KR102147576B1 - 세포내 타우-튜불린의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍 - Google Patents

세포내 타우-튜불린의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살아있는 세포내에서 타우-튜불린 사이의 상호작용을 모니터링하기 위한 단백질 쌍, 이를 암호화하는 염기서열 쌍, 이를 포함하는 벡터 쌍, 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주, 및 상기 세포주를 이용하여 살아있는 세포들에서 타우-튜불린 상호작용을 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 타우 유전자와 제1 형광 단백질 유전자를 포함하는 제1 아미노산 서열; 및 제2 형광 단백질 유전자와 튜불린(tubulin) 유전자를 포함하는 제2 벡터;를 포함하고, 상기 타우 유전자와 튜불린 유전자로부터 발현된 단백질의 상호 응집에 의하여, 상기 제1 형광 단백질 유전자와 제2 형광 단백질 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 결합해서 형광을 띄는 것을 특징으로 하여, 살아있는 세포 내에서 타우와 튜불린의 상호작용을 관찰할 수 있는 효과가 있다.

Description

세포내 타우-튜불린의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍 {A pair of amino acid sequences for monitoring tau-tubulin interaction in living cells via bimolecular fluorescence complementation}
본 발명은 살아있는 세포 내에서 타우 및 튜불린 사이의 상호작용을 모니터링하기 위한 단백질 쌍, 이를 암호화하는 염기서열 쌍, 이를 포함하는 벡터 쌍, 상기 벡터 쌍에 의해서 형질전환된 세포주, 및 상기 세포주를 이용하여 살아있는 세포들에서 타우-튜불린 상호작용을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
타우(tau)는 미세소관(Microtubules) 결합 단백질로, 특히 신경세포의 축삭에서 미세소관과 결합함으로써 미세소관의 형성을 촉진하고 이를 안정화시킨다. 비정상적인 타우의 응집과 이로 인한 미세소관의 불안정화는 타우병증으로 분류되는 신경퇴행성 뇌질환의 병리학적인 특징이다. 따라서, 타우의 응집을 저해하고자 하는 많은 연구들이 진행되고 있는 가운데, 보다 근본적인 타우와 미세소관의 상호작용에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다. 그러나 타우병증의 조건하에서 타우와 미세소관, 또는 미세소관을 형성하는 단위체인 튜불린(tubulin)과의 상호작용의 변화에 관해서는 거의 알려진 바가 없다.
최근의 연구 중 파킨슨 증상을 동반한 전두측두엽성 치매(FTDP-17)를 유발하는 타우 단백질의 돌연변이가 튜불린 이량체에 강한 결합력을 보인다는 보고는 타우 응집체 형성에 튜불린 단백질이 기여할 수 있음을 시사한다. 또한, 치매환자의 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles)과 피크소체(pick’s body)에서 타우와 베타 튜불린이 함께 응집하는 것이 확인되었다. 이러한 연구 결과들로 인해 타우와 튜불린과의 상호작용에 관한 연구의 중요성이 대두되었으나, 대부분의 연구들은 인위적으로 정제된 타우와 튜불린을 사용하여 비생리학적 조건 하에서 수행되어왔다. 비생리학적 조건에서의 연구는 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification)과정이 결핍되어 있으며, 타우와 튜불린의 농도에 따라 이들 복합체 형성 정도가 크게 달라진다는 단점이 있다. 따라서 살아 있는 세포 내에서 이들의 상호작용을 모니터링 할 수 있는 시스템이 필요하다.
상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 살아있는 세포의 생리적 조건 하에서 타우-튜불린 상호작용을 모니터링하기 위한 신뢰성 있는 시스템을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 살아있는 세포 내에서 타우와 튜불린의 상호작용을 관찰할 수 있는, 이분자 형광 상보성(BiFC, bimolecular fluorescence complementation)을 도입한 세포 모델을 제공하는 것이 목적이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다
본원의 제1 측면은, 타우 유전자와 제1 형광 단백질 유전자를 포함하는 제1 아미노산 서열; 및 제2 형광 단백질 유전자와 튜불린(tubulin) 유전자를 포함하는 제2 아미노산 서열;을 포함하고, 상기 타우 유전자와 튜불린 유전자로부터 발현된 단백질의 상호 응집에 의하여, 상기 제1 형광 단백질 유전자와 제2 형광 단백질 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 결합해서 형광을 띄는, 세포 내 타우-튜불린(tubulin) 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍이다.
상기 타우 유전자는 전장 타우, 상기 전장 타우의 단편, 또는 상기 전장 타우의 변이체일 수 있다. 예를 들어서, 상기 타우 유전자는 인간의 hTau40 유전자일 수 있고, 인간 전장타우 유전자 Tau-P301L인 것도 가능하며, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 상기 타우 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어진 것이 가능하다. 본원의 일 실시예에서는 서열번호 1로 표시되는 전장타우 유전자를 사용하였다.
아직까지도 타우병증에 있어서 신경섬유매듭들의 병리생리학적 중요성, 이러한 과정을 유발하는 원인 및 분자적 메카니즘에 대해서는 그다지 알려진 바가 없는데, 이는 생리학적 조건하에서 타우 응집을 모니터링하기 위한 신뢰성 있는 방법이 존재하지 않는다는 점 때문이다. 현재까지 타우 응집에 대한 대부분의 연구들은 정제된 타우 또는 타우 단편을 사용하여 비생리학적 조건하에서 수행되었다. 나아가, 타우의 응집 프로세스 과정에서 타우와 튜불린(tubulin)의 상호작용은 아직까지 자세하게 알려진 바가 없다. 이러한 이유로, 살아있는 세포 내에서 타우와 튜불린의 결합을 유도하고 이를 모니터링할 수 있는 세포 모델은 타우 병리학을 연구하고, 그 과정을 방지 및 되돌릴 수 있는 방법들을 개발하는데 유용한 도구가 될 수 있다.
상기 제1 형광 단백질 유전자 및/또는 제2 형광 단백질 유전자는, 상기 타우 유전자와 튜불린 유전자로부터 발현된 단백질의 상호 응집에 의하여, 상기 제1 형광 단백질 유전자와 제2 형광 단백질 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 결합해서 형광을 띄는 것일 수 있다. 즉, 상기 타우 유전자와 튜불린 유전자로부터 발현된 단백질의 상호 응집이 일어나면, 그에 따라 동시에 또는 연속해서 서로 결합함으로서 형광을 띠는 단백질인 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 형광 단백질은 비너스(Venus) 단백질이거나 그것의 단편일 수 있다.
본 발명은 이분자 형광 상보 기법(BiFC), 즉 관심 단백질에 부착된 비형광성 구성요소로부터 형광 단백질 복합체를 형성하는 기술에 기반을 둔 단백질-단백질 상호작용을 가시화하기 위한 방법(Annu. Rev. Biophys. 37: 465-487)을 응용한 것이다. 종래에는 분할 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP) 상보 기법이 타우 응집을 정량화하기 위해 사용되었는데, 이는 타우를 더 작은 GFP 단편들에 융합시키고(GFP 11), 더 큰 GFP 단편(GFP 1-10)을 갖는 세포들에서 발현키는 방법이었다. 타우가 모노머 또는 작은 응집체로 존재하는 경우에는 큰 GFP 단편이 타우에 융합된 작은 GFP 단편에 접근할 수 있으며, 이로 인해서 형광 활성을 갖는 GFP의 결합이 이루어진다. 그러나, 타우가 응집하는 경우에는 활성 GFP의 재구성이 억제되고, 세포들에서 GFP 형광이 감소하게 된다. 따라서 타우의 응집을 정량화하는 방법으로서 상기 분할-GFP 분석법이 제안되었지만, 분해능이 낮고 형광의 감소를 측정할 수 있는 범위가 제한적이므로, 신경 독성의 원인이 되는 타우 올리고머의 생성과정을 모니터링하기에는 적합하지 않은 문제점이 제기되었다.
황색 형광 단백질(yellow fluorescence protein, YFP)의 일종인 비너스(Venus) 단백질을 이용한 BiFC는 서로 다른 두 표적 단백질들이 상호작용을 하기 위해 근접하게 되면 표적 단백질에 연결된 형광 단백질 절편 또한 가까워지게 되고, 그 결과 형광 절편 단백질 사이에 재구성(reconstruction)이 일어나게 되어 형광을 발하게 되는 원리를 이용한 것이다. 이를 이용하면 두 표적 단백질 간에 상호작용이 일어났음을 시각적으로 확인할 수 있으므로, 세포 또는 조직 내, 즉 단백질간 상호작용이 일어나고 유지될 수 있는 최적의 물리·화학적인 환경하에서 단백질간 상호작용을 직접 눈으로 확인할 수 있는 장점이 있다. 이 기술은 세포 또는 조직 내에서 단백질 상호작용이 일어나는 위치뿐만 아니라 이들의 움직임 정보까지도 확인 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 형광 단백질은 비너스 단백질일 수 있는데, 비너스 단백질은 (1) 빠르고 효과적으로 성숙되고 (maturation), (2) 자가-조립 (self-assembly) 속도가 다른 BiFC 쌍들에 비해서 낮으며, (3) 비너스계 BiFC의 형광 강도가 EYFP계 BiFC의 형광 강도보다 10 배 더 높은 특징을 보이므로 타우 단백질과 같이 시공간적으로 분석하기 어려운 세포내 단백질 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 타우 유전자와 제1 형광 단백질 유전자; 및 상기 제2 형광 단백질 유전자와 튜불린 유전자;는 각각 작동 가능하게 연결된 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 따른 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열을 각각 포함하는 벡터에서, 하나의 프로모터에 의해 타우 유전자와 제1 형광 단백질 유전자 및 제2 형광 단백질 유전자와 튜불린 유전자가 연속적으로 발현되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 타우 유전자와 제1 형광 단백질 유전자는 제1 링커에 의해 연결된 것이 가능하고, 상기 제2 형광 단백질 유전자와 튜불린 유전자는 제2 링커에 의해 연결된 것일 수도 있다.
본원의 다른 일 구현예로서, 상기 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열은, 각각 신경 특이적 프로모터를 포함하는 것이 가능하다. 상기 신경 특이적 프로모터는, 본 발명에 따른 아미노산 쌍을 신경 관련 조직에서 발현시키기 위한 것으로, 특별히 제한되지 않으며, 이 기술분야에 알려진 다양한 모든 것을 포함할 수 있다. 예를 들어서, 상기 신경 특이적 프로모터는 CMV6 및/또는 Thy1 프로모터인 것이 가능하다. 상기 CMV6 및/또는 Thy1 프로모터는 신경세포에서 특이적으로 발현하기 때문에, 신경 세포 또는 신경 조직, 특히 뇌조직 내에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 아미노산 쌍(컨스트럭트 또는 융합단백질)을 발현시키면, 상기 타우 유전자와 튜불린 유전자로부터 발현된 단백질의 상호 응집에 의하여, 상기 제1 형광 단백질 유전자와 제2 형광 단백질 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 결합해서 형광을 띄는 것이 특징이고, 이에 따르면, 살아있는 세포 내에서 타우와 튜불린의 상호작용을 관찰할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 미세소관 및 α/β-튜불린 이량체(dimer)의 구조를 나타낸 도이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 튜불린은 알파-튜불린(α-tublin) 또는 베타-튜불린(β-tublin)일 수 있고, 그 중에서도 상기 튜불린은 알파-튜불린(α-tublin)인 것이 바람직하다. 후술하는 제조예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 튜불린에 대한 BiFC-labeling site 결정 실험에 의하면, 알파-튜불린-BiFC 쌍이 가장 강한 형광을 나타내었고, 이는 BiFC 형광신호가 세포질의 미세소관-번들(microtubule-bundle) 구조에 국한(localized)되어 있기 때문인 것으로 보여진다.
그리고, 본 발명에 따른 제1 아미노산 서열의 경우, 상기 타우 유전자의 N-말단 또는 C-말단에 상기 제1 형광 단백질 유전자가 연결되어 있을 수 있고, 그 중에서도 상기 타우 유전자의 C-말단에 상기 제1 형광 단백질 유전자가 연결되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 제2 아미노산 서열의 경우, 상기 튜불린 유전자의 N-말단 또는 C-말단에 상기 제2 형광 단백질 유전자가 연결되어 있을 수 있고, 그 중에서도 상기 튜불린 유전자의 N-말단에 상기 제2 형광 단백질 유전자가 연결되어 있는 것이 바람직하다. 이는 제1 아미노산 서열에서는 타우 유전자를 형광 단백질의 유전자보다 앞에 위치시키고, 제2 아미노산 서열에서는 튜불린 유전자를 형광 단백질의 유전자보다 뒤에 위치시키는 것이, 구조적으로 상기 유전자들에 의해 발현된 타우 단백질과 튜불린 단백질의 상호작용(또는 결합)으로 인한 형광 단백질의 발광 효과를 더욱 높일 수 있기 때문인 것으로 보여진다. 실제로, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 타우 유전자가 형광 단백질의 유전자보다 앞에 위치하고, 튜불린 유전자가 형광 단백질의 유전자보다 뒤에 위치하는 경우(실시예 3~6)가 그렇지 않은 경우(실시예 1~2)보다 형광 강도가 높게 발현되었다.
이와 함께, 본 발명에 따른 상기 제1 및 제2 형광 단백질은 각각 비너스(Venus) 단백질 중에서도 서로 결합 가능한 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 제1 및 제2 아미노산 서열에서 형광 단백질은 같거나 다를 수도 있다.
예를 들어, 상기 제1 형광 단백질 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어지고, 상기 제2 형광 단백질 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어진 것이 가능하다. 즉, 상기 제1 형광 단백질 유전자는 VN173이고, 상기 제2 형광 단백질 유전자는 VC155인 것이 가능하다.
또한, 상기 제1 형광 단백질 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어지고, 상기 제2 형광 단백질 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어진 것일 수 있다. 즉, 상기 제1 형광 단백질 유전자는 VC155이고, 상기 제2 형광 단백질 유전자는 VN173인 것이 가능하다.
후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 튜불린으로서 알파-튜불린을 사용하는 경우(실시예 1, 5, 6), 상기 타우 유전자의 C-말단에 상기 제1 형광 단백질 유전자가 연결되어 있고, 상기 튜불린 유전자의 N-말단에 상기 제2 형광 단백질 유전자가 연결되어 있는 경우(실시예 5, 6)가 그렇지 않은 경우(실시예 1)보다 발광효과가 우수하였다.
나아가, 상기 타우 유전자의 C-말단에 상기 제1 형광 단백질 유전자가 연결되어 있고, 상기 튜불린 유전자의 N-말단에 상기 제2 형광 단백질 유전자가 연결되어 있는 경우(실시예 5, 6) 중에서, 상기 제1 형광 단백질 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어지고, 상기 제2 형광 단백질 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어진 경우(실시예 5)가 그렇지 않은 경우(실시예 6)보다 발광효과가 더욱 우수하였다.
본원의 제2 측면은, 상기한 아미노산 서열 쌍을 암호화하거나 코딩하는 염기서열 쌍이다. 즉, 상기 제1 아미노산 서열을 암호화하는 제1 염기서열과 상기 제2 아미노산 서열을 암호화하는 제2 염기서열을 포함할 수 있다.
본원의 제3 측면은, 상기한 염기서열 쌍을 포함하는 재조합 벡터이다. 하나의 벡터 안에 상기한 염기서열 쌍을 모두 포함할 수 있고, 제1 염기서열과 제2 염기서열을 각각 포함하는 제1 벡터와 제2 벡터의 쌍인 것도 가능하다.
본원의 제4 측면은, 상기한 재조합 벡터에 의해 트랜스펙션(transfection)된 세포주이다. 상기한 재조합 벡터에 의해 일시적으로 형질감염된 세포이거나, 장기적 또는 지속적으로 형질전환된 세포일 수 있다. 본 발명자들은 후술하는 실시예 5에 해당하는 아미노산 서열 쌍을 HEK 세포에 형질감염시켰고, 그 중에서도 발광 효과가 우수한 세포주를 계대배양하여 안정한 세포주(KIST_HTTB1)를 얻었으며, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC13639BP로 기탁하였는바, 본 발명에 따른 세포주는 기탁번호 KCTC13639BP로 기탁된 것일 수 있다.
본원의 제5 측면은, 상기한 아미노산 서열 쌍에 의해 발현된 단백질을 포함하는, 타우-튜불린 상호작용 모니터링용 조성물이다. 또한, 본 발명은 상기한 아미노산 서열 쌍에 의해 발현된 단백질을 포함하는, 타우-튜불린 결합 현상 검출용 조성물이거나 또는 타우-튜불린 결합 저해제 스크리닝용 조성물인 것도 가능하다.
본원의 제6 측면은, 상기한 세포주에 미세소관의 교란을 일으키는 물질을 처리하고, 상기 처리된 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 세포주에 대해서 면역블롯 분석을 수행하는 단계;를 포함하는, 세포에서 타우-튜불린 상호작용을 모니터링하는 방법이다. 상기 미세소관의 교란을 일으키는 물질은 택솔 또는 빈블라스틴 또는 노코다졸인 것이 가능하다.
본 발명에 따른 타우-튜불린 세포 모델을 이용하여, 노코다졸에 의해 형성이 증가된 용해성 타우-튜불린 복합체와, 빈블라스틴에 의해 유도된 나선형 타우-튜불린 복합체를 관찰하였고, 또한, 타우응집을 유도하는 약물을 처리함으로써 타우와 튜불린의 공동 응집현상을 관찰한 결과, 본 세포 모델은 타우와 튜불린의 상호작용의 변화를 모니터링 할 수 있으며, 이로써 퇴행성 뇌질환을 제어하는 약물을 개발하기 위한 플랫폼으로서 활용될 수 있다.
상기한 본 발명에 의하면, 이분자 형광 상보성(BiFC, bimolecular fluorescence complementation)을 도입한 세포 모델을 이용하여, 살아있는 세포 내에서 타우와 튜불린의 상호작용을 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 타우와 튜불린 각각에 부착된 비형광성 구성 요소는 타우와 튜불린의 결합으로 인해 물리적 거리가 가까워질 때 형광을 발하여 두 단백질간의 상호작용을 관찰할 수 있게 한다.
본 발명에 따르면, 살아있는 세포들에서 타우-튜불린 상호작용을 직접적으로 가시화할 수 있게 함으로써, 타우와 튜불린의 상호작용 과정을 모니터링하고 정량화할 수 있다. 따라서, 타우 및 튜불린이 관여하는 질병의 발생을 연구하며, 타우-튜불린 결합을 방지하고 되돌리기 위한 방법을 개발하는데 있어서 유용한 수단으로 활용될 수 있다.
도 1은 미세소관 및 α/β-튜불린 이량체(dimer)의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 비너스(Venus) 단백질인 BiFC와 융합된 튜불린 쌍을 나타낸 모식도로, 튜불린 간의 상호작용에 의해 비너스 형광이 켜지는 형광 turn-on 센서로 작용하는 원리이다.
도 3은 튜불린의 N-말단 또는 C-말단에 BiFC가 표지된 플라스미드 6 개를 나타낸 pCMV 벡터를 이용한 벡터 지도(Vector maps)이다(pCMV6-VN173-Tubulin-α, pCMV6-VC155-Tubulin-α, pCMV6-Tubulin-α- VN173, pCMV6-VN173-Tubulin-β, pCMV6-VC155-Tubulin-β, 및 pCMV6-Tubulin-β-VN173).
도 4는 튜불린-BiFC 컨스트럭트 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹의 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교군)의 형질감염 72시간 후에 총 RNA를 추출하여 mRNA 발현 정도를 확인한 것이다. 좌측은 mRNA로부터 합성된 cDNA를 겔 전기영동으로 분획하여 나타낸 것이고, 우측은 VN173 및 VC155 프라이머를 이용하여 RT-PCR 분석하여 나타낸 그래프이다(데이터는 평균±s.d.).
도 5는 튜불린-BiFC 컨스트럭트 쌍 (i)~(vi) 그룹의 HEK293 세포 및 BiFC only(VN173-VC155 쌍) 그룹의 HEK293 세포에 대한 BiFC 형광 이미지이다. 핵은 Hoechst로 염색하였다(Scale bar = 20 μm).
도 6은 튜불린-BiFC 컨스트럭스 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹의 cellular BiFC 강도의 Single-cell 분석을 나타낸 그래프이다. BiFC 형광 강도는 Harmony 3.1 소프트웨어를 사용하였으며, Graphpad prism 소프트웨어로 플롯(plot)하였다. 각 실험마다 총 19,000개의 세포를 분석하였고, 그래프의 각 점은 개별 세포를 나타낸다.
도 7은 튜불린-BiFC 컨스트럭스 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i), (iii), 및 (v) 그룹의 고해상도(1,000x) 이미지이다(Scale bar = 20 μm).
도 8은 튜불린-BiFC 컨스트럭스 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i), (iii), 및 (v) 그룹의 세포질 BiFC 형광 강도 및 총 번들 길이에 대한 정량값을 나타낸 그래프이다(데이터는 평균±s.d., n = 20).
도 9는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹(실시예 1 내지 6)의 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교예 1)의 총 RNA를 추출하여 mRNA 발현 정도를 확인한 것이다. 좌측은 mRNA로부터 합성된 cDNA를 겔 전기영동으로 분획하여 나타낸 것이고, 우측은 VN173 및 VC155 프라이머를 이용하여 RT-PCR 분석하여 나타낸 그래프이다(데이터는 평균±s.d.).
도 10은 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹(실시예 1 내지 6)의 BiFC 형광 이미지이다(Scale bar = 50 μm).
도 11은 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹(실시예 1 내지 6)의 cellular BiFC 강도의 Single-cell 분석을 나타낸 그래프이다. BiFC 형광 강도는 Harmony 3.1 소프트웨어를 사용하였으며, 각 실험마다 총 7,000개의 세포를 분석하였고, 그래프의 각 점은 개별 세포를 나타낸다.
도 12는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (v) 그룹(실시예 5) 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교예 1; Control)의 FACS 분석을 나타낸 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 FACS를 이용하여 선별된 P2 부분 세포에 대한 G418 성분을 함유한 성장 배지에서 6회 계대 배양하는 모습을 나타낸 안정한 타우-튜불린 BiFC 세포주 확립에 대한 scheme이다.
도 14는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (v) 그룹(실시예 5)의 살아있는 세포에서 타우와 튜불린의 상호작용을 보여주는 고해상도(1,000X) BiFC 형광 이미지이다(Scale bar = 20 μm).
도 15는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (v) 그룹(실시예 5) 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교예 1; Control)의 타우(S262) 항체 및 α/β-튜불린 항체를 이용한 면역블롯(Immunoblot) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 Straight 미세소관 또는 탈폴리머화된 미세소관에서 타우-튜불린 상호작용을 나타낸 다이어그램이다.
도 17은 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포주에 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastsin), 및 노코다졸(nozodazole)을 각각 처리 후 살아있는 세포에서의 고해상도(1,000X) BiFC 형광 이미지이다(Scale bar = 20 μm). Control은 상기 3가지 물질을 처리하지 않은 상태이다.
도 18은 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포주에 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastsin), 및 노코다졸(nozodazole)을 각각 처리 후 Tubulin 항체로 면역형광염색을 실시한 이미지이다(Scale bar = 20 μm). Control은 상기 3가지 물질을 처리하지 않은 상태이다.
도 19는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포주에 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastsin), 및 노코다졸(nozodazole)을 각각 처리시간(0, 6, 20, 29, 및 50 hrs)에 따른 BiFC 형광 강도를 정량화한 그래프이다(데이터는 평균±s.d., Student's t-test, *p<0.05, **p<0.01).
도 20은 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 제조된 타우-BiFC 세포(비교군)에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지이다. Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다(Scale bar = 20 μm).
도 21은 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 제조된 타우-BiFC 세포(비교군)에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지에 대한 번들(bundles) 또는 전체 세포 면적(total cell area)의 정량화 그래프이다(Error bars = Standard deviation of two independent experiments; **p<0.01, ***p<0.001). Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다.
도 22는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지에 대한 번들(bundles) 또는 전체 세포 면적(total cell area)의 정량화 그래프이다(Error bars = Standard deviation of two independent experiments; **p<0.01, ***p<0.001). Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다.
도 23은 (A) 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 제조된 타우-BiFC 세포(비교군)에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지이며, 핵은 Hoechst로 염색한 것이다. Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다(Scale bar = 100 μm). (B, C) (A)의 BiFC 형광 강도를 정량화한 그래프이다(데이터는 평균±s.d., ***p<0.001).
도 24는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 아무것도 처리하지 않은 세포(비교예 1)에 대하여 3가지 타우 응집 유도제를 각각 처리 후 면역블롯을 실시한 결과이다(anti-TauS262, p-Tau (S199), p-Tau (S396) 또는 α / β-tubulin 항체). Loding control은 endogenous tubulin이다.
도 25는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 아무것도 처리하지 않은 세포(비교예 1)에 대하여 3가지 타우 응집 유도제를 각각 처리 후 면역블롯을 실시한 결과에 대하여 total tau, phosphorylated tau, 및 VN173-α-tubulin을 정량화한 그래프이다. VN173-α-tubulin의 상대량은 endogenous tubulin 상대량에 대하여 노말라이즈하였다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명에서는 비너스 단백질의 N-말단 또는 C-말단 비형광 부분들에 타우 또는 튜불린을 융합시킨, 비너스 단백질 기반의 BiFC 방법을 채용하였다. 후술하는 제조예, 실시예, 실험예에서는 타우와 튜불린이 함께 결합되는 경우에 비너스 형광이 관찰된다.
제조예 : 튜불린에 대한 BiFC -labeling site 결정
도 2는 비너스(Venus) 단백질인 BiFC와 융합된 튜불린 쌍을 나타낸 모식도로, 튜불린 간의 상호작용에 의해 비너스 형광이 켜지는 형광 turn-on 센서로 작용하는 원리이다.
본 제조예에서는 타우-튜불린-BiFC 컨스트럭트(constructs)를 제조하기에 앞서, BiFC-라벨링(labeling)이 튜불린의 생리적 기능이나 세포 생존능력에 대한 저해여부를 파악하고자, 도 2에 나타난 바와 같이 비너스 단백질과 튜불린이 연결된 융합단백질을 준비하여 튜불린에 대한 BiFC-라벨링 효과를 확인하였다(도 2).
1) 튜불린-BiFC 플라스미드의 제작
α- 및 β- 튜불린-BiFC 플라스미드를 타우-BiFC 플라스미드(pCMV6-hTau40-VN173 및 pCMV6-hTau40-VC155)를 기초로 하여 제조하였다. 상기 타우-BiFC 플라스미드는 대한민국 등록특허 제10-1721920호에 기재된 방법에 따라 준비할 수 있고, 상기 타우는 전장 인간 타우(441개 아미노산, 서열번호 1)를 이용하였다.
타우를 튜불린으로 대체하기 위하여 α- 및 β- 튜불린 cDNAs(OriGene Technologies, Inc., NM006009 및 NM178014) 이용하였고, 상기 α- 및 β- 튜불린 cDNAs를 BglII/PmeI (Tubulin-α)과 KpnI/PmeI (Tubulin-β) 제한효소 서열을 포함하는 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 상기 Tubulin-α 및 Tubulin-β에 해당하는 Forawrd(전방; F) 및 Reverse(후방; R) 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
구분 이름 서열
1 Tubulin-α F 5’-CTGTACAAGAGATCTATGCGTGAGTGCATCTCCATC -3’
2 Tubulin-α R 5’-CGGCCGGCCGTTTAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT GGAT-3’
3 Tubulin-β F 5’-CTGTACAAGGGTACCATGAGGGAAATCGTGCACATC CAG-3’
4 Tubulin-β R 5’-CGGCCGGCCGTTTAAACTCATCAATGTATCTTAT CATGTCTGGATCCC-3’
이와 같이 α- 및 β- 튜불린-BiFC 플라스미드를 도 3에 나타낸 바와 같이 제조하였다 (pCMV6-VN173-Tubulin-α, pCMV6-VC155-Tubulin-α, pCMV6-Tubulin-α- VN173, pCMV6-VN173-Tubulin-β, pCMV6-VC155-Tubulin-β, 및 pCMV6-Tubulin-β-VN173). 상기 제조된 α- 및 β- 튜불린-BiFC 플라스미드는 DNA 시퀀싱 및 제한 효소 절단(restriction enzyme digestion)을 통해 제조가 잘 되었음을 확인하였다.
2) Transient transfection(일시적 형질감염) 및 BiFC-이미지 획득
도 3은 튜불린의 N-말단 또는 C-말단에 BiFC가 표지된 플라스미드 6 개를 나타낸 pCMV 벡터를 이용한 벡터 지도(Vector maps)이다(pCMV6-VN173-Tubulin-α, pCMV6-VC155-Tubulin-α, pCMV6-Tubulin-α- VN173, pCMV6-VN173-Tubulin-β, pCMV6-VC155-Tubulin-β, 및 pCMV6-Tubulin-β-VN173).
본 발명자들은 BiFC로서 비너스 단백질인 VN173(서열번호 2) 및 VC155(서열번호 3)를 이용하였고, 상기 VN173 또는 VC155는 타우 또는 튜불린의 N-말단 또는 C-말단과 연결될 수 있다.
N- 또는 C- 말단에서 VN173 또는 VC155 단편을 포함하는 다양한 α- 또는 β- 튜불린 컨스트럭트를 도 3에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 그리고, 도 3에 나타낸 컨스트럭트 6가지를 2개씩 조합하여, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 컨스트럭트 1과 컨스트럭트 2를 조합한 총 6 그룹의 컨스트럭트 쌍(표 2; 도 5의 도식 참조; (i)~(vi)그룹)을 준비하였고, 상기 6 그룹의 컨스트럭트 쌍을 HEK293 세포에 형질감염시켰다.
그룹 컨스트럭트 1 컨스트럭트 2
(i) VN173-α-tubulin VC155-α-tubulin
(ii) VN173-β-tubulin VC155-β-tubulin
(iii) VN173-α-tubulin VC155-β-tubulin
(iv) α-tubulin-VN173 β-tubulin-VC155
(v) VN173-α-tubulin β-tubulin-VC155
(vi) α-tubulin-VC155 VN173-β-tubulin
비교군(Con) 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포
* α-tubulin 또는 β-tubulin 의 좌측 : N-말단
* α-tubulin 또는 β-tubulin 의 우측 : C-말단
이를 위하여,HEK293 세포를 10% FBS, 100 units/ml penecillin, 및 100 μg/ml steptomycin을 포함하는 DMEM 배지에 37 ℃, 5% CO2 조건을 만족하는 가습 환경(humidified atmosphere)에서 유지시켰다. 이어서, 일시적 형질감염을 위해 HEK293 세포를 Opti-MEM 배지(Invitrogen 제조사)와 함께 μ-clear 96-well 플레이트에 도말하였다. 12시간 동안 상기 도말된 HEK293 세포를 부착 후, Lipofectamineⓡ2000 시약(Invitrogen 제조사)을 사용하여, 상기한 6 그룹의 컨스트럭트 쌍(하기 표 2 참조)을 각각 0.1 μg을 넣어 형질감염을 진행하였다. 상기 형질감염 후 48 시간 내지 72 시간이 지난 뒤에, 전체 플레이트를 Operettaⓡ (PerkinElmer)를 사용하여 자동으로 이미지화하고 Nikon Eclipse inverted microscope (Ti, Nikon) 1,000x 배율에서 모든 고해상도 이미지를 얻었다.
3) RNA 추출 및 QPCR(Real-time quantitative RT-PCR) 분석
제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약(Life Technologies)을 사용하여 형질감염된 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. mRNA 전사는 TaqMan Reverse Transcriptase(Bioneer Inc.)로 수행하였고, QPCR은 FAST qPCR Kit Master Mix(KAPABIOSYSTEMS)를 이용하였다. 증폭시킨 mRNA 양을 제조자의 지시에 따라 StepOne Plus(Life Technologies)를 사용하여 평가하였다. mRNA의 상대적인 양(RQ)은 비교 역치주기(Ct) 방법을 통해 얻어지고, 내인성 대조군으로서 GAPDH를 사용하여 노말라이즈하였다. VN173, VC155, GAPDH에 대한 Forawrd(전방; F) 및 Reverse(후방; R) 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
구분 이름 서열
1 VN173-F 5’-GAC GAC GGA CAA CTA CAA GAC-3’
2 VN173-R 5’-TTC AGC TCG ATG CGG TTC AC-3’
3 VC155-F 5’-AGC AAA GAC CCC AAC GAG AA-3’
4 VC155-R 5’-TCG TCC ATG CCG AGA GTG AT-3’
5 GAPDH-R 5’-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TT-3’
6 GAPDH-F 5’-CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3’
4) BiFC-이미지 분석
Operettaⓡ 로부터 얻은 BiFC 형광 이미지를 Harmony 3.1 소프트웨어 (PerkinElmer)를 이용하여 분석하였다. 모든 실험은 3번 반복 수행되었으며 BiFC 형광 강도의 평균 및 표준편차는 Prism 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 플롯하였다. 또한, 정량화 데이터는 Student’s t-test로 분석하였다.
5) 결과
도 4는 튜불린-BiFC 컨스트럭트 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹의 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교군)의 형질감염 72시간 후에 총 RNA를 추출하여 mRNA 발현 정도를 확인한 것이다. 좌측은 mRNA로부터 합성된 cDNA를 겔 전기영동으로 분획하여 나타낸 것이고, 우측은 VN173 및 VC155 프라이머를 이용하여 RT-PCR 분석하여 나타낸 그래프이다(데이터는 평균±s.d.). 그리고, 도 5는 튜불린-BiFC 컨스트럭트 쌍 (i)~(vi) 그룹의 HEK293 세포 및 BiFC only(VN173-VC155 쌍) 그룹의 HEK293 세포에 대한 BiFC 형광 이미지이다. 핵은 Hoechst로 염색하였다(Scale bar = 20 μm).
상기 표 2에 나타난 컨스트럭트 1 및 2의 구성을 이용하여 형질감염시킨 HEK293 세포((i) 내지 (vi) 그룹) 및 형질감염시키지 않은 HEK293 세포(도 5의 con 그룹)로부터 각 튜불린-BiFC 쌍의 mRNA 발현 수준을 비교하였고(도 4), 상기 비교된 조합 중 α-튜불린-BiFC 쌍이 가장 강한 BiFC 형광을 나타내었다(도 5).
도 6은 튜불린-BiFC 컨스트럭스 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹의 cellular BiFC 강도의 Single-cell 분석을 나타낸 그래프이다. BiFC 형광 강도는 Harmony 3.1 소프트웨어를 사용하였으며, Graphpad prism 소프트웨어로 플롯(plot)하였다. 각 실험마다 총 19,000개의 세포를 분석하였고, 그래프의 각 점은 개별 세포를 나타낸다. 도 7은 튜불린-BiFC 컨스트럭스 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i), (iii), 및 (v) 그룹의 고해상도(1,000x) 이미지이다(Scale bar = 20 μm). 도 8은 튜불린-BiFC 컨스트럭스 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i), (iii), 및 (v) 그룹의 세포질 BiFC 형광 강도 및 총 번들 길이에 대한 정량값을 나타낸 그래프이다(데이터는 평균±s.d., n = 20).
(i)그룹의 이미지(도 5 ~ 7)에 나타난 바와 같이, α-튜불린-BiFC 쌍((i)그룹)의 형광이 가장 강하게 나왔음을 알 수 있고, 이는 BiFC 형광신호가 세포질의 미세소관-번들(microtubule-bundle) 구조에 국한(localized)되어 있음을 알 수 있었다. 이와 반대로, 도 5의 β-튜불린-BiFC 쌍((ii)그룹)의 발현은 수축된 세포 형태를 보여줌으로써 세포 독성을 일으킬 수 있음을 보여주었다.
α- 또는 β- 튜불린의 N- 또는 C- 말단의 다양한 위치에서 BiFC가 표지된 α- 및 β- 튜불린 쌍의 동시 발현(도 5의 (iii)~(vi) 그룹)은 미세소관-유사 BiFC 표현형을 보이지 않았다. 이러한 실험결과는 β- 튜불린의 과발현이 소량이라 할지라도 미세소관 조립을 방해하고, 궁극적으로 세포 독성을 유발한다는 것이다.
흥미롭게도 BiFC가 α- 및 β- 튜불린 쌍의 각 N-말단에 표지되었을 때((iii)그룹), 세포질에서 BiFC 형광이 강하게 나타났다(도 5 및 7). 이는 도 8의 결과를 바탕으로 세포질에서 BiFC 형광강도가 강하게 나타나고, Longest-bundle의 길이가 길지 않으므로 α- 및 β- 튜불린의 이합체 또는 올리고머가 형성되었음을 의미한다(도 8).
또한, BiFC가 α- 및 β- 튜불린 쌍의 각 C-말단에 표지되었을 때((iv)그룹), BiFC 형광이 미약하였다(도 5). 이는 BiFC가 C-말단에 표지된 튜불린은 세포독성이 있음을 보여준다.
BiFC가 α-튜불린의 N-말단 및 β- 튜불린의 C-말단에 각각 표지되었을 경우((v)그룹), BiFC의 형광신호는 핵을 포함한 세포 전체에서 검출되었다(도 5 및 7). 이는 도 5에 나타난 VN173 및 VC155 쌍(BiFC only)의 BiFC background 형광 표현형과 유사함을 알 수 있다.
따라서, 결과적으로 N-말단에 BiFC가 표지된 α-튜불린 쌍((i)그룹)이 튜불린의 자체 기능에 영향을 미치지 않으면서 타우-튜불린 상호작용을 확인하는데 가장 우수함을 보여주었다.
실시예 : 안정한 타우-튜불린-BiFC 세포주 확립
1) 타우-튜불린 BiFC 세포주 확립
타우-튜불린 BiFC 세포주 생성을 위해 HEK293 세포를 하기 표 4에 나타낸 것과 같이 실시예 1 내지 6의 컨스트럭트 1 및 2의 구성에 따라 실시예별 동시 형질감염을 진행하였다. 안정적인 세포주 확립을 위해 상기 형질감염된 세포는 100 ㎍/ml Geneticin(G418; Sigma)을 함유하는 성장배지와 함께 배양하여 선별하였다. 또한, 상기 선별된 세포는 FACSAria(BD Bioscience)를 이용하여 형광을 나타내는 세포로 분류하였다.
또한, 실시예와의 비교를 위해 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포를 비교군(비교예 1)으로 준비하였다.
구분 그룹 컨스트럭트 1 컨스트럭트 2
실시예 1 (i) Tau-VN173 α-tubulin-VC155
실시예 2 (ii) Tau-VN173 β-tubulin-VC155
실시예 3 (iii) Tau-VC155 VN173-β-tubulin
실시예 4 (iv) Tau-VN173 VC155-β-tubulin
실시예 5 (v) Tau-VC155 VN173-α-tubulin
실시예 6 (vi) Tau-VN173 VC155-α-tubulin
비교예 1 비교군(Con) 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포
* α-tubulinm, β-tubulin, 또는 Tau 의 좌측 : N-말단
* α-tubulinm, β-tubulin, 또는 Tau 의 우측 : C-말단
2) Transient transfection(일시적 형질감염) 및 BiFC-이미지 획득
HEK293 세포를 이용하여 상기 실시예 구성에 따른 타우-튜불린 BiFC 세포주 생성을 위한 형질감염 실험방법에 대해 서술한다.
상기 제조예의 "Transient transfection(일시적 형질감염) 및 BiFC-이미지 획득" 부분의 실험방법과 동일하나, 그 실험대상이 튜불린-튜불린-BiFC 플라스미드 쌍이 아닌 타우-튜불린-BiFC 플라스미드 쌍으로 실험을 진행하였다. 상기 타우-튜불린-BiFC 플라스미드 쌍은 상기 표 4의 실시예 1 내지 6의 컨스트럭트 1 및 2로 구성된다.
3) 세포 배양 조건
상기 실시예 1 내지 6에 따른 타우-튜불린-BiFC 플라스미드 쌍을 적용한 타우-튜불린 BiFC 세포를 10% FBS, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 및 100 μg/mL G418를 포함하는 DMEM 배지에 37 ℃, 5% CO2 조건을 만족하는 가습 환경(humidified atmosphere)에서 유지시켰다.
아무것도 처리하지 않은 HEK293세포(비교예 1)도 상기와 동일한 조건에서 배양을 실시하였다.
4) RNA 추출 및 QPCR(Real-time quantitative RT-PCR) 분석
상기 제조예와 동일한 방법으로 분석하였다. 상기 실시예 및 비교예에 대한 결과는 도 9에 나타낸 바와 같다.
5) BiFC-이미지 분석
상기 제조예와 동일한 방법으로 분석하였다.
6) 면역블롯(Immunoblot) 분석
상기 표 4의 실시예 5((v)그룹)에 해당하는 VN173-α-tubulin과 Tau-VC155를 처리한 HEK293 세포와 아무것도 처리하지 않은 HEK293세포(비교예 1)를 준비하였다. 이어서, 상기 실시예 5에 의해 제조된 세포 및 비교예 1의 세포로부터 프로테아제(protease)와 포스파타제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail; Sigma)를 포함하는 RIPA lysis buffer(Sigma)를 이용하여 세포 용해액을 준비하였다. 이어서, SDS PAGE gel (7.5%)로부터 10 μg 의 단백질 용해물을 분리하여 상기 분리된 단백질 용해물을 PVDF 멤브레인에 옮겨 면역블롯 분석을 실시하였다. Tau antibodies 및 α/β-tubulin antibody 는 AbCam(Cambridge, MA)에서 구입하였다. 정량화 데이터는 Student’s t-test로 분석하였다.
7) 결과
타우-튜불린-BiFC 쌍(tau-tubulin BiFC pairs)을 스크리닝하기 위해서, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이 6개의 그룹 및 비교군에 대한 HEK293 세포를 준비하였다(도 10의 도식 참조; (i)~(vi)그룹; 실시예 1 내지 6 및 비교군).
상기 6개 (i)~(vi) 그룹 및 아무것도 처리하지 않은 비교군(con)에 대한 mRNA 발현 수준을 비교하였고, 그 결과는 도 9에 나타낸 바와 같다. 도 9는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹(실시예 1 내지 6)의 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교예 1)의 총 RNA를 추출하여 mRNA 발현 정도를 확인한 것이다. 좌측은 mRNA로부터 합성된 cDNA를 겔 전기영동으로 분획하여 나타낸 것이고, 우측은 VN173 및 VC155 프라이머를 이용하여 RT-PCR 분석하여 나타낸 그래프이다(데이터는 평균±s.d.). 형질감염된 HEK293 세포에서 실시예의 (i)~(vi)그룹이 cDNA 및 mRNA에 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다.
도 10은 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹(실시예 1 내지 6)의 BiFC 형광 이미지이다(Scale bar = 50 μm). 그리고, 도 11은 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (i)~(vi) 그룹(실시예 1 내지 6)의 cellular BiFC 강도의 Single-cell 분석을 나타낸 그래프이다. BiFC 형광 강도는 Harmony 3.1 소프트웨어를 사용하였으며, 각 실험마다 총 7,000개의 세포를 분석하였고, 그래프의 각 점은 개별 세포를 나타낸다.
도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, BiFC 형광 강도가 가장 유의하게 증가한 그룹은 (v)그룹으로서, VN173(BiFC)가 α-튜불린의 N-말단에 결합하고, VC155(BiFC)가 타우의 C-말단에 결합한 것에 해당된다. 또한, α-튜불린의 C-말단에 BiFC가 결합한 (i)그룹, β-튜불린의 C-말단에 BiFC가 결합한 (ii)그룹, 또는 β-튜불린의 N-말단에 BiFC가 결합한 (iii) 및 (iv)그룹의 경우, BiFC 형광이 (v)그룹에 비하여 상대적으로 약하게 나타났다.
다음으로, 안정한 세포주를 개발하기 위하여, 상기 표 4의 (v)그룹과 같이 타우-VC155(Tau-VC155)와 VN173-α-튜불린(VN173-α-tubulin)을 발현하는 HEK293 세포에 대해서 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 이용하여 분리하였다. 도 12는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (v) 그룹(실시예 5) 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교예 1; Control)의 FACS 분석을 나타낸 결과를 나타낸 도이다. 도 12에 나타난 바와 같이, (v)그룹에 해당하는 HEK293 Tau-tubulin BiFC 그래프의 P2에 해당하는 상위 10%의 세포들이 수집되었으며, 상기 해당 세포들은 매우 강한 BiFC 형광 강도를 보였다. 이와 반대로, 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포 비교군(control)에서는 BiFC 형광이 나타나지 않음을 확인하였다(도 12).
도 13은 FACS를 이용하여 선별된 P2 부분 세포에 대한 G418 성분을 함유한 성장 배지에서 6회 계대 배양하는 모습을 나타낸 안정한 타우-튜불린 BiFC 세포주 확립에 대한 scheme이다. 상기 P2에 해당하여 수집된 세포들은 선택적 약물인 G418을 포함하는 성장 배지에 Passage 6번째까지 계대배양하였다(도 13).
도 14는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (v) 그룹(실시예 5)의 살아있는 세포에서 타우와 튜불린의 상호작용을 보여주는 고해상도(1,000X) BiFC 형광 이미지이다(Scale bar = 20 μm). 결과적으로, 계대배양한 타우-튜불린-BiFC 세포주가 안정화되고, 미세소관 번들 유사 BiFC 형광 표현형을 나타냄을 확인하였다.(도 14).
다음으로, 튜불린과 타우에 대한 면역블롯(immunoblot) 분석을 수행하여 α-튜불린과 타우의 발현 여부를 확인하였고, 그 결과는 도 15에 나타낸 바와 같다. 도 15는 타우-튜불린-BiFC 쌍을 발현하는 HEK293 세포 (v) 그룹(실시예 5) 및 아무것도 처리하지 않은 HEK293 세포(비교예 1; Control)의 타우(S262) 항체 및 α/β-튜불린 항체를 이용한 면역블롯(Immunoblot) 분석 결과를 나타낸 도이다. 결과적으로, VN173-α-tubulin과 Tau-VC155는 각각 75 kD 근처에서 감지되었고, 타우-튜불린-BiFC 세포로서 안정한 세포주를 개발하였고, 타우-튜불린 상호작용을 연구에 이용될 수 있음을 판단하였다.
후술하는 실험예에서는 상기 표 4의 실시예 5((v)그룹)에 해당하는 VN173-α-tubulin과 Tau-VC155를 이용한 타우-튜불린-BiFC 세포를 대상으로 실험을 진행하였다.
실험예 1 : 미세소관 교란 물질 처리에 따른 타우-튜불린 상호작용에 대한 Live-cell investigation
1) 세포 배양 조건 및 화합물 처리
상기 실시예 5로부터 제조된 타우-튜불린 BiFC 세포를 10% FBS, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 및 100 μg/mL G418를 포함하는 DMEM 배지에 37 ℃, 5% CO2 조건을 만족하는 가습 환경(humidified atmosphere)에서 유지시켰다. 다음으로, 미세소관 파괴 약물(microtubuel-disrupting agents)을 처리하기 위해서 타우-튜불린 BiFC 세포는 μ-clear 96-well 플레이트에 올린 후, 다음 날 상기 플레이트에 부착된 타우-튜불린 BiFC 세포에 택솔(taxol), 노코다졸(nocodazole), 및 빈블라스틴(vinblastin)을 각 1μM 농도로 처리하였다. 상기 처리 후 배양 6, 20, 29, 및 50 시간마다 플레이트 전체를 Operettaⓡ (PerkinElmer)로 이미지화하였다.
2) BiFC-이미지 획득 및 분석
전체 플레이트를 Operettaⓡ (PerkinElmer)를 사용하여 자동으로 이미지화하고 Nikon Eclipse inverted microscope (Ti, Nikon) 1,000x 배율에서 모든 고해상도 이미지를 얻었다.
Operettaⓡ 로부터 얻은 BiFC 형광 이미지를 Harmony 3.1 소프트웨어 (PerkinElmer)를 이용하여 분석하였다. 모든 실험은 3번 반복 수행되었으며 BiFC 형광 강도의 평균 및 표준편차는 Prism 소프트웨어(GaphPad)를 사용하여 플롯되었다. 또한, 정량화 데이터는 Student’s t-test로 분석되하였다.
3) 면역형광염색
튜불린에 대하여 면역형광염색을 위해 96-well 플레이트에서 성장 타우-튜불린 BiFC 세포에 택솔(taxol), 노코다졸(nocodazole), 및 빈블라스틴(vinblastin)을 24 시간 동안 처리하였다. 이어서, 상기 처리된 세포를 3.7% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 침투시켰다. α-tubulin 검출을 위해 1차 항체 DM1A (AbCam, 1:1000)을 사용하였다. 다음으로, Nikon Eclipse inverted microscope를 이용하여 1,000x 배율에서 고해상도의 형광 이미지를 얻었다.
4) 결과
도 16은 Straight 미세소관 또는 탈폴리머화된 미세소관에서 타우-튜불린 상호작용을 나타낸 다이어그램이다. 최근 연구에 따르면, 타우의 4개 반복 도메인들이 미세소관 표면에 나란히 결합하여 미세소관 또는 튜불린 올리고머의 inter-dimer 및 intra-dimer 인터페이스를 지지한다(도 16).
타우-튜불린 간의 상호작용 변화를 관찰하기 위해서 본 발명자들은 타우-튜불린-BiFC 세포에 미세소관 교란 물질(microtubule dynamic disrupting agents)을 처리하였다.
도 17은 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포주에 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastsin), 및 노코다졸(nozodazole)을 각각 처리 후 살아있는 세포에서의 고해상도(1,000X) BiFC 형광 이미지이다(Scale bar = 20 μm). Control은 상기 3가지 물질을 처리하지 않은 상태이다. 그리고, 도 18은 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포주에 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastsin), 및 노코다졸(nozodazole)을 각각 처리 후 Tubulin 항체로 면역형광염색을 실시한 이미지이다(Scale bar = 20 μm). Control은 상기 3가지 물질을 처리하지 않은 상태이다. 또한, 도 19는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포주에 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastsin), 및 노코다졸(nozodazole)을 각각 처리시간(0, 6, 20, 29, 및 50 hrs)에 따른 BiFC 형광 강도를 정량화한 그래프이다(데이터는 평균±s.d., Student's t-test, *p<0.05, **p<0.01).
첫 번째로, 타우-튜불린-BiFC 세포에 택솔(taxol) 약물을 처리하였다. 택솔은 β-튜뷸린 N-말단 결합하여 미세소관을 안정화하는 것으로 알려져 있다. 또한, 타우는 택솔과 미세소관의 같은 자리에 결합하기 때문에 경쟁적으로 작용한다. 택솔을 처리한 결과, 타우-튜불린 상호작용으로 인한 BiFC 강도가 택솔 처리 전보다 24%로 두드러지게 감소하였다(도 17 및 18). 튜불린을 면역형광 염색했을 경우, 세포질에 미세소관 번들이 광범위하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 18). 따라서, 택솔은 튜불린의 평형을 용해성에서 중합 형태로 변화시키고, 그에 따라 미세소관에서 타우를 해리시킬 수 있다.
다음으로, 타우-튜불린-BiFC 세포에 빈블라스틴(Vinblastine) 약물을 처리하였다. 빈블라스틴은 미세소관 조립을 억제하고 튜불린의 자가조립으로 코일 나선형 응집체(coiled spiral aggregates)를 유도한다. 빈블라스틴을 처리한 결과, BiFC 강도는 처리 전보다 2.3배 증가하였고, 세포들은 나선형 필라멘트 표현형을 나타내는 것을 확인하였다(도 17 ~ 19). 튜불린을 면역형광 염색했을 경우, 튜불린 또한 나선형 필라멘트 구조를 나타냈다(도 18). 따라서, 빈블라스틴 처리로 타우-튜불린 간의 상호작용이 증가함을 확인하였다. 한편, 이러한 결과는 정제된 튜불린과 타우 절편을 이용한 in vitro binding assay에서 타우-튜불린 상호작용이 빈블라스틴에 의해 방해받는 다는 Kadavath group의 in vitro 결과와 모순되는데, 이는 in vitro binding assy와 live cell investigation의 조사방법의 차이일 수 있다.
마지막으로, 타우-튜불린-BiFC 세포에 노코다졸(Nocodazole) 약물을 처리하였다. 노코다졸은 미세소관의 폴리머화를 방해하는 것으로 알려져 있다. 노코다졸을 처리한 결과, 미세소관은 탈폴리머화를 진행하였고(도 18), 이와 반대로 BiFC 형광 강도는 처리 전보다 세포질에서 2.1배 증가한 것을 확인하였다(도 17 및 19). 이는 타우가 노코다졸 처리에 의해 세포질의 튜불린 올리고머에 강하게 결합하였음을 의미한다. 몇몇 in vitro 연구에서는 타우가 free cytosolic tubulin dimers와 결합하여 미세소관 폴리머화를 향상시킨다고 보고한 바 있다. 따라서, 타우는 살아있는 세포 내의 폴리머화되지 않은 튜불린과 결합함을 확인할 수 있다.
실험예 2 : 타우 응집 유도제 처리에 따른 타우-튜불린 상호작용의 증가
1) 면역블롯(Immunoblot) 분석
6-well 플레이트에서 성장한 타우-BiFC 세포(비교군) 및 타우-튜불린 BiFC 세포(실시예 5)를 forskolin (30 μM), thapsigargin (1 μM), 또는 tauK18P301L (5 μg/ml)를 48 시간 처리하였다. 이어서, 상기 처리된 세포로부터 프로테아제(protease)와 포스파타제 억제제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail; Sigma)를 포함하는 RIPA lysis buffer(Sigma)를 이용하여 세포 용해액을 준비하였다. 이어서, SDS PAGE gel (7.5%)로부터 10 μg 의 단백질 용해물을 분리하여 상기 분리된 단백질 용해물을 PVDF 멤브레인에 옮겨 Immuno-blot 분석을 실시하였다. Ser262, pSer199, 및 pSer396 는 AbCam(Cambridge, MA)에서 구입하였다. 정량화 데이터는 Student’s t-test로 분석하였다.
상기 타우-BiFC 세포(비교군)는 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 준비한 세포이다.
2) BiFC-이미지 획득 및 분석
전체 플레이트를 Operettaⓡ (PerkinElmer)를 사용하여 자동으로 이미지화하고 Nikon Eclipse inverted microscope (Ti, Nikon) 1,000x 배율에서 모든 고해상도 이미지를 얻었다.
Operettaⓡ 로부터 얻은 BiFC 형광 이미지를 Harmony 3.1 소프트웨어 (PerkinElmer)를 이용하여 분석하였다. 모든 실험은 3번 반복 수행되었으며 BiFC 형광 강도의 평균 및 표준편차는 Prism 소프트웨어(GaphPad)를 사용하여 플롯되었다. 또한, 정량화 데이터는 Student’s t-test로 분석하였다.
3) 결과
본 발명자들은 병리학적 타우 응집을 유도하는 조건에서 타우-튜불린 상호작용을 조사하였다. 타우-튜불린 BiFC 세포(실시예 5) 및 타우-BiFC 세포에 타우 응집 유도제로서 잘 알려진 Forskolin, thapsigargin, 및 tauK18P301L 정제 단백질을 사용하였다. Forskolin은 PKA(protein kinase A)의 활성제 역할을 가지며, 타우 응집을 유도한다. thapsigargin은 ER-stress inducer로, 타우의 과인산화 유도에 관여한다. tauK18P301L 정제 단백질은 prion-like tau species로, intracellular 타우 응집을 유도하는 것으로 알려져 있다.
도 20은 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 제조된 타우-BiFC 세포(비교군)에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지이다. Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다(Scale bar = 20 μm). 상기에서 언급한 타우 응집 유도제 3가지 약물을 각각 처리했을 경우, 모든 약물 경우에서 타우-튜불린 BiFC 세포가 타우-BiFC 세포에 비교하여 BiFC 강도가 급격하게 증가함을 볼 수 있었다(도 20).
도 21은 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 제조된 타우-BiFC 세포(비교군)에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지에 대한 번들(bundles) 또는 전체 세포 면적(total cell area)의 정량화 그래프이다(Error bars = Standard deviation of two independent experiments; **p<0.01, ***p<0.001). Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다. 그리고, 도 22는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지에 대한 번들(bundles) 또는 전체 세포 면적(total cell area)의 정량화 그래프이다(Error bars = Standard deviation of two independent experiments; **p<0.01, ***p<0.001). Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다. 또한, 도 23은 (A) 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 타우-BiFC 컨스트럭트 쌍(Tau-VN173 및 Tau-VC155)을 HEK293 세포에 형질감염시켜 제조된 타우-BiFC 세포(비교군)에 타우 응집 유도제인 forskolin(30 μM), thapsigargin(1 μM) 또는 tauK18P301L(5 μg/ml)를 각각 24시간 처리 후 얻은 BiFC 형광 이미지이며, 핵은 Hoechst로 염색한 것이다. Control은 상기 3가지 유도제를 처리하지 않은 상태이다(Scale bar = 100 μm). (B, C) (A)의 BiFC 형광 강도를 정량화한 그래프이다(데이터는 평균±s.d., ***p<0.001).
각각의 약물 처리에 따른 결과를 보면, Forskolin 처리 후 BiFC 강도는 타우-BiFC 세포가 2.9배, 타우-튜불린 BiFC 세포가 3.4배 증가하였다(도 20 ~ 23). Forskolin은 타우-BiFC 세포에서 필라먼트 모양의 타우 응집을 유도하는 것으로 알려져 있다. 유사하게도, forskolin 처리된 타우-튜불린 BiFC 세포는 두꺼운 번들 표현형을 나타냈고, BiFC 형광 또한 증가함을 확인하였다(도 22).
Thapsigargin 처리 후 BiFC 강도는 타우-BiFC 세포가 3.4배, 타우-튜불린 BiFC 세포가 4.7배 증가하였다(도 20 ~ 23). Thapsigargin은 증가된 BiFC 형광이 타우-BiFC 세포와 타우-튜불린-BiFC 세포 모두 세포질에서 형태를 갖추지 않고 나타났다.
prion-like tau seed (tauK18P301L) 처리 후 BiFC 강도는 타우-BiFC 세포가 3.1배, 타우-튜불린 BiFC 세포가 4.1배 증가하였다(도 20 ~ 23). 증가된 BiFC 형광은 번들과 형태를 갖추지 않은 모습이 모두 관찰되었다.
상기 3가지의 약물이 처리된 타유-튜불린 세포 용해액과 아무것도 처리되지 않은 세포 용해액 비교군(control)을 준비하여 면역블롯 분석을 실시하였다. 도 24는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 아무것도 처리하지 않은 세포(비교예 1)에 대하여 3가지 타우 응집 유도제를 각각 처리 후 면역블롯을 실시한 결과이다(anti-TauS262, p-Tau (S199), p-Tau (S396) 또는 α / β-tubulin 항체). Loding control은 endogenous tubulin이다. 그리고, 도 25는 실시예 5에 따라 제조된 타우-튜불린-BiFC 세포 및 아무것도 처리하지 않은 세포(비교예 1)에 대하여 3가지 타우 응집 유도제를 각각 처리 후 면역블롯을 실시한 결과에 대하여 total tau, phosphorylated tau, 및 VN173-α-tubulin을 정량화한 그래프이다. VN173-α-tubulin의 상대량은 endogenous tubulin 상대량에 대하여 노말라이즈하였다. 여기에 나타난 바와 같이, forskolin, thapsigargin, 및 tauK18P301L 처리에 의해 Ser199와 Ser396의 타우 병리학적 인산화가 유도됨을 확인하였다(도 24 및 25).
따라서, 결과적으로 병리학적 타우 응집과정에서 튜불린이 타우와 함께 응집된다는 것을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
<110> Korea Institute Of Science And Technology <120> A pair of amino acid sequences for monitoring tau-tubulin interaction in living cells via bimolecular fluorescence complementation <130> PA-D2018-10 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 2 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VN173 <400> 2 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu 165 170 <210> 3 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VC155 <400> 3 Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu 1 5 10 15 Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 20 25 30 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln 35 40 45 Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 50 55 60 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 65 70 75 80 Tyr Lys

Claims (20)

  1. 타우 유전자를 암호화하는 아미노산 서열의 C-말단에 제1 형광 단백질 유전자를 암호화하는 아미노산 서열이 연결된 제1 아미노산 서열; 및
    튜불린(tubulin) 유전자를 암호화하는 아미노산 서열의 N-말단에 제2 형광 단백질 유전자를 암호화하는 아미노산 서열이 연결된 제2 아미노산 서열;를 포함하고,
    상기 타우 유전자를 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 단편으로 이루어지며, 상기 제1 형광 단백질 유전자를 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 제2 형광 단백질 유전자를 암호화하는 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 튜불린(tubulin) 유전자를 암호화하는 아미노산 서열은 알파-튜불린(α-tublin) cDNAs 로부터 얻은 단편의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    상기 타우 유전자와 튜불린 유전자로부터 발현된 단백질의 상호 응집에 의하여, 상기 제1 형광 단백질 유전자와 제2 형광 단백질 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 결합해서 형광을 띄는, 세포 내 타우-튜불린(tubulin) 단백질의 상호작용을 모니터링하기 위한 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 타우 유전자와 제1 형광 단백질 유전자; 및
    상기 제2 형광 단백질 유전자와 튜불린 유전자;는 각각 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열은, 각각 신경 특이적 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이분자 형광 상보성 아미노산 서열 쌍.
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  14. 제1항, 제5항 또는 제6항에 따른 아미노산 서열 쌍을 암호화하는 염기서열 쌍.
  15. 제14항에 따른 염기서열 쌍을 포함하는 재조합 벡터.
  16. 제15항에 따른 재조합 벡터에 의해 트랜스펙션(transfection)된 세포주.
  17. 제16항에 있어서, 기탁번호 KCTC13639BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 세포주.
  18. 제1항, 제5항 또는 제6항에 따른 아미노산 서열 쌍에 의해 발현된 단백질을 포함하는, 타우-튜불린 상호작용 모니터링용 조성물.
  19. 제16항에 따른 세포주에 미세소관의 교란을 일으키는 물질을 처리하고, 상기 처리된 세포주를 배양하는 단계; 및
    상기 세포주에 대해서 면역블롯 분석을 수행하는 단계;를 포함하는, 세포에서 타우-튜불린 상호작용을 모니터링하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 미세소관의 교란을 일으키는 물질은 택솔 또는 빈블라스틴 또는 노코다졸인 것을 특징으로 하는, 세포에서 타우-튜불린 상호작용을 모니터링하는 방법.
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