CN111298129A - 二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用,所述自组装方法是通过二甲双胍在纯水中以恒温退火、梯度退火以及慢退火等方式诱导核酸纳米材料自组装。所制备的二甲双胍/核酸复合纳米材料,细胞对其摄取的效率要高于传统方法制备的核酸纳米材料,在血清中具有更好的稳定性。采用该方法得到的携带Kras siRNA的二甲双胍/DNA折纸术纳米棒,是可用于协同治疗Kras基因突变肺癌的纳米制剂。该制剂具有更高效的siRNA递送效率,并与二甲双胍发挥协同抗肿瘤作用,在体内体外展现出更好的抗肿瘤效应,可用于制备治疗Kras基因突变肺癌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸介导纳米材料的自组装方法,尤其涉及一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法,特别涉及一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的携带siRNA的纳米制剂和应用。
背景技术
开发通用药物载体是纳米医学研究中最重要的主题。既往已开发了多种药物递送载体,如:阳离子脂质体,环糊精材料,高分子聚合物材料,病毒衣壳等,但是这些有机材料有一定的免疫原性以及潜在毒性,因此医学实用性受到局限。近来新兴的DNA纳米技术为上述问题提供了很好的解决方法,DNA为人体内的天然组分,短链DNA无免疫原性和潜在毒性,且易于被生物降解,同时根据DNA碱基互补配对原则,DNA纳米材料可实现很好的可编程性,同时具有实现靶向性治疗的潜力。因此,自组装DNA纳米材料在疾病的基因治疗中有着巨大的应用前景。
随着技术的发展,将DNA纳米材料应用于疾病的基因治疗也面临着新的挑战,传统的镁离子合成体系需要较高浓度的盐溶液体系,所含高浓度镁离子对特定条件下酶的活性有潜在伤害,并且维持纳米材料稳定性的体系与生理条件具有很大的差异。由于DNA纳米材料自身具有高负电性,细胞对于材料的摄取效率往往不够理想,这也在一定程度上限制了自组装核酸纳米材料的应用。因此以上问题亟待解决。
胍基化合物是一类含有胍基基团的化合物,在生物体内广泛存在并且在生物医药中广泛应用。二甲双胍含有两个胍基,在生理条件下带两个单位的正电荷,因此具有介导DNA纳米材料自组装的潜力。二甲双胍介导的DNA自组装纳米材料稳定性更好;与镁离子相比,所带电荷数相近;但是镁离子的电荷排布是球型的,而二甲双胍的电荷排布是线性的,且分子量较大,分子的空间结构都比较大,因此可能附着DNA磷酸骨架的表面,在DNA纳米结构的表面覆盖一层二甲双胍分子。同时,DNA表面结合的二甲双胍可能遮盖磷酸二酯键,延缓酶对于其的作用,从而使得DNA双螺旋结构在血清中存在更长时间。二甲双胍介导的DNA自组装纳米材料无需额外的纳米递送系统,其本身由于质子化的氨基中和核酸的负电性,更易为细胞所摄取。二甲双胍不仅作为治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物,而且研究证实其同时具有抗肿瘤的生物学效应,其所介导的DNA纳米管在不携带任何药物以及 siRNA的情况,也存在杀伤肿瘤的效应,这是二甲双胍介导的DNA自组装纳米材料对于肿瘤协同治疗的基础。
肺癌是发病率和死亡率增长最快,严重危害人类健康。非小细胞肺癌占比80%以上。近些年来肺癌的诊疗方面取得了一些进展,其中最为重要的就是对于不同基因突变靶点的靶向药物治疗,主要是使用一些酪氨酸激酶的抑制剂去靶向抑制突变基因的下游信号通路的持续激活,从而阻止癌细胞的恶性增殖。尽管如此,肺癌的五年生存率仍然只有16%左右,同时市面仍然没有针对对于Kras基因突变的靶向药物,往往Kras基因突变的患者其化疗效果也不是很理想。这是目前需要解决的问题,也是难题。RNA干扰技术自1998年Fire和 Melo首次提出并证实以来,经过多年的发展与进步,于2018年全球首款的siRNA药物用于治疗多发性神经病由FDA批准上市,这为无靶向药物的肺癌治疗提供了参考和思考。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),可高效、特异地抑制靶基因翻译过程,实现靶基因的表达下调。因此,如何设计开发临床适用的针对Kras 基因突变肺癌治疗的siRNA递送系统仍然存在巨大的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法及采用该方法制备的携带siRNA的二甲双胍/DNA纳米棒制剂和应用,该方法可以在梯度退火、恒温退火以及慢退火条件下实现自组装,通过本发明发现,肺癌细胞对其摄取效率显著提高,与传统方法相比,该法制备的核酸纳米材料可以更稳定存在于生理体系中,并在血清中稳定存在的时间更长,同时该制剂中二甲双胍与siRNA发挥协同抗肿瘤作用。
本发明的技术方案是提供:
一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法,所述方法主要包含如下步骤:
1)取合成纳米材料所需的DNA冻干粉,分别加水稀释,混匀,测浓度,得到DNA溶液;
2)根据核酸组装所需的摩比取相应体的上述DNA溶液,在二甲双胍水溶液中以恒温退火、梯度退火以及慢退火等方式诱导核酸纳米材料的自组装合成;
3)通过二甲双胍可介导DNA模块设计和DNA折纸术设计的自组装,获得所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装结构。
根据上述的方法,步骤2)所述的恒温可以优选为22℃或37℃或45℃;
步骤2)所述恒温合成为,在所述恒温条件放置30~90分钟;
步骤2)所述梯度退火合成可以优选为,95℃放置5分钟,65℃放置30分钟,50℃放置30分钟,37℃放置30分钟,22℃放置30分钟;
根据上述的方法,步骤2)所述的慢退火合成为,密封DNA溶液,放入100℃的水中缓慢降温,两天降至室温;
根据上述的方法,步骤2)所述二甲双胍溶液的pH值可以为 6.0-10.0;
根据上述的方法,步骤2)所述二甲双胍水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围5μM-1000μM;更有选的,浓度范围200 μM-400μM。
根据上述的方法,步骤3)二甲双胍介导的DNA模块的自组装方法通过二甲双胍介导由多条短于100碱基单链的DNA或RNA自组装 DNA形成纳米结构,所述纳米结构包括但不限于DNA四面体和/或DNA 纳米管;
根据上述的方法,步骤3)二甲双胍介导的DNA折纸术自组装方法:二甲双胍介导利用折纸术设计的DNA结构自组装,包括但不限于 DNA折纸术纳米棒和/或DNA折纸术四边形;
根据本发明,采用上述方法制备的携带siRNA的DNA折纸术纳米棒的纳米制剂,所述的纳米材料由SEQ ID NO.8所述序列骨架链 p3024,SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.80所述订书针链1~72、SEQ ID NO.151所述Kras siRNA通过单链分子碱基互补配对合成,具体序列如表3与表4和表6所述。
根据本发明所述的纳米制剂,所述的Scaffold与Staples的摩尔比优选为1:8,纳米棒、Kras siRNA的摩尔比优选为为1:6。
上述的纳米制剂,可通过如下的制备方法获得,所述方法主要包含步骤:
1)取订书针链1~72的冻干粉,分别加水稀释至100μM,取等体积混匀后得到订书针链预混液溶液;
2)取骨架链p3024溶液和订书针链预混液按照1:2,1:4,1:6, 1:8比例在二甲双胍溶液中混合,DNA以恒温退火或梯度退火或慢退火方式合成;将Kras siRNA添加到纳米材料溶液中,再次放置30分钟,得到携带Kras siRNA的纳米棒溶液。
根据本发明所述制备的制剂,可用于制备治疗肺癌的药物中。
由此,本发明也提供一种预防或治疗肺癌的制剂,其有效成分包含权利要求11-12任一所述的携带siRNA的DNA折纸术纳米棒,及医用辅料。
与采用传统方法制备的核酸纳米材料相比,二甲双胍介导的纳米材料自组装具有如下优点:1)可以在恒温条件下介导核酸纳米材料自组装,使合成方法更为简单;2)可以不需要转染剂的辅助,并且细胞摄取率与转染剂辅助传统镁离子介导的自组装核酸纳米材料的摄取率相当;3)二甲双胍介导自组装的核酸纳米材料可稳定存在于生理条件下的体系中,使其临床应用的可能性大大提高;4)二甲双胍介导自组装的核酸纳米材料可以于血清中稳定存在更长时间,因而保证了在其到达靶细胞之前不会被降解,以利于更好地发挥效应;5) 从而可以更安全有效地发挥效能。
采用本发明所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法制备的携带siRNA的纳米制剂,通过二甲双胍介导单链核酸分子碱基互补配对(adenine简写A,代表腺嘌呤;thymine简写T,代表胸腺嘧啶; guanine简写为G,代表鸟嘌呤;cytonine简写为C,代表胞嘧啶; uracil简写为U代表尿嘧啶;其中G和C互补配对,A可以与T或U 互补配对)进行纳米自组装。每个纳米棒携带6个Kras siRNA,并由二甲双胍代替镁离子作为介导核酸纳米材料的自组装。
核酸纳米制剂由p3024Scaffold、Staples通过二甲双胍介导单链核酸分子碱基互补配对合成。随后Kras siRNA与DNA纳米棒上单链突出部分结合,siRNA被结合在纳米结构表面,使siRNA的稳定性提高,不易被核酸酶降解。其在血清中的稳定性通过血清稳定性实验也得到证实,同时在使用转染剂辅助的情况下,细胞仍有较高的摄取率。我们通过实验进一步证实用DNA携带siRNA可以保护siRNA生物学活性并发挥作用:二甲双胍介导的携带Kras siRNA的DNA纳米棒对于Kras突变型A549细胞的杀伤效应如图18所示,结果显示,二甲双胍介导合成不携带Kras siRNA的DNA纳米棒(MNT)其本身就具有一定杀伤肿瘤细胞的效应;同时使用镁离子介导合成的携带Kras siRNA的DNA纳米棒(TNTK)也具有杀伤肿瘤细胞的效应;二甲双胍介导合成的携带Kras siRNA的DNA纳米棒(MNTK),其对A549细胞的杀伤效果最佳,这说明了二甲双胍与Kras siRNA有着协同抗肿瘤的效应。
申请人的实验验证,采用本发明所述方法制备的DNA纳米材料相比于传统方法具有更好地血清稳定性以及肿瘤细胞对其摄取的效率更高。
本发明所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法,可用于多种核酸纳米材料的自组装,如:基于模块组装策略的DNA纳米管或 DNA四面体,基于DNA折纸术策略的DNA纳米棒或DNA纳米长方形,均可以得到较高产率的DNA纳米结构。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图表,作详细说明如下。
附图说明
图1是DNA纳米管的示意图;
图2表示DNA四面体的结构示意图;
图3表示DNA纳米棒的设计图;
图3A是图3的局部放大图;
图4表示DNA Origami纳米长方形的设计图;
图5显示不同浓度二甲双胍介导DNA纳米管自组装的PAGE表征;
图6(A)显示二甲双胍溶液(400mM)介导DNA纳米管自组装的PAGE表征;
图6(B)显示二甲双胍溶液(400mM)介导DNA四面自组装的 PAGE表征;
图7显示DNA纳米管AFM表征;
图8显示DNA四面体AFM表征;
图9显示浓度400mM的二甲双胍介导DNA纳米管的恒温自组装的PAGE表征;
图10表示DNA纳米棒的琼脂糖凝胶电泳表征图;
图11显示DNA纳米棒的原子力显微镜AFM表征;
图12表示DNA纳米长方形的琼脂糖凝胶电泳表征图;
图13显示DNA纳米长方形的AFM表征图;
图14表示二甲双胍介导的DNA纳米棒热稳定性的琼脂糖凝胶电泳表征;
图15显示二甲双胍与镁离子介导的DNA纳米棒血清稳定性的琼脂糖凝胶电泳表征;
图16(A)和图16(B)显示A549细胞对二甲双胍所介导DNA纳米棒的摄取;
其中图16(A)激光共聚焦荧光成像测定A549细胞对二甲双胍所介导DNA纳米棒的摄取随时间;变化的情况(上三荧光图为二甲双胍所介导合成的DNA纳米棒处理12h,下三荧光图为二甲双胍所介导合成的DNA纳米棒处理24h,scale bar=20μm)
图16(B)显示流式细胞仪测定孵育12h后A549细胞对二甲双胍所介导DNA纳米棒的摄取(以TAE/Mg2+作对比);
图17(A)显示DNA纳米棒随着时间的变化在裸鼠体内的组织分布小动物成像;
图17(B)显示DNA纳米棒在24小时后裸鼠体内主要脏器和移植瘤的分布情况;其中图中标记的123456:1是肿瘤,2是肾脏,3 是脾脏,4是肝脏,5是心脏,6是肺脏。
图18显示MTT法检测不同纳米材料组处理A549细胞后的细胞活力
图19(A)显示二甲双胍介导合成携带Kras siRNA的DNA纳米棒抗肿瘤协同效应的机制示意图;
图19(B)显示不同实验分组对于各个信号分子的western blot 结果图;Control为空白对照组,TNT为镁离子介导合成的DNA纳米棒,MNT为二甲双胍介导合成的DNA纳米棒,TNTK为镁离子介导合成的DNA纳米棒携带Kras siRNA,MNTK为二甲双胍介导合成的DNA纳米棒携带Kras siRNA。
图20表示本发明的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一、试验材料
A549细胞购自美国模式培养物研究所;
胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司;
Kras siRNA序列由上海吉玛基因有限公司合成
Scaffold、Staples序列均由上海生工有限公司合成;
0.25%胰蛋白酶购自Hyclone公司;
Hoechst 33432购自上海生工有限公司;
F12K培养基、胰蛋白酶、OPTI-MEM为Gibco公司产品;
X-tremeGENE siRNA转染试剂为瑞士Roche公司产品;
NaOH、NaCl、KCl、Tris碱、乙酸、EDTA、乙酸镁、HCl、酚购自海时代生物科技有限公司;
RT-PCR试剂盒由美国Thermo公司提供。
磁力搅拌器购自英国Jenway公司。
二甲基亚砜、MTT购自美国Sigma公司
二、具体实施例
实施例1:基于模块组装DNA纳米管以及DNA四面体的设计
依据碱基互补配对原理利用SEQUIN软件设计DNA纳米管,有三条单链DNA组成(具体序列见表1-SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3):中心链Y1T9-,用于折叠形成纳米管;X-2LS链构成纳米管管壁;X-3S 链则构成纳米管管壁并形成粘性末端。Y1T9:X-2LS:X-3S按摩尔比1:3:3混合后,利用梯度退火法,首先自组装形成两个中空的三臂纳米管结构,再通过粘性末端的结合,两个三臂结构折叠形成一个完整的DNA纳米管。图1即DNA纳米管的结构示意图,该结构主要是由两个三臂星形模块,通过粘性末端相连而形成DNA纳米管。
同样依据碱基互补配对原理利用SEQUIN软件设计DNA四面体,由4条单链DNA组成(具体序列见表2-SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.7),其中每条链均有三分之一段序列分别与另外3条链互补,从而分别参与组成DNA四面体的三条边,每条单链DNA在与另外三条单链DNA相互结合的同时,形成四面体的其中一个面,四个面相互结合后形成一个完整的DNA四面体,同时四面体的顶点皆为每条链的5’端以及3’端的结合位置,可在此位置进行化学修饰。四条链T1:T2:T3:T4按摩尔比1:1:1:1混合后进行合成。DNA纳米四面体的结构设计示意图如图2。
实施例2:不同浓度的二甲双胍介导DNA纳米管的合成(模块组装方式)
称量取一定质量的二甲双胍并将其溶解于去离子水中,使得母液的浓度1M。将Y1T9、X-2LS、X-3S各序列(见表1)干粉样品用无菌无酶的去离子水稀释,随后使用Nanodrop测每一管的浓度,根据浓度计算相应比例所需要的量,Y1T9、X-2LS、X-3S按照1:3:3的比例加入到灭酶的离心管中,并加入一定量的二甲双胍水溶液,使得二甲双胍在体系中的浓度为50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、 500mM,其余加去离子水制备成30μL的体系,制备6组不同浓度二甲双胍介导纳米管结构以梯度退火方法自组装合成:95℃放置5 min,65℃放置30min,50℃放置30min,37℃放置30min,然后22℃放置30min。所述二甲双胍溶液的pH值为6.0-10.0。首先自组装形成两个中空的三臂纳米管结构,再通过粘性末端的结合,两个三臂结构折叠形成一个完整的DNA纳米管。将合成的少量样品在6%非变性PAGE胶[丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺](19:1)溶液 (40%):3.6mL,10×TAE-Mg2+:2.4mL,10%过硫酸铵(APS):400μL,TEMED:40μL,水:18.2mL]中冰浴(4℃)下电泳,最后一个泳道为镁离子介导DNA纳米管。通过扫描仪扫描图片,DNA纳米管电泳图片见图5,结果显示:浓度在200mM时,合成产率较低;浓度在 300mM以上时,DNA纳米管的产率较高。因此得出结论:当二甲双胍浓度在200mM以上时,可介导DNA纳米管的自组装。
实施例3:二甲双胍介导DNA纳米管以及DNA四面体的合成(模块组装方式)
实施例2实验结果提示,二甲双胍浓度在200mM以上时,合成产率较高,因此本发明优选使用浓度为400mM的二甲双胍介导DNA 纳米管及DNA四面体的自组装。将DNA纳米管以及DNA四面体所需的各条单链按照摩尔比(Y1T9、X-2LS、X-3S为1:3:3;T1:T2:T3:T4 按摩尔比1:1:1:1)进行加样混合,同时都需加入3μL 10×TAE/Mg2+,尔后加生物纯水定容至30μL,涡旋混匀后快速离心。采用梯度退火的方法实现DNA纳米材料的自组装,所述二甲双胍溶液的pH值为 6.0-10.0。即将上述合成液置于PCR仪或者金属浴中进行梯度退火: 95℃,5min;65℃,30min;50℃,30min;37℃,30min;22℃,30min。
利用PAGE胶、原子力显微镜AFM进行表征,其表征具体结果如图:图6(A)为DNA纳米管PAGE胶表征,图6(B)为DNA四面体 PAGE胶表征,图7为DNA纳米管AFM表征,图8为DNA四面体AFM 表征。结果显示,DNA纳米管及DNA四面体均可合成,产率较高。因此,二甲双胍可在高浓度下介导DNA纳米结构自组装(模块自组装策略)。
实施例4:二甲双胍介导DNA纳米管的恒温自组装(模块组装方式)
使用镁离子作为合成介质协助DNA纳米材料的自组装,往往采用梯度退火或慢退火的方式。这两种退火方式通过将溶液体系加热到高温,给予很高的能量,使DNA变性,再缓慢降温,在降温的过程中 DNA单链之间通过碱基互补配对以及溶液中阳离子的辅助构成DNA双螺旋以及相应的DNA纳米结构。前期研究者们也发现将尿素用于镁离子的溶液体系中可介导DNA纳米材料在恒温下进行自组装。因此,可探究二甲双胍介导DNA纳米管的恒温自组装,实验过程与方法同前述,使用400mM的二甲双胍溶液分别在4℃,22℃,37℃以及45℃恒温下进行自组装,并用梯度退火的方式作为对照,使用PAGE胶进行表征,其结果如图9所示。结果显示,在22℃,37℃以及45℃的恒温条件下,二甲双胍可介导DNA纳米管进行恒温自组装,且具有较高产率。
实施例5:二甲双胍介导DNA Origami纳米棒的设计与合成
运用DNA折纸术的合成策略,用Cadnano设计软件对DNA纳米棒进行设计。其具体的设计方法是由一条碱基数为3024的单链DNA作为脚手架链Scaffold(其具体序列如表3-SEQID NO.8),根据所预先手绘的DNA纳米结构在Cadnano上进行下一步设计,选泽的方式是Honeycomb,该种DNA纳米棒的结构主要是由六个DNA双螺旋所组成,其设计图如图3及图3A所示,根据DNA双链每前进7个碱基对就会旋转240°的原理进行脚手架链的折叠,从而根据软件辅助自动生成订书针链staples(其具体序列如表4-SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.86)。同时在每个双螺旋的两端,尽量保证不出现碱基对,从而减小因为磷酸骨架之间的相互斥力,从而减小DNA纳米结构中的应力,设计出更加合理的DNA纳米结构。设计完成后进行对于纳米棒应力的分析,使用在线服务器CanDo进行分析,优化结构。
将脚手架链(scaffold)与订书针链(staples)的混合液按照相应摩尔比(1:1至1:8)进行加样,并在每个样品中加入二甲双胍溶液,而后其余用水补足。对于退火方式而言,可选用慢退火即将 DNA合成液至于沸水中,并在保温装置使其缓慢降至室温;也可选择梯度退火(同前述方法),不同的是可以根据实际情况进行变性温度的调节。合成的DNA纳米棒用琼脂糖凝胶电泳进行,表征结果如图 10所示,各个泳道从左到右分别为:p3024Scaffold的单链DNA, Scaffold与Staples(1:2),Scaffold与Staples(1:4),Scaffold 与Staples(1:6),Scaffold与Staples(1:8)以及DNA ladder。结果显示DNA纳米棒在脚手架链与订书针链比例为1:4时产率较高并在1:6时产率增高,到1:8时达到饱和。为设计携带Kras siRNA的 DNA纳米棒,首先在合成DNA纳米棒时,将订书针链NT12,NT14,NT16, NT56,NT58,NT60替换为NT12’,NT14’,NT16’,NT56’,NT58’, NT60’;其次,将合成好的DNA纳米棒和Kras siRNA按摩尔比1:6混合,室温下放置30min即可。DNA纳米棒提纯后使用原子力显微镜 AFM表征,AFM表征结果如图11所示。
实施例6:二甲双胍介导DNA Origami纳米长方形的设计与合成
基于DNA折纸术的合成策略同样使用长链DNA p3024作为脚手架链scaffold,在Cadnano上选择的模式为Square,其设计图如图4 所示。该纳米结构主要是由16个DNA双螺旋所排列而成的长方形结构,其订书针链由软件根据scaffold的序列以及排列方式自动生成,其具体序列见表5-SEQ ID NO.87至SEQ ID NO.150。通过脚手架链折叠形成长方形骨架,并通过订书针链的互补配对,形成完整的DNA 纳米长方形,其排列方式不同于Honeycomb排列而是紧密排列。
按照前述实施例4中的二甲双胍溶液及退火合成方法,合成DNA 纳米长方形,使用琼脂糖凝胶电泳对DNA纳米矩形表征。其表征结果如图12所示,各个泳道从左到右分别为:p3024Scaffold的单链DNA, Scaffold与Staples(1:2),Scaffold与Staples(1:4),Scaffold 与Staples(1:6),Scaffold与Staples(1:8)以及DNA ladder。结果显示DNA纳米长方形在脚手架链与订书针链比例为1:4时,产率较高,且副产物相对较少,符合后续实验要求。DNA纳米长方形提纯后使用AFM进行表征,AFM表征结果如图13所示,可见均匀分布着大小相同的DNA纳米长方形,结构完整,高度一致,均一性良好,尺寸大约50nm×60nm,结构形貌与尺寸符合设计。
实施例7:二甲双胍介导DNA纳米棒自组装的37℃热稳定性以及血清稳定性
二甲双胍介导自组装的DNA纳米棒的制备如实施例5所述。热稳定性检测方法为:将合成好的DNA纳米材料按照前述琼脂糖凝胶电泳表征方法进行加样,将1×TBE/Mg2+缓冲溶液加热至35℃注入电泳槽,并放入温度计于电泳过程中检测电泳温度;将电泳槽放入37℃恒温水浴箱中开始电泳,控制电泳液温度,使其恒定于37摄氏度;琼脂糖凝胶电泳表征结果如图14所示。结果显示,图14中二甲双胍介导合成的DNA纳米棒在37℃下可稳定存在。得出结论,二甲双胍介导的DNA纳米棒在生理温度下可以稳定存在,可将其运用于后续的生物医学研究当中。
二甲双胍介导自组装的DNA纳米棒血清稳定性检测方法为:将胎牛血清与PBS按照1:8的比例进行混合(10μL的100%FBS与80μL 的PBS混合),即血清稳定性准备液,放置4℃冰箱以待后用;将合成好的DNA纳米材料与配制好的血清稳定性准备液混合,比例为1:9,尔后放入CO2细胞孵育箱模拟温度,孵育时间为0h、3h、6h、12h、24h指定时间。以镁离子介导合成的DNA纳米棒作为对照,到达时间点后进行PAGE表征,其结果如图15所示。实验结果显示,镁离子介导合成的DNA纳米棒在12小时之时就有所降解,24小时之时就已经完全降解;对比于二甲双胍介导合成的DNA纳米棒,其在24小时之时也有所降解,但还存在着一定的结构。因此,相对于镁离子而言,二甲双胍所介导合成的DNA纳米棒可以在血清中存在更长时间。对比传统使用镁离子作为合成介质,其血清稳定性更好,在生物体内的循环时间更久,可以更好地进行药物递送,达到更好的治疗效果。分析原因,可能是由于二甲双胍在生理条件下带二价正电荷,与镁离子相比,所带电荷数差不多,但是镁离子的电荷排布是球型的,而二甲双胍的电荷排布是线性的,且分子量较大,分子的空间结构都比较大,因此可能并不能进入DNA双螺旋的大小沟壑中,从而附着DNA磷酸骨架的表面,也因为此而使得DNA纳米结构的表面覆盖一层二甲双胍分子,或者遮盖了磷酸二酯键,延缓了酶对于其的作用,从而使得DNA 双螺旋结构在血清中存在更长时间。
实施例8:A549细胞对于二甲双胍介导合成的DNA纳米棒的摄取
使用二甲双胍介导DNA纳米棒的合成,同时将DNA纳米棒用Cy5 进行修饰,方便进行荧光成像,更加直观地观察A549细胞对于DNA 纳米棒的摄取情况。带荧光基团的DNA纳米棒与A549细胞的共孵育时间为12h、24h,同时荧光基团的浓度为300nM,利用激光共聚焦显微镜进行图像的拍摄,并通过Leica公司软件LAS AF Lite进行对图像的处理,其结果如图16(A)和16(B)所示,十二小时之时,纳米材料就被A549细胞有所摄取,随着时间的延长,在二十四小时的时候,细胞对于纳米材料摄取增多;在十二小时细胞即有摄取,故选此时间点用流式细胞仪测定A549细胞对二甲双胍所介导DNA纳米棒的摄取(以TAE/Mg2+作对比),结果对比明显:相比于TAE/Mg2+所介导DNA纳米棒,A549细胞对二甲双胍所介导DNA纳米棒的摄取效率显著更高。
实施例9:二甲双胍介导自组装的DNA纳米棒在荷瘤鼠体内的组织器官分布
使用荷瘤鼠来探究DNA纳米棒在动物体内组织和器官的分布情况,DNA纳米棒经过Cy5修饰,实验结果显示:DNA纳米棒通过尾静脉注射入如裸鼠体内,1小时后便富集于皮下移植瘤中;随着时间的延长,富集在移植瘤中的荧光强度逐渐增强,3小时之后其强度就有所减低,随后其主要富集于肾。24小时后,将裸鼠的各个器官以及移植瘤取出,进行荧光成像后发现,DNA纳米棒主要富集在肾与肺,移植瘤上仍然有富集。本发明说明了DNA纳米棒可以根据纳米材料的 EPR效应富集于肿瘤中,同时其主要代谢器官肾脏也是DNA纳米棒的富集区,因此可以认为DNA纳米棒可达到移植瘤上并发挥其功能。结果如图17(A)和17(B)所示,图17(A)显示DNA纳米棒随着时间的变化在裸鼠体内的组织分布小动物成像图,图17(B)显示DNA 纳米棒在24小时后裸鼠体内主要脏器和移植瘤的分布情况。其中图中标记的123456:1是肿瘤,2是肾脏,3是脾脏,4是肝脏,5是心脏,6是肺脏。
实施例10:二甲双胍介导合成携带Kras siRNA的DNA纳米棒及协同抗肺癌效应
前述实施例已证明二甲双胍可介导DNA材料的自组装,具有更好的稳定性以及更高的细胞摄取效率,同时二甲双胍本身对肿瘤细胞具有一定的杀伤效果。因此本实施例主要研究二甲双胍介导的携带Kras siRNA(MNTK)的DNA纳米棒对于Kras突变型A549细胞的杀伤效应,其结果如图18所示。合成DNA Origami纳米棒所携带的siRNA序列如表6-SEQ IDNO.151所示。结果显示,二甲双胍介导合成的不携带 Kras siRNA的DNA纳米棒(MNT)其本身就具有一定杀伤肿瘤细胞的效应;同时使用镁离子介导合成的携带Kras siRNA的DNA纳米棒 (TNTK)也具有杀伤肿瘤细胞的效应;二甲双胍介导合成的携带Kras siRNA的DNA纳米棒,其对A549细胞的杀伤效果最佳,这说明了二甲双胍与Kras siRNA有着协同抗肿瘤的效应。
实施例11:二甲双胍介导合成携带Kras siRNA的DNA纳米棒协同抗肺癌机制
二甲双胍介导合成携带Kras siRNA的DNA纳米棒具有更好的抗Kras突变型肺癌的效果,本节主要运用Western blot技术去验证该复合纳米载体的协同抗肿瘤机制的作用,信号通路示意图如图19(A) 所示,Western blot结果如图19(B)所示。mTOR是细胞生命活动中的重要蛋白,影响着细胞增殖。根据图19(A)中的示意图,二甲双胍通过激活AMPK通路来抑制mTOR,同时通过AMPK通路来促进 TSC1/TSC2复合体形成,抑制Rheb分子,进一步抑制mTOR;Kras siRNA 可以抑制Kras蛋白表达,进而抑制下游的Erk通路,最终抑制细胞增殖,同时也可通过抑制Kras蛋白的表达,抑制PI3K-Akt通路,进一步地抑制mTOR,最终达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。从图19(B) 中分析,实验分组为对照组(Control),镁离子介导合成的DNA纳米棒组(TNT),TNTK组,MNT组以及MNT K组,western blot结果显示:MNT组以及MNTK组通过激活AMPK通路来抑制mTOR;TNT K组与MNTK组分别都对Kras基因有所敲低,从而抑制PI3K-Akt通路,进而抑制了mTOR,同时MAPK通路也被抑制;同时对比发现MNT K组对于MAPK通路的抑制程度低于TNTK组,对比MNT组与TNT组,发现这是由于二甲双胍通过激活AMPK从而激活TSC2复合物再去抑制 Rheb,Rheb受到抑制后,MAPK通路被激活,这也使得MNTK组对于 MAPK通路抑制能力较弱的原因。同时对比TNTK组与MNTK组发现, MNTK组对于mTOR的抑制能力更强,符合MTT的结果,也简单阐明了协同效应的机制。
因此,本发明所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法,可用于多种核酸纳米材料的自组装,不仅包括实施例中的DNA纳米管, DNA四面,DNA纳米棒,DNA纳米长方形,还包括DNA纳米坏,DNA纳米飞镖等等,可广泛应用于核酸纳米材料自组装。
综上如实施例1至实施例11所述,本发明提供了:一种通过二甲双胍,并采用三种不同的控制温度和时间的方式(包括:慢退火,恒温自组装以及梯度退火)来介导核酸纳米材料进行自组装的方法。本发明还设计了一种新型的二甲双胍/DNA复合纳米材料,运用本发明提供的制备方法,将功能基因Kras siRNA由特定的摩尔比,通过碱基互补配对结合到纳米材料上形成新型的纳米复合体制剂。本发明的这种新型复合纳米材料,不但保留了传统核酸纳米材料所具有的良好的生物相容性、可编程性和生物稳定性等特点,而且在生理条件下的体系中有良好的稳定性,更好的血清稳定性以及更高的细胞摄取效率,从而释放更多的Kras siRNA,与二甲双胍协同发挥抗肿瘤效应。具体可参照图20,呈现上述的实施例1至实施例11所述的技术流程。基于二甲双胍介导核酸自组装纳米载体所具有的多种优势,其在基因研究和癌症化疗中具有巨大的应用潜力。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明之精神和范围内,当可作些许之更动与改进,因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 二甲双胍介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的纳米制剂和应用
<141> 2019-08-27
<160> 151
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcaccatc gtaggttatt taatcttgcc aggcaccatc gtaggttatt taatcttgcc 60
aggcaccatc gtaggttatt taatcttgcc 90
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgtgtggt tgctagtcgt t 21
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcaacctg cctgagcgct tttgcgctgt gcaagcctac gatggacacg gtaacgac 58
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 8
<211> 3024
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccggtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt 60
acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 120
ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 180
gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 240
ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 300
tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 360
gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta 420
gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 480
ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 540
ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 600
tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta 660
ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 720
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 780
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 840
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 900
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 960
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 1020
gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 1080
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 1140
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 1200
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 1260
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 1320
accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 1380
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 1440
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 1500
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 1560
gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 1620
ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 1680
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1740
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1800
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1860
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1920
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 1980
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 2040
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 2100
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 2160
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 2220
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 2280
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 2340
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 2400
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 2460
gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 2520
gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 2580
gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 2640
tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 2700
gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 2760
ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 2820
gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctcca ccgcggtggc 2880
ggccgctcta gaactagtgg atccgtaaat caatgactta cgcgcaccga aaggtgcgta 2940
ttgtctatag ccccctcagc cacgaattcg tctgacgacg acaagacaag cttgcgtgtg 3000
aattccctgg cttctcctga gaaa 3024
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgttcgctc caagctgggc tggtggtttt tttgtttgca agcagcaga 49
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggaagcgct ccctagcata aagtgtaagc tcgtcgtttg gt 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggtgcgccg taagaaccca ctcgtgcaat ttttgcgtaa ag 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcttagc cggacgtgcg ctctcctgtt ccgacccaca ca 42
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctgtgacaa tacgcgccag ggttttccct aatca 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtaagtctt ttgtgggaag ggcgatcgaa agccg 35
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
actggcaaca tgtgtcgctc actgactcta tcagcaataa ac 42
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcgttaaccc aactgatctt cagcatcttt tacttggcag ca 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtgaggcga tcgtccgcaa aaaagggata aacaagggaa ga 42
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaacccggt aagacacgac tggtatctgc gctctgctga agccagtta 49
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatgattgt gtgaccgccg cgcttaatgc gccgctcata gc 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccattggag ctaaaggact ataaagatac caggcggtgc ct 42
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgatgcctt ctatacatgc cattggagct aaaggactat aaagatacca ggcggtgcct 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
attaattcca gctggctccg cccccctgcc cgttc 35
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgagtcta caggtccttt taaattaaca gaaaaggtat ct 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgatgcctt ctatacataa tgagtctaca ggtcctttta aattaacaga aaaggtatct 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctgtccgcc tttcgacgct cagtggaacg aaagcattta tc 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgcagaattt gcgtcaggaa ccgtaaaact tgagt 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgatgcctt ctatacatcg cagaatttgc gtcaggaacc gtaaaacttg agt 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttcggtca gcgatctgtc tatttcgttc atccaggccg ag 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttatccgcca acgcgttgct ggcgtttttc catagcatta at 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgaattcat tctgaactct caaggatctc ggcaacgtga ac 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtcctcgtt aattcattca ggctgcgcaa ctgtttccct tt 42
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagatagatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaagaat ag 42
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<400> 36
ctgcatatcc actatggcga aagggggatc ggaac 35
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<400> 37
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<210> 38
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agagtaacca gtcgtcacaa aaatcgacgc tcaagtcact gc 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gccgaaatta ccgctgttga gatccagttc gatgtatgct tt 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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acatacgcat tcagggattt tggtcatggg ggtcttccct tc 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
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<400> 92
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<400> 97
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<211> 32
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<400> 102
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atagtttgcg caacgttatc agcaataaac caatgatac 39
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<211> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcataattc tcttacttaa aagtgctcat ca 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
aagggaagcg cttaatgcgc cgctttacgc cagctggcga ggccagtg 48
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<211> 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gctgtgtgtg agtccaaccc ggtacagagt tcttgaagtg tgaagcca 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
attgggtatc actgcccgct ttcc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ggtgctaaga cacgacttat cgcgtaggtc gttcgctctc ccttcg 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
ggtaacagga accgtacgtg cgctctcgta gc 32
<210> 125
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
caagtctgtt ccgaccagcc cgaccgctgg cc 32
<210> 126
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ttctgtgaac gggataatac cgcgcgctgt tgagatccag aaaacagg 48
<210> 127
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ttcaccaggg atacatattt gaataaataa acaaataggg aaagaata 48
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
cacatttcta ttgtctcatg agccgtttct gggtgagcat tcgatg 46
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<211> 46
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
ttaccattgt ctatttcgtt cataaattaa aaatgaagca cgttaa 46
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
cactgactcg ctgcgcataa cgcaggaaag aatggcgttt 40
<210> 132
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
atactcatac tcttccaata ttttgttaaa at 32
<210> 133
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
ggcatcgtgg tgtcacgtta tcactcatgg tt 32
<210> 134
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
gggttttccc agtcacgcgg ggagaggcgg tt 32
<210> 135
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
aagcgttttt ttcaatatta ttgatgccgc aaaaaaggct ctcaag 46
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
caaaaggctt ccgcttcctc gct 23
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ggaagggcag tagttcgcca gtta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
ttctgagacg gcgaccgagt tgcttcgtgc acccaactga cttttact 48
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actaaatcaa caagagtcca ctatatccct tataaatcag ttccgcg 47
<210> 140
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
caagttttca acgtcaaagg gcgcattttt taaccaatat aaattgt 47
<210> 141
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
ggaagcgtcc gacaggacta taagctccgc ccccctgacc cacagaa 47
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<211> 48
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atccttttcc atagttgcct gacttagata actacgatac cctgcaac 48
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<211> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tgcgtattgg gcgctccagc aaaaggccgc ca 32
<210> 145
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
ttttgttaaa tcagctaaaa accgtctatc ag 32
<210> 146
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
ggcgagcggt atcagcgcgg taatacggtt atgagcatca 40
<210> 147
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
aaggcaaaaa gcatttatca gggtcccgaa aagtgccacc ggccgaaa 48
<210> 148
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
tgtgctgacc accacacccg ccgaaagcga aaggagcgac cctaat 46
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
tttatccggt ctattaattg ttgc 24
<210> 150
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
actacggccg gtaactatcg tctcacgaac cccccgttcc tgccgc 46
<210> 151
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
auguauagaa ggcaucauct t 21
Claims (10)
1.一种二甲双胍介导核酸纳米材料自组装的方法,其特征在于,所述方法包含:
1)取合成纳米材料所需的DNA冻干粉,分别加水稀释,混匀,测浓度,得到DNA溶液;
2)根据核酸组装所需的摩比取相应体的上述DNA溶液,在二甲双胍水溶液中以恒温退火、梯度退火以及慢退火方式诱导核酸纳米材料的自组装合成;
3)通过二甲双胍可介导的DNA模块设计和DNA折纸术设计的自组装,获得所述二甲双胍介导核酸纳米材料自组装结构。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中:
所述的恒温为22℃或37℃或45℃,所述恒温合成为,在恒温条件放置30~90分钟;
所述梯度退火合成为,95℃放置5分钟,65℃放置30分钟,50℃放置30分钟,37℃放置30分钟,22℃放置30分钟;
所述慢退火合成为,密封DNA溶液,放入100℃的水中缓慢降温,两天降至室温。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤2)所述二甲双胍水溶液的pH值为6.0-10.0,并且所述二甲双胍水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围5μM-1000μM。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述二甲双胍水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围200μM-400μM。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤3)中:
所述二甲双胍介导的DNA模块设计的自组装通过二甲双胍介导由多条短于100碱基单链的DNA或RNA自组装DNA形成纳米结构,所述纳米结构包括DNA四面体和/或DNA纳米管;
所述二甲双胍介导的DNA折纸术设计的自组装为:二甲双胍介导利用折纸术设计的DNA结构自组装,包括DNA折纸术纳米棒和/或DNA折纸术四边形。
6.采用权利要求1-5任一所述方法制备的携带siRNA的DNA折纸术纳米棒的纳米制剂,其特征在于:所述的纳米材料由SEQ ID NO.8所述序列骨架链p3024,SEQ ID NO.9至SEQ IDNO.80所述订书针链1~72、SEQ ID NO.151所述Kras siRNA通过单链分子碱基互补配对合成。
7.根据权利要求6所述的纳米制剂,其特征在于:SEQ ID NO.8所述序列骨架链p3024与SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.80所述订书针链1~72的摩尔比为1:8,DNA折纸术纳米棒与KrassiRNA的摩尔比为1:6。
8.权利要求6或7所述的纳米制剂的制备方法,其特征在于,包含步骤:
1)取订书针链1~72的冻干粉,分别加水稀释至100μM,取等体积混匀后得到订书针链预混液溶液;
2)取骨架链p3024溶液和订书针链预混液按照1:2,1:4,1:6,1:8比例在二甲双胍溶液中混合,DNA以恒温退火或梯度退火或慢退火方式合成;将Kras siRNA添加到纳米材料溶液中,再次放置30分钟,得到携带Kras siRNA的DNA折纸术纳米棒溶液。
9.权利要求6或7所述的纳米制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。
10.一种预防或治疗肺癌的制剂,其特征在于,该制剂的有效成分包含权利要求6-7中任一所述的携带siRNA的DNA折纸术纳米棒,及医用辅料。
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