CN113174400A - 一种自动删除选择标记的转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种自动删除选择标记的转基因方法。构建包含选择标记的自动删除选择标记的转基因载体，转化至植物中获得愈伤组织；所述选择标记基因可以正常表达，加入细胞分裂素后，诱导选择标记基因自动删除；所述自动删除选择标记的转基因载体的DNA序列按照“载体骨架‑‑‑loxP‑‑‑Arr5‑‑‑Cre‑‑‑选择标记‑‑‑loxP‑‑‑载体骨架”排列。本发明的转基因载体包含Cre/loxP重组系统，且选择标记、Arr5启动子基因和Cre基因位于两个loxP位点之间，Arr5启动子可启动Cre重组酶表达，进而诱导loxP重组反应以将两个loxP位点间的DNA序列删除，由此实现选择标记基因的删除，为转基因植物的安全性提供一条可能的技术途径。

Description

一种自动删除选择标记的转基因方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种自动删除选择标记的转基因方法。

背景技术

转基因植物是指使用基因工程技术对其基因组进行了修饰的作物，以改善现有性状或引入外源的目标基因使其发生新性状。利用基因工程技术将目标基因导入到植物细胞时，通常在转化系统中使用抗生素抗性标记基因或除草剂抗性标记基因等作为选择标记基因，用于筛选转化细胞和组织。在选择压力下，不含选择标记基因及其产物的非转化细胞将死亡；转化细胞和组织则整合有选择标记基因而存在抗性，从而能够继续成活并分化成植株。用于筛选转化细胞和组织的选择标记基因虽然给转基因工作带来了很大的方便，但选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，在获得转基因植物之后，选择标记基因的存在对转基因植物和环境安全带来隐患，如选择标记基因及其产物在食用时可能有毒性或会引起过敏反应，尤其是人们担心抗生素抗性标记基因从转基因食品向动物和人肠道微生物水平转移的可能性，将可能导致肠道菌群产生抗生素抗性，从而引起抗生素失效。如何解决因选择标记基因所引起的转基因植物和食品的安全性问题，已成为当今基因工程技术研究中的重要课题。

当前解决抗性标记基因安全问题的策略有两种:一是选择非抗生素抗性基因等用生物安全标记基因作为选择标记；二是在转基因植物当代或其后代中剔除选择标记。虽然生物安全标记基因在能够克服植物转基因安全问题，但从长远看剔除选择标记基因可能才是解决植物转基因安全问题的最佳方法，因为剔除选择标记基因不仅可以解决转基因安全问题，而且可以利用同一选择标记连续进行多次转化选择，从而实现对农作物多个性状的改造，实现综合改良。

剔除选择标记基因主要有以下几种方法:共转化、转座子介导的再定位和同源重组技术。共转化技术是指将选择标记基因和目标基因插入两个质粒中，或者将选择标记基因和目标基因装配在质粒的两个不同T-DNA片段上，并且转化同时进行。T-DNA的插入是随机的，因此，标记基因和基因可以同时在同一细胞插入不同的染色体上，经过几代的遗传重组使两个基因分离，从而获得不带选择标记的转基因植物。利用共转化通过自交或杂交分离后代植物，需要进行有性杂交以将目标基因与标记基因分离，这限制了共转化在无性繁殖的具有较长繁殖时间的植物和物种中的应用；而且该方法转化效率低，工作量大，费时，限制了共转化系统在转基因植物中的应用。转座子介导的再定位技术是将转座子与目标基因或选择标记基因的连接，在转座子移动期间，将目标基因与标记基因分离，并且通过仅包含目标基因的转基因植物的遗传分离获得无选择标记基因的转基因植物。但是该方法不能实现多基因聚合，而且也不适合农作物的无性繁殖。另外，大多数植物中存在大量效率不同的转座子，转座子的不精确和费时的去除以及后代的突变导致转座子的效率不尽人意，也限制了转座子介导的再定位技术的应用。同源重组技术是指在没有外源重组酶的前提下，在两个具有重组结合位点的同源序列之间构建待删除的基因，植物染色体上的同源重组系统可以将其中被删除的基因转化为同源序列，序列的结构可能会刺激基因重组，或者这种结构很容易导致DNA双链断裂，导致基因重组。染色体内同源重组技术的优点是不需要引入外源重组酶就能在植物基因组中表达，不需要有性繁殖就能获得只含有目的基因的植物。然而，同源重组的频率较低，限制了该技术的应用。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种自动删除选择标记的转基因方法。

本发明的目的一在于提供一种自动删除选择标记的转基因方法。

构建包含选择标记的自动删除选择标记的转基因载体，转化至植物中获得愈伤组织；所述选择标记基因可以正常表达，加入细胞分裂素后，诱导选择标记基因自动删除。

进一步地，所述动删除选择标记的转基因方法包括如下步骤：

S1、构建包含Cre-loxP系统、Arr5诱导启动系统和选择标记的自动删除选择标记的转基因载体，转化至植物中获得具有抗性的愈伤组织；

S2、加入细胞分裂素诱导所述愈伤组织中Cre基因表达，从而获得自动删除选择标记的转基因植株。

进一步地，所述自动删除选择标记的转基因载体的DNA序列按照“载体骨架---loxP---Arr5---Cre---选择标记---loxP---载体骨架”排列。

本发明利用Cre/loxP系统具有的特异重组特性，与细胞分裂素诱导启动子Arr5基因连锁，Arr5启动子能够在细胞分裂素存在的情况下高效表达，在缺失细胞分裂素的情况下不表达，用该启动子启动Cre基因表达产生CRE酶，就可以巧妙地实现在筛选的时候CRE酶不表达，选择标记基因与正常情况下一样起作用，当进展到阳性愈伤组织分化阶段，此时不再需要进行筛选，因为细胞分裂素的存在，启动Cre基因高效表达CRE酶，进而引起loxP的重组，诱导处于loxP位点之间的选择标记基因和Arr5-Cre融合基因的剔除，仅保留目标基因表达元件，得到无选择标记的转基因植物，为转基因植物的安全性提供一条可能的技术途径。

进一步地，所述Arr5基因的序列长度为2196bp，所述Arr5基因的序列参见SEQ IDNO:1。

进一步地，所述选择标记为抗生素抗性基因或除草剂类抗性基因。

可选地，所述抗生素抗性基因包括但不限于潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、青霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因或红霉素抗性基因。所述除草剂类抗性基因包括但不限于bar(草丁膦-N-乙酰转移酶)基因、epsps(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)基因

本发明的目的二在于提供上述所述的自动删除选择标记的转基因载体的构建方法。

所述自动删除选择标记的转基因载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、构建包括接受载体A(pBWA)和供给载体B1(pBWD(a))、供给载体B2(pBWD(b))的载体系统；所述载体系统的构建方法参见中国专利CN103215296B，专利名称为：一种多片段DNA分子组装方法及应用；

S2、将loxP基因、Arr5基因与Cre基因、Hyg基因和Loxp基因分别依次克隆进供给载体B1和供给载体B2，构建供给载体pBWD(a)-loxP、pBWD(b)12B-Cre、pBWD(a)C-Hyg和pBWD(b)-loxP；即，将loxP基因克隆进供给载体B1中，得到供给载体pBWD(a)-loxP；将Arr5基因与Cre基因先后克隆进供给载体B2中，得到供给载体pBWD(b)12B-Cre；将Hyg基因克隆进供给载体B1中，得到供给载体pBWD(a)C-Hyg；将Loxp基因克隆进供给载体B2中，得到供给载体pBWD(b)-loxP；

S3、用核酸内切酶EN1酶切接受载体A和酶切供给载体pBWD(a)-loxP，通过组装反应将loxP基因装配到接受载体A中，得到接受载体pBWALP，然后采用核酸内切酶EN2酶切接受载体pBWALP和酶切供给载体pBWD(b)12B-Cre，通过组装反应将Cre基因到装配到接受载体pBWALP中，得到接受载体pBWALP-Cre，接着采用核酸内切酶EN1酶切接受载体pBWALP-Cre和酶切供给载体pBWD(a)C-Hyg，通过组装反应将Hyg基因到装配到接受载体pBWALP-Cre中，得到接受载体pBWALPHC，之后采用核酸内切酶EN2酶切接受载体pBWALPHC和酶切供给载体pBWD(b)-loxP，通过组装反应将loxP基因装配到接受载体pBWALPHC中，得到目标载体，命名为：pBWARE(Ⅰ)。

组装反应过程简述如下：

pBWA+pBWD(a)-loxP→pBWALP；

pBWALP+pBWD(b)12B-Cre→pBWALP-Cre；

pBWALP-Cre+pBWD(a)C-Hyg→pBWALPHC；

pBWALPHC+pBWD(b)-loxP→pBWARE(Ⅰ)。

本发明的连续组装的原理为：首先用EN1酶切接受载体pBWA和供给载体pBWD(a)-loxP，获得线性化pBWA和目标片段loxP，线性化pBWA的切口两端的序列和目标片段loxP的切口两端的序列完全互补，然后用DNA连接酶可以将pBWA载体骨架和目标片段loxP连接在一起，得到接受载体pBWALP，同时将EN2酶切位点带入到pBWALP上，同理通过EN2线性化载体pBWALP和获得目标片段Arr5-Cre融合基因，线性化的pBWALP与目标片段Arr5-Cre融合基因的粘末端完全互补，通过酶连即可将Arr5-Cre融合基因整合进接受载体pBWALP中，得到pBWALP-Cre，同时将EN1酶切位点带入到pBWALP-Cre上，循环上述过程，即可实现将2个loxP基因、Arr5基因与Cre基因以及Hyg基因在接受载体pBWA上实现无缝组装，得到DNA序列按照：“载体骨架---loxP---Arr5---Cre---选择标记---loxP---载体骨架”排列的转基因载体，

进一步地，所述组装反应为酶连反应，所述酶连反应采用T4 DNA连接酶。

进一步地，所述核酸内切酶EN1和所述核酸内切酶EN2不同。且可选地，所述核酸内切酶EN1和所述核酸内切酶EN2为BsmBI限制性内切酶、SapI限制性内切酶和BsaI限制性内切酶中任一种。例如：所述核酸内切酶EN1为BsmBI限制性内切酶，所述核酸内切酶EN2为SapI限制性内切酶；或者，所述核酸内切酶EN1为SapI限制性内切酶，所述核酸内切酶EN2为BsmBI限制性内切酶；或者所述核酸内切酶EN1为BsaI限制性内切酶，所述核酸内切酶EN2为SapI限制性内切酶。

本发明的目的三在于提供上述所述的自动删除选择标记的转基因载体在制备转基因植物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明的转基因载体包含Cre/loxP重组系统，选择标记、Arr5启动子基因和Cre基因位于两个loxP位点之间，Arr5启动子可启动Cre重组酶表达，进而诱导loxP重组反应以将两个loxP位点间的序列删除，由此实现选择标记基因的删除。将本发明的转基因载体通过根癌农杆菌介导法导入水稻基因组中，基于Cre/loxP重组系统和受细胞分裂素诱导的Arr5启动子结合形成融合蛋白，通过调节重组酶在细胞内的表达实现在特定条件下删除1oxP位点之间的选择标记基因，从而为转基因植物的安全性提供一条可能的技术途径。

2)采用本发明的转基因载体能运用于无性繁殖的植物中，并精确的控制选择标记基因的切除时间，不依赖表型而进行筛选。

3)在诱导愈伤组织分化时本身就需要细胞分裂素的诱导，在二筛阶段加入细胞分裂素筛选出的抗性愈伤组织即为无选择标记的转基因愈伤组织，不会给转基因操作带来任何的多余步骤，方便简单。相比物理诱导和酒精、雌二醇等化学诱导更加安全，不对植物造成伤害，方法更可靠有效。

附图说明

图1为本发明实施例的pBWARE(Ⅰ)载体构建的流程图；

图2为本发明实施例1中Arr5启动子载体图谱；

图3为本发明实施例1的Arr5-gus转基因染色分析图，其中，图A为阴性株系；图B为无关的其他株系；图C-F为不同的阳性株系(包含有pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体)；

图4为本发明实施例1的含有不同长度的arr5启动子分析载体的转基因水稻染色分析图，其中，图A为pBWA(V)HG-rr5pro1K+，图B为pBWA(V)HG-rr5pro0.5K+；

图5为本发明实施例2中pBWD(a)的载体骨架图；

图6为本发明实施例2中pBWD(a)-loxP的载体骨架图；

图7为本发明实施例2中pBWD(b)的载体骨架图；

图8为本发明实施例2中pBWD(b)12B的载体骨架图；

图9为本发明实施例2中pBWD(b)12B-cre的载体骨架图；

图10为本发明实施例2中pBWD(a)C-Hyg的载体骨架图；

图11为本发明实施例2中pBWD(b)-loxP的载体骨架图；

图12为本发明实施例2中pBWA的载体图谱；

图13为本发明实施例2中pBWARE(Ⅰ)的载体图谱；

图14为本发明实施例3中水稻转基因实验流程图；

图15为本发明实施例3中loxp扩增产物分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 Arr5启动子序列的优化

在拟南芥中，Arr5启动子的表达可由细胞分裂素诱导，但在其他物种中的活性未知，本实施例从拟南芥基因组中获得Arr5启动子基因序列(Arr5基因)，之后将该基因序列连入启动子活性分析载体转化水稻中研究其活性。

为了验证Arr5启动子活性与长度的关系，并最终找到一个能够有效发挥作用并且序列最短的启动子序列，本实施例中，分别扩增3段长度不同的Arr5基因序列，长度分别为2k+bp(2196bp，具体序列见SEQ ID NO:1)、1k+bp(997bp，为SEQ ID NO:1中第607位点到第1603位点长度的序列)、0.5k+bp(517bp，为SEQ ID NO:1中第1位点到第517位点长度的序列)，然后将3段Arr5基因分别连入启动子活性分析载体中，分别命名为pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D、pBWA(V)HG-rr5pro1K+、pBWA(V)HG-rr5pro0.5K+，其中，pBWA(V)HG载体购自武汉伯远生物科技有限公司，pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体图谱见图2。

1、pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体的构建

构建pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D的引物为：

1)aRR5U引物

aRR5U-F：cagtGGTCTCatagagtctaaaatgtatttgacaa(SEQ ID NO:3)

aRR5U-R：cgatGGTCTCagtctcggtttttacctctca(SEQ ID NO:4)

2)aRR5D引物

aRR5D-F：cagtGGTCTCaagacattaggattattctttatag(SEQ ID NO:5)

aRR5D-R：cagtGGTCTCagttgatcaagaagagtaggatcgt(SEQ ID NO:6)

采用拟南芥基因组DNA作为模板，PCR扩增长度为2k+bp的Arr5基因序列，PCR反应体系如表1所示。

表1 pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体构建的PCR反应体系

PCR程序为：94℃变形5min，30×(94℃30s，50℃45s，72℃60s)，72℃延伸10min，16℃退火30min。将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小为606bp、1590bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，然后将回收的Arr5基因片段和载体pBWA(V)HG-ccdB通过T4DNA连接酶连接，酶连反应体系如表2所示。

表2 pBWA(V)HG-ccdB和Arr5基因的酶连反应体系

酶连反应程序为：37℃20min，5×(37℃10min，20℃10min)，37℃20min，80℃5min。反应完成后，得到连接产物，之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，挑取培养后的单克隆提取质粒送于擎科生物技术生物公司进行测序，测序结果正确的质粒命名为pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D，其环状质粒图谱见图2。

2、pBWA(V)HG-rr5pro1K+载体的构建

构建pBWA(V)HG-rr5pro1K+的引物为：

rr5pro1K引物

rr5pro1K-F：cagtGGTCTCatagagatgcgtgttgctaaatatgtga(SEQ ID NO:7)

rr5pro1K-R：cagtGGTCTCagttgatcaagaagagtaggatcgtgac(SEQ ID NO:8)

用pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D作为模板，PCR扩增长度为1k+bp的Arr5基因序列，PCR反应体系和程序同pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体的构建。

将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小为997bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，其余操作同pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体的构建，将测序结果正确的质粒命名为pBWA(V)HG-rr5pro1K+。

3、pBWA(V)HG-rr5pro0.5K+载体的构建

构建BWA(V)HG-rr5pro0.5K+的引物为：

rr5pro0.5K引物

rr5pro0.5K-F：cagtGGTCTCatagatcttgaaaaatgggaaaatcaag(SEQ ID NO:9)

rr5pro0.5K-R：cagtGGTCTCagttgatcaagaagagtaggatcgtgac(SEQ ID NO:10)

采用pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D+作为模板，此载体片段的3’端与rr5pro1K的3’端序列相同，所以共用一个反向引物扩增，PCR扩增长度为0.5k+bp的Arr5基因序列，PCR反应体系和程序同pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体的构建。

将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小为517bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，其余操作同pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体的构建，将测序结果正确的质粒命名为pBWA(V)HG-rr5pro0.5K+。

4、Arr5启动子活性分析

将含有不同长度片段的Arr5启动子片段的分析载体pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D、pBWA(V)HG-rr5pro1K+、pBWA(V)HG-rr5pro0.5K+分别通过农杆菌介导法转入到水稻中。用已报道的GUS(β-D葡糖醛酸酶)组织化学染色法进行染色，取组织新鲜样品浸渍于GUS染色液中，于37℃下保温适当时间至样品变蓝，染色结束后将根用透明剂(60mL H2O，160g水合氯醛，20mL甘油)处理后，用尼康Eclipse Ti倒置显微镜观察染色结果并记录，用75％乙醇进行脱色处理后用尼康SMZ1000立体显微镜观察染色结果并拍照，GUS染色液包括1mM 5-溴-4-氯-3-二甲苯-bD-葡萄糖醛酸(X-gluc)、100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)、10mM Na2EDTA、1mM铁氰化钾、1mM亚铁氰化钾、20％(v/v)甲醇、0.5％(v/v)Triton X-100。

对愈伤组织进行染色，结果见图3，其中，图A为阴性株系；图B为无关的其他株系；图C-F为不同的阳性株系(包含有pBWA(V)HG-aRR5U-aRR5D载体)。由图3可知，阴性对照无蓝色反应，含有arr5启动子-gus转基因载体的C-F均有蓝色反应，说明Arr5启动子确实可以通过细胞分裂素诱导在愈伤组织阶段启动表达。

对含有不同长度的arr5启动子分析载体的转基因水稻进行比较，一筛阶段的5天、12天、18天以及二筛阶段(二筛阶段和分化阶段均添加细胞分裂素6-BA)结束分别进行GUS染色并拍照记录，结果见图4。图4中，图A表示含有pBWA(V)HG-rr5pro1K+的转基因水稻，图B表示含有pBWA(V)HG-rr5pro0.5K+的转基因水稻。由图4中可以看出，0.5k+长度的arr5启动子的载体，在一筛阶段并无颜色变化，直到二筛阶段结束才微有颜色变化，说启动子活性较低，而Arr5启动子的长度保留2k+时，颜色变化最为明显，启动子活性最高，后续实验采用2k+长度的Arr5启动子元件转入转基因表达载体。

实施例2一种自动删除选择标记的转基因载体及其构建

一种自动删除选择标记的转基因载体的DNA序列按照“载体骨架---loxP---Arr5---Cre---选择标记---loxP---载体骨架”排列，其具体序列见SEQ ID NO:2。本实施例中，采用潮霉素抗性基因作为选择标记基因。

参见图1，所述自动删除选择标记的转基因载体构建方法，包括以下步骤：

S1、构建包括接受载体A(pBWA)和供给载体B1(pBWD(a))、供给载体B2(pBWD(b))的载体系统，所述载体系统的构建方法参见中国专利CN103215296B，专利名称为：一种多片段DNA分子组装方法及应用；本发明不再赘述。

S2、将loxP基因、Arr5基因与Cre基因、Hyg基因和Loxp基因分别依次克隆进供给载体B1和供给载体B2，构建供给载体pBWD(a)-loxP、pBWD(b)12B-Cre、pBWD(a)C-Hyg和pBWD(b)-loxP；

S21、供给载体pBWD(a)-loxP的构建

以供给载体pBWD(a)为基础骨架，在pBWD(a)中加入loxp位点，pBWD(a)的载体骨架图谱见图5，图中，LP：Cre loxP重组位点，1L：Cre loxP重组突变位点1L，LACmcs：多克隆位点，2R：Cre loxP重组突变位点2R，I：I-Scel归巢内切酶，CL：氯霉素抗性基因；322ori：来源于质粒pBR322的复制起始位点，用于在大肠杆菌中复制，322bom：来源于质粒pBR322的复制动员位点(basis of mobility)，LaxZ：LaxZ阅读框。

在目的基因loxP片段(该片段是现有技术中已知序列片段，由武汉伯远生物科技有限公司提供)的两端加入BbsI限制性内切酶的识别位点以及粘性末端，得到LOXP引物如下：

LOXP-F：cagtGGTCTCatagacatattcaataacccttaat(SEQ ID NO:11)

LOXP-R：cagtGGTCTCacgactaaactcctcttcagaccta(SEQ ID NO:12)

采用目的基因loxP片段作为模板，PCR扩增loxP基因序列，PCR反应体系如表3所示。

表3 pBWD(a)-loxP载体构建的PCR反应体系

PCR程序为：94℃变性5min，30×(94℃30s，50℃45s，72℃4s)，72℃延伸10min，16℃退火30min。将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小为74bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，然后将回收的loxP目的片段和接受载体pBWD(a)通过T4 DNA连接酶连接，酶连反应体系如表4所示。

表4 pBWD(a)和loxP基因的酶连反应体系

酶连反应程序为：37℃20min，5×(37℃10min，20℃10min)，37℃20min，80℃5min。反应完成后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，并涂chlR抗性平板，挑取培养后的单克隆提取质粒送于擎科生物技术生物公司进行测序，测序结果正确的质粒命名为供给载体pBWD(a)-loxP，其载体骨架图谱见图6。

S22、供给载体pBWD(b)12B-Cre的构建

在供给载体pBWD(b)上组装arr5启动子，Ta3终止子构成pBWD(b)12B中间载体，pBWD(b)的载体骨架图谱见图7，图中，LaxZ：LaxZ阅读框，322bom：来源于质粒pBR322的复制动员位点(basis of mobility)，322ori：来源于质粒pBR322的复制起始位点，用于在大肠杆菌中复制，AMPr：氨苄青霉素抗性基因，1R：Cre loxP重组突变位点1R，lbc mcs：多克隆位点，2L：Cre loxP重组突变位点2L，LP：Cre loxP重组位点。

合成如下2对引物：

1)arr5引物

arr5-F：cagtCGTCTCatagagtctaaaatgtatttgacaaaaaaaaaagt(SEQ ID NO:13)

arr5-R：cgatCGTCTCaattccttttggtctctgttgatcaagaagagtaggatcgtg(SEQ IDNO:14)

2)ta3引物

ta3-F：cagtCGTCTCagaatttaggtctcatgtatctgacgtccgtatcatcggtttcgaca(SEQID NO:15)

ta3-R：cagtCGTCTCacgacctaaaaagcctatactgtacttaacttgat(SEQ ID NO:16)

采用Arr5基因片段(SEQ ID NO:1)、Ta3基因片段(该片段是现有技术中已知序列片段，由武汉伯远生物科技有限公司提供)作为模板，PCR扩增Arr5基因序列和ta3基因序列，PCR反应体系同上述供给载体pBWD(a)-loxP的构建。

PCR程序为：94℃变性5min，30×(94℃30s，50℃45s，72℃81s)，72℃延伸10min，16℃退火30min。将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，分别切取目的大小为2196bp、477bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，然后将回收的Arr5与ta3目的片段和接受载体pBWD(b)分别进行酶切反应，酶切反应体系如表5所示。

表5酶切反应体系

上述体系在37℃的条件下反应1h，即可完成酶切反应。

酶切之后通过T4 DNA连接酶连接，酶连反应体系如表6所示。

表6酶连反应体系

上述体系在20℃的条件下反应1h，即可完成酶连反应。

反应完成后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，并涂ampR抗性平板，挑取培养后的单克隆提取质粒送于擎科生物技术生物公司进行测序，测序结果正确的质粒命名为供给载体pBWD(b)12B，其载体骨架图谱见图8。

在供给载体pBWD(b)12B上组装cre重组酶位点构成pBWD(b)12B-cre供给载体，合成如下1对引物：

cre-F：cagtGGTCTCacaacatgtctaatcttcttactgt(SEQ ID NO:17)

cre-R：cagtGGTCTCatacactacaccttcctcttcttct(SEQ ID NO:18)

采用cre基因片段(该片段是现有技术中已知序列片段，由武汉伯远生物科技有限公司提供)作为模板，PCR扩增cre基因序列，PCR反应体系同上述供给载体pBWD(a)-loxP的构建。

PCR程序为：94℃变性5min，30×(94℃30s，50℃45s，72℃63s)，72℃延伸10min，16℃退火30min。将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小为1053bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，然后将回收的cre目的片段和供给载体pBWD(b)12B通过T4 DNA连接酶连接，酶连反应体系如表7所示。

表7 pBWD(b)12B和cre基因的酶连反应体系

酶连反应程序为：37℃20min，5×(37℃10min，20℃10min)，37℃20min，80℃5min。反应完成后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，并涂ampR抗性平板，挑取培养后的单克隆提取质粒送于擎科生物技术生物公司进行测序，测序结果正确的质粒命名为供给载体pBWD(b)12B-cre，其载体骨架图谱见图9。

S23、供给载体pBWD(a)C-Hyg的构建

pBWD(a)C-Hyg载体是先分段克隆后进行拼接的，具体步骤如下：合成2对引物：

1)35s-hyg-Tnos引物

35s-hyg-Tnos-F：cagtGGTCTCatagactgaattaacgccgaattaa(SEQ ID NO:19)

35s-hyg-Tnos-R：cgatGGTCTCaacgacactctcgtctactcc(SEQ ID NO:20)

2)35s引物

35s-F：cagtGGTCTCatcgtgctccaccatgttatcacat(SEQ ID NO:21)

35s-R：cagtGGTCTCacgacacgacactctcgtctactcc(SEQ ID NO:22)

采用Hyg基因片段(该片段是现有技术中已知序列片段，由武汉伯远生物科技有限公司提供)作为模板，PCR扩增Hyg基因序列，PCR反应体系如表8所示。

表8 pBWD(a)C-Hyg载体构建的PCR反应体系

PCR程序为：94℃变形5min，30×(94℃30s，50℃45s，72℃62s)，72℃延伸10min，16℃退火30min。将PCR得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小为327bp、1746bp的电泳片段进行溶胶回收、纯化，然后将回收的Hyg基因片段和载体pBWD(a)C通过T4 DNA连接酶连接，酶连反应体系如表9所示。

表9 pBWD(a)C和Hyg基因的酶连反应体系

酶连反应程序为：37℃20min，5×(37℃10min，20℃10min)，37℃20min，80℃5min。反应完成后，得到连接产物，之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，挑取培养后的单克隆提取质粒送于擎科生物技术生物公司进行测序，测序结果正确的质粒命名为pBWD(a)C-Hyg，其载体骨架图谱见图10。

S24、供给载体pBWD(b)-loxP构建

在供给载体pBWD(b)上加入loxp位点，得到供给载体pBWD(b)-loxP。

构建所需要的引物、PCR扩增体系、酶切连接体系同步骤S21供给载体pBWD(a)-loxP的构建一样，不同之处在于：

反应完成后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，并涂ampR抗性平板，挑取培养后的单克隆提取质粒送于擎科生物技术生物公司进行测序，测序结果正确的质粒命名为供给载体pBWD(b)-loxP，其载体骨架图谱见图11。

S3、多轮构建得到自动删除选择标记的转基因载体：通过组装反应将loxP基因装配到接受载体A中，得到接受载体pBWALP；然后采用核酸内切酶EN2酶切接受载体pBWALP和酶切供给载体pBWD(b)12B-Cre，通过组装反应将Cre基因到装配到接受载体pBWALP中，得到接受载体pBWALP-Cre；接着采用核酸内切酶EN1酶切接受载体pBWALP-Cre和酶切供给载体pBWD(a)C-Hyg，通过组装反应将Hyg基因到装配到接受载体pBWALP-Cre中，得到接受载体pBWALPHC，之后采用核酸内切酶EN2酶切接受载体pBWALPHC和酶切供给载体pBWD(b)-loxP，通过组装反应将loxP基因装配到接受载体pBWALPHC中，得到自动删除选择标记的转基因载体pBWARE(Ⅰ)。

第一轮：接受载体pBWALP的构建

用BsmbI限制性内切酶酶切接受载体A(pBWA)(其载体图谱见图12)和酶切供给载体pBWD(a)-loxP，pBWA和pBWD(a)-loxP的摩尔比为1:1，酶切连接反应体系如表10所示：

表10接受载体pBWA和供给载体pBWD(a)-loxP的酶切连接反应体系

反应条件为：Step1：37℃2h，Step2：37℃10min，Step3：80℃5min。

反应完成后，取5μL反应体系转化到E.coli DH5α超级感受态中，由于接受载体pBWA的抗性为卡那霉素，采用涂有卡那霉素的抗性平皿过夜培养，之后挑取单克隆用限制性内切酶ECORV酶切检测，得到相应的条带为阳性，即得到接受载体pBWALP。

第二轮：pBWALP-Cre的构建

用SapI限制性内切酶酶切接受载体pBWALP和酶切供给载体pBWD(b)12B-Cre，pBWALP和pBWD(b)12B-Cre的摩尔比为1:1，酶切连接反应体系如表11所示：

表11接受载体pBWALP和供给载体pBWD(b)12B-Cre的酶切连接反应体系

反应条件为：Step1：37℃2h，Step2：37℃10min，Step3：80℃5min。

反应完成后，取5uL反应体系转化到E.coli DH5α超级感受态中，采用涂有卡那霉素的抗性平皿过夜培养，之后挑取单克隆用限制性内切酶ECORV酶切检测，得到相应的条带为阳性，即得到接受载体pBWALP-Cre。

第三轮：接受载体pBWALPHC的构建

构建方法同第一轮反应，区别在于采用pBWALP-Cre替换pBWA，采用pBWD(a)C-Hyg替换pBWD(a)-loxP，构建得到pBWALPHC载体。

第四轮：pBWARE(Ⅰ)的构建

构建方法同第二轮反应，区别在于采用pBWALPHC替换pBWALP，采用pBWD(b)-loxP替换pBWD(b)12B-Cre，构建得到的pBWARE(Ⅰ)的载体图谱见图13，具体序列见SEQ ID NO:2。

将最终目标载体pBWARE(Ⅰ)，送于擎科生物技术生物公司进行测序，验证是否构建成功，测序结果复合预期，表明成功构建pBWARE(Ⅰ)。

实施例3自动删除选择标记的转基因载体应用于水稻转基因实验

将实施例2中构建好的pBWARE(Ⅰ)载体通过农杆菌介导转化至水稻M294，具体的实验过程如图14所示：

成熟水稻胚去壳之后，经过一系列的处理，加入到愈伤组织培养基(N6macro+B5micro+B5vit+2,4-D 2mg/L+CH 300mg/L+L-proline 500mg/L+L-glutamine 500mg/L+sucrose 30g/L+agar 7.5g/L pH5.8)中进行培养形成愈伤组织，之后加入含有pBWARE(Ⅰ)载体的农杆菌侵染所述愈伤组织，转移到筛选培养基(N6macro+B5micro+B5vit+2,4-D2mg/L+CH 300mg/L+L-proline 500mg/L+L-glutamine 500mg/L+sucrose30g/L+agar7.5g/L+Hm 50mg/L+ceph 250mg/L pH5.8)中，进行两次抗性筛选，获得抗潮霉素以及kana的转基因愈伤组织，将上述抗潮霉素以及kana的转基因愈伤组织转移到分化培养(添加细胞分裂素6-BA,KT等)中进行培养，最后生根，获得转基因水稻。

需要说明的是，具体的遗传转化的操作是现有技术，在此不做赘述。

提取获得的转基因水稻的DNA，采用转基因自动删除载体上的四个元件部分序列进行验证，分别是Arr5启动子，Cre酶，两个loxp位点区间，kana目的基因序列；其中，切除标签植株含：loxp，kana；嵌合体含：Arr5，Cre，loxp，kana；或含有Arr5，Cre，kana；

采用引物设计软件，分别设计Arr5启动子基因扩增引物序列、Cre基因的扩增引物、Loxp基因的扩增引物和kana基因的扩增引物，选取T0代24株转基因水稻，用上述4对引物进行扩增，结果发现11株转基因水稻能扩出loxp，kana(切除标签植株)；12株转基因水稻能扩出：Arr5，Cre，loxp，kana；或Arr5，Cre，kana(嵌合体植株)，切除效率为46％。

进一步地，把loxp引物扩增产物送一代测序，对测序结果进行拼接分析：

结果如图15所示，loxp切割位点上下游引物把扩增产物连接起来，与转基因载体上留下的序列进行比对，结果表明是在loxp位点发生了剪切，转基因标签被成功去除。

基于切割事件发生在愈伤组织阶段，水稻转基因T0代植株就能检测出成功剔除转基因标记的目标植株，以及大部分的嵌合体，切割效率高达60％～70％，相比其他传统诱导切割系统在同样的筛选育种时间多切割一次，节省人力物力时间成本的同时增大了切除效率，这种转基因切割标记系统有望在水稻育种中发挥重要作用。

以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉伯远生物科技有限公司

<120> 一种自动删除选择标记的转基因方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2196

<212> DNA

<213> 启动子序列(Arr5 gene sequence)

<400> 1

gtctaaaatg tatttgacaa aaaaaaaagt ctaaaatgta aattcactaa gcaacaaaaa 60

caaaattgta agctgtaata atcttgtaca tttatagata attattaaat aatttcagat 120

atataatcaa tgaatgatga ataacaattg aatataagta attcagttac tcacgattat 180

ttatagaata ggagaattca taaaataaat cgagtatttg taatccataa cttaaaattt 240

ctatatcaaa agattacgta cgtagagaaa tcaaaatttg gaccccgaat ataattttga 300

ataatcatat attagcttat tgattctcat tttataacat tttcctttgt catatagtga 360

aattgagaca cacacaaaga aaagattttt ttttttaagt ataatacaag aacattttta 420

tttagaccat gctaacatct tcccaatttt atcagatgtc ccaaaagaac ctaatacaac 480

aacatgcatg taccaattca tatcacatag acagttaaca cgaaagttcg ttggtttttg 540

taaggaaacc aataaagcat atttgtcttc agcctctcat actatttgag aggtaaaaac 600

cgagacatta ggattattct ttatagaatg ttttggtgcc taacaaattt tactggcatt 660

tctttttttt gccataaact gttaagaggt ttatttatga attgttaact taatttcttt 720

gatcaaacaa tagtaagttc tataaatgta tcttgtgatc tttgactatg atagacacta 780

agctcggact catgtacata gccaaaacac tcatatatat taaaacaata atttcatcgg 840

taaactcatg ttgtttccaa atatacaagt agagaaaacg tgtagactta ctctgaaggg 900

acacgcatat acatactgat aaacaaccat catggagaaa tccgagccgt ttctctgcaa 960

gccaaaccaa atttgacata tatagtaagg tcatgtgctc tatacaccta gtacctcaca 1020

ttcatttgat atctcctcta gagatacatc gatcatagtc atattttcag ctttcaatga 1080

tgatttagtc attaccattc ttgaaatata ttggtcgagt ttagtccata gatcttcgat 1140

cctgtcgtga caaagccttc catcaattgt caaaagatct ctcacgtgtg gaaatactcg 1200

atgcgtgttg ctaaatatgt gaataaaaga acgccaaatt tatagaaaaa gcgaattaaa 1260

attcaagtaa acatatgaat atttttcaag aaaagtgaat tgaaatttta ttttcatgaa 1320

aacttactat tttttttttt ttttttgaac actcatgaaa acttactatt aactcatcaa 1380

tcttatgcca ttcgaccacg atcgatagta gaggcaacta ttatggtaca gttacgagat 1440

ggacaaacaa caataacttg aaaaataatg attttttgtt ttgtttctag aaatatacac 1500

atacggatct tgaatttatc tgattgcgca actagagata tcaacattga aattcattcg 1560

cccaaatagt caatctggcg gtcacatgtc agctaacttt tccaacaatg ttcattaatt 1620

aattaacaat ctcaaagatt ttgtagattg aaatacaaat cttctctctg tggtacattt 1680

cttgaaaaat gggaaaatca agaaagtatc gaaaatgtac aaaaataaaa agaaatgaat 1740

caaagtagcc atgatcttga caacaataat cgagagagat cgtcatgata cgatttccct 1800

catccaaaat tgattttatt tcccttccca aatcaaacat atcatatgat ttcaccactc 1860

accattactt gactattctc aacaaaaaaa atattaaaaa actttatgac tttgatttta 1920

tttttatttg aagtttagcc aaaatttgaa aatatgactt ttgagaagaa aacagaataa 1980

acaaataatt agccacgcgc tatcagacag acaaaatccc acagatatgc aaagatctct 2040

cagaatcctc tccccatatc atatttttct cttttccctc tccttctttc ttcctttata 2100

aatccattta ttctcctctc atctctcagc aaaatcaaat cctcatagtt gattctctct 2160

atctctctca cgagtcacga tcctactctt cttgat 2196

<210> 2

<211> 12743

<212> DNA

<213> 载体序列(pBWAREⅠ)

<400> 2

tagaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg 60

ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg 120

gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga 180

caacttaata acacattgcg gacgttttta atgttagaca tattcaataa cccttaatat 240

aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attaggtctg aagaggagat tagtcgtaga 300

gtctaaaatg tatttgacaa aaaaaaaagt ctaaaatgta aattcactaa gcaacaaaaa 360

caaaattgta agctgtaata atcttgtaca tttatagata attattaaat aatttcagat 420

atataatcaa tgaatgatga ataacaattg aatataagta attcagttac tcacgattat 480

ttatagaata ggagaattca taaaataaat cgagtatttg taatccataa cttaaaattt 540

ctatatcaaa agattacgta cgtagagaaa tcaaaatttg gaccccgaat ataattttga 600

ataatcatat attagcttat tgattctcat tttataacat tttcctttgt catatagtga 660

aattgagaca cacacaaaga aaagattttt ttttttaagt ataatacaag aacattttta 720

tttagaccat gctaacatct tcccaatttt atcagatgtc ccaaaagaac ctaatacaac 780

aacatgcatg taccaattca tatcacatag acagttaaca cgaaagttcg ttggtttttg 840

taaggaaacc aataaagcat atttgtcttc agcctctcat actatttgag aggtaaaaac 900

cgagacatta ggattattct ttatagaatg ttttggtgcc taacaaattt tactggcatt 960

tctttttttt gccataaact gttaagaggt ttatttatga attgttaact taatttcttt 1020

gatcaaacaa tagtaagttc tataaatgta tcttgtgatc tttgactatg atagacacta 1080

agctcggact catgtacata gccaaaacac tcatatatat taaaacaata atttcatcgg 1140

taaactcatg ttgtttccaa atatacaagt agagaaaacg tgtagactta ctctgaaggg 1200

acacgcatat acatactgat aaacaaccat catggagaaa tccgagccgt ttctctgcaa 1260

gccaaaccaa atttgacata tatagtaagg tcatgtgctc tatacaccta gtacctcaca 1320

ttcatttgat atctcctcta gagatacatc gatcatagtc atattttcag ctttcaatga 1380

tgatttagtc attaccattc ttgaaatata ttggtcgagt ttagtccata gatcttcgat 1440

cctgtcgtga caaagccttc catcaattgt caaaagatct ctcacgtgtg gaaatactcg 1500

atgcgtgttg ctaaatatgt gaataaaaga acgccaaatt tatagaaaaa gcgaattaaa 1560

attcaagtaa acatatgaat atttttcaag aaaagtgaat tgaaatttta ttttcatgaa 1620

aacttactat tttttttttt ttttttgaac actcatgaaa acttactatt aactcatcaa 1680

tcttatgcca ttcgaccacg atcgatagta gaggcaacta ttatggtaca gttacgagat 1740

ggacaaacaa caataacttg aaaaataatg attttttgtt ttgtttctag aaatatacac 1800

atacggatct tgaatttatc tgattgcgca actagagata tcaacattga aattcattcg 1860

cccaaatagt caatctggcg gtcacatgtc agctaacttt tccaacaatg ttcattaatt 1920

aattaacaat ctcaaagatt ttgtagattg aaatacaaat cttctctctg tggtacattt 1980

cttgaaaaat gggaaaatca agaaagtatc gaaaatgtac aaaaataaaa agaaatgaat 2040

caaagtagcc atgatcttga caacaataat cgagagagat cgtcatgata cgatttccct 2100

catccaaaat tgattttatt tcccttccca aatcaaacat atcatatgat ttcaccactc 2160

accattactt gactattctc aacaaaaaaa atattaaaaa actttatgac tttgatttta 2220

tttttatttg aagtttagcc aaaatttgaa aatatgactt ttgagaagaa aacagaataa 2280

acaaataatt agccacgcgc tatcagacag acaaaatccc acagatatgc aaagatctct 2340

cagaatcctc tccccatatc atatttttct cttttccctc tccttctttc ttcctttata 2400

aatccattta ttctcctctc atctctcagc aaaatcaaat cctcatagtt gattctctct 2460

atctctctca cgagtcacga tcctactctt cttgatcaac atgtctaatc ttcttactgt 2520

tcatcagaac ttgccagcat tgccagttga tgctacttct gatgaagttc gtaagaatct 2580

tatggatatg ttcagggacc gccaggcctt ctcagaacac acatggaaga tgcttctttc 2640

tgtttgcaga tcttgggctg cttggtgcaa gctgaacaat agaaagtggt tcccagcaga 2700

accagaagat gttcgtgatt atcttcttta tcttcaggcc cgcggcctcg ccgtcaagac 2760

aattcagcag catcttggtc aacttaatat gcttcatagg aggagcggcc tcccccgccc 2820

ttctgattca aatgctgttt ctcttgttat gaggaggatc aggaaggaga acgtggatgc 2880

tggtgaaaga gctaagcagg ccctcgcctt cgagaggaca gatttcgacc aggtgaggag 2940

cctcatggag aacagcgacc gctgccagga tattagaaat cttgcttttc ttggtattgc 3000

ttataatact cttcttcgta ttgctgaaat tgctagaatt agagttaaag atatttctag 3060

aacagatggt ggaaggatgc ttattcatat tggtagaaca aagacacttg tttctactgc 3120

tggtgttgag aaggctcttt ctcttggtgt tacaaagctg gtggagaggt ggatttctgt 3180

ttctggtgtt gctgatgatc caaataacta cctcttctgc cgcgtcagga agaatggtgt 3240

tgctgctcca tcagctactt ctcagctgtc aactagagct cttgagggca tcttcgaggc 3300

cactcatagg ctcatctacg gcgccaagga tgattcagga cagaggtacc tcgcctggag 3360

cggccacagc gcccgcgtcg gcgccgcccg cgacatggcg agggctggtg tttctattcc 3420

tgaaattatg caagctggtg gttggacaaa tgttaatatt gttatgaact acatcaggaa 3480

cttggattca gaaacaggag ctatggtgag gctgctggag gacggcgacc cgaagaagaa 3540

gaggaaggtg tagtgtatct gacgtccgta tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc 3600

aatgcatcag tttcattgcc cacacaccag aatcctacta agtttgagta ttatggcatt 3660

ggaaaagctg ttttcttcta tcatttgttc tgcttgtaat ttactgtgtt ctttcagttt 3720

ttgttttcgg acatcaaaat gcaaatggat ggataagagt taataaatga tatggtcctt 3780

ttgttcattc tcaaattatt attatctgtt gtttttactt taatgggttg aatttaagta 3840

agaaaggaac taacagtgtg atattaaggt gcaatgttag acatataaaa cagtctttca 3900

cctctctttg gttatgtctt gaattggttt gtttcttcac ttatctgtgt aatcaagttt 3960

actatgagtc tatgatcaag taattatgca atcaagttaa gtacagtata ggctttttag 4020

gtcgtagact gaattaacgc cgaattaatt cgggggatct ggattttagt actggatttt 4080

ggttttagga attagaaatt ttattgatag aagtatttta caaatacaaa tacatactaa 4140

gggtttctta tatgctcaac acatgagcga aaccctatag gaaccctaat tcccttatct 4200

gggaactact cacacattat tatggagaaa ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcg 4260

gcatctactc tatttctttg ccctcggacg agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc 4320

gagtacttct acacagccat cggtccagac ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg 4380

cccgacagtc ccggctccgg atcggacgat tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc 4440

atcatcgaaa ttgccgtcaa ccaagctctg atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat 4500

atacgcccgg agtcgtggcg atcctgcaag ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt 4560

ctgctgctcc atacaagcca accacggcct ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg 4620

ggaatccccg aacatcgcct cgctccagtc aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt 4680

caggacattg ttggagccga aatccgcgtg cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc 4740

ggcccaaagc atcagctcat cgagagcctg cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat 4800

cacagtttgc cagtgataca catggggatc agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt 4860

agtgtattga ccgattcctt gcggtccgaa tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc 4920

ggccgcagcg atcgcatcca tagcctccgc gaccggttgt agaacagcgg gcagttcggt 4980

ttcaggcagg tcttgcaacg tgacaccctg tgcacggcgg gagatgcaat aggtcaggct 5040

ctcgctaaac tccccaatgt caagcacttc cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg 5100

ccgataaaca taacgatctt tgtagaaacc atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata 5160

tccacgccct cctacatcga agctgaaagc acgagattct tcgccctccg agagctgcat 5220

caggtcggag acactgtcga acttttcgat cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag 5280

ttcaggcttt ttcatatctc attgcccccc cggatctgcg aaagctcgag agagatagat 5340

ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata 5400

tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat 5460

atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 5520

cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc 5580

ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt 5640

gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg 5700

ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat tcttggagta 5760

gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt 5820

tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact 5880

gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt 5940

gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc 6000

gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga 6060

gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg tgtcgtagac atattcaata 6120

acccttaata taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tattaggtct gaagaggagt 6180

ttagtcgtag aggagacgag tctgagactc agcgtctcgg tcgaagcttg gcactggccg 6240

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 6300

cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 6360

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgct agagcagctt gagcttggat cagattgtcg 6420

tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa 6480

gagaaaagag cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 6540

tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat 6600

ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagg agatgatcgc 6660

ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca tgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct 6720

ggccggtttg tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac 6780

cgagcgccgc cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt 6840

cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt 6900

atcgctgtac ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc 6960

cgcgccctgc aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt 7020

gcccgcgatt gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc 7080

ccgacgattg accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga 7140

gcgccccagg cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt 7200

ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag 7260

cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc 7320

aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt 7380

cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc 7440

gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa 7500

attaaatcaa aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca 7560

cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg 7620

cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc 7680

tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg 7740

cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa 7800

ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt 7860

ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc 7920

actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca 7980

aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca 8040

gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg 8100

aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc 8160

caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga 8220

tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg 8280

cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg 8340

catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc 8400

catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt 8460

tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt 8520

agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa 8580

gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt 8640

aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg 8700

cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat 8760

cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga 8820

agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa 8880

gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa 8940

ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg 9000

cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg 9060

ggaaaaaggt cgaaaagatc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc 9120

gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc 9180

acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt 9240

aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac 9300

agccgaagct cccggatacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 9360

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac 9420

gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 9480

agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 9540

gcgttcatcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 9600

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 9660

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 9720

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 9780

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 9840

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 9900

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 9960

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 10020

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 10080

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 10140

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 10200

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 10260

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 10320

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 10380

tttggtcatg cattctaggg aaggtgcgaa caagtccctg atatgagatc atgtttgtca 10440

tctggagcca tagaacaggg ttcatcatga gtcatcaact taccttcgcc gacagtgaat 10500

tcagcagtaa gcgccgtcag accagaaaag agattttctt gtcccgcatg gagcagattc 10560

tgccatggca aaacatggtg gaagtcatcg agccgtttta ccccaaggct ggtaatggcc 10620

ggcgacctta tccgctggaa accatgctac gcattcactg catgcagcat tggtacaacc 10680

tgagcgatgg cgcgatggaa gatgctctgt acgaaatcgc ctccatgcgt ctgtttgccc 10740

ggttatccct ggatagcgcc ttgccggacc gcaccaccat catgaatttc cgccacctgc 10800

tggaacagca tcaactggcc cgccaattgt tcaagaccat caatcgctgg ctggccgaag 10860

caggcgtcat gatgactcaa ggcaccttgg tcgatgccac catcattgag gcacccagct 10920

cgaccaagaa caaagagcag caacgcgatc cggagatgca tcagaccaag aaaggcaatc 10980

agtggcactt tggcatgaag gcccacattg gtgtcgatgc caagagtggc ctgacccaca 11040

gcctggtcac caccgcggcc aacgagcatg acctcaatca gctgggtaat ctgctgcatg 11100

gagaggagca atttgtctca gccgatgccg gctaccaagg ggcgccacag cgcgaggagc 11160

tggccgaggt ggatgtggac tggctgatcg ccgagcgccc cggcaaggta agaaccttga 11220

aacagcatcc acgcaagaac aaaacggcca tcaacatcga atacatgaaa gccagcatcc 11280

gggccagggt ggagcaccca tttcgcatca tcaagcgaca gttcggcttc gtgaaagcca 11340

gatacaaggg gttgctgaaa aacgataacc aactggcgat gttattcacg ctggccaacc 11400

tgtttcgggc ggaccaaatg atacgtcagt gggagagatc tcactaaaaa ctggggataa 11460

cgccttaaat ggcgaagaaa cggtctaaat aggctgattc aaggcattta cgggagaaaa 11520

aatcggctca aacatgaaga aatgaaatga ctgagtcagc cgagaagaat ttccccgctt 11580

attcgcacct tccctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc 11640

tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg 11700

atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg 11760

cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct 11820

cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca 11880

tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcctcttccc agttttcgca atccacatcg 11940

gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta 12000

tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg 12060

ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc 12120

tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca 12180

ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc 12240

cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta 12300

tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt 12360

tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac 12420

agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc 12480

ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg 12540

cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc 12600

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 12660

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 12720

aacggctctc ccgctgacgc cgt 12743

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtggtctc atagagtcta aaatgtattt gacaa 35

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgatggtctc agtctcggtt tttacctctc a 31

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagtggtctc aagacattag gattattctt tatag 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtggtctc agttgatcaa gaagagtagg atcgt 35

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtggtctc atagagatgc gtgttgctaa atatgtga 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagtggtctc agttgatcaa gaagagtagg atcgtgac 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagtggtctc atagatcttg aaaaatggga aaatcaag 38

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagtggtctc agttgatcaa gaagagtagg atcgtgac 38

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagtggtctc atagacatat tcaataaccc ttaat 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagtggtctc acgactaaac tcctcttcag accta 35

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagtcgtctc atagagtcta aaatgtattt gacaaaaaaa aaagt 45

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgatcgtctc aattcctttt ggtctctgtt gatcaagaag agtaggatcg tg 52

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtcgtctc agaatttagg tctcatgtat ctgacgtccg tatcatcggt ttcgaca 57

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagtcgtctc acgacctaaa aagcctatac tgtacttaac ttgat 45

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagtggtctc acaacatgtc taatcttctt actgt 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagtggtctc atacactaca ccttcctctt cttct 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagtggtctc atagactgaa ttaacgccga attaa 35

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgatggtctc aacgacactc tcgtctactc c 31

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagtggtctc atcgtgctcc accatgttat cacat 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagtggtctc acgacacgac actctcgtct actcc 35

Claims (10)

1.一种自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，构建包含选择标记的自动删除选择标记的转基因载体，转化至植物中获得愈伤组织；所述选择标记基因可以正常表达，加入细胞分裂素后，诱导选择标记基因自动删除。

2.如权利要求1所述的自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建包含Cre-loxP系统、Arr5诱导启动系统和选择标记的自动删除选择标记的转基因载体，转化至植物中获得具有抗性的愈伤组织；

S2、加入细胞分裂素诱导所述愈伤组织中Cre基因表达，从而获得自动删除选择标记的转基因植株。

3.如权利要求2所述的自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，所述自动删除选择标记的转基因载体的DNA序列按照“载体骨架---loxP---Arr5---Cre---选择标记---loxP---载体骨架”排列。

4.如权利要求3所述的自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，所述Arr5基因的序列长度为2196bp，所述Arr5基因的序列参见SEQ ID NO:1。

5.如权利要求2所述的自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，所述选择标记为抗生素抗性基因或除草剂类抗性基因。

6.如权利要求5所述的自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因为潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、青霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因或红霉素抗性基因中的一种。

7.如权利要求5所述的自动删除选择标记的转基因方法，其特征在于，所述除草剂类抗性基因为bar基因、epsps基因中的一种。

8.一种自动删除选择标记的转基因载体的构建方法，其特征在于，用于构建如权利要求1-6任一项所述的自动删除选择标记的转基因载体，所述构建方法，包括以下步骤：

S1、构建包括接受载体A(pBWA)和供给载体B1(pBWD(a))、供给载体B2(pBWD(b))的载体系统；

S2、将loxP基因、Arr5基因与Cre基因、Hyg基因和Loxp基因分别依次克隆进供给载体B1和供给载体B2，构建供给载体pBWD(a)-loxP、pBWD(b)12B-Cre、pBWD(a)C-Hyg和pBWD(b)-loxP；

S3、用核酸内切酶EN1酶切接受载体A和酶切供给载体pBWD(a)-loxP，通过组装反应将loxP基因装配到接受载体A中，得到接受载体pBWALP，然后采用核酸内切酶EN2酶切接受载体pBWALP和酶切供给载体pBWD(b)12B-Cre，通过组装反应将Cre基因到装配到接受载体pBWALP中，得到接受载体pBWALP-Cre，接着采用核酸内切酶EN1酶切接受载体pBWALP-Cre和酶切供给载体pBWD(a)C-Hyg，通过组装反应将Hyg基因到装配到接受载体pBWALP-Cre中，得到接受载体pBWALPHC，之后采用核酸内切酶EN2酶切接受载体pBWALPHC和酶切供给载体pBWD(b)-loxP，通过组装反应将loxP基因装配到接受载体pBWALPHC中，得到自动删除选择标记的转基因载体；所述组装反应为酶连反应。

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述核酸内切酶EN1和所述核酸内切酶EN2不同；所述核酸内切酶EN1和所述核酸内切酶EN2为BsmBI限制性内切酶、SapI限制性内切酶和BsaI限制性内切酶中任一种。

10.如权利要求1-7任一项所述的自动删除选择标记的转基因载体在制备转基因植物中的应用。

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