14:387-392 (1998)), pirosecuenciación (Ronaghi y otros, Analytical Biochemistry 267:65-71 (1999); Ronaghi y otros solicitud de PCT WO 98/13523; Nyren y otros, solicitud de PCT WO 98/28440; http//www.pyrosequencing.com), usando espectroscopia de masa, por ejemplo el sistema asscode™ (Howbert y otros, WO 99/05319; Howber y otros, WO 97/27331 ; http//www.rapigene.com; Becker y otros, solicitud de PCT WO 98/26095; Becker y otros, solicitud PCT WO 98/12355; Becker y otros, solicitud PCT WO 97/33000; Monforte y otros, patente de E.U.A. No. 5,965,363), corte invasor de sondas de oligonucleótido (Lyamichev y otros, Nature Biotechnology 17:292-296; http//www.twt.com), y usando arreglos de oligonucleótido de alta densidad (Hacia y otros, Nature Genetics 22: 64-167; http//www.affymetr¡x.com). Los polimorfismos también se pueden detectar usando oligonucleótidos específicos de alelos (ASO) que, por ejemplo, se pueden usar en combinación con tecnología basada en hibridación, incluyendo hibridaciones Southern, Northern y dot blot, hibridaciones dot blot inversas e hibridaciones realizadas en microarreglo y tecnología relacionada. La severidad de hibridación para detectar polimorfismos es muy dependiente de una variedad de factores, incluyendo la longitud del oligonucleótido específico de alelo, la composición de la secuencia, el grado de complementariedad (esto es, la presencia o ausencia de errores de apareamiento de bases), la concentración de sales y otros factores tales como formamida y temperatura. Estos factores son importantes tanto durante la hibridación misma como durante los lavados subsiguientes realizados para remover el polinucleótido objetivo que no está hibridado específicamente. En la práctica, las condiciones del lavado final más severo son las más críticas. Además, la cantidad de polinucleótido objetivo que puede hibridar con el oligonucleótido específico de alelo también es gobernada por factores tales como la concentración de ASO y del polinucleótido objetivo, la presencia y concentración de factores que actúan para "recoger" moléculas de agua, a fin de concentrar eficazmente los reactivos (por ejemplo PEG, dextrano, sulfato dextrano, etc.), si los ácidos nucleicos están inmovilizados o en solución, y la duración de los pasos de hibridación y lavado. Preferiblemente, las hibridaciones se realizan debajo de la temperatura de fusión (Tm) del ASO. Mientras más cercana sea la temperatura del paso de hibridación o lavado a la Tm, será mayor la severidad. Se puede hacer una aproximación a la Tm de un oligonucleótido por ejemplo de acuerdo con la siguiente fórmula: Tm = 81.5+16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%G+C) - 675/n; en donde [Na+] es la concentración molar de sal de Na+ o cualquier otro catión adecuado, y n = número de bases del oligonucleótido. Están disponibles otras fórmulas de aproximación a Tm y son conocidas para la persona con conocimientos medios en la materia. La severidad se ajusta preferiblemente de tal manera de permitir que un ASO dado hibride diferencialmente con un polinucleótido objetivo del alelo correcto y un polinucleótido objetivo del alelo incorrecto. Preferiblemente, habrá una diferencia de por lo menos dos veces entre la señal producida por el ASO que híbrida con un polinucleótido objetivo del alelo correcto, y el nivel de señal producido por el ASO que híbrida cruzadamente con un polinucleótido objetivo del alelo incorrecto (por ejemplo, un ASO específico de un alelo muíante que híbrida cruzadamente con un alelo silvestre). En modalidades más preferidas de la presente invención existe una diferencia de por lo menos cinco veces en la señal. En modalidades muy preferidas de la presente invención existe una diferencia de señal de por lo menos un orden de magnitud entre el ASO que híbrida con un polinucleótido objetivo del alelo correcto y el nivel de la señal producida por el ASO que híbrida cruzadamente con un polinucleótido objetivo del alelo incorrecto. Aunque se describen aquí algunos métodos para detectar polimorfismos, se pueden usar otros métodos de detección. Por ejemplo, existen más métodos y se describen en las siguientes referencias: Birren y otros, Genome Analysis, 4:135-186; "A Laboratory Manual. Mapping Genomes", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999); Maliga y otros, "Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995); Paterson, "Biotechnology Intelligence Unit: Genome Mapping in Plañís", R. G. Landes Co., Georgetown, Texas, y Academic Press, San Diego, California (1996); "The Maize Handbook", Freeling and Walbot, eds., Springer-Verlag, New York, N.Y. (1994); "Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases", Elles, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1996); "Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual", Clark, ed., Springer-Verlag, Berlín, Alemania (1997). Los requisitos para la selección asistida por marcador en un programa de reproducción de planta son: (1 ) el o los marcadores se deben cosegregar o deben estar enlazados estrechamente con el rasgo deseado; (2) debe estar disponible un medio eficiente para examinar grandes poblaciones y seleccionar el o los marcadores moleculares; y (3) la técnica de examen y selección debe ser altamente reproducible entre laboratorios y de preferencia debe ser económica y fácil de usar. El enlace genético de moléculas marcadoras puede ser establecido por medio de un modelo de mapeo genético tal como por ejemplo, sin limitación, el modelo de marcador flanqueador reportado por Lander y Botstein, Genetics 121 :185-199 (1989) y el mapeo de intervalo, basado en métodos de probabilidad máxima, descrito por Lander y Botstein, Genetics 121 :185-199 (1989) y puesto en práctica en el paquete de software MAPMAKER/QTL (Lincoln y Lander, "Mapping Genes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL", Instituto Whitehead de Investigación Bioquímica, Massachusetts, (1990). Softaware adicional incluye Qgene, versión 2.23 (1996), Departamento de Reproducción y Biometría Vegetal, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, N.Y.). El uso del software Qgene es un enfoque particularmente preferido. Se calcula una probabilidad máxima estimada (MLE) de la presencia de un marcador, junto con una MLE suponiendo que no hay efecto QTL, para evitar falsos positivos. Entonces se calcula un log10 de una razón de ventaja (LOD) como LOD = log10 (MLE de la presencia de un QTL/QTL no enlazado dado por MLE). La puntuación LOD indica esencialmente cuanto mayor probabilidad hay de que los datos hayan aparecido suponiendo la presencia de un QTL que con respecto a su ausencia. El valor de umbral de LOD para evitar un falso positivo con una confianza dada, por ejemplo de 95%, depende del número de marcadores y de la longitud del genoma. Gráficas que indican umbrales de LOD se describen en Lander y Botstein, Genetics 121 :185-199 (1989) y también en Arús y Moreno-González, Plant Breeding, Hayward y otros, (eds.) Chapman & Hall, Londres, p. 314-331 (1993). En una modalidad preferida de la presente invención, el marcador de ácido nucleico exhibe una puntuación LOO mayor de 2.0, de preferencia 2.5, muy preferiblemente mayor de 3.0 o 4.0, con el rasgo o fenotipo de interés. En una modalidad preferida, el rasgo de interés es el nivel o la composición alterados de tocoferol. Se pueden usar modelos adicionales. Se han reportado muchas modificaciones y enfoques alternativos al mapeado de intervalo, incluyendo el uso de métodos no paramétricos (Krugiyak y Lander, Genetics 139:1421-1428 (1995)). También se pueden usar métodos o modelos de regresión múltiple en los cuales el rasgo es regresado en un número grande de marcadores (Jansen, "Biometrics in Plant Breeding", van Oijen y Jansen (eds.), "Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding", Países Bajos, p. 1 16-124 (1994); Weber y Wricke, "Advances in Plant Breeding", Blackwell, Berlín, 16 (1994)). Procedimientos que combinan mapeo de intervalo con análisis de regresión, con los cuales el fenotipo es regresado en un QTL putativo único en un intervalo de marcador dado y al mismo tiempo en varios marcadores que sirven como "cofactores", han sido reportados por Jansen y Stam, Genetics 136:1447-1455 (1994), y Zeng, Genetics 136:1457-1468 (1994). Generalmente, el uso de cofactores reduce la desviación y el error de muestreo de las posiciones estimadas de QTL (Utz y Melchinger, "Biometrics in Plant Breeding", van Oijen y Jansen (eds.), "Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding", Países Bajos, p.195-204 (1994), mejorando así la precisión y eficiencia del mapeo de QTL (Zeng, Genetics 136:1457-1468 (1994)). Estos modelos se pueden extender a experimentos multiambientales para analizar las interacciones genotipo-medio ambiente (Jansen y otros, Theo. Appl. Genet. 91 :33-37 (1995)). Se entiende que una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar como marcadores moleculares. También se entiende que una o más de las moléculas de proteína de la invención se pueden usar como marcadores moleculares. En una modalidad preferida está presente el polimorfismo y se le selecciona de una población de mapeo, por ejemplo una colección de plantas susceptibles de ser usadas con marcadores tales como marcadores polimórficos para mapear la posición genética de los rasgos. La elección de la población de mapeo apropiada depende frecuentemente del tipo de sistema de marcador empleado (Tanksley y otros, J.P. Gustafson y R. Appels (eds.). Plenum Press, New York, p. 157- 73 (1988)). Se debe considerar la fuente de los progenitores usados en la población de mapeo (adaptados contra extraños). Las proporciones de apareamiento y recombinación cromosómico pueden ser perturbadas (suprimidas) severamente en las cruzas amplias (adaptado x extraño) y generalmente producen distancias de enlace muy reducidas. Las cruzas amplias usualmente proveerán poblaciones segregantes con un número relativamente grande de polimorfismos cuando se comparan con la progenie en una cruza reducida (adaptada x adaptada). Una población F2 es la primera generación de autofecundación (autopolinización) después de ser producida la semilla híbrida. Usualmente una sola planta F-? es autofecundada para generar una población segregante para todos los genes en el patrón Mendeliano (1 :2:1 ). Se obtiene información genética máxima de una población F2 completamente clasificada usando un sistema marcador codominante (Mather, " easurement of Linkage ¡n Heredity": Methuen and Co., (1938)). En el caso de marcadores dominantes se requieren pruebas de progenie (por ejemplo F3, BCF2) para identificar los heterocigotos para clasificar la población. Sin embargo, frecuentemente este procedimiento es prohibitivo debido al costo y tiempo involucrados en el análisis de la progenie. El análisis de la progenie de individuos F2 se usa frecuentemente en la construcción de mapas en donde los fenotipos no reflejan consistentemente el genotipo (por ejemplo la resistencia a enfermedad), o en donde la expresión del rasgo es controlada por un QTL. Los datos de segregación de poblaciones de prueba de progenie (por ejemplo F3 o BCF2) se pueden usar en la construcción del mapa. Se puede aplicar entonces selección asistida por marcador a la progenie de la cruza en base a asociaciones marcador-rasgo del mapa (F2, F3), en donde los grupos de enlace no han sido disociados completamente por eventos de recombinación (esto es, desequilibrio máximo). Se pueden usar líneas endogámicas recombinantes (RIL) (líneas relacionadas genéticamente; usualmente >F5, desarrolladas de líneas F2 continuamente autofecundadas) como una población de mapeo. La información obtenida de marcadores dominantes puede ser maximizada usando RIL porque todos los locus son homocigóticos o casi homocigóticos.

Bajo condiciones de enlace estrecho (esto es, aproximadamente <10% de recombinación), los marcadores dominantes y codominantes evaluados en poblaciones RIL proveen más información por individuo que cualquier tipo de marcador en poblaciones de retrocruza (Reiter, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A) 89:1477-1481 (1992)). Sin embargo, como la distancia entre los marcadores se hace más grande (esto es, los locus se hacen más independientes), la información en las poblaciones RIL disminuye dramáticamente cuando se compara con los marcadores codominantes. Las poblaciones de retrocruza (por ejemplo generadas de una cruza entre una variedad exitosa (progenitor recurrente) y otra variedad (progenitor donador) que lleva un rasgo ausente en la primera) se pueden utilizar como una población de mapeo. Se puede hacer una serie de retrocruzas con el progenitor recurrente para recuperar la mayoría de sus rasgos deseables. De esta manera, se crea una población que consiste de individuos casi como el progenitor recurrente, pero cada individuo lleva cantidades variables o mosaico de regiones genómicas del progenitor donador. Las poblaciones de retrocruza pueden ser útiles para mapear marcadores dominantes si todos los locus en el progenitor recurrente son homocigóticos y el donador y el progenitor recurrente tienen alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:1477-1481 (1992)). La información obtenida de poblaciones de retrocruza usando marcadores codominantes o dominantes es menor a la obtenida de poblaciones F2 porque es muestreado por planta un gameto recombinante en lugar de dos. Sin embargo, las poblaciones de retrocruza son más informativas (a saturación baja de marcador) cuando se comparan con RlLs, pues aumenta la distancia entre locus enlazados en poblaciones RIL (esto es, aproximadamente 0.15% de recombinación). El aumento de recombinación puede ser benéfico para resolución de enlaces estrechos, pero puede ser inconveniente en la construcción de mapas con saturación de marcador baja. Se pueden usar líneas casi isogénicas (NIL) (creadas por muchas retrocruzas para producir una colección de individuos que son casi idénticos en composición genética, excepto por el rasgo o región genómica bajo interrogación), como una población de mapeo. Al mapear con NlLs, se espera mapear solo una porción del locus polimórfico a una región seleccionada. El análisis de segregante en masa (BSA) es un método desarrollado para la identificación rápida de enlace entre marcadores y rasgos de interés (Michelmore y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88:9828-9832 (1991 )). En el BSA, se extraen dos muestras de ADN en masa de una población segregante que se origina de una sola cruza. Estas masas contienen individuos que son idénticos para un rasgo particular (resistente o susceptible a una enfermedad particular) o región genómica, pero arbitrarios en regiones no enlazadas (esto es, heterocigóticas). Las regiones no enlazadas a la región objetivo no diferirán entre las muestras en masa de muchos individuos en BSA.

En un aspecto de la presente invención, una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se usan para determinar en una planta (preferiblemente cañóla, maíz, Brassica campestris, Brassica napus, soya, col de abisinia, mostaza, ricino, cacahuate, ajonjolí, algodón, linaza, cártamo, palma de aceite, lino o girasol), el nivel (esto es, la concentración de ARNm en una muestra, etc.) o patrón (esto es, la cinética de expresión, la velocidad de descomposición, perfil de estabilidad, etc.) de la expresión de una proteína codificada parcial o totalmente por una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (colectivamente, la "respuesta de expresión" de una célula o tejido). Como se usa aquí, se dice que la respuesta de expresión manifestada por una célula o tejido está "alterada" si difiere de la respuesta de expresión de células o tejidos de plantas que no exhiben el fenotipo. Para determinar si una respuesta de expresión está alterada, la respuesta de expresión manifestada por la célula o tejido de la planta que exhibe el fenotipo, se compara con la de una muestra de célula o tejido similar de una planta que no exhibe el fenotipo. Como se apreciará, no es necesario volver a determinar la respuesta de expresión de la muestra de célula o tejido de las plantas que no exhiben el fenotipo cada vez que se hace dicha comparación; en su lugar, la respuesta de expresión de una planta particular se puede comparar con valores de plantas normales obtenidos previamente. Como se usa aquí, el fenotipo del organismo es cualquiera de una o más características de un organismo (por ejemplo resistencia a enfermedad, tolerancia a plaguicida, tolerancia al medio ambiente tal como tolerancia al esfuerzo abiótico, esterilidad masculina, mejoramiento de la calidad o rendimiento, etc.). Un cambio en el genotipo o fenotipo puede ser transitorio o permanente. También, como se usa aquí, una muestra de tejido es cualquier muestra que comprende más de una célula. En un aspecto preferido, una muestra de tejido comprende células que comparten una característica común (por ejemplo derivan de raíz, semilla, flor, hoja, tallo o polen, etc.). En un aspecto de la presente invención se puede realizar una evaluación para determinar si está presente una molécula de ARNm particular. Una o más de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se utilizan para detectar la presencia o cantidad de las especies de ARNm. Dichas moléculas se incuban entonces con extractos de célula o tejido de una planta, bajo condiciones suficientes para permitir la hibridación de ácido nucleico. La detección de moléculas híbridas de sonda de doble cadena-ARNm es indicativa de la presencia del ARNm; la cantidad de este híbrido formado es proporcional a la cantidad de ARNm. De esta manera, estas sondas se pueden usar para determinar el nivel y la magnitud de la producción de ARNm en las células o tejidos de una planta. Tal hibridación de ácido nucleico puede ser realizada bajo condiciones cuantitativas (dando así un valor numérico de la cantidad del ARNm presente). Alternativamente, el ensayo puede ser realizado como un ensayo cualitativo que indica que el ARNm está presente, o que su nivel sobrepasa un valor predefinido fijado por el usuario.

Se pueden usar varios métodos para comparar la respuesta de expresión entre dos o más muestras de células o tejidos. Estos métodos incluyen ensayos de hibridación tales como Northerns, ensayos de protección de ARNasa e hibridación in situ. Alternativamente, los métodos incluyen ensayos de tipo PCR. En un método preferido, la respuesta de expresión es comparada hibridando ácidos nucleicos de las dos o más muestras con un arreglo de ácidos nucleicos. El arreglo contiene una pluralidad de secuencias sospechosas conocidas o sospechosas de estar presentes en las células o tejido de las muestras. Una ventaja de la hibridación sin situ sobre las técnicas más convencionales para la detección de ácidos nucleicos, es que permite a un investigador determinar la población espacial precisa (Angerer y otros, Dev. Biol. 101 :477-484 (1984); Angerer y otros, Dev. Biol. 1 12:157-166 (1985); Dixon y otros, EMBO J. 10:1317-1324 (1991)). La hibridación in situ se puede usar para medir el nivel de estado constante de la acumulación de ARN (Hardin y otros, J. Mol. Biol. 202:417-431 (1989)). Se han contemplado varios protocolos para hibridación in situ, cada uno con condiciones de preparación de tejido, hibridación y lavado (Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5:242-250 (1987); Cox y Goldberg en "Plant Molecular Biology: A Practical Approach", Shaw (ed.), p. 1-35, IRL Press, Oxford (1988); Raikhel y otros, "In situ RNA hybridization in plant tissues" en "Plant Molecular Biology Manual", vol. B9:1-32, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Bélgica (1989)). La hibridación ¡n situ también permite la localización de proteínas dentro de un tejido o célula (Wilkinson, "In Situ Hybridization", Oxford University Press, Oxford (1992); Langdale, "In Situ Hybridization" en "The aize Handbook", Freeling and Walbot (eds.), p. 165-179, Springer-Verlag, New York (1994)). Se entiende que una o más de las moléculas de la invención, preferiblemente una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención o fragmentos de las mismas, o uno o más de los anticuerpos de la invención, se pueden utilizar para detectar el nivel o patrón de una proteína, o ARNm de la misma, por hibridación in situ. La hibridación in situ fluorescente permite la localización de una secuencia particular de ADN a lo largo de un cromosoma, lo que es útil, entre otros cosas, para mapeo de gen, para seguir cromosomas en líneas híbridas o para detectar cromosomas con traslocaciones, transversiones o supresiones. La hibridación in situ se ha usado para identificar cromosomas en varias especies de plantas (Griffor y otros, Plant Mol. Biol. 17:101-109 (1991 ); Gustafson y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:1899-1902 (1990); Mukai y Gilí, Genome 34:448-452 (1991 ); Schwarzacher y Heslop-Harrison, Genome 34:317-323 (1991 ); Wang y otros, Jpn. J. Genet. 66:313-316 (1991); Parra y Windle, Nature Genetics 5:17-21 (1993)). Se entiende que las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar como sondas o marcadores para localizar secuencias a lo largo de.un cromosoma. Otro método para localizar la expresión de una molécula es la impresión de tejido. La impresión de tejido provee una forma de examinar, al mismo tiempo sobre la misma membrana, muchas secciones de tejido de diferentes plantas o diferentes etapas de desarrollo (Yomo y Taylor, Planta 1 12:35-43 (1973); Harris y Chrispeels, Plant Physiol. 56:292-299 (1975); Cassab y Varner, J. Cell. Biol. 105:2581-2588 (1987); Spruce y otros, Phytochemistry 26:2901 -2903 (1987); Barres y otros, Neuron 5:527-544 (1990); Reíd y Pont-Lezica, "Tissue Printing: Tools for the Study of Anatomy, Histochemistry and Gene Expression", Academic Press, New York, N.Y. (1992); Reid y otros, Plant Physiol. 93:160-165 (1990); Ye y otros, Plant J. 1 :175-183 (1991 )). Un experto en la materia puede consultar los textos de referencia general para revisar las descripciones detalladas de técnicas conocidas aquí descritas o técnicas equivalentes. Estos textos incluyen: "Current Protocols ¡n Molecular Biology" Ausubel, y otros, eds., John Wiley & Sons, N.Y. (1989), y suplementos hasta septiembre (1998); "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Sambrook y otros, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); "Genome Analysis: A Laboratory Manual: 1. Analyzing DNA", Birren y otros, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1997); "Genome Analysis: A Laboratory Manual: 2. Detecting Genes", Birren y otros, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); "Genome Analysis: A Laboratory Manual 3: Cloning Systems", Birren y otros, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999); "Genome Analysis: A Laboratory Manual 4: Mapping Genomes", Birren y otros, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999); "Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual", Clark, Springer-Verlag, Berlín, (1997); "Methods in Plant Molecular Biology", Maliga y otros, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995). Desde luego, también se puede hacer referencia a estos textos al hacer o usar un aspecto de la invención. Se entiende que cualquiera de los agentes de la invención puede ser sustanciaimente puro o puede ser biológicamente activo o recombinante. Habiendo descrito en general la invención, esta será entendida más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proveen a modo de ilustración y no se consideran limitativos de la presente invención, a menos que se especifique. Cada revista, patente y otro documento o referencia aquí citada se incorpora como referencia en su totalidad.

EJEMPLO 1 Clonación de tyrA de Erwínia herbicola Se obtuvieron los vectores pJX1 , pJX181 y pJX184 (Zhao y Jensen of Molecular Evolution 36(2): 107-20 (1993)). El gen tyrA se amplificó por PCR usando los iniciadores tyrA5' (ACT GCC ATG GTG GCT GAA CTG ACC G (SEQ ID NO: 5)) y tyrA3' (ACT GGA ATT CTT ATT ATG GGC GGC TGT CAT TG (SEQ ID NO: 6)) y ADN plasmídico de los vectores pJX1 , pJX 81 y pJX184 como ADN molde. Se realizaron reacciones de PCR usando el equipo de PCR de alta fidelidad Expand™ de Boehringer Mannheim, en un volumen total de 50 pl de acuerdo con el protocolo del fabricante. El gen tyrA se amplificó por medio de 30 ciclos de PCR bajo las siguientes condiciones: 10 min de incubación a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de apareamiento a 56° C y 1.5 min de extensión a 72°C. Estas reacciones fueron seguidas por una incubación de 5 min a 72°C. El producto de PCR de pJX 84 se eligió para clonación de gen y se digirió con Ncol y EcoRI. El fragmento de restricción purificado en gel se ligó a pSE280 digerido con Ncol/EcoRI y purificado en gel (Invitrogen Co., Carlsbad, California), dando como resultado la formación de p ON26588 (figura 2). El Inserto de tyrA en pMON26588 se verificó por secuenciación de ADN.

EJEMPLO 2 Clonación de tyrA de Escherichia coli El gen tyrA de E. coli se amplificó por PCR usando los iniciadores tyrAecoli5' (ACT GCC ATG GTT GCT GAA TTG ACC G (SEQ ID NO: 7)) y tyrAecoliS1 (ACT GGA ATT CTT ATT ACT GGC GAT TG (SEQ ID NO:8)) y ADN genómico total de E. coli DH5a como ADN molde. Se aisló ADN genómico total de E. coli usando el equipo Qiaamp Tissue de Qiagen (Qiagen Inc. Valencia, California). Se realizaron reacciones de PCR usando el equipo de PCR de alta fidelidad Expand™ de Boehringer Mannheim en un volumen total de 50 pl, de acuerdo con el protocolo del fabricante. El gen tyrA se amplificó por medio de 30 ciclos de PCR bajo las siguientes condiciones: 10 min de incubación a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de apareamiento a 56° C y 1.5 min de extensión a 72°C. Estas reacciones fueron seguidas por una incubación de 5 min a 72°C. El producto de PCR se digirió con Neol y EcoRI. El fragmento de restricción purificado en gel se ligó a pSE280 digerido con Ncol/EcoRI y purificado en gel (Invitrogen Co., Carlsbad, California), dando como resultado la formación de pMON26589 (figura 3). El inserto de tyrA en pMON26589 se verificó por secuenciación de ADN.

EJEMPLO 3 Expresión de prefenato deshidrogenasa bifuncional en E. col¡ Los vectores pMON26588 y p ON26589 se transformaron en E. coli DH5oc y las células se desarrollaron en 15 mi de cultivo LB hasta una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 0.6, y se indujeron agregando IPTG hasta una concentración final de 0.66 µ?. Las células se cosecharon después de incubación durante 2 a 3 horas. La pella celular se resuspendió en 0.5 mi de Tris/HCl 25 mM, pH 8.2, y las células se lisaron por sonicación. Las membranas y los desechos celulares se sedimentaron por centrifugación a 100,000 x g durante tres horas. El sobrenadante se usó en pruebas de enzima como un extracto celular crudo. La actividad prefenato deshidrogenasa se midió en un volumen final de 1.5 mi conteniendo EDTA 1 mM, DTE 1 mM, NAD 1 mM, y prefenato (sal de Ba) 1 mM en Tris/HCl 25 mM, pH 8.2. La actividad específica de prefenato deshidrogenasa se determinó monitoreando la conversión de NAD+ a NADH como se describe en "Methods in Enzymology" Vol. 17 (Parte A) p. 564-574 (1970). Los resultados se muestran en el siguiente cuadro 1.

CUADRO 1 EJEMPLO 4 Colocación del gen tyrA bajo el control del promotor T7 Los genes tyrA de E. coli y E. herbicola se cortaron como fragmentos Ncol/EcoRI de pMON26589 y pMON26588, se purificaron en gel y se clonaron en pMON26541 digerido con NcOI/EcoRl y purificado en gel (figura 28), dando como resultado la formación de pMON26591 y pMON26590, respectivamente (figuras 4 y 5). Estos vectores pusieron el gen tyrA bajo el control del promotor T7.

EJEMPLO 5 Preparación de un vector de expresión en planta con tyrA El gen tyrA de E. herbicola se eligió para expresión en planta. El gen se cortó de pMON26590 por digestión con Ncol/EcoRl, se purificó en gel, y se ligó en pMON26541 digerido con Ncol/EcoRl y purificado en gel, dando como resultado la formación del vector transportador pMON36510 (figura 6). Estas ligaciones fusionaron el gen tyrA bacteriano con CTP1 , que es el péptido de dirección a cloroplasto de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa de Arabidopsis, y lo ponen bajo el control del promotor e35S. Para poner el gen tyrA bajo el control de promotor Napin, se digirió pMON36510 con EcoRI, los extremos se rellenaron usando el fragmento Klenow (Maniatis), y el vector purificado en gel se digirió con Bgl II. El fragmento más pequeño que codifica el gen tyrA fusionado a CTP1 se purificó en gel y se ligó en pCGN3223 digerido y purificado en gel (figura 45). Para realizar esta ligación, se digirió pCGN3224 con Pstl, los extremos se rellenaron con fragmento Klenow (Maniatis) y subsiguientemente el vector se digirió con con Bgl II y se purificó en gel. La ligación del vector purificado y la fusión CTP1 ::tyrA da como resultado la formación de pMON36512 (figura 7). Para transferir el gen tyrA de E. herbicola a un vector binario de Arabidopsis, pMON36510 se digirió con HindIII y Sac I, y el fragmento purificado en gel que lleva el promotor e35S se fusionó a CTP1 y tyrA se ligó a p ON26543 digerido con Hindili/Sacl y purificado en gei (figura 29), que dio como resultado la formación de p ON36511 (figura 8). Este vector contiene tyrA bajo el control del promotor e35S. El vector de expresión binario pNapin se obtuvo ligando el fragmento Notl purificado en gei que aloja el cassette de expresión pNapin::CTP1 ::tyrA::napin 3' en pMON36176 digerido con Notl (figura 30), lo que da como resultado la formación de pMON36520 (figura 9).

EJEMPLO 6 Transformación de Arabidopsis con pMON36520 y pMON36511 Se preparó Agrobacterium que había sido transformado con pMON36520 y pMON36511 , de la siguiente manera. Se extendieron 100 µ? de un cultivo nocturno sobre una placa de agar LB con antibióticos. La placa se puso boca abajo en una cámara a 30CC durante la noche. Las placas se retiraron después que las colonias se habían desarrollado (24-48 horas). Se inició un cultivo a pequeña escala colocando 10 mi de medio líquido LB en un tubo de 50 mi. Se le agregaron 10 µ? de kanamicina (50 pg/pl), 10 µ? de espectinomicina (75-100 pg/µ?), y 10 µ? de cloranfenicol (25 pg/µ?). Se le agregó Agrobacterium de una placa, y el tubo se agitó y se puso en un agitador a 30°C durante la noche. Después del desarrollo nocturno del cultivo de 0 mi, este se removió a un matraz de 500 mi. En un matraz se pusieron 200 mi de líquido LB, se le agregaron 200 µ? de kanamicina (50 pg/pl), 200 µ? de espectinomicina (75-100 pg/µ?) y 200 µ? de cloranfenicol (25 g µl), y entonces se le agregaron los 10 mi del cultivo nocturno. El matraz de 500 mi se puso en un agitador a 30°C y se dejó desarrollar durante la noche. Los 200 mi del cultivo se pusieron en un tubo de centrífuga y se centrifugaron 25 minutos a 3,750 rpm y 19°C. Después de la centrifugación el líquido se separó por decantación y la pella se volvió a suspender en 25 mi de solución de sacarosa al 5% (0.05% Silwet). Se pusieron en una cubeta 900 µ? de la solución de sacarosa y 100 µ? de los 25 mi de cultivo bacteriano, y la cubeta se agitó con una cubierta de parafilm. Se tomó una lectura en blanco de DO con 1 mi de solución de sacarosa y después se tomaron lecturas de todas las soluciones bacterianas. Se registró la DO de cada cultivo (a una longitud de onda de 600). Se realizaron los siguientes cálculos: CiV-, = C2V2; C1V1=(0.8)(200 mi); ?-,?-??d?; V-,=160/Ci; y Vi= X ml/10 para determinar D06oo= 0.8 de un cultivo de Agrobacteríum. Las plantas se remojaron en agua durante por lo menos 30 minutos antes de inmersión. La solución bacteriana se vació en un recipiente de plástico poco hondo y partes aéreas de la planta (saetas, rosetas) se sumergieron en la solución 3-5 segundos con agitación suave. Las plantas sumergidas se colocaron sobre su lado en una charola negra forrada con lienzo, y se cubrieron con una cubierta durante la noche (16-24 horas) para mantener una humedad alta. La cubierta se retiró y se restablecieron las condiciones normales de crecimiento de la planta durante 4 semanas. Después de la transformación y el tratamiento con humedad alta, las plantas se mantuvieron a 22°C, 60% de H.R. y un fotoperíodo de 16 horas durante 4 semanas. Las plantas produjeron conos de cinco a siete días después de la transformación. Semanalmente se fertilizó con un fertilizante suave 20-20-20. Después de 4 semanas de desarrollo, las plantas se pusieron en el invernadero y se detuvo toda provisión de agua para estimular la desecación de la planta para cosechar semillas. Las plantas quedaron listas para cosechar semillas después de 1-1.5 semanas de desecación. Las semillas se cosecharon cortando la base de la planta debajo de los conos, sosteniendo la planta sobre un tamiz de semillas y una pieza blanca de papel, moviendo las saetas a través del agujero del cono y recogiendo las semillas limpias a través del tamiz. Las semillas se esterilizaron conectando al vacío una manguera de vacío de desecador en una campana / mesa de flujo. Se pusieron 100 mi de blanqueador en un matraz de 250 mi y se le agregaron 3 mi de ácido clorhídrico concentrado. El matraz se puso en el desecador y las semillas en tubos de semilla en un soporte de tubos y se pusieron en el desecador. Se puso una cubierta sobre el desecador y se hizo vacío. El desecador se dejó así durante la noche pero no más de 16 horas. Una vez esterilizadas, las semillas se sembraron en placa sobre medio de selección (preparado agregando 10 g (2 g/l) de Phyta-Gel, 10.75 g (2. 5 g/l) de sales MS Basal (M-5524 de Sigma), 50 g (10 g/l) de sacarosa, y 6 mi (1.2 ml/l) de solución de kanamicina (950 mg/ml), 5 mi (1 ml/l) de solución de cefotaxima (250 mg/ml), y 5 mi (1 ml/l) de solución de carbenecilina (250 mg/ml) hasta un volumen total de 5 litros a un pH de 5.7). Los tubos de semillas se inclinaron ligeramente sobre una placa para distribuir las semillas de forma dispersa. Las placas se envolvieron en parafilm y se pusieron en un refrigerador a 4°C durante 1-2 días para tratamiento con frío. Después de este tratamiento con frío, las placas se pusieron en una cámara a 28°C para germinación. Las plántulas seleccionadas son verdes y tienen desarrollo de hojas secundarias. Las plántulas seleccionadas se transfirieron a tierra después de haber desarrollado hojas secundarias. Las plántulas se sembraron en maceta con tierra y se cubrieron con una cubierta durante 5 días para mantener alta la humedad. Las plantas se transfirieron a un invernadero después de que las siliquias inferiores empezaron a tornarse amarillas. Semillas de las plántulas seleccionadas se desarrollaron en macetas de 6.25 cm con tierra (mezcla ½ Metro-200; /2 PGX). La tierra se amontonó y la maceta se cubrió con malla. La malla se sujeta a la maceta con una banda de hule. Se sembró las semillas y se les cubrió con una cubierta de germinación. - Las semillas se desarrollaron en un fotoperíodo de 12 horas a 70% de humedad relativa a 22°C. Se suministró agua cada tercer día según fuera necesario y se aplicó quincenalmente fertilizante 20-20-20 de Peter desde abajo.

EJEMPLO 7 Se desarrollaron plantas de las semillas transformadas del ejemplo 6 que representan 20 eventos de transformación independientes, y las semillas se cosecharon para producir semillas T2. Las semillas T2 se desarrollaron y se analizó su nivel de tocoferol. En la figura 1 , los niveles de tocoferol se expresan como nanogramos de tocoferol total por miligramo de semilla. Los niveles de tocoferol se determinaron agregando 10 a 15 mg de semilla de Arabidopsis a un microtubo de 2 mi. Se agregó al tubo una masa de 1 g de microglóbulos de 0.5 mm (Biospecifics Technologies Corp. Lynbrook, New York) y 500 µ? de pirogalol al 1 % (Sigma Chem., St. Louis O) en etanol, conteniendo 5 pg/ml de tocol. La muestra se agitó dos veces durante 45 segundos en un FastPrep (Bio101/Savant) a una velocidad de 6.5. El extracto se filtró (acrodisco Gelman PTFE 0.2 pm, filtros de jeringa de 13 mm, Pall Gelman Laboratory Inc, Ann Arbor MI) en un tubo automuestreador. Se realizó HPLC en una columna de HPLC de sílice Zorbax, 4.6 mm x 250 mm (5 pm) con detección fluorescente usando un HPLC Hewlettt Packard (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Se realizó excitación de la muestra a 290 nm, y la emisión se monitoreó a 336 nm. Los tocoferoles se separaron con un gradiente de hexano y éter metil-t-butílico usando un volumen de inyección de 20 µ?, una velocidad de flujo de 1.5 ml/min, y un tiempo de corrida de 12 min (40°C). La concentración y la composición de tocoferol se calculó en base a curvas patrón para a, ß, ? y d-tocoferol y a, ß, d y ?-tocotrienol usando software Chemstation (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

EJEMPLO 8 Plantas transformadas con tyrA v otros genes de la biosíntesis de tocoferol Plantas de cañóla, Brassica napus, Arabidopsis y soya se transformaron con una variedad de construcciones de ADN usando un enfoque de bombardeo de partículas, esencialmente como lo describe Christou en "Particle Bombardment for the Genetic Engineering of Plants", Biotechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, California (1996), o usando transformación mediada por Agrobacteríum. Se produjeron dos series de construcciones de ADN. La primera serie de construcciones son "construcciones de un solo gen". Cada uno de los siguientes genes se insertó en una construcción de ADN de planta separada bajo el control de un promotor de napin (Krindl y otros, Seed Sci. Res. 1 :209:219 (1991 )), y los productos de los genes pueden ser dirigidos a plástido por medio de un péptido codificado de dirección a plástido tal como CTP 1 (Keegstra, Cell 56(2):247-53 (1989); Nawrath, y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 2760-12764 (1994)) o CTP2; un gen tyrA de E. herbicola (Xia y otros, J. Gen.

Microbiol. 138:1309-1316 (1992)), un gen slr1736 (en Cyanobase en la Internet: kazusa.orjp/cyanobase), un gen de ATPT2 de planta (Smith y otros, Plant J. 11 : 83-92 (1997)), un gen dxs (Lois y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95 (5):2105-21 10 (1998)), un gen dxr (Takahashi y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95 (17), 9879-9884 (1998)), un gen de HPPD de Arabidopsis thaliana (Norris y otros, Plant Physiol. 117:1317-1323 (1998)), un gen de GGH (Keller y otros, Eur. J. Biochem. 251 :413-417 (1998)), un gen de GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley y Scolnik, Plant Physiol. 104:1469-1470 (1994)), un gen de AANT1 (Saint Guily y otros, Plant Physiol., 100(2): 1069- 071 (1992)), un gen de MT1 (se usó la secuencia de MT1 de Synechocystis (Número de identificación general NCBI 1653572) en una búsqueda de Blast contra ESTs de Anabaena sp., cepa PCC 7120 (Kaneko 2001 ). Se encontró una secuencia con homología sustancial a MT1 de Synechocystis en una búsqueda blast contra ESTs de Anabaena sp., cepa PCC 7120 (Kaneko y otros, DNA Research 8(5): 205-213 (2001)), un gen de TMT2 (como se describe en la solicitud de E.U.A. S/N 60/330,563, presentada el 25 de octubre de 2001 , que se incorpora en su totalidad en la presente como referencia), un gen de GMT (como se describe en la solicitud de E.U.A. S/N 60/312,758, presentada el 17 de agosto de 2001 , que se incorpora en su totalidad en la presente como referencia); WO 00/32757, WO 00/10380), y un gen slrl737 (en Cyanobase (en el Internet en kazusa.orjp/cyanobase), y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa (Sato y otros, J. DNA Res. 7 (1 ):31-63 (2000))). Cada construcción se transformó por lo menos en una planta de cañóla, Brassica napus, Arabidopsis y soya. Las plantas que expresaban cada uno de estos genes se seleccionaron para participar en cruzas adicionales. También se analizó la composición y nivel de tocoferol en cada planta usando el método que se describe en el ejemplo 7. Las cruzas se llevaron a cabo para cada especie para generar plantas transgénicas que tienen una combinación de uno o más de los siguientes genes introducidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. En una combinación preferida, la construcción o construcciones de ácido nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. La composición y el nivel de tocoferol de cada planta generada por las cruzas (incluyendo todas las cruzas intermedias) también se analizó usando el método que se describe en el ejemplo 7. La progenie de los transformantes de estas construcciones será cruzada entre sí para apilar los genes adicionales para alcanzar el nivel deseado de tocoferol. Se generó una segunda serie de construcciones de ADN y se denominó las "construcciones de genes múltiples". Las construcciones de genes múltiples contienen múltiples genes cada uno bajo el control de un promotor de napin (Krindl y otros, Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991 )) y los productos de cada uno de los genes se dirigieron al plástido por medio de un péptido codificado de dirección a plástido. La construcción de genes múltiples puede tener dos o más de los siguientes genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. En una combinación preferida, la construcción o construcciones de ácido nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y slr1736 o ATPT2. Después se transformó cada construcción en por lo menos una planta de cañóla, Brassica napus, Arabidopsis y soya. También se analizó la composición y el nivel de tocoferol en cada planta, usando el método que se describe en el ejemplo 7. La progenie de los transformantes de estas construcciones se cruzó entre sí para apilar los genes adicionales para alcanzar el nivel deseado de tocoferol.

EJEMPLO 9 Plantas de Arabidopsis transformadas con tyrA, ATPT2 y otros genes de la biosíntesis de tocoferol Se desarrollaron plantas de Arabidopsis silvestres y líneas de plantas Arabidopsis transformadas con el vector plasmídico pMON69907 (figura 12), y las semillas se recogieron como se describió en los ejemplos de arriba, y su contenido de tocoferol o tocotrienol se analizó como se describió arriba. El . plásmido p ON69907 codifica una prefenato deshidrogenasa bifuncional (tyrA) y una fitil feniltransferasa (ATPT2). La figura 14 representa el contenido total de tocoferol y tocotrienol de semillas de Arabidopsis de las plantas silvestres y varias de las líneas de plantas transformadas con el vector plasmídico pMON69907. La figura 15 representa el contenido de tocoferol total de semillas de Arabidopsis de una planta silvestre y varias líneas de plantas transformadas con el vector plasmídico pMON69907. La figura 31 muestra estándares de LC/MS para tocoferol y tocotrienol. La figura 32 muestra los resultados de LC/MS para líneas seleccionadas, mostrando la presencia de tocotrienoles. La figura 33 muestra un cromatograma de HPLC/FLD de extracto de semilla de control que no muestra la presencia de tocotrienoles. La figura 34 muestra un cromatograma de HPLC/FLD del extracto de semilla de control que muestra la presencia de tocotrienoles en líneas seleccionadas.

EJEMPLO 10 Plantas de Arabidopsis transformadas con tyrA y otros genes de la biosíntesis de tocoferol Se prepararon las construcciones de expresión pCGN 10822, pMON36528, pMON69907 y pMON69909, mostradas en las figuras 10-13, respectivamente. Las plantas de Arabidopsis se transformaron con los vectores indicados usando las técnicas de transformación que se describen en el ejemplo 8. Los transformantes se aislaron y desarrollaron en líneas individuales por medio de autopolinización, y se recogieron las semillas de cada línea. Se analizó la composición total de tocoferol y tocotrienol de las semillas de cada línea usando el método que se describe en el ejemplo 7. La figura 16 muestra los niveles totales de tocoferol y tocotrienol de líneas de planta que alojan las construcciones descritas o un control. En la figura 17 se muestra un análisis de semillas T2 de líneas de planta derivadas por transformación con el vector pMON69909 con respecto al tipo silvestre. Se observó que las líneas de plantas transformadas con pMON69909 tienen un aumento sustancial de tocoferol total y tocotrienol total, con los incrementos más grandes en delta-tocoferol, alfa-tocotrienol, delta-tocotrienol y gamma-tocotrienol. Algunas semillas de las plantas que alojan el vector pMON69909 mostraron una coloración oscura como resultado de la acumulación de ácido homogentísico, que se confirmó por análisis de LC/MS (véanse las figuras 31 Y 32). La expresión heteróloga de tyrA en semillas de plantas transgénicas de Arabidopsis produjo un aumento de 1.6 veces en el nivel de tocoferol en semilla en comparación con las líneas de control. Otra enzima clave esencial para la biosíntesis del tocoferol es HPT, que está involucrada en la condensación de fitil pirofosfato (PPP) y homogentisato (HGA) para producir 2-metil-6-fitilplastoquinol (2M6PPQ), un precursor en la síntesis de cuatro formas diferentes de tocoferoles. La sobreexpresión independiente de HPT Arabidopsis (ATPT2) y HPT synechocystis (slr1736) en semillas de A. thaliana transgénica, produjo un aumento de 1.6 veces de los tocoferoles en semilla. Se mostró que un transportador putativo de adenilato de A. thaliana (AANT1 ) expresado como un solo gen aumentó los niveles de tocoferol en semilla hasta 1.4 veces en A. thaüana. Para probar si una combinación de estos genes produciría un efecto sinérgico sobre la biosíntesis de tocoferol, se probaron varias combinaciones en A. thaliana. Las semillas de Arabidopsis T2 que alojan las construcciones del gen doble ATPT2 y tyrA (pMON69907), las construcciones del gen triple ATPT2, tyrA, y HPPD (pMON69909), las construcciones del gen triple ATPT2, tyrA y GGPPS (pMON69915 (figura 35)), y las construcciones del gen triple ATPT2, tyrA y AANT1 (pMON69919 (figura 36)), se analizaron para determinar el contenido y composición de tocoferol en semilla. El contenido total de tocoferol y tocotrienol en semilla aumentó hasta aproximadamente 2.4 veces en las líneas transformadas con pMON69907 (vector de gen doble) y hasta 5 veces en las líneas que llevan el vector de gen triple (pMON69909) (véanse las figuras 16 y 17). El HPPD expresado como un solo gen en A. thaliana resulta en un aumento escasamente detectable de los niveles de tocoferol. La combinación de HPPD con ATPT2 no produce un aumento mayor de los niveles de tocoferol en comparación con las líneas que alojan ATPT2 solo (datos no mostrados). En contraste, cuando se combinó HPPD con tyrA y ATPT2, los niveles de tocoferol o tocotrienol se duplicaron en comparación con la combinación de tyrA y ATPT2. Las semillas que alojan la construcción de gen triple pMON69909 aparecieron de un color mucho más oscuro que las semillas de control. Además, se sabe que las plantas dicotiledóneas de tipo silvestre no acumulan tocotrienoles. Sin embargo, las semillas de A. thaliana transgénica que alojan las cuatro construcciones acumulan niveles sustanciales de tocotrienoles (confirmado por HPLC y, para muestras seleccionadas, por LC-MS; véanse las figuras 31 , 32, 33 y 34). El contenido de tocoferol y tocotrienol en semillas que alojan la construcción de gen triple, pMON69909, consisten de 60% de tocotrienoles y 40% de tocoferoles. Cuando la disponibilidad de HGA endógeno es elevada por la sobreexpresión de las enzimas de la biosíntesis de HGA (tyrA y HPPD) junto con HPT, la HPT utilizaría geranilgeranil pirofosfato (GGPP) y HGA para producir tocotrienoles en lugar de tocoferoles bajo condiciones limitadas por la disponibilidad del nivel endógeno de geranilgeranil reductasa (GGH). La GGH funciona hidrogenando GGPP a PPP, un substrato para HPT en la síntesis del tocoferol. Por lo tanto, la mayor acumulación de tocotrienoles observada en las construcciones probadas puede ser superada por la sobreexpresión de GGH en combinación con tyrA, HPPD, y HPT.

EJEMPLO 11 Plantas transformadas con tyrA y otros genes de la biosíntesis de tocoferol Se transformaron plantas con las construcciones de ADN mostradas en los siguientes cuadros 2 y 3, empleando las técnicas descritas en el ejemplo 8. Las construcciones contienen uno o más genes bajo el control de un promotor de napin (Krindl y otros, Seed Sci. Res. 1 :209:219 (1991)), el promotor 7Sa' (Chen y otros, PNAS 83(22 ):8560-8564 (1998)) o el promotor ArcS (Goossens y otros, Plant Physio!. 120:1095-1 104 (1999)). Los productos de los genes pueden ser dirigidos al plástido por medio de un péptido codificado de dirección a plástido, tal como el CTP1 (Keegstra, Cell 56(2):247-53 (1989); Nawrath y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91 :12760- 12764 (1994)) o CTP2. Se usaron uno o más de los siguientes genes: un gen tyrA de E. herbicola (Xia y otros, J. Gen. Microbio!. 138:1309-13 6 (1992)), un gen slr1736 (en Cyanobase la Internet en: kazusa.orgjp/cyanobase), un gen ATPT2 (Smith y otros, Plant J. 11 : 83-92 ( 997)), un gen dxs de E. coli (Lois y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95 (5):2105-21 10 (1998)), un gen dxr (Takahashi y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95 (17), 9879-9884 (1998)), un gen HPPD (Norris y otros, Plant Physio!. 1 17:1317-1323 (1998)), un gen GGH (Keller y otros, Eur. J. Biochem. 251 :413-417 (1998)), un gen GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley y Scolnik, Plant Physiol. 104:1469-1470 (1994)), un gen AANT1 (Saint Guily y otros, Plant Physiol., 100(2): 1069-1071 (1992)), un gen MT1 (como arriba para el ejemplo 8), un gen TMT2 (como arriba para el ejemplo 8), un gen GMT (como arriba para el ejemplo 8, y WO 00/32757, WO 00/10380), un gen slr1737 (en Cyanobase en Internet en kazusa.orgjp/cyanobase), y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa (denotada como HGDAs) (Sato y otros, J. DNA Res. 7 (1 ):31-63 (2000)). Cada construcción se transformó por lo menos en una planta de cañóla, Brassica napus, Arabidopsis y soya. También se analizó la composición y nivel de tocoferol de cada planta usando el método descrito en el ejemplo 7. Ejemplos de plantas transformadas con tyrA y otros genes de la biosíntesis del tocoferol incluyen plantas de Arabidopsis transformadas con la serie de construcciones que se describen en el cuadro 2, y plantas de soya transformadas con las construcciones indicadas en el cuadro 3. Las plantas con las características deseadas se pueden someter a más cruzas para generar plantas transgénicas que tienen una o más de las siguientes combinaciones de genes introducidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. Alternativamente, las plantas se pueden cruzar para apilar múltiples copias de uno o más de los genes antes mencionados en una planta transgénica.

CUADRO 2 CUADRO 3 Se prepararon las siguientes combinaciones de gen y se probaron en Glycine max 1 p7S::CTP2::HPPD::E9 37p7S '::CTP1 ::TyrA::E9 3' 2 pArc5::ATPT2::Arc 37p7Sa'::CTP1 ::TyrA::E9 37pNapin::GGH::Napin3' 3 pArc5::ATPT2::Arc 37p7S::CTP1 ::TyrA::E9 37pNap¡n::GGH::Napin3'- /pNapin::CTP1 ::DXS::Napin 3' EJEMPLO 12 Construcción de vectores binarios de planta que alojan combinaciones de tyrA con otros genes de la síntesis del tocoferol Los componentes de cada cassette de expresión de gen incluyen un promotor, en este ejemplo el promotor de napin, un terminador, un péptido de dirección a plástido (que puede ser el péptido nativo de dirección a plástido o un péptido fusionado N-terminal de dirección a cloroplasto), y un gen de interés, como se muestra en las figuras 18a y 18b. Los cassettes de expresión pueden ser orientados de cabeza a cola, de cabeza a cabeza, o la orientación puede variar. La clonación se realizó usando cassettes de expresión flanqueados por sitios de restricción Bsp120 I y Not I. Se construyó un vector transportador (pMON36582, figura 19), apareando los iniciadores SV MCS A y SV MCS I B: Xma l Bsp120 l Eag Xba I EcoRI SV MCS 1A GATCT CCCGGG AA GGGCCC CGGCCG TCTAGA GAATTC Not I Ase I Age Iv GCGGCCGC GGCGCGCC ACCGGT (SEQ ID NO:9) Xma l Bsp120 l Eag Xba I EcoRI SV MCS 1 B TCGA ACCGGT GGCGCGCC GCGGCCGC GAATTC TCTAGA Not I Ase I Age I CGGCCG GGGCCC TT CCCGGG A (SEQ ID NO: 10) y ligándolos en pSP72 digerido con Bg1 II y Xho I y purificado en gel (Promega, www.promega.com). El vector resultante se designó como pMON36582 (figura 19). El vector se confirmó por secuenciación de ADN. Todos los cassettes de expresión de gen se dispusieron para ser flanqueados por sitios de restricción Not I. Estos cassettes se aislaron digiriendo los vectores anteriores con Not I, seguido por purificación en gel de los cassettes de expresión. Se digirió pMON36582 con Eag I, que corta dos veces en este vector, una vez dentro del sitio Not I, y una vez a 19 pb hacia el extremo 5' del sitio Not I. Ambos tramos salientes son compatibles con Not I. El cassette de expresión de Not I se ligó en pMON36582 digerido con Eag I purificado en gel, dando como resultado un vector con un solo sitio Not I. Por lo tanto, el cassette de expresión está disponible como un cassette Bsp120 I / Not I. Un ejemplo de un cassette de expresión para la homogentisato fitiltransferasa de Arabidopsis, disponible como un cassette Bsp120 I / Not I, se muestra como pMON36586 en la figura 20. Este vector se obtuvo como se describió arriba. El ensamble de cassettes de expresión se realiza en un vector transportador, tal como pMON36586. Los cassettes de expresión de gen se liberan de otros vectores transportadores por digestiones con Bsp 20 I / Not I, y se ligan en un vector transportador como pMON36586, que se ha digerido con Not I. El vector resultante aloja un cassette de expresión de gen adicional y un solo sitio Not I. Este procedimiento se puede repetir según se requiera. Al terminar el ensamble de genes, los cassettes de expresión combinados pueden ser liberados por digestión con Bsp120 I / Not I (pMON10098, figura 37). Después se purifica el fragmento resultante que lleva los cassettes de expresión y se liga en un sitio Not I único de un vector binario. Alternativamente, el ensamble de cassettes de expresión de gen puede ser realizado directamente en un vector binario (figura 21 ). Un vector binario está definido por la presencia de las secuencias de margen derecho e izquierdo, que son necesarias para la transferencia de ADN de Agrobacterium a células vegetales. Todos los reactivos químicos y enzimas de esta manipulación son de grado molecular. Estos reactivos y enzimas se utilizan de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se usan técnicas estándares de clonación molecular. Se representan varios ejemplos de construcciones binarias de planta, sus componentes y mapas plasmídicos. En las figuras 18a y 18b se dan los ejemplos representados que contienen combinaciones de tyrA con otros genes de interés para la ingeniería de la ruta del tocoferol. En el cuadro 4 se dan los componentes de estas construcciones. Los mapas de vector mostrados como figuras 22-27 representan varias construcciones.

CUADRO 4 Lista de vectores binarios ser transformados en Arabidopsis thaliana para dirigir la biosíntesis de tocoferol pMON # Combinación de genes Elementos genéticos 36596 HPPDAt/tyrA Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 36597 H P P D At/ty r A/G G H s vn Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos 77601 HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2 Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos 77602 HPPDAt/tyrA/GGHSVn/ATPT2 Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos 66657 HPPDAt rA/GGHsvn/slr1736 Napin 5' & Napin 3' CTP1&2 CTPs nativos 66659 HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/TMT2 Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/GGHsvn/ATPT2/MT1 Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/ATPT2/TMT2 Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/MT1 /DxS Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt tyrA/GGHAt/ATPT2/DxSE.Coi¡ Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/GGHAt/slr1736/MT1 /GGPPSAt Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/ATPT2/GGHAt/DxRAt Napin 5' & Napin 3' CTP1&2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/GGHAt/slr1736/C¡clasasvn/MT1 Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/GGHsvn/sIr1736/Ciclasasvn Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA slr1736/Ciclasasyn J Napin 5' & Napin 3' CTP1 &2 CTPs nativos HPPDAt/tyrA/GGHAt/ATPT2/GMTAt Napin 5' & Napin 3' CTP1&2 CTPs nativos EJEMPLO 13 Construcción de vectores que codifican múltiples enzimas Este ejemplo describe el uso de una prefenato deshidrogenasa (tyrA) tal como la tyrA de Erwinia herbicola, en combinación con otras enzimas clave en la ruta de la biosíntesis del tocoferol para aumentar la producción de tocoferol en semillas de plantas transgénicas, tales como las semillas de Arabidopsis thaliana. Las enzimas combinadas con tyrA incluyen ATPT2, p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa y geranilgeranilpirofosfato sintetasa (GGPPSArat,¡cioPsis) de Arabidopsis thaliana. Además, también se probó tyrA en combinación con ATPT2 y un transportador putativo de adenilato de Arabidopsis thaliana. La construcción de un vector de doble gen que aloja cassettes de expresión de tyrA y ATPT2 específica en semilla se hizo de la siguiente manera. Se sometió ADN plasmídico purificado de pMON36520 (figura 38) a una digestión parcial con Kpnl y se ligó con un fragmento Kpn I de 4.2 kpb purificado en gel, aislado de pMON43853 (figura 39). El inserto de 4.2 kb de pMON43853 contiene el cassette de expresión del gen PPT (pNapin::ATPT2::Napin 3'). El vector binario de planta resultante, pMON69907 (figura 12), se usó para la transformación de Arabidopsis thaliana para probar el efecto combinatorio de la expresión de tyrA y ATPT2 específica en semilla. Para aumentar más la biosíntesis de tocoferol, además de tyrA son expresadas la HPPD¿ra6/dopsís y la ATPT2 en semilla de Arabidopsis thaliana. Esto se logró añadiendo a pMON69907 un cassette de expresión específico de semilla para HPPD Arabidopsis, dando como resultado la formación de pMON69909. El vector binario pMON69909 se construyó digiriendo parcialmente pMON69907 con Kpnl. El pMON69907 con un corte único Kpnl se purificó en gel y se ligó con un inserto Kpnl/Kpnl de 4.6 kb aislado de pMON36525 (figura 40). El inserto Kpnl/Kpnl de 4.6 kb de pMON36525 contiene el cassette de expresión del gen de HPPD, pNapin::CTP2::HPPD¾raWiiops/s::Napin 3', para dirigir la expresión de HPPD dirigida a plástido especifica de semilla. El CTP2 es una señal de dirección a cloroplasto del gen de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) de Arabidopsis. El vector binario p ON699 5 (figura 35) se construyó para probar el efecto de las tres combinaciones de gen, tyrA, ATPT2, y GGPPSArabidopsis sobre la producción de tocoferol en semilla. El vector pMON69907 se digirió parcialmente con Kpnl. Se purificó en gel pMON69907 con un corte único de Kpnl y se ligó con un fragmento Kpnl/Kpnl de pMON43861 de 4.3 kb purificado en gel (figura 41) para crear pMON69915. El fragmento Kpnl de pMON43861 contiene el cassette de expresión para la geranilgeranildifosfato sintetasa de Arabidopsis thaliana (pNapin::GGPPS rawa^ste::Napin 3'). El ADNc de GGPPS se identificó como una clona EST, buscando en una base de datos EST con información de secuencia disponible en la literatura (Okada y otros, Plant Physiol. 122:1045- 1056 (2000)). La clona EST se digirió con Ncol y sus extremos se emparejaron rellenando el tramo saliente 5' con el fragmento Klenow. Subsiguientemente la clona se digirió con BamHI y para cortar el fragmento de ADNc. El fragmento de ADNc BamHI/emparejado purificado en gel se ligó con el vector pCGN7770 digerido con Bg1 ll/Sa1 l (y emparejado de extremos con Sa1 l) (figura 42) para crear pMON43861. El vector binario de planta pMON69919 (figura 36) se construyó para probar la expresión combinada de tyrA, ATPT2 y AANT1 ¿ra¿/c/ops/s sobre los niveles de tocoferol en semilla. Para generar este vector, pMON69907 se digirió parcialmente con Kpnl. El pMON69907 de corte único de Kpnl se purificó en gel y se ligó con un fragmento Kpnl/Kpnl de pMON6991 purificado en gel de 4.2 kb (figura 43). El fragmento de 4.3 kb contiene un cassette de expresión específico de semilla para el transportador de adenilato AANT1 de Arabidopsis (pNapin::AANT1¿ra,b/dops/s::napin 3'). El pMON6991 1 se generó cortando el fragmento AANTI de pCGN11301 (figura 44) con Salí y Pstl (el sitio Pstl se emparejó removiendo el tramo saliente 3' con Klenow), y después se ligó con pCGN7770 digerido con Sall/Xhol (emparejado de extremos con Xhol). Usando la secuencia parcial publicada de AANT1 (Saint-Guily y otros, Plant Physiol. 100(2):1069-1071 (1992)) se identificaron varias clonas de longitud completa en bases de datos EST. La región codificadora de AANT1 se amplificó por PCR usando los iniciadores, AANT1 F 5'-GGATCCGCGGCCGCACCATGGTTGATCAAGTTCAGCA (SEQ ID NO: 1 ), y AANT1 R 5'-G AG CTCCTGCAG G AAGCTT TL4G G CACCTCCTG ATCCGT-3' (SEQ ID NO: 12). El sitio oíl (subrayado) se colocó hacia 5' del codón de iniciación (itálica) en el iniciador AANT1 F, mientras que el sitio Sse8387l (subrayado) se puso hacia 3' del codón de iniciación (itálica) en AANT1 R. Los productos de PCR se clonaron primero en pCR2.1 y los insertos se verificaron por secuenciación de ambas cadenas. Subsiguientemente, los fragmentos A oíl/Sse83871 se insertaron en los sitios A/orl/Sse83871 del cassette de expresión de napin en pCGN9979, en orientación de sentido con respecto al promotor de napin para generar pCGN11301. Las construcciones de expresión en planta se usaron para transformar Arabidopsis thaliana por medio de transformación mediada por Agrobacterium como se describió arriba.

EJEMPLO 14 Expresión de vectores que codifican múltiples enzimas en plantas Usando la técnica de transformación dada en el ejemplo 8, se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con los vectores del ejemplo 13. Los resultados para pMON69909 se dan en las figuras 14, 15, 16, 17 y 31-34. Se dan más resultados en el siguiente cuadro y en las figuras 75 y 76, que muestran los niveles de tocoferol, tocotrienol, homogentisato y 2-metilfitilplastoquinol en plantas transformadas que tienen pMON69909.

EJEMPLO 15 Expresión de construcciones en soya Este ejemplo describe el método para preparar vectores binarios de planta para probar tyrA solo y en combinación con otras enzimas clave en la ruta de la biosíntesis de tocoferol, para aumentar la producción de tocoferol en semillas de Glycine ma transgénica. El siguiente cuadro describe los vectores binarios de planta preparados para transformar G. max, con sus respectivos cassettes de expresión del gen de interés para expresión específica en semilla de los transgenes.

Lista de construcciones para transformar G. max El pMON36575 (figura 46) se preparó ligando el fragmento Notl de 3 kb purificado en gel de pMON38207R (figura 47) en el sitio Notl de pMON36571 (figura 48), que contiene el cassette de expresión p7S '::CTP1 ::tyrA£ herb¡coia':E9 3'. La CTP1 codifica la secuencia de señal de dirección a cloroplasto de la subunidad pequeña de RUBISCO de Arabidopsis. El fragmento Notl de 3 kb contiene el cassette marcador seleccionare, pFMV::CTP2::CP4syn::E9 3'. La CTP2 codifica la secuencia de señal de dirección a cloroplasto de la 5-enolpiruvilshik¡mato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) de Arabidopsis. El CP4syn es un gen sintético de EPSPS. El vector pMON36575 se digirió adicionalmente con Hindlll para liberar un fragmento de 3 kb que contiene el cassette de expresión p7Sa'-::CTP1 ::tyrA£ erbicoia'- 9 3'. Los extremos del fragmento se emparejaron rellenando los tramos salientes 5' con el fragmento Kienow, se purificaron en gel y se ligaron en el sitio Pmel de pMON36576 (figura 49), que lleva el cassette de expresión de ?75a'::???2::? ?0 ?G3?0?5/5::?9 3\ para generar pMON69924 (figura 50). El vector binario de planta pMON69943 (figura 51 ) se preparó digiriendo con Notl pMON69929 (figura 52), que contiene el cassette de expresión p7Sa'::CTP2::HPPD¿rab;tfops/s::E9 3', y se ligó con un fragmento de 7.3 kb purificado en gel generado por la digestión de p ON69936 (figura 53) con Bsp120l y Notl. Este fragmento contiene los cassettes de expresión de p7Sa'::CTP1 ::tyrAE. herbi8ia--^Q 3' y pArcelin-5::CTP1 ::slr1736::Arcelin 3'. El vector pMON69943 se digirió adicionalmente con Notl y se ligó con un fragmento Bsp120l/Notl de pMON36592 de 4.5 kb purificado en gel (figura 54) para generar pMON69945 (figura 55). El fragmento de pMON36592 contiene el cassette de expresión de pNapin::GGH¿rafc,'cíops/s"nap¡n 3'. Se transformó Glycine max con los vectores descritos, de acuerdo con el procedimiento que se indica en WO 00/61771 A3 en las páginas 99-100.

EJEMPLO 16 Combinaciones de genes múltiples expresadas en cañóla Todos los cassettes de expresión de gen usados para expresión en cañóla se prepararon como cassettes Not I que contienen el promotor de napin, un gen de interés, y el terminador de napin. Los genes de interés se fusionaron N-terminalmente con un péptido de dirección a cloroplasto, a menos que estuviera presente un péptido natural de dirección a cloroplasto. Todas las combinaciones de genes se ensamblaron en un solo vector de genes múltiples.

Para facilitar la construcción de vectores de genes múltiples, los cassettes de expresión Notl se aislaron por digestión con Not I de pMON16602 (figura 56), pMON36525 (figura 57) y pMON36520 (figura 38), y se clonaron en pMON36582 (figura 19) digerido con Eag I y purificado en gel, dando como resultado la formación de pMON58171 (figura 58) (cassette de expresión de slr1736), pMON58172 (figura 59) (cassette de expresión de HPPDArab d0pS/s), y pMON58 70 (figura 60) (cassette de expresión de tyrAn. herbicoia)- Todos los cassettes de expresión resultantes se flanquearon con Bsp120 l y Not l. Se obtuvo un cassette de expresión manejado por napin para la GGH de Arabidopsis por aislamiento y purificación en gel de un fragmento Not I / Hind III de pMON36591 (figura 61 ) de 3191 pb y un fragmento Not I / Hind III de pMON36588 (figura 62) de 5612 pb. Estos dos fragmentos purificados se ligaron, dando como resultado la formación de pMON36592 (figura 63). El vector pMON36592 se digirió con Bsp120l y Not I, el cassette de expresión de GGH se purificó en gel y se ligó en pMON36582 (figura 19) digerido con Eag I y purificado en gel, dando como resultado la formación de pMON58182 (figura 64). Se obtuvieron vectores de genes múltiples combinando estos cuatro genes por medio de digestión de los vectores pMON58171 , pMON58172, pMON58170 y pMON58182 con Bsp120l y Not I, seguido por purificación en gel de los fragmentos más grandes de cada construcción. Estos fragmentos contienen los cassettes de expresión slr 736, HPPD, tyrA, y GGH, respectivamente- El cassette de expresión tyrA de pMON58170 se ligó en p ON58 71 digerido con Not I y tratado con fosfatasa alcalina, dando como resultado la formación del vector de doble gen pMON58176 (figura 65) que contiene cassettes de expresión de gen para tyrA y slr1736, respectivamente. Este vector se digirió nuevamente con Not I, se trató con fosfatasa alcalina y se ligó con el cassette de expresión HPPD de pMON58172. El vector de triple gen resultante pMON58183 (figura 66) contiene los cassettes de expresión HPPD, tyrA y slr1736. También, pMON58183 se digirió con Bsp120 I, se trató con fosfatasa alcalina y se ligó con el cassette de expresión GGH purificado en gel (véase la purificación arriba), dando como resultado la formación de pMON58185 (figura 67). El vector transportador pMON36593 (figura 68) (que contiene cassettes de expresión tyrA y HPPD) se preparó ligando un cassette de expresión tyrA de pMON36589 (figura 69) digerido con Bsp120l / Not I, purificado en gel, en pMON36590 (figura 70) digerido con Notl y tratado con fosfatasa alcalina. Los cassettes de expresión combinados se cortaron de PMON36593 (HPPD/tyrA), pMON58 83 (HPPD/tyrA/slr1736) y pMON58185 (HPPD, tyrA, slr1736, GGH) por digestión con Bsp120 I / Not I. Estos cassettes de expresión de gen combinados se purificaron en gel y se ligaron en pMON67162 (figura 71) digerido con Not I y tratado con fosfatasa alcalina, dando como resultado la formación de los vectores binarios pMON58178 (figura 72), pMON58186 (figura 73) y pMON58188 (figura 74), respectivamente. Estos últimos tres vectores binarios se usan para transformación de cañóla.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Valentín, Henry E. Mifcsky, Timothy A. <120> Genes TyrA y usos de los mismos <130> 16515.149 <140> Por asignar <141> 2002-05-03 <150> US 60/289,527 <151> 2001-05-09 <160> 12 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 1122 <212> ADN <213> Erwinia herbicola <400> 1 atggtggctg aactgaccgc gttacgcgat caaattgaca gtgtagataa agcgctgctg SO gatctgctgg ctaagcgact ggaactggtg gccgaggtag gtgaggtgaa gagccgttac 120 ggcctgccta tctatgtgcc tgagcgtgag gcgtcgatgc tggcttcgcg tcgcaaagag 180 gccgaagcgc tcggcgtacc accggatctg attgaggatg tgctgcgtcg cgtgatgcgg 240 gaatcctata ccagcgagaa tgataaaggc tttaaaaccc tctgtcctga actgcgcccg 300 gtggtgattg tcggtggtaa gggccagatg ggccggctgt ttgaaaaaat gctcgggcta 360 tcaggctaca cggttaaaac gctggataaa gaggactggc ctcaggctga gactctgctc 420 agcgatgccg gaatggtgat cattagcgtg ccgattcacc tgaccgagca ggtgattgcc 480 caactgccac cactgccgga agattgtatt ctggtcgatc tggcgtcagt caaaaaccgg 540 cctctgcagg caatgctggc tgcccataac gggcctgtac tgggtctgca tccgatgttt 600 ggcccggaca gcggcagcct ggcaaaacag gtggtggtct ggtgtgatgg aagacaaccg 660 gaagcgtatc agtggttcct ggagcagatt caggtctggg gtgcgcgtct gcatcgtatc 720 agcgctgttg agcatgacca gaacatggca ttcattcagg cgctgcgtca ctttgctacc 780 ttcgcttatg gtctgcattt agccgaagag aacgtcaatc tggatcagct gctggcgctc 840 tcgtcgccca tttaccggct tgaactggcg atggtggggc ggttgttcgc tcaggatccg 900 caactctatg cggatatcat catgtcttca gagagtaatc tggcgctgat aaaacgctat 960 taccagcggt ttggtgaagc gattgcgctg ctggagcagg gcgacaagca ggcgtttatc 1020 gccagcttta accgggttga acagtggttt ggcgatcacg caaaacgctt cctggtcgaa 1080 agccgaagcc tgttgcgatc ggccaatgac agccgcccat aa 1122 <210> 2 <211> 373 < 12> P T <213> Erwinia herbicola <400> 2 Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln lie Asp Ser Val Asp 1 5 10 15 Lys Ala Leu Leu Asp Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu 20 25 30 Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Tyr Gly Leu Pro lie Tyr Val Pro Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Lys Glu Ala Glu Ala Leu 50 55 60 Gly Val Pro Pro Asp Leu lie Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg 65 70 75 80 Glu Ser Tyr Thr Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro 85 90 95 Glu Leu Arg Pro Val Val lie Val Gly Gly Lys Gly Gln Met Gly Arg 100 105 110 Leu Phe Glu Lys Met Leu Gly Leu Ser Gly Tyr Thr Val Lys Thr Leu 115 120 125 Asp Lys Glu Asp Trp Pro Gln Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ala Gly 130 135 140 Met Val lie lie Ser Val Pro lie His Leu Thr Glu Gln Val lie Ala 145 150 155 160 Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Asp Cys lie Leu Val Asp Leu Ala Ser 165 170 175 Val Lys Asn Arg Pro Leu Gln Ala Met Leu Ala Ala His Asn Gly Pro 180 185 190 Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala 195 200 205 Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Gln Pro Glu Ala Tyr Gln 210 215 220 Trp Phe Leu Glu Gln lie Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg lie 225 230 235 240 Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe lie Gln Ala Leu Arg 245 250 255 His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val 260 265 270 Asn Leu Asp Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro lie Tyr Arg Leu Glu 275 280 285 Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala 290 295 300 Asp lie lie Met Ser Ser Glu Ser Asn Leu Ala Leu lie Lys Arg Tyr 305 310 315 320 Tyr Gln Arg Phe Gly Glu Ala lie Ala Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys 325 ' 330 335 Gln Ala Phe lie Ala Ser Phe Asn Arg Val Glu Gln Trp Phe Gly Asp 340 345 350 His Ala Lys Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg Ser Leu Leu Arg Ser Ala 355 360 365 Asn Asp Ser Arg Pro 370 <210> 3 <211> 1122 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 3 stSSttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120 ggactgccta tttatgttcc ggagcgagag gcatctatgt tggcctcgcg tcgtgcagag 180 gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240 gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacgc tttgtcctgc gttacgcccg 300 gtagttatcg ttggcggcgg cggtcagatg ggacgtctgt tcgagaagat gctgacactc 360 tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420 gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca 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Phe Gly Leu Pro lie Tyr Val Pro Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu 50 55 60 Gly Val Pro Pro Asp Leu lie Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg 65 70 75 80 Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro 85 90 95 Ala Leu Arg Pro Val Val lie Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg 100 105 110 Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg lie Leu 115 120 125 Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp lie Val Ala Asp Ala Gly 130 135 140 Met Val lie Val Ser Val Pro lie His Val Thr Glu Gln Val lie Gly 145 150 155 160 Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys lie Leu Val Asp Leu Ala Ser 165 170 175 Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Ala Ala His Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala 195 200 205 Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gln 210 215 220 Trp Phe Leu Glu Gln lie Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg lie 225 230 235 240 Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe lie Gln Ala Leu Arg 245 '250 255 His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val 260 265 270 Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro lie Tyr Arg Leu Glu 275 280 285 Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala 290 295 300 Asp lie lie Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu lie Lys Arg Tyr 305 310 315 320 Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala lie Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys 325 330 335 Gln Ala Phe lie Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu- His Trp Phe Gly Asp 340 345 350 Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Ser Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gln Ala 355 360 365 Asn Asp Asn Arg Gln 370 <210> 5 <211> 25 <212> ADW <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 5 actgccatgg tggctgaact gaccg 25 <210> 6 <211> 32 <212> ADU <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 6 actggaattc ttattatggg cggctgtcat tg 32 <210> 7 <211> 25 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 7 actgccatgg ttgctgaatt gaccg <210> 8 <211> 26 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 8 actggaattc ttattactgg cgattg <210> 9 <211> 59 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 9 gatctcccgg gaagggcccc ggccgtctag agaattcgcg gccgcggcgc gccaccggt <210> 10 <211> 59 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 10 tcgaaccggt ggcgcgccgc ggccgcgaat tctctagacg gccggggccc ttcccggga <210> 11 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 11 ggatccgcgg ccgcaccatg gttgatcaag ttcagca 37 <210> 12 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 12 gagctcctgc aggaagcttt taggcacctc ctgatccgt 39

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una molécula de ácido nucleico sustancialmente puro que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, o un fragmento de la misma de por lo menos 20 aminoácidos contiguos de dicha enzima. 2 - Una molécula de ácido nucleico sustancialmente puro que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, y fragmentos de las mismas de por lo menos 20 aminoácidos contiguos. 3.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poiiadeniiados en un extremo 3' de la molécula de ARNm. 4.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo codifica tyrA de Erwinia herbicoia o tyrA de Escherichia coli. 5 - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3. 6. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende un cassette de expresión que expresa fitil preniltransferasa. 7. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende un cassette de expresión que expresa hidroxifenilpiruvato deshidrogenasa. 8. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho fragmento codifica un polipéptido que tiene actividad de prefenato deshidrogenasa. 9.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende dos o más cassettes de expresión, cada uno de los cuales expresa un miembro seleccionado del grupo que consiste de slr1736, A TPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. 10. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica HPPD y cualquiera de slr1736 o A TPT2. 11. - Una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo con una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa. 12.- Una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo con una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4. 13.- Una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4, o fragmentos de las mismas de por lo menos 20 aminoácidos contiguos, y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de dicha molécula de ARNm. 14.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico exógeno comprende un cassette de expresión que expresa fitil preniltransferasa. 15. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende un cassette de expresión que expresa hidroxifenilpiruvato deshidrogenasa. 16. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende dos o más cassettes de expresión, cada uno de los cuales expresa un miembro del grupo que consiste de: slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. 7. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica HPPD y cualquiera de slr1736 o ,4 G??2. 18. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha planta se selecciona de! grupo que consiste de cañóla, maíz, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soya, col de abisinia, mostaza, ricino, cacahuate, ajonjolí, algodón, linaza, cártamo, palma de aceite, lino y girasol. 9. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha planta es soya. 20. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha planta es cañóla. 21. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha planta es Brassica napus. 22 - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocoferoi aumentados con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 23.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocoferoi aumentados por lo menos aproximadamente 25% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 24. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 250% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 25. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque exhibe niveles de tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 2500% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 26. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocotrienol aumentados con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 27.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 25% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 28.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 250% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 29. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 2500% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 30. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de a-tocoferol aumentados con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 31. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de a-tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 25% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 32. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de -tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 250% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 33. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de a-tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 2500% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 34. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de a-tocotrienol aumentados con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 35. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de a-tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 25% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 36. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de a-tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 250% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 37. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de -tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 2500% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 38. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocoferol aumentados con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 39 - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 25% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 40 - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 250% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 41. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocoferol aumentados por lo menos aproximadamente 2500% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 42. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocotrienol aumentados con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 43. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 25% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 44. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 250% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 45. - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque exhibe niveles de ?-tocotrienol aumentados por lo menos aproximadamente 2500% con respecto a una planta que tiene una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico exógeno. 46 - La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico comprende también una secuencia de dirección a plástido, en donde dicha secuencia de dirección a plástido está enlazada operativamente a dicha molécula de ácido nucleico exógeno para ocasionar que un transcrito de dicha molécula de ácido nucleico exógeno codifique adicionalmente una secuencia de péptido de dirección a plástido enlazada operativamente a dicha secuencia de aminoácidos. 47.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende un cassette de expresión que expresa fitil preniltransferasa. 48.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico comprende dicho cassette de expresión. 49.- La planta transformada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico codifica un fragmento de las SEQ ID NOs: 2 o 4, en donde dicho fragmento tiene actividad de prefenato deshidrogenasa. 50. - Una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterologo con una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y fragmentos de las mismas que comprenden por lo menos 20 aminoácidos contiguos. 51. - Un método para producir una planta que tiene niveles de íocoferol aumentados, que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una región de promotor, en donde dicha región de promotor está enlazada a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4; y (B) desarrollar dicha planta. 52. - El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha molécula de ácido nucleico también comprende un cassette de expresión que expresa fitil preniltransferasa. 53. - El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque dicha molécula de ácido nucleico también comprende un cassette de expresión que expresa hidroxifenilpiruvato deshidrogenasa. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha molécula de ácido nucleico también comprende dos o más cassettes de expresión, cada uno de los cuales expresa un miembro seleccionado del grupo que consiste de slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. 55. - El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha molécula de ácido nucleico comprende también una secuencia de ácido nucleico que codifica HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. 56. - El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha molécula de ácido nucleico está enlazada a una secuencia 3' no traducida que funciona en la planta para ocasionar la terminación de transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de una molécula de ARNm, y en donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico da como resultado la sobreexpresión de dicha proteína. 57. - El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 5 , caracterizado además porque dicha planta se selecciona del grupo que consiste de cañóla, maíz, Arabídopsis, Brassica campestrís, Brassica napus, soya, col de abisinia, mostaza, ricino, cacahuate, ajonjolí, algodón, linaza, cártamo, palma de aceite, lino y girasol. 58. - El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta es cañóla. 59. - El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta es soya. 60. - El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta es Brassica napus. 61. - El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta exhibe niveles de a-tocoferol aumentados con respecto a una planta con una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico. 62.- El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta exhibe niveles de ?-tocoferol aumentados con respecto a una planta con una base genética similar, pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico. 63.- El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta exhibe niveles de tocoferol aumentados con respecto a una planta con una base genética similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico. 64.- El método de producción de una planta de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicha planta exhibe niveles de tocotrienol aumentados con respecto a una planta con una base genética similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico. 65. - Un método para reducir los niveles de tocoferol en una planta, que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende como componentes enlazados operativamente una región de promotor exógeno que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una molécula de ARNm, una molécula de ácido nucleico heterólogo que tiene una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en donde dicha cadena transcrita es complementaria a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3; y en donde dicha molécula de ácido nucleico está ligada a una secuencia 3' no traducida que funciona en las células vegetales para ocasionar la terminación de transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la secuencia de ARNm; y (B) desarrollar dicha planta transformada. 66. - Un método para examinar los niveles aumentados de tocoferol en una planta, que comprende examinar ADN genómico buscando la presencia de una molécula marcadora que híbrida específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 y 3, y complementos de las mismas; y detectar la presencia o ausencia de dicho marcador. 67.- Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heterólogo, en donde dicha molécula de ácido nucleico heterólogo codifica una enzima con actividad de corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, o un fragmento de dicha molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos 20 aminoácidos contiguos. 68.- La célula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico también comprende un cassette de expresión que expresa fitil preniltransferasa. 69. - La célula de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico también comprende un cassette de expresión que expresa hidroxifenilpiruvato deshidrogenasa. 70. - La célula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico también comprende dos o más cassettes de expresión, cada uno de los cuales expresa un miembro del grupo que consiste de: slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MTI, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737, y una construcción de antisentido para ácido homogentísico dioxigenasa. 71.- La célula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica HPPD y cualquiera de slr1736 o ATPT2. 72.- La célula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque es una célula bacteriana. 73.- La célula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque es una célula de alga azul-verde. 74.- Aceite derivado de una semilla de una planta transformada que tiene una molécula de ácido nucleico que comprende, como componentes enlazados operativamente: (A) una región de promotor que funciona en una célula vegetal para ocasionar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2 y 4, y (C) una secuencia 3' no traducida que funciona en dicha célula vegetal para ocasionar la terminación de transcripción y la adición de ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la molécula de ARNm.