WO2015053439A1 - 세포내 타우 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍 - Google Patents

세포내 타우 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍 Download PDF

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김동진
박기덕
탁혜진
그레일레지스
민선준
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김영수
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한국과학기술연구원
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Definitions

  • the present invention provides a protein pair for monitoring the interaction between tau proteins in living cells, a sequence pair encoding the same, a vector pair comprising the same, a cell line transformed by the vector pair, and a living cell using the cell line.
  • a method for monitoring tau-tau interaction in cells is described in detail below.
  • tauopathies Abnormal agglutination of tau is a major feature in Alzheimer's disease (AD) and many other neurodegenerative diseases (collectively called tauopathies)
  • AD Alzheimer's disease
  • tauopathies neurodegenerative diseases
  • tau stabilizes microtubules by promoting growth from axons and polarization of nerve cells.
  • tau separates from microtubules to produce insoluble aggregates (Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13).
  • tau aggregation Over the years, a structural framework for tau aggregation has been proposed, and there is evidence that insoluble filaments form from ten soluble monomers and that these filaments bind into high-dimensional structures called neurofibrillary tangles (NFTs). It has been proposed. However, little is known about the pathophysiological significance of NFTs, the causative agents of these processes, and the molecular mechanisms in taupeci, which do not have reliable methods for monitoring tau aggregation under physiological conditions. Because it does not. Most studies on tau aggregation have been performed under nonphysiological conditions using purified tau or tau fragments. Furthermore, because tau is extremely soluble, tau aggregation needs to be induced artificially by adding cofactors such as heparin. For this reason, cell-based models that can monitor tau assembly in living cells can be useful tools for studying tau pathology and developing methods to prevent and reverse the process.
  • NFTs neurofibrillary tangles
  • Human full-length tau comprises a microtubule binding domain consisting of four conserved sequence repeats. Positively charged residues during this sequence repetition play an important role in binding to negatively charged microtubules (20-30 electrons per ⁇ -tubulin dimer) to a high degree (Minoura I, Muto E (2006) Dielectric measurement of individual microtubules using the 5 electroorientation method.Biophys. J. 90: 3739-3748 .; Mukrasch MD, Biernat J, von Bergen M, Griesinger C, Mandelkow E, et al. (2005) Sites of tau important for aggregation populate ⁇ beta ⁇ -structure and bind to microtubules and polyanions.J. Biol. Chem. 280: 24978-24986).
  • the binding affinity of tau to microtubules is also actively regulated by phosphorylation, which leads to dynamic rearrangement of the microtubule network. Abnormally excessive phosphorylation of tau hinders the balancing of these dynamic rearrangements and dramatically reduces affinity for microtubules (Drewes G, Trinczek B, Illenberger S, Biernat J, Schmitt-Ulms G, et al. (1995) Microtubule-associated protein / microtubule affinity-regulating kinase (p110mark) .A novel protein kinase that regulates tau-microtubule interactions and dynamic instability by phosphorylation at the Alzheimer-specific site serine 262. J. Biol. Chem.
  • BiFC bimolecular fluorescence complementation
  • TK Bimolecular fluorescence complementation
  • a first fluorescent complementary amino acid sequence wherein the N-terminal sequence of the venus amino acid sequence is joined to the C-terminus of the full-length human tau amino acid sequence;
  • a bimolecular fluorescent complementary amino acid sequence pair consisting of a second fluorescent complementary amino acid sequence in which the C-terminal sequence of the venus amino acid sequence is joined to the C-terminus of the full-length human tau amino acid sequence is provided.
  • the first fluorescent complementary amino acid sequence may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the second fluorescent complementary amino acid sequence may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a base sequence pair encoding a bimolecular fluorescent complementary amino acid sequence pair consisting of a second base sequence encoding the second fluorescent complementary amino acid sequence is provided.
  • the first base sequence may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the second base sequence may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a first pCMV vector comprising the first base sequence
  • It provides a vector pair for transformation consisting of a second pCMV vector comprising the second base sequence.
  • the present invention also provides a cell line transformed by the transformation vector pair.
  • the cell line may be a HEK293 cell line transformed by the vector pair.
  • the present invention comprises the steps of treating the transformed cell line with a substance inducing hyperphosphorylation of tau protein and culturing the treated cell line; And it provides a method for monitoring the tau-tau interactions in living cells comprising the step of performing an immunoblot analysis on the cell line.
  • the substance that induces hyperphosphorylation of the tau protein may be forskolin or okadaic acid.
  • the tau oligomerization process can be monitored and quantified by allowing direct visualization of tau-tau interactions in living cells, thus studying the occurrence of diseases associated with tau and studying the oligomerization process. It can be used as a useful tool in developing ways to prevent and revert.
  • 1A is a schematic diagram of a pair of protein constructs according to the invention wherein the N-terminal and C-terminal portions of the Venus protein are fused to full-length tau
  • 1b is a photograph showing basal fluorescence intensity for Tau-GFP and Tau-BiFC cell lines
  • 1c is a photograph showing immunoblot results for measuring expression and basal phosphorylation levels of Tau-GFP and Tau-BiFC cell lines
  • immunoblots with anti-Tau (ser 262) antibodies show the level of total Tau expression.
  • Immunoblot with anti-tau phosphorylation (ser 396) antibody represents the basal level of phosphorylated tau and anti-actin means loading control.
  • Figure 2a is a photograph showing the cell distribution of tau-GFP
  • 2b is a cell distribution of tau-BiFC
  • cells were incubated with nocodazole or vinblastine (3 ⁇ M) for 30 minutes to take a fluorescence picture.
  • Figure 3a is a schematic diagram of the BiFC maturation according to tau phosphorylation
  • 3b is a photograph taken after culturing Tau-BiFC cells for 24 hours with okadaic acid (30 nM) and forskolin (20 ⁇ M)
  • 3c Is a graph quantifying the increase in BiFC-fluorescence at various time zones
  • 3d-f is a cell lysate prepared by incubating Tau-BiFC cells with each of the compounds shown for 24 hours and the results of performing an immunoblot
  • the black arrow represents the full length tau
  • the red arrow represents the tau dimer
  • the blue arrow represents the tau fragment.
  • 4 is a photograph showing the cell distribution of tau-BiFC fluorescence
  • 4a is a tau-GFP control
  • 4b is a photograph observed after culturing the tau-BiFC cells with each compound for 24 hours.
  • FIG. 5 is a diagram for sorting Tau-BiFC cells by FACS
  • 5a is a result graph for flow cytometry analysis of HEK293 cells and HEK293 cells expressing Tau-BiFC sequence.
  • Cells transfected using geneticin were selected, and then cells displaying BiFC-fluorescence (green dots in the P2 region in the graph) were further sorted using FACS, 5b before and after FACS sorting.
  • As fluorescence images for Tau-BiFC cells it can be seen that Tau-BiFC cells exhibiting basal BiFC-fluorescence increased significantly after sorting.
  • the tau-BiFC cell model was completed to visualize tau-tau interactions at the oligomer level.
  • the cell model according to the present invention can solve the narrow application range and low resolution problem of the conventional split-GFP assay, specifically, the N-terminal and C-terminal non-fluorescent portions of Venus protein In order to solve the problems of the prior art by employing a fused, Venus protein-based BiFC method.
  • the model according to the invention does not observe fluorescence when the tau is present as a monomer, but Venus fluorescence is observed when the tau is bound together.
  • tau dimerization and oligomerization in living cells can be analyzed in time and space without staining with foreign molecules.
  • Venus protein is a type of yellow fluorescence protein (YFP), which is well suited for time-space analysis of tau binding, where (i) venus protein matures quickly and effectively (matuartion), and (ii) its self- The self-assembly rate is lower than other BiFC pairs, and (iii) the fluorescence intensity of Venus-based BiFC is 10 times higher than that of EYFP-based BiFC (Shyu YJ, Liu H, Deng X, Hu).
  • YFP yellow fluorescence protein
  • pCMV6-hTau40-GFP was obtained from OriGene Technologies Inc. (Rockville, MD).
  • pBiFC-VN173 and pBiFC-VC155 were purchased from Addgene (Cambridge, Mass.) And then amplified using PCR primers with XhoI / PmeI restriction enzyme sequences. Each front and back primer sequence is as follows:
  • pCMV6-hTau40-VN173 and pCMV6-hTau-VC155 according to the present invention were constructed by cutting and conjugating pCMV6-hTau40-GFP and PCR amplified inserts using XhoI / PmeI.
  • HEK293 cells were purchased from ATCC (Manassas, VA) and 37 ° C., 5% with Dulbecco's modified eagle medium and 10,000 ⁇ g / mL of streptomycin containing 10% fetal calf serum and 10,000 units / mL of penicillin. Cultured under CO 2 containing humidified atmospheric conditions. The day before transfection, HEK-293 cells were plated on 12-well plates with OPTI-MEM medium (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, Calif.).
  • tau-GFP cell line As a control, cells were transfected with pCMV6-hTau40-GFP using Lipofectamine2000 reagent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) According to the manufacturer's guidelines.
  • the tau-BiFC cell line cells were transfected together with pCMV6-hTau40-VN173 and pCMV6-hTau40-VC155 by the same procedure.
  • To establish stable cell lines cells were selected and stored in culture medium containing 400 ng / mL Genecticin.
  • the Tau-BiFC cells were then sorted by fluorescence cytometry to select cells expressing both BiFC constructs (FIGS. 5A and 5B). Specifically, fluorescent cells were sorted using FACSAria (BD Bioscience, San Jose, Calif.). Meanwhile, tau-GFP cell lines were also prepared for comparison. In order to compare the expression levels of recombinant tau, cell lysates were prepared and subjected to SDS-PAGE analysis. Specifically, cells were grown in 96-well plates for fluorescence image analysis and Tau-BiFC cells were treated with various concentrations of okadaic acid or forskolin and incubated at 37 ° C. for 24 hours. Fluorescence images were acquired and analyzed using Operetta (PerkinElmer).
  • HEK293 did not cause the expression of endogenous tau, which may reduce the efficiency of tau-BiFC maturation.
  • immunoblot analysis with phosphorylated-tau antibody (phospho-Ser396) showed basal levels of tau phosphorylation in both cell lines (FIG. 1C).
  • the fluorescence intensity of tau-BiFC cells was significantly lower than that of tau-GFP cells (FIG. 1B). This fact means that the majority of the tau molecules expressed in HEK293 are present as monomers under base conditions. Therefore, tau-conjugated BiFC portions cannot be close enough to induce BiFC complementarity.
  • tau-BiFC cells were treated with forskolin and okadaic acid, which induce hyperphosphorylation of tau It is known.
  • Full length tau has 79 putative serine and threonine residues. Phosphorylation of these residues is precisely regulated by protein kinases and phosphatases to maintain the dynamics of microtubules required for neural flexibility.
  • protein phosphatase 2A P2A
  • P2A protein phosphatase 2A
  • Okadaic acid has an inhibitory activity of PP2A and is known to induce Tau phosphorylation similar to Alzheimer's in rat brain (Arias C, Sharma N, Davies P, Shafit-Zagardo B (1993) Okadaic acid induces early changes in microtubule-associated protein 2 and tau phosphorylation prior to neurodegeneration in cultured cortical neurons.J. Neurochem. 61: 673-682 .; Zhang Z, Simpkins JW (2010) Okadaic acid induces tau phosphorylation in SH-SY5Y cells in an estrogen-preventable manner.Brain Res 1345: 176-181).
  • PKA protein kinase A
  • Tau becomes a more favorable substrate for GSK-3 when it is prephosphorylated by PKA in rat brain.J. Biol. Chem. 279: 50078-50088 .; Tian Q, Zhang JX, Zhang Y, Wu F, Tang Q, et al. 2009) Biphasic effects of forskolin on tau phosphorylation and spatial memory in rats.J. Alzheimers Dis. 17: 631-642).
  • BiFC fluorescence As expected, when Tau-BiFC cells were incubated with okadaic acid and forskolin for 24 hours, BiFC fluorescence increased by 2.2 and 1.9 fold, respectively ( Figures 3b, c). The increase in BiFC fluorescence directly means that the level of tau-tau interaction in the cells is increased.
  • tau oligomerization may be an effective strategy for treating neurodegenerative diseases associated with tau. Identifying the causes and molecular mechanisms of tau aggregation and reversing this process requires a reliable system that can monitor the tau oligomerization process.
  • the tau-BiFC system according to the present invention provides a means to monitor and quantify the tau oligomerization process by allowing direct visualization of tau-tau interactions in living cells.
  • the tau-BiFC sensor according to the present invention will be a useful means in studying the development of diseases involving tau and in developing methods for preventing and reversing the oligomerization process.

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Abstract

본 발명은 살아있는 세포 내에서 타우 단백질 사이의 상호작용을 모니터링하기 위한 단백질 쌍, 이를 암호화하는 염기서열 쌍, 이를 포함하는 벡터 쌍, 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주, 및 상기 세포주를 이용하여 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 세포내 타우 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍으로서, 전장 인간 타우 아미노산 서열의 C-말단에 비너스 아미노산 서열의 N-말단 서열이 결합된 제1 형광 상보성 아미노산 서열; 및 전장 인간 타우 아미노산 서열의 C-말단에 비너스 아미노산 서열의 C-말단 서열이 결합된 제2 형광 상보성 아미노산 서열로 이루어지는 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍, 이를 암호화하는 염기서열 쌍, 이를 포함하는 벡터 쌍, 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주 및 상기 세포주를 이용하여 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 직접적으로 가시화할 수 있게 함으로써 타우 올리고머화 과정을 모니터링하고 정량할 수 있으며, 따라서 타우가 관여하는 질병의 발생을 연구하고 그 올리고머화 과정을 방지하고 되돌리기 위한 방법을 개발하는데 있어서 유용한 수단으로 활용될 수 있다.

Description

세포내 타우 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍
본 발명은 살아있는 세포 내에서 타우 단백질 사이의 상호작용을 모니터링하기 위한 단백질 쌍, 이를 암호화하는 염기서열 쌍, 이를 포함하는 벡터 쌍, 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주, 및 상기 세포주를 이용하여 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
비정상적인 타우 (tau)의 응집은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD) 및 다른 여러 신경퇴행성 질병들 (집합적으로, 타우오패씨 (tauopathies)라 부름)에 있어서 주된 특징이다 (Brandt R, Hundelt M, Shahani N (2005) Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models. Biochimica. et biophysica. acta. 1739: 331-354). 건강한 신경에서, 타우는 축색돌기 (axon)로부터의 성장 및 신경 세포 분극화 (polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관 (microtubules)을 안정화한다. 병리학적으로 과다인산화 (hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우는 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성한다 (Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13).
여러 해에 걸쳐서, 타우 응집에 대한 구조적 골격이 제안된 바 있으며, 10개의 가용성 모노머들로부터 불용성 필라멘트가 형성되고, 이러한 필라멘트가 신경섬유매듭 (neurofibrillary tangles, NFTs)이라 불리우는 고차원 구조로 결합된다는 증거들이 제안된 바 있다. 그러나, 아직까지도 타우오패씨에 있어서 NFT들의 병리생리학적 중요성, 이러한 과정을 유발하는 원인 및 분자적 메카니즘에 대해서는 그다지 알려진 바가 없는데, 이는 생리학적 조건 하에서 타우 응집을 모니터링하기 위한 신뢰성 있는 방법이 존재하지 않는다는 점 때문이다. 타우 응집에 대한 대부분의 연구들은 정제된 타우 또는 타우 단편을 사용하여 비생리학적 조건 하에서 수행되었다. 더 나아가, 타우는 용해도가 극히 높기 때문에, 타우 응집은 헤파린과 같은 보조인자를 첨가함으로써 인위적으로 유도될 필요성이 있다. 이러한 연유로, 살아있는 세포들 내에서 타우 어셈블리를 모니터링할 수 있는 세포 기반 모델은 타우 병리학을 연구하고 그 과정을 방지 및 되돌릴 수 있는 방법들을 개발하는데 유용한 도구가 될 수 있다.
인간의 전장 타우는 4개의 보존된 서열 반복으로 구성되는 마이크로세관 결합 도메인을 포함한다. 이러한 서열 반복 중의 양으로 대전된 잔기들은 높은 정도로 음으로 대전된 마이크로세관 (αβ-튜불린 다이머 당 20-30개 전자들)과 결합하는데 중요한 기능을 한다 (Minoura I, Muto E (2006) Dielectric measurement of individual microtubules using the 5 electroorientation method. Biophys. J. 90: 3739-3748.; Mukrasch MD, Biernat J, von Bergen M, Griesinger C, Mandelkow E, et al. (2005) Sites of tau important for aggregation populate {beta}-structure and bind to microtubules and polyanions. J. Biol. Chem. 280: 24978-24986). 타우의 마이크로세관에 대한 결합 친화도는 또한 인산화에 의해서 능동적으로 조절되는데, 이와 같은 인산화에 의해서 마이크로세관 네트워크의 동적 재배열이 야기된다. 타우가 비정상적으로 과도하게 인산화되는 경우에는 이러한 동적 재배열의 균형을 방해하고, 마이크로세관에 대한 친화도를 급격하게 감소시킨다 (Drewes G, Trinczek B, Illenberger S, Biernat J, Schmitt-Ulms G, et al. (1995) Microtubule-associated protein/microtubule affinity-regulating kinase (p110mark). A novel protein kinase that regulates tau-microtubule interactions and dynamic instability by phosphorylation at the Alzheimer-specific site serine 262. J. Biol. Chem. 270: 7679-7688.; Biernat J, Gustke N, Drewes G, Mandelkow EM, Mandelkow E (1993) Phosphorylation of Ser262 strongly reduces binding of tau to microtubules: distinction between PHF-like immunoreactivity and microtubule binding. Neuron 11: 153-163).
알츠하이머병을 앓고 있는 뇌들에서 비정상적으로 과도하게 인산화된 타우 및 그 응집체들이 발병원으로서 관찰된다. 따라서, 과도한 인산화는 일반적으로 타우 응집의 원인으로 간주된다. 그러나, 이러한 관계는 과도하게 인산화된 타우가 매우 높은 용해도를 갖기 때문에 아직까지도 완전히 설명된 바가 없다. 자발적인 과다 인산화인지 또는 유도된 과다 인산화인지에 관계없이, 과발현된 타우는 대부분의 세포주에서 응집하는 경향을 내재적으로 나타내는 것은 아니다 (Guo JL, Lee VM (2011) Seeding of normal Tau by pathological Tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. J. Biol. Chem. 286: 15317-15331.; Jenkins SM, Johnson GV (1999) Modulation of tau phosphorylation within its microtubule-binding domain by cellular thiols. J. Neurochem. 73: 1843-1850.; Chun W, Johnson GV (2007) Activation of glycogen synthase kinase 3beta promotes the intermolecular association of tau. The use of fluorescence resonance energy transfer microscopy. J. Biol. Chem. 282: 23410-23417).
타우 인산화와 응집 사이의 연결고리를 연구하기 위해서는, 타우 응집체의 가용성 형태에 대해서 연구할 필요성이 있으며, 최근 연구들에서는 가용성 타우 올리고머들이 기억 감퇴 및 신경 퇴행을 유도한다는 가설이 제기된 바 있고 (Lasagna-Reeves CA, Castillo-Carranza DL, Sengupta U, Clos AL, Jackson GR, et al. (2011) Tau oligomers impair memory and induce synaptic and mitochondrial dysfunction in wild-type mice. Mol. Neurodegener. 6: 39.; Brunden KR, Trojanowski JQ, Lee VM (2008) Evidence that non-fibrillar tau causes pathology linked to neurodegeneration and behavioral impairments. J. Alzheimers Dis. 14: 393-399), 가용성 올리고머들이 실제로 신경 세포들에 독성을 나타낼 수도 있다는 것으로 널리 받아들여지고 있다.
한편, BiFC (이분자 형광 상보성; bimolecular fluorescence complementation)는 관심 대상이 되는 단백질에 부착된 비형광성 구성요소로부터 형광 단백질 복합체를 형성하는 기술에 기반을 둔 단백질-단백질 상호작용을 가시화하기 위한 방법이다 (Kerppola TK (2008) Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37: 465-487). 종래에, 분할 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP) 상보 기법이 타우 응집을 정량화하는데 사용되었다 (Chun W, Waldo GS, Johnson GV (2011) Split GFP complementation assay for quantitative measurement of tau aggregation in situ. Methods Mol. Biol. 670: 109-123.; Chun W, Waldo GS, Johnson GV (2007) Split GFP complementation assay: a novel approach to quantitatively measure aggregation of tau in situ: effects of GSK3beta activation and caspase 3 cleavage. J. Neurochem. 103: 2529-2539). 이러한 분석 방법들에서는, 타우를 더 작은 GFP 단편들에 융합시키고 (GFP 11), 더 큰 GFP 단편 (GFP 1-10)을 갖는 세포들에서 발현시켰다. 타우가 모노머 또는 작은 응집체로 존재하는 경우에는, 큰 GFP 단편이 타우에 융합된 작은 GFP 단편에 접근할 수 있으며, 이로 인해서 형광 활성을 갖는 GFP의 결합이 이루어진다. 그러나, 타우가 응집하는 경우에는 활성 GFP의 재구성이 억제되고, 세포들에서 GFP 형광이 감소하게 된다. 응집을 정량화하는 방법으로서 상기 분할-GFP 분석법이 각광을 받아 왔지만, 그 범위가 제한적이고, 분해능이 낮다는 점 때문에 타우 올리고머를 모니터링하는데에는 한계가 있었다.
따라서, 본 발명에서는 헤파린 등과 같은 인위적인 보조인자의 첨가 없이도 살아있는 세포의 생리적 조건 하에서 타우 상호작용을 모니터링하기 위한 신뢰성 있는 시스템으로서, 종래의 녹색 형광 단백질 상보 기법이 갖는 단점, 즉 제한적 적용 범위 및 낮은 분해능 문제를 해결한 새로운 타우 상호작용 모니터링 시스템을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 달성하기 위해서,
세포내 타우 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍으로서,
전장 인간 타우 아미노산 서열의 C-말단에 비너스 아미노산 서열의 N-말단 서열이 결합된 제1 형광 상보성 아미노산 서열; 및
전장 인간 타우 아미노산 서열의 C-말단에 비너스 아미노산 서열의 C-말단 서열이 결합된 제2 형광 상보성 아미노산 서열로 이루어지는 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 형광 상보성 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 상기 제2 형광 상보성 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 과제를 달성하기 위해서,
상기 제1 형광 상보성 아미노산 서열을 암호화하는 제1 염기서열; 및
상기 제2 형광 상보성 아미노산 서열을 암호화하는 제2 염기서열로 이루어지는 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍을 암호화하는 염기서열 쌍을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1 염기서열은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열이고, 상기 제2 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 과제를 달성하기 위해서,
상기 제1 염기서열을 포함하는 제1 pCMV 벡터; 및
상기 제2 염기서열을 포함하는 제2 pCMV 벡터로 이루어지는 형질전환용 벡터 쌍을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환용 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포주는 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 HEK293 세포주일 수 있다.
마지막으로, 본 발명은, 상기 형질전환된 세포주에 타우 단백질의 과인산화를 유도하는 물질을 처리하고 처리된 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 세포주에 대해서 면역블롯 분석을 수행하는 단계를 포함하는 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 타우 단백질의 과인산화를 유도하는 물질은 포스콜린 또는 오카다산일 수 있다.
본 발명에 따르면, 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 직접적으로 가시화할 수 있게 함으로써 타우 올리고머화 과정을 모니터링하고 정량할 수 있으며, 따라서 타우가 관여하는 질병의 발생을 연구하고 그 올리고머화 과정을 방지하고 되돌리기 위한 방법을 개발하는데 있어서 유용한 수단으로 활용될 수 있다.
도 1a는 비너스 단백질의 N-말단 및 C-말단 부위가 전장 타우에 융합된 본 발명에 따른 단백질 구조체 쌍에 대한 개략도이고, 1b는 타우-GFP 및 타우-BiFC 세포주에 대한 기저 형광 강도를 나타낸 사진이고, 1c는 타우-GFP 및 타우-BiFC 세포주의 발현 및 기저 인산화 수준을 측정하기 위한 면역블롯 결과를 도시한 사진으로서, 항-타우 (ser 262) 항체를 사용한 면역블롯은 전체 타우 발현의 수준을, 항-타우 인산화 (ser 396) 항체를 사용한 면역블롯은 인산화된 타우의 기저 수준을 나타내며, 항-액틴은 로딩 대조군을 의미한다.
도 2a는 타우-GFP의 세포 분포를, 2b는 타우-BiFC의 세포 분포를 나타낸 사진이며, 세포들은 노코다졸 또는 빈블라스틴 (3 μM)과 함께 30분 동안 배양되어 형광 사진을 찍었다.
도 3a는 타우 인산화에 따라서 BiFC가 성숙화하는 과정에 대한 개략도이고, 3b는 오카다산 (30 nM) 및 포스콜린 (20 μM)과 함께 24시간 동안 타우-BiFC 세포들을 배양한 후에 찍은 사진이며, 3c는 다양한 시간대에서의 BiFC-형광 증가를 정량화한 그래프이고, 3d-f는 타우-BiFC 세포들을 도시된 각 화합물들과 함께 24시간 동안 배양하여 세포 용해액을 제조한 다음 면역블롯을 수행한 결과를 도시한 사진으로서, 흑색 화살표는 전장 타우를 나타내고, 적색 화살표는 타우 다이머를 나타내며, 청색 화살표는 타우 단편을 나타낸다.
도 4는 타우-BiFC 형광의 세포 분포를 나타낸 사진으로서, 4a는 타우-GFP 대조군을, 4b는 타우-BiFC 세포들을 각 화합물과 함께 24시간 동안 배양한 다음 관찰한 사진이다.
도 5는 FACS에 의해서 타우-BiFC 세포를 분류하는 것에 관한 도면이며, 5a는 HEK293 세포들 및 타우-BiFC 서열을 발현하는 HEK293 세포들을 유동 세포계수 분석법 (flow cytometry analysis)에 대한 결과 그래프로서, 먼저 제네티신을 사용하여 트랜스펙션된 세포들을 선택하고, 이어서 BiFC-형광을 나타내는 세포들 (그래프에서 P2 영역의 녹색 점들)을 FACS를 사용하여 더욱 분류한 그래프이고, 5b는 FACS 분류 이전 및 이후의 타우-BiFC 세포들에 대한 형광 영상들로서, 기저 BiFC-형광을 나타내는 타우-BiFC 세포들은 분류 이후에 크게 증가된 것을 알 수 있다.
본 발명에서는 올리고머 수준에서 타우-타우 상호작용을 가시화하기 위해서, 타우-BiFC 세포 모델을 완성하였다. 본 발명에 따른 세포 모델은 종래 분할-GFP 분석법의 좁은 응용범위 및 낮은 분해능 문제를 해결할 수 있는 바, 구체적으로는, 비너스 단백질 (Venus protein)의 N-말단 및 C-말단 비형광 부분들을 타우에 융합시킨, 비너스 단백질 기반의 BiFC 방법을 채용하여 상기 종래기술의 문제점들을 해결하고자 하였다. 형광 "턴-온 (turn-on)" 접근방법으로서, 본 발명에 따른 모델은 타우가 모노머로 존재하는 경우에는 형광이 관찰되지 않으나, 타우가 함께 결합되는 경우에는 비너스 형광이 관찰된다. 따라서, 모노머 타우로부터 야기되는 배경 노이즈를 제거함으로써, 외래 분자로 염색시키지 않고서도 살아있는 세포들 중에서의 타우 다이머화 및 올리고머화를 시공간적으로 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
타우-BiFC 센서의 제작
타우-BiFC 센서를 제작하기 위해서, 본 발명에서는 비너스 (Venus) 기반의 BiFC 시스템을 사용하였다. 비너스 단백질은 황색 형광 단백질 (yellow fluorescence protein, YFP)의 일종으로서, 타우 결합을 시공간적으로 분석하기에 매우 적합한데, 이는 (i) 비너스 단백질이 빠르고 효과적으로 성숙되고 (matuartion), (ii) 그 자가-조립 (self-assembly) 속도가 다른 BiFC 쌍들에 비해서 낮으며, (iii) 비너스계 BiFC의 형광 강도가 EYFP계 BiFC의 형광 강도보다 10배 더 높기 때문이다 (Shyu YJ, Liu H, Deng X, Hu CD (2006) Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques 40: 61-66.; Kodama Y, Hu CD (2010) An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. Biotechniques 49: 793-805).
비너스계 타우-BiFC 센서를 제작하기 위해서, 전장 인간 타우 (441 a.a.)를 비너스의 N-말단 단편 (1-172 a.a., VN173) 및 C-말단 단편 (155-238 a.a., VC155)에 융합시켰다. 구체적으로, 포유류 발현 벡터 pCMV6-hTau40-GFP를 미국 OriGene Technologies Inc. (Rockville, MD)로부터 구입하였다. GFP를 BiFC 부분으로 치환하기 위해서, pBiFC-VN173 및 pBiFC-VC155를 Addgene (Cambridge, MA)으로부터 구입한 다음, XhoI/PmeI 제한효소 서열을 갖는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 각각의 전방 및 후방 프라이머 서열은 하기와 같다:
(VC155-F) 5'-AATTCGGTCG ACCGAGATCT CTCGAGGTAC-3'
(VC155-R) 5'-CTAGTTGTGG TTTGTTTAAA CTCATCAATG TATC-3'
(VN173-F) 5'-ATGACGACAA GCTCGAGGCC GCGAATTCAT CG-3'
(VN173-R) 5'-CTAGTTGTGG TTTGTTTAAA CTCATCAATG TATC-3'
pCMV6-hTau40-GFP 및 PCR 증폭된 인써어트를 XhoI/PmeI를 사용하여 절단하고 접합시킴으로써 본 발명에 따른 pCMV6-hTau40-VN173 및 pCMV6-hTau-VC155를 제작하였다.
이어서, 상기와 같이 제작된 타우-BiFC의 2개 DNA 서열들을 HEK293 세포들 내에서 안정적으로 발현시켰다 (도 1a). 구체적으로, HEK293 세포는 ATCC (Manassas, VA)로부터 구입하였으며, 10% 우태아 혈청 및 10,000 유닛/mL의 페니실린을 함유하는 Dulbecco's modified eagle 배지 및 10,000 μg/mL의 스트렙토마이신과 함께 37 ℃, 5% CO2 함유 가습 대기 조건 하에서 배양하였다. 트랜스펙션 전날에, HEK-293 세포들을 OPTI-MEM 배지 (Invitrogen - Gibco, Carlsbad, CA)와 함께 12-well 플레이트 상에 플레이팅하였다. 한편, 대조군으로서 타우-GFP 세포주를 제작하기 위해서, 제조업체의 가이드라인에 따라서 Lipofectamine2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 세포들을 pCMV6-hTau40-GFP로 트랜스펙션시켰다. 또한, 타우-BiFC 세포주를 제작하기 위해서는, 동일한 과정에 의해서 세포들을 pCMV6-hTau40-VN173 및 pCMV6-hTau40-VC155로 함께 트랜스펙션시켰다. 안정적인 세포주를 구축하기 위해서, 세포들을 400 ng/mL 제넥티신 (Genecticin)을 포함하는 배양 배지 중에서 선택하고 보관하였다.
이어서, 타우-BiFC 세포들을 형광 세포계수법 (fluorescence cytometry)을 사용하여 세포들을 분류함으로써 2가지 BiFC 구조체들 모두를 발현하는 세포들을 선택하였다 (도 5a 및 5b). 구체적으로는, 형광 세포들을 FACSAria (BD Bioscience, San Jose, CA)를 사용하여 분류하였다. 한편, 비교를 위해서 타우-GFP 세포주 역시 제조하였다. 재조합 타우의 발현 수준을 비교하기 위해서, 세포 용해액을 제조하였으며, 이에 대해서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 구체적으로는, 형광 영상 분석을 위해서 세포들을 96-웰 플레이트 중에서 성장시켰으며, 타우-BiFC 세포들을 다양한 농도의 오카다산 또는 포스콜린으로 처리하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 형광 영상들은 Operetta (PerkinElmer)를 사용하여 획득 및 분석하였다.
타우 항체들을 사용하여 세포 단백질 추출물에 대해서 면역블롯 분석을 수행한 결과, 85 kD 근방에서 타우-BiFC 세포들에 대한 2개의 밴드들이 나타났고, ~100 kD에서 타우-GFP 세포들에 대한 1개의 밴드가 나타났다 (도 1c). 구체적으로는, 상기와 같이 배양된 세포들을 단백질분해효소 및 포스파타아제 억제 칵테일을 포함하는 세포 용해 시약인 CelLytic M (Sigma, St.Louis, MO)로 용해시켰다. 단백질 농도는 Bradford (Thermo scientific, Waltham, MA) 분석법을 사용하여 측정하였으며, 단백질 샘플들을 10% SDS PAGE 젤에 로딩하고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 타우 항체들은 abcam (Cambridge, MA)으로부터 구입하였다: pSer199 + Ser202 (abcam, ab4864), pSer396 (abcam, ab64193) 및 Ser262 (abcam, ab32057).
주목할 점은, HEK293가 내생적 타우의 발현을 일으키지 않았다는 점인데, 이러한 내생적 타우는 타우-BiFC 성숙화의 효율성을 감소시킬 수 있다. 이에 더해서, 인산화-타우 항체 (phospho-Ser396)를 사용한 면역블롯 분석의 결과 2개의 세포주들 모두에서 타우 인산화의 기저 수준이 관찰되었다 (도 1c). 예상한 바대로, 비슷한 수준의 발현에도 불구하고, 타우-BiFC 세포들의 형광 강도는 타우-GFP 세포들의 형광 강도보다 현저하게 낮았다 (도 1b). 이러한 사실은 HEK293에서 발현되는 타우 분자들의 대다수가 기저 조건 하에서 모노머로 존재한다는 것을 의미한다. 그러므로, 타우-접합된 BiFC 부분들은 BiFC 상보화를 유도할 정도로 근접할 수가 없다.
타우-BiFC 및 마이크로세관과의 결합
다음으로, 타우-BiFC 형광의 세포 분포 패턴을 조사하였다. 타우-GFP 세포들의 경우에, GFP-형광은 마이크로세관과의 특별한 관련성 없이 세포질 전반에 걸쳐서 풍부하게 관찰되었다 (도 2a). 이와는 대조적으로, BiFC-형광은, 비록 매우 약한 정도이지만, 마이크로세관과 명확한 관련성을 보여주었다 (도 2b). 이러한 결과는 매우 높게 과발현된 타우가 마이크로세관과 충분히 밀접하게 결합함으로써 마이크로세관 상에서 BiFC 성숙화를 유도한다는 것을 의미한다; BiFC 성숙화는 2개의 부분들이 근접하는 경우에만 발생된다 (10 nm 미만) (Shyu YJ, Liu H, Deng X, Hu CD (2006) Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques 40: 61-66.; Kodama Y, Hu CD (2010) An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. Biotechniques 49: 793-805).
더욱이, 타우-GFP 세포들의 세포질에서는 강한 형광이 관찰되었지만, 타우-BiFC 세포들에서는 그렇지 않았다. 이는 세포질에서 발현된 과량의 타우들이 모노머 상태로 존재한다는 것을 의미한다. 타우와 마이크로세관 사이의 상호작용을 더욱 조사하기 위해서, 세포들을 마이크로세관을 불안정화시키는 작은 분자들로 처리하였다. 마이크로세관들을 분해시키는 노코다졸 (nocodazole)로 처리한 경우, 마이크로세관-관련된 BiFC 형광은 거의 사라졌다. 마이크로세관을 침전시키는 빈블라스틴 (vinblastine)으로 처리한 경우, BiFC 형광은 로드형 (load-shaped) 침전물에서 매우 높은 정도로 향상되었다. 상기 결과들은 BiFC 부분들의 융합에 의해서 타우와 마이크로세관 사이의 상호작용이 방해를 받지는 않는다는 사실을 명확히 보여준다.
타우 과다 인산화에 따른 타우-BiFC의 성숙화
타우-BiFC를 타우 어셈블리의 지표로 사용할 수 있는지의 가능성 여부를 타진하기 위해서, 타우-BiFC 세포들을 포스콜린 (forskolin) 및 오카다산 (okadaic acid)으로 처리하였으며, 상기 물질들은 타우의 과인산화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 전장 타우는 79개의 추정 세린 및 쓰레오닌 잔기들을 갖는다. 이러한 잔기들에 대한 인산화는 단백질 키나아제 및 포스파타아제에 의해서 정밀하게 조절됨으로써 신경 유연성에 대해서 요구되는 마이크로세관의 역학을 유지한다. 이러한 조절 효소들 중에서도, 인간 뇌의 주된 타우 포스파타아제는 단백질 포스파타아제 2A (PP2A)로서, 이는 타우를 인산화하는 몇몇 단백질 키나아제들의 활성을 조절한다. 오카다산은 PP2A의 저해능을 갖고, 쥐의 뇌에서 알츠하이머와 유사한 타우 인산화를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Arias C, Sharma N, Davies P, Shafit-Zagardo B (1993) Okadaic acid induces early changes in microtubule-associated protein 2 and tau phosphorylation prior to neurodegeneration in cultured cortical neurons. J. Neurochem. 61: 673-682.; Zhang Z, Simpkins JW (2010) Okadaic acid induces tau phosphorylation in SH-SY5Y cells in an estrogen-preventable manner. Brain Res. 1345: 176-181). 포스콜린에 의한 단백질 키나아제 A (PKA)의 활성화는 타우의 과인산화 및 기억 감퇴를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Liu SJ, Zhang JY, Li HL, Fang ZY, Wang Q, et al. (2004) Tau becomes a more favorable substrate for GSK-3 when it is prephosphorylated by PKA in rat brain. J. Biol. Chem. 279: 50078-50088.; Tian Q, Zhang JX, Zhang Y, Wu F, Tang Q, et al. (2009) Biphasic effects of forskolin on tau phosphorylation and spatial memory in rats. J. Alzheimers Dis. 17: 631-642). 예상한 바대로, 타우-BiFC 세포들이 오카다산 및 포스콜린과 함께 24시간 동안 배양된 경우에는, BiFC 형광이 각각 2.2배 및 1.9배만큼 크게 증가하였다 (도 3b, c). BiFC 형광의 증가는 해당 세포들에서 타우-타우 상호작용의 수준이 증가하였다는 것을 직접적으로 의미한다.
면역블롯 분석 결과, 오카다산 (30 nM) 처리에 따라서 전장 타우 및 몇몇 타우 단편들의 Ser199 및 Ser202에서 인산화 수준이 증가하였으며 (도 3f), 이는 오카다산이 타우의 과인산화를 유도한다는 것을 의미한다. 또한, 일부 타우 단편들은 Ser396에서 강한 인산화 현상을 나타낸 반면에 (도 3e의 청색 화살표로 표시), 전장 타우의 경우에는 그렇지 않았으며 (도 3e), 이는 타우의 절단된 단편들이 다른 단백질 키나아제에 대해서 취약한 기질이 된다는 것을 의미한다. 더욱 중요하게는, Ser199, Ser202, 및 Ser396에서 인산화된 타우 다이머의 밴드가 150 kD 근방 (도 3e, f의 적색 화살표로 표시)에서 관찰되었다. 이러한 결과들은 오카다산 처리가 비정상적인 타우 과인산화, 단편화, 및 다이머화라는 특징을 갖는 타우 병증을 개시한다는 사실을 의미한다. 더욱이, 실 형태의 타우-BiFC 응집 현상이 오카다산 처리된 세포들에서 관찰된다는 사실은, 오카다산에 의해서 유도되는 타우 병증 발생 현상을 강하게 뒷받침하는 것이다 (도 4).
이와는 대조적으로, 포스콜린 (20 μM) 처리도 Ser396에서의 타우 인산화를 유도한 반면에, 면역블롯 상에서는 타우 단편화 또는 다이머화가 관찰되지 않았다 (도 3e). 비록 포스콜린이 타우 인산화 및 어셈블리를 유도하였지만, 이러한 효과들은 오카다산 처리에서 보여진 바와 같은 타우 병증 발생을 촉진하기에는 충분하지 않을 수 있다. 아데닐 싸이클레이즈의 활성화인자로서, 포스콜린은 싸이클릭 AMP (cAMP) 의존성 신호 전달 경로를 자극하며, 상기 경로는 전사, 대사, 세포 싸이클 진전 및 아폽토시스를 포함하는 다양한 세포 과정에 관여한다. 특히 신경 세포들에서, 포스콜린-유도된 cAMP 활성화가 신경 분화 및 신경돌기 (neurite)의 성장을 촉진한다는 사실은 잘 알려져 있다 (Richter-Landsberg C, Jastorff B (1986) The role of cAMP in nerve growth factor-promoted neurite outgrowth in PC12 cells. J. Cell Biol. 102: 821-829.; Cheng HC, Shih HM, Chern Y (2002) Essential role of cAMP-response element-binding protein activation by A2A adenosine receptors in rescuing the nerve growth factor-induced neurite outgrowth impaired by blockage of the MAPK cascade. J. Biol. Chem. 277: 33930-33942.; Hansen T, Rehfeld JF, Nielsen FC (2003) KCl potentiates forskolin-induced PC12 cell neurite outgrowth via protein kinase A and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways. Neurosci. Lett. 347: 57-61). 심지어 타우 BiFC 세포들에서도, 포스콜린 처리에 의해서 HEK293 세포들 상에서 신경돌기형 구조들이 뚜렷하게 증가하였다 (도 4a). 포스콜린 및 오카다산은 타우 인산화를 유도하기 위해서 통상적으로 사용되는 작은 분자들이지만, 그들이 타우 응집에 기여하는 바는 아직까지 명확하게 밝혀진 바가 없다. 따라서, 본 발명에서는 타우-타우 상호작용을 가시화함으로써, 살아있는 세포들에서 타우 어셈블리에 작은 분자들이 미치는 영향을 직접적으로 모니터링하고 정량화할 수 있다.
알츠하이머병을 앓는 환자 뇌의 신경에서 비정상적인 섬유량이 존재한다는 사실이 발견된 이래로, 신경섬유매듭은 타우의 병리적 구조인 것으로 여겨져 왔다. 그러나, 최근의 증거들은 더 작은, 가용성 타우 올리고머들이 독성 응집체들로서, 신경퇴행 및 기억 감퇴와 밀접하게 연관된 것임을 말해준다. 큰 덩어리들은 아마도 독성 올리고머들을 격리함으로써 신경 세포들을 보호하기 위한 생존 전략일 수도 있다. 따라서, 타우 올리고머화를 방지하는 것은 타우와 관련된 신경퇴행성 질환들을 치료하는데 효과적인 전략이 될 수 있다. 타우 응집의 원인 및 분자적 메카니즘을 확인하고, 이러한 과정을 되돌리기 위해서는 타우 올리고머화 과정을 모니터링할 수 있는 신뢰성 있는 시스템이 필요하다.
본 발명에 따른 타우-BiFC 시스템은 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 직접적으로 가시화할 수 있게 함으로써 타우 올리고머화 과정을 모니터링하고 정량할 수 있는 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 타우-BiFC 센서는 타우가 관여하는 질병의 발생을 연구하고 그 올리고머화 과정을 방지하고 되돌리기 위한 방법을 개발하는데 있어서 유용한 수단이 될 것이다.

Claims (9)

  1. 세포내 타우 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍으로서,
    전장 인간 타우 아미노산 서열의 C-말단에 비너스 아미노산 서열의 N-말단 서열이 결합된 제1 형광 상보성 아미노산 서열; 및
    전장 인간 타우 아미노산 서열의 C-말단에 비너스 아미노산 서열의 C-말단 서열이 결합된 제2 형광 상보성 아미노산 서열로 이루어지는 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 형광 상보성 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열이고, 상기 제2 형광 상보성 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 아미노산 서열 쌍.
  3. 제1항에 따른 아미노산 서열 쌍을 암호화하는 염기서열 쌍으로서,
    상기 제1 형광 상보성 아미노산 서열을 암호화하는 제1 염기서열; 및
    상기 제2 형광 상보성 아미노산 서열을 암호화하는 제2 염기서열로 이루어지는 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍을 암호화하는 염기서열 쌍.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 염기서열은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열이고, 상기 제2 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 염기서열 쌍.
  5. 제3항에 따른 제1 염기서열을 포함하는 제1 pCMV 벡터; 및
    제3항에 따른 제2 염기서열을 포함하는 제2 pCMV 벡터로 이루어지는 형질전환용 벡터 쌍.
  6. 제5항에 따른 형질전환용 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포주는 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 HEK293 세포주인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포주.
  8. 제6항에 따른 세포주에 타우 단백질의 과인산화를 유도하는 물질을 처리하고 처리된 세포주를 배양하는 단계; 및
    상기 세포주에 대해서 면역블롯 분석을 수행하는 단계
    를 포함하는 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 모니터링하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 타우 단백질의 과인산화를 유도하는 물질은 포스콜린 또는 오카다산인 것을 특징으로 하는 살아있는 세포들에서 타우-타우 상호작용을 모니터링하는 방법.
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