CN104830878A

CN104830878A - Lrk2基因或其编码蛋白在促进水稻分蘖中的应用

Info

Publication number: CN104830878A
Application number: CN201510152200.3A
Authority: CN
Inventors: 查笑君; 康君方; 高爽; 田超; 李健敏; 陈伟杰
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2035-04-01
Also published as: CN104830878B

Abstract

本发明公开了一种LRK2基因或其编码蛋白在促进水稻分蘖中的应用。本发明提供了LRK2基因或其编码蛋白或含有LRK2基因的重组载体在促进水稻分蘖中的应用。本发明实验证明，构建含有LRK2基因的重组载体，将该表达载体利用农杆菌介导法转入水稻日本晴中，得到转基因水稻株系，与野生型水稻日本晴相比，转基因水稻株系得到的分蘖数增多。

Description

LRK2基因或其编码蛋白在促进水稻分蘖中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LRK2基因或其编码蛋白在促进水稻分蘖中的应用。

背景技术

随着人口的增长，城市化进程的加快，耕地面积大幅缩小，粮食短缺现象日益突出。水稻是我国重要的粮食作物之一，其生产直接关系着国家安全。水稻高产是水稻育种的重要目标，也是目前研究的热点之一。20世纪50年代后期，利用矮秆水稻育成高产抗倒伏品种，形成第一次水稻产量的“绿色革命”；70年代初，杂交籼稻三系配套成功，形成第二次“绿色革命”。水稻产量的这两次突破分别源于半矮秆基因和野败雄性不育胞质基因的发掘和利用，90年代以来水稻单产处于徘徊不前的局面，提高水稻单产迫切需要拓宽遗传资源实现第三次突破。产量性状属于复杂的数量性状，由单株有效穗数、每穗实粒数和千粒重三因素组成。遗传基础上由多个数量性状位点(Qualitativetrait locus,QTL)所控制，在遗传群体性状分离中表现为连续的变化。因其作用机制的复杂性，目前仅有少数几个水稻产量相关的QTL得到克隆和功能鉴定，这些QTL所编码的蛋白不同、行使的功能也各异。与水稻产量相关的QTL主要有：Gn1a，该区域编码细胞分裂素氧化酶OsCKX2,通过降解细胞分裂素(CK)调控水稻内源CK的浓度，从而影响穗部细胞的分裂速度，决定穗的大小。林鸿宣课题组分离了具有Ubiquitin E3连接酶活性的GW2基因，该基因通过抑制细胞分裂，影响水稻的粒形。张启发课题组分离了编码CCT蛋白的Ghd7基因，该基因具有调控水稻的株高，抽穗期，茎秆和每穗颖花数等功能。傅向东课题组分离了DEP1基因，其蛋白中类似磷酸酰乙醇胺结合结构域突变后促进细胞分裂，使稻穗变密、枝梗数增加和每穗粒数增多。调控水稻产量除了这些功能基因外，还有部分是转录因子。如：李家洋课题组通过图位克隆的方法克隆了控制水稻分蘖的基因MOC1。水稻MOC1突变株系只有主茎，没有分蘖，MOC1编码的蛋白为GRAS家族成员，定位于细胞核内，行使转录因子的功能。从已克隆的QTL或基因结构分析，目前还未见与产量相关的富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶的报道。

植物富亮氨酸类受体蛋白激酶(leucine-rich-repeat receptorkinases,LRKs)在真核生物中广泛存在，拟南芥和水稻中分别鉴定出这个基因亚家族的216和300多个成员。LRK在植物生长发育和抗性反应中起着广泛的调节作用，由信号肽、胞外富亮氨酸受体结构域、跨膜区和胞内激酶域4部分组成，这些激酶大多数居于各种信号传导途径的节点，与它们的上下游蛋白组成复杂而有序的网络系统。野生稻具有许多优良特性，如抵御生物或非生物胁迫、蛋白质含量高等。申请工作人员构建了以普通野生稻为供体亲本,桂朝2号为受体的高代回交群，从中定位的QTL(qGY2-1)可使籼稻桂朝2号单株产量增加16％。精细定位表明该高产QTL候选基因为富亮氨酸重复受体蛋白激酶基因簇。

发明内容

本发明的目的在于LRK2基因或其编码蛋白或含有LRK2基因的重组载体的新用途。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了LRK2基因或其编码蛋白或含有LRK2基因的重组载体在促进水稻分蘖中的应用。

所述的LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的LRK2基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的含有LRK2基因的重组载体为将所述的LRK2基因插入pCAMBIA1300S表达载体中，以2倍的35S为启动子，以KpnI与SalI为酶切位点所得到的表达载体。

本发明所述的应用为将所述的LRK2基因导入目的植物中，得到分蘖数大于所述目的植物的转基因植物。

本发明所述的LRK2基因通过所述的含有LRK2基因的重组载体导入目的植物中。

本发明所述的应用中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。

本发明的另一个目的在于提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所述的方法为将所述的LRK2基因导入目的植物中，得到分蘖数大于所述目的植物的转基因植物中。

本发明所述的方法中，所述的LRK2基因通过所述的含有LRK2基因的重组载体导入目的植物中。

本发明所述的方法中，所述的含有LRK2基因的重组载体为将所述的LRK2基因插入pCAMBIA1300S表达载体中，以2倍的35S为启动子，以KpnI与SalI为酶切位点所得到的表达载体。

本发明的另一个目的在于提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体为将所述的LRK2基因插入pCAMBIA1300S表达载体中，以2倍的35S为启动子，以KpnI与SalI为酶切位点所得到的表达载体。

本发明实验证明，构建含有LRK2基因的重组载体，将该表达载体利用农杆菌介导法转入水稻日本晴中，得到转基因水稻株系，与野生型日本晴水稻相比，转基因水稻株系得到的分蘖数增加。

附图说明

图1是载体pCAMBIA1300-2X35S::LRK2的结构示意图；

图2是载体pBI121-LRK2::GUS的结构示意图；

图3是载体pCAMBIA1300-2X35S::LRK2:eGFP的结构示意图；

图4是阳性转基因植株PCR鉴定电泳图；M：DNA质量标准物；CK：阳性对照；

图5是LRK2启动子GUS染色结果示意图；a.根茎基部的分蘖芽；b.节；c.根；d.花粉；

图6是亚细胞定位表达LRK2基因结构模式图；a.430nm激发光下对照组细胞；b.明场下对照组细胞；c.a,b重合；d.430nm激发光下实验组细胞；e.明场下对照组细胞；f.d,e重合；标尺为50μm；

图7是灌浆期日本晴与转基因植株对比；A为日本晴；B为转基因植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1构建载体

1、构建载体所用的引物：

LRK2-1300-KpnI-F：GTCGGTACCATGCAGCCACCTCATTCTTCATGCAAC；

LRK2-1300-SalI-R：CAGGTCGACTCAGTCGGAGCCTACACTGTCCAG；

2、重组载体

①LRK2基因的获得：

提取水稻总DNA：

1)取新鲜的水稻叶子放于1.5ml离心管中，加入200μl裂解液。

2)用研磨棒将叶子尽量磨成匀浆，利于裂解。

3)将离心管放入65℃烘箱中温育30min，每10min充分混匀一次。

4)将离心管从烘箱取出，加入65μl 5M的KAC溶液，上下颠倒温和混匀，然后放置于-20℃冰浴5min。

5)加入300μl氯仿，剧烈振荡混匀，12000rpm，离心10min。

6)取上清液约300μl，加至新的无菌1.5ml离心管中，再加入180μl异丙醇，上下颠倒温和混匀，室温下放置10min，12000rmp，离心5min，可见管底部的小块沉淀物(含DNA)，弃上清。

7)加入800μl 70％乙醇，充分混匀，室温下放置10min。

8)12000rmp，离心5min，弃上清，并用枪头吸去残留的乙醇，将离心管放在干燥处，待管内完全干燥后加入150-200μl的PCR H2O，溶解DNA，保存于-20℃。

以DNA为模板，LRK2-1300-KpnI-F与LRK2-1300-SalI-R为引物，PCR扩增LRK2基因片断。

PCR体系：2×GC buffer 25ul，dNTPs 4ul，LRK2-1300-KpnI-F1.5ul，LRK2-1300-SalI-R 1.5ul，Template:rice DNA 2ul，高保真酶primestar Taq(Takara)0.5ul，PCR H₂O up to 50ul。

程序：94℃4min，98℃10s，60℃15s，72℃2min 30X，72℃10min，16℃24h。

②构建过程如图1～图3所示，

1)PCR扩增基因片断(同步骤①中LRK2基因扩增)；

2)PCR产物回收；

3)pCAMBIA1300S载体与基因片断酶切；

酶切体系：10×multibuffer 4ul，KpnI 1.75ul，SalI 1.75ul，BSA 0.4ul，载体/基因片断6ul，PCR H₂O 26ul，合计40ul，37℃酶切反应3hours。

4)采用上海生工胶回收试剂盒对酶切产物切胶回收；

5)连接；

连接体系：10X连接buffer 1ul，载体片断DNA 2ul，基因片断DNA 6ul，T4连接酶1ul，16℃，过夜连接反应。

6)转化：

大肠杆菌感受态制备：

A.取菌株，在LB培养基上划线，37℃培养过夜。

B.在LB平板上挑去单克隆菌落，接种于5mL左右的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。

C.将菌液以1:50的比例接种于50mL LB液体培养基中，37℃,250rpm培养1-2h，直至菌液OD600为0.5-0.6之间。

D.将菌液转入50mL离心管中，预冷30min。

E.4℃,4000rpm离心10min。弃上清。

F.加入5mL SSCS溶液，悬浮细胞。

G.分装到1.5mL离心管(提前遇冷)中，每管100μL。

H.液氮速冻，然后转移-80℃保存。

大肠杆菌转化：

A.从-80℃中取出感受态，冰上融化，将连接产物加入并用枪轻轻打匀，冰浴30min。

B.42℃热击90s，马上转移到冰上。冰浴10min。

C.加入500μL LB液体培养基，37℃180rpm培养1h。

D.涂布于LB固体培养基上(含抗生素)，超净台吹干。

E.倒放于37℃生化培养箱，培养过夜。

7)阳性菌落PCR鉴定；

PCR体系：10X buffer 1ul，dNTPs 0.5ul，LRK2-1165-F 0.5ul，LRK2-1884-R 0.5ul，Taq酶(TIANGEN)0.5ul，PCR H₂O 7ul，模板菌落总体积10ul。

PCR程序：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃1min 25cycles，72℃10min，16℃保存。

引物：

LRK2-1165-F：agctgtcatcagaaataggcaag；

LRK2-1884-R：aagttcaggctattcagttcacc。

8)摇菌提取质粒：

A.1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液，1min，12000rpm离心，去除上清。

B.加入250μL悬浮液，重新悬浮细胞。

C.加入250μL裂解液，上下轻轻颠倒，至液体变澄清，再加入10μ碱性蛋白酶，混勻。静止1min。

D.加入350μL中和液，点到混勻，离心10min 12000rpm。

E.取上清转移到柱子里边，离心1min 12000rpm。

F.弃废液，加入750μL洗漆液，离心1min 12000rpm。

G.弃废液加入250μL洗潘液，重复(6)—次。

H.将柱子转移到新的离心管中，加入100μL左右PCR H2O,静止5min。离心1min,12000rpm。保存于-20℃。

9)酶切鉴定；

酶切体系：10×multibuffer 2ul，KpnI 0.5ul，SalI 0.5ul，BSA 0.2ul，质粒6ul，PCR H₂O 11ul，合计20ul，37℃酶切反应3hours。

10)送英骏公司测序。

实施例2转基因水稻的获得及鉴定

1)转基因水稻的获得

水稻受体：日本晴。

所需培养基(液)：

成熟胚诱导愈伤培养基：NB+2mg/L 2,4-D，pH＝5.8，植物凝胶3g/L；

农杆菌活化培养基：YEP，pH＝7.0；

农杆菌扩大培养基：YEB+200μM AS，pH＝7.0；

农杆菌悬浮侵染液：NB+2mg/L 2,4-D+200μM AS，pH＝5.4；

愈伤与农杆菌共培养培养基：NB+2mg/L 2,4-D+200μM AS，pH＝5.4，植物凝胶3g/L；

转基因愈伤筛选培养基：NB+2mg/L 2,4-D+500mg/L Cef+150mg/L G418或50mg/L Hyg，pH＝5.8，植物凝胶3g/L；

转基因愈伤分化培养基：MS+0.5mg/L NAA+2mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+75mg/L G418或25mg/L Hyg+125mg/L Cef，pH＝5.8，植物凝胶3g/L；

组培再生苗生根培养基：1/2MS+35mg/L G418或15mg/L Hyg+50mg/L Cef，pH＝5.8，植物凝胶1.5g/L。

操作步骤(需无菌操作)：

①选取饱满光洁的水稻日本晴成熟胚，机械脱壳，次氯酸钠消毒40min，均匀地铺在成熟胚诱导愈伤培养基上，大约十天左右，愈伤组织从胚部位生成，致密坚硬；

②去掉胚根和胚乳，将愈伤转移到新的愈伤培养基上继续培养，一周左右，愈伤生长旺盛，致密，成不规则形状散铺在培养基上；

③将含有目的质粒载体的农杆菌(EHA105)用YEP培养基活化培养，然后接种于YEB培养基扩大培养过夜，待菌液OD600nm值达到0.6-0.8时，4℃,5000rpm，离心10min，收集菌体细胞，弃上清，然后加入农杆菌悬浮侵染液，振荡使菌体细胞充分重旋，将农杆菌悬浮液转到无菌的锥形瓶中，摇床100rpm，培养2h；

④将愈伤置于农杆菌悬浮液中，摇床100rpm，20min，再静止10min后，捞出愈伤组织，放置于无菌滤纸上，吸取多余水分，约30min，倒入共培养培养基；

⑤愈伤与农杆菌共培养2-3d，将愈伤用含有500mg/L Cef的无菌水清洗脱菌数次直到液体清澈，清洗期间可用摇床轻微振荡，脱菌后放置于无菌滤纸上晾干，吸取多余水分，再均匀地铺在含相应抗生素的筛选培养基上筛选，约一周左右，愈伤出现褐化现象，同时也长出抗性愈伤，整个筛选持续约30天；

⑥转移新长出的愈伤到分化培养基上，数天后，愈伤生长旺盛，并开始出现绿点；

⑦愈伤变绿的部位逐渐分化出小苗并逐渐长大，但一般无根；

⑧将分化出的小苗转移至装有生根培养基的玻璃长瓶中进行生根培养，数天后即可生根；

⑨待小苗成活，并且生长茂盛后，打开玻璃瓶的封盖，并倒入少许无菌水炼苗；

⑩最后将成活的组培再生苗取出，洗净根部的培养基，插置于水稻营养液中继续培养。

2)转基因阳性植株鉴定

依照TIANGEN Taq DNA Polymerase说明书进行操作。

根据载体pBI121::GUS上的GUS基因序列设计引物(表1)。用GUS-pBI121-BamHI-F和GUS-499-R或GUS-545-F和GUS-pBI121-PstI-R，以组培再生苗DNA为模板，并以未转基因水稻日本晴DNA作阴性对照，进行PCR扩增。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，重复35个循环；72℃充分延伸5min；反应结束后电泳检测PCR产物。

表1 根据GUS基因序列设计的引物

利用农杆菌介导的转基因技术，将基因超表达载体转入水稻日本晴。所获得的组培再生植株提取叶组织DNA，用载体pCambia1300潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物Hyg-1300-301-和Hyg-1300-741-R(见表2)进行PCR，阴性对照为非转基因水稻日本晴叶组织DNA。电泳检测PCR产物，大多数再生苗都能扩增出与预期大小一致的条带(约400bp)，而非转基因植株则没有扩增出相应条带，部分电泳结果如图4所示。分析不同株系的条带明暗不一的原因可能是PCR反应模板DNA的加入量不同所致。

表2 引物序列

实施例3LRK2启动子表达分析

配制GUS染液，配方如表3所示。取特定的转基因水稻组织(如叶片、小穗、茎、茎节、根、根茎结合基部)浸没于GUS染液中，抽真空处理30-60min，37℃过夜；用无水乙醇脱去植物材料本底颜色，拍照记录，放置于4℃保存。

表3 1×GUS染液配方

如图5所示，LRK2启动子GUS染色结果表明分蘖芽、节、根与花粉处有LRK2基因表达。

实施例4亚细胞定位

1)本氏烟的培养

选取饱满的本氏烟种子，播撒于潮湿的花卉用土上，再覆盖上约0.5cm厚的土层，用保鲜膜加盖保湿；放置于光照培养箱内，16℃黑暗12h，22℃光照12h，交替培养；数天后，种子发芽，幼苗期间注意保湿；待小苗地上部分长至约5cm时，即可分盆培养，注意保持水源充足；待小苗地上部分长至约10-15cm时，即可用于实验。

2)农杆菌(GV3101)的培养及侵染液的制备

挑取含有LRK2基因质粒的农杆菌单菌落，接种于YEP(含Kan 50μg/ml，Rif 50μg/ml)液体培养基中，28℃，230rpm，活化培养过夜；次日按1:1000接种于YEB(含Kan 50μg/ml，Rif 50μg/ml)液体培养基中，28℃，230rpm，扩大培养过夜；待OD600nm值达到1.2-1.6时，4℃，4000rpm，离心8min收集菌体，弃上清；用含200μM AS，20g/L蔗糖，PH＝5.6的MS液体充分重旋菌体，25℃，100rpm，恢复培养2h；将含有A质粒农杆菌的菌旋液与含有B质粒农杆菌的菌旋液等体积混合，振荡均匀，制成侵染液。

3)农杆菌侵染

选取生长良好的本氏烟叶片，用注射器针头在较为平整的部位刺穿，一般一片叶子可穿2孔；将含有两种农杆菌的侵染液吸入注射器，去掉针头，注射器的出液头正对着轻轻顶住叶片上的穿孔处，在叶片的另一面用手指隔着叶片轻轻顶住注射器的出液头；缓慢注射，会观察到侵染液进入叶片，由穿孔处扩散开，叶片颜色变深(若未观察到此现象，则需调整注射位置)，扩散面积达到约1元硬币大小即可，继续注射下一个穿孔部位。

4)后续培养及观察

注射完成后，将植株放回培养箱，常规培养3-6天即可剪下叶片，用激光扫描共聚焦显微镜观察。

结果如图6所示，亚细胞定位表达LRK2基因表达于细胞膜上。

实施例5转基因水稻的考种试验

将种子在37℃温室中催芽两天，发芽后的水稻种子移往大田苗床培养育苗。六叶期后，小苗转移到大田中，按照15cm×15cm的间距进行种植，观察生长情况。成熟后，对日本晴野生型及转基因株系的每株有效穗数(长谷粒子的有效分蘖)以20株为群体进行考察。考察结果如表4：

表4 成熟期拷种数据分析

由表4和图7可知，转基因水稻株系的有效穗数明显高于日本晴野生型，有效穗数最高可增长35.7％，说明本发明方法对于提高水稻产量具有积极的作用，具有极大的推广使用价值。

Claims

1.LRK2基因或其编码蛋白或含有LRK2基因的重组载体在促进水稻分蘖中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的LRK2基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用为将所述的LRK2基因导入目的植物中，得到分蘖数大于所述目的植物的转基因植物。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：所述的LRK2基因通过所述的含有LRK2基因的重组载体导入目的植物中。

5.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：将权利要求1所述的LRK2基因导入目的植物中，得到分蘖数大于所述目的植物的转基因植物中。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的LRK2基因通过权利要求1所述的含有LRK2基因的重组载体导入目的植物中。

7.一种重组载体，其特征在于：该重组载体为将所述的LRK2基因以2倍35S promoter为启动子插入表达载体Pcambia1300S中，得到的表达载体。