KR20150015588A - Ｃ4 화합물 생산을 위한 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 ｃ4 화합물 생산 방법 - Google Patents

Ｃ4 화합물 생산을 위한 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 ｃ4 화합물 생산 방법 Download PDF

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Abstract

일 구현예에 따른 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(SUCD)가 벡터상에서 발현하는 미생물은 C4 화합물을 효율적으로 생산할 수 있다. 이러한 미생물에 유전자의 변환을 더 시킬 경우 다양한 C4 화합물의 생산이 가능하다. 또한, 이러한 미생물을 이용하여 C4 화합물을 생산할 경우 생산성이 우수하므로 산업적으로 활용가능성이 매우 높다.

Description

Ｃ4 화합물 생산을 위한 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 Ｃ4 화합물 생산 방법{Corynebacterium for producing C4-chemicals and method for producing C4 chemicals using them}
조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제가 플라스미드에서 발현되는 미생물 및 이를 이용한 대사물질의 생산 방법에 관한 것이다
바이오 플라스틱은 기존의 화석 연료 대신 재생 가능한 식물 유래 자원인 바이오매스를 원료로 하여 고분자를 합성한 것이다. 원료인 바이오매스가 광합성 과정에서 공기 중의 이산화탄소를 필요로 하기 때문에, 바이오 플라스틱은 탄소배출 저감이라는 측면에서 매우 유용한 소재이다. 바이오 플라스틱은 화석 원료를 대체하고, 이산화탄소를 저감하며, 환경오염 문제를 야기하지 않기 때문에 저탄소 녹색성장산업 분야에서 널리 활용될 수 있다.
생분해성 고분자 물질은 합성 고분자 소재를 대체할 수 있는 대안으로 제시되고 있다. 4-히드록시부티레이트는 결정질의 플라스틱으로부터 고탄성의 고무에 이르기까지 폭넓은 물성을 나타내므로, 미생물 분해성 플라스틱으로서 많은 연구가 진행중이다. 4-히드록시부티레이트는 1,4-부탄디올로 전환될 수 있고, 1,4-부탄디올은 고분자, 솔벤트, 정밀화학에서 사용되는 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다. 그러나, 유가가 올라감에 따라 늘어나는 생산 비용을 고려하면, 화학적 공정을 보완 및 대체하는 생물학적 생산 방법의 도입이 요구된다.
이에, 형질전환된 미생물을 이용한 4-히드록시부티레이트 및 그로부터 전환되는 화학물질을 고농도로 생산할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 발명의 목적은, 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 벡터상에 발현하는 C4 화합물을 생산하는 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 C4 화합물의 생산량을 증대시키는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여 다음과 같은 방법을 제공한다.
일 측면에 따르면, C4 화합물을 생산하는 미생물에 있어서, 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제가 벡터상에서 발현되는 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 루멘박테리아, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브리비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브리비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물일 수 있다.
상기 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)는 숙시닐-CoA를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소 일 수 있다. 상기 효소는 EC.1.2.1.b로 분류되는 효소일 수 있다. 일 구체예로 상기 효소는 SucD일 수 있다. 상기 SucD은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 sucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다. 상기 벡터가 유전자를 발현하는 벡터로서 작동을 하려면 복제원점, 프로모터, 다클로닝 부위(multiple cloning site, MCS) 및 선택 마커를 함유할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해 주고, 프로모터는 삽입되는 외래 유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 다중 클로닝 사이트로서 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 한다. 선택 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선택 마커는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 비용의 측면을 고려하여 앰피실린 또는 겐타마이신 내성 유전자가 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 강한 프로모터, 예컨대 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 또는 tac 프로모터 등을 포함하며, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 또는 tac 프로모터 일 수 있다. 이와 같은 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있다,
또한, 상기 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 전사조절인자 결합 위치의 어레이, 터미네이터 또는 인핸서)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은 피루베이트로부터 락테이트를 합성하는 경로가 불활성화 또는 감소된 것인 미생물 일 수 있다. 상기 미생물은 L-락테이트 데히드로게나아제(L-lactate dehydrogenase, Ldh)의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 Ldh는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 Ldh는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Ldh는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 미생물은 L-락테이트 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다.
명세서에서 사용된 용어 "불활성화(inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감쇄(attenuation)"는 유전자의 발현이 야생 균주, 조작되지 않은 균주, 또는 모 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 상동 재조합에 의해 야기될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선발 마커에 의해 선발함으로써 이루어질 수 있다.
상기 미생물은 상기 유전자의 불활성화 또는 감쇄로 인해, 상기 유전자가 코딩하고 있는 효소의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 미생물에 비하여 조작된 상기 미생물에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다.
명세서에서 사용된 용어, "형질전환"이란 유전자를 미생물 내에 도입하여 미생물 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주 세포에 도입되어, 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한 상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은, 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제(SSDH)의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제(SSDH)는 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 SSDH는 EC.1.2.1.16 또는 EC.1.2.1.39로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 SSDH는 NADP+ 의존성일 수 있다. 상기 SSDH는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 SSDH를 코딩하는 유전자는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
또한 상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은, 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(Cat1)를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 미생물의 크로모좀 상에 위치하며, 발현한다. 또한, 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(cat1), 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(sucD) 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4hbd)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 크로모좀 상에 포함할 수 있다.
상기 미생물은 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(succinyl-CoA:coenzyme A transferase, Cat1)는 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 Cat1은 EC.2.8.3.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Cat1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 cat1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 4HbD는 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 4HbD는 EC.1.1.1.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 4HbD는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 4HbD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 C4 화합물은 유기산일 수 있으며, 숙시네이트(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말릭산(malic acid), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 또한, 숙시네이트로 유래한 물질은 4-히드록시부티레이트(4-HB), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), γ-부티로락톤(γ-butyrolactone, GBL), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은 목적에 따라 여러 가지 효소를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 미생물은 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제(Cat2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 알코올 데히드로게나제(AdhE2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이와 같은 효소를 더 포함할 경우 상기 미생물은 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
상기 Cat2는 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 Cat2는 EC.2.8.3.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Cat2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 Cat2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 AdhE2는 4-히드록시부티릴-CoA를 1,4-부탄디올로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 AdhE2는 EC.1.1.1.c로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 AdhE2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 AdhE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(sucD)가 벡터상에서 발현되는 C4 화합물을 생산하는 미생물에 있어서, 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4hbd)가 추가로 플라스미드 벡터상에서 발현되는 미생물을 제공한다.
이때, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 일 수 있다. 또한, 상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은 피루베이트로부터 락테이트를 합성하는 경로가 불활성화 또는 감쇄된 것인 미생물 일 수 있다. 상기 미생물은 L-락테이트 데히드로게나아제(L-lactate dehydrogenase, Ldh)의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은, 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제(SSDH)의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 C4 화합물을 생산하는 미생물은, 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(cat1), 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(sucD) 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4hbd)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 미생물의 크로모좀 상에 위치하며, 발현한다.
또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환된 미생물을 배양하는 단계, 및 배양물로부터 C4 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 C4 화합물을 수득하는 방법을 제공한다.
첫째, 형질전환된 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 상기 4-히드록시부티레이트를 생산하는 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 배양은 혐기성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 용어 "혐기성 조건"은 정상 대기상태보다 산소의 함량이 적은 상태를 의미한다. 혐기성 조건은 예를 들면, 이산화탄소 또는 질소를 약 0.1 내지 0.4 vvm (Volume per Volume per minute), 약 0.2 내지 0.3 vvm, 또는 약 0.25 vvm의 유속으로 공급하여 조성될 수 있다. 또한, 혐기성 조건은 통기 속도가 약 0 내지 0.4 vvm, 약 0.1 내지 0.3 vvm, 약 0.15 내지 0.25 vvm인 것일 수 있다.
이후, 배양물로부터 생산된 C4 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 생산된 C4 유기화합물을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 생산된 C4 화합물은 숙시네이트(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말릭산(malic acid), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 본 발명에 일례에 따르면, 본 발명의 미생물을 배양시 TCA 회로상의 C4 화합물 및 이로부터 유래한 물질의 생산을 증가시킬 수 있다. 또한, 숙시네이트로 유래한 물질은 4-히드록시부티레이트(4-HB), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), γ-부티로락톤(γ-butyrolactone, GBL), 또는이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 4-히드록시부티레이트의 회수는 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다.
또한, 회수한 생산된 C4 화합물을 다른 유기화합물으로 전환시켜 다양한 C4 화합물을 수득하는 단계가 더 포함될 수 있다. 상기 방법에 의해 생산된 4-히드록시부티레이트를 화학적으로 전환함으로써 그와 구조적으로 관련된 기질을 합성할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 4-히드록시부티레이트를 강산 존재하에서 약 100℃ 내지 약 200℃에서 반응시킨 후, 증류에 의해 감마-부티로락톤(GBL)을 수득할 수 있다. 수득된 GBL은 아민화제, 예를 들면, 메틸아민을 이용한 아민화 반응에 의해 N-메틸피롤리돈(NMP)으로 전환될 수 있다. 또한, 수득된 GBL은 금속함유 촉매, 예를 들면, Ru 또는 Pd 등을 이용한 수소화 반응에 의해 테트라히드로퓨란(THF), 1,4-부탄디올 또는 부탄올로 선택적으로 전환될 수 있다.
또한, 상기 생산된 4-히드록시부티레이트를 생물학적으로 전환함으로써 폴리-4-히드록시부티레이트를 수득할 수 있다. 상기 생물학적 전환은 폴리히드록시알카노에이트 신테아제, 4HB-조효소 A:조효소 A 트란스퍼라제, 또는 그 조합에 의한 것일 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 생산된 4-히드록시부티레이트를 화학적으로 전환함으로써 그와 구조적으로 관련된 기질을 합성할 수 있다. 예를 들면, 4-히드록시부티레이트를 강산 존재하에서 약 100℃ 내지 약 200℃에서 반응시킨 후, 증류에 의해 감마-부티로락톤(GBL)을 수득할 수 있다. 수득된 GBL은 아민화제, 예를 들면, 메틸아민을 이용한 아민화 반응에 의해 N-메틸피롤리돈(NMP)으로 전환될 수 있다. 또한, 수득된 GBL은 금속함유 촉매, 예를 들면, Ru 또는 Pd 등을 이용한 수소화 반응에 의해 테트라히드로퓨란(THF), 1,4-부탄디올 또는 부탄올로 선택적으로 전환될 수 있다.
또한, 상기 생산된 4-히드록시부티레이트를 생물학적으로 전환함으로써 폴리-4-히드록시부티레이트를 수득할 수 있다. 상기 생물학적 전환은 폴리히드록시알카노에이트 신테아제, 4HB-조효소 A:조효소 A 트란스퍼라제, 또는 그 조합에 의한 것일 수 있다.
일 측면에 따른 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제가 플라스미드 벡터 상에서 발현되는 C4 화합물을 생산하는 미생물은 보다 효과적으로 C4 화합물을 생산할 수 있다. 이러한 미생물을 이용하여 C4 화합물의 효율성을 높여 산업적으로 활용 가능한 다양한 C4 화합물을 생산할 수 있다.
도 1는 4-히드록시부틸레이트 생산을 위한 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 pGT1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 pG3G 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 pGSK+ 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pGSX1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pcat1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 psucD 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 8은 p4hbD 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 9는 pG2G 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 10은 형질전환된 균주의 4HB 생산량을 나타낸 것이다.
도 11은 형질전환된 균주의 4HB 생산량을 나타낸 것이다.
도 12는 형질전환된 균주의 4HB 생산량을 나타낸 것이다.
도 13은 배양 조건에 따른 4HB 생산량을 나타낸 것이다.
도 14는 pC2E2 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 15는 p2G-C2E2 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. L- 락테이트 데히드로게나제 유전자를 제거한 균주의 제조
1.1. ldh 치환 벡터( replacement vector )의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum, CGL) ATCC 13032의 L-락테이트 데히드로게나제(ldh) 유전자를 pK19 mobsacB (ATCC 87098) 벡터를 사용하여 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.
ldh 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 주형으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 통한 증폭에 의하여 얻었다. 상기 상동 부위는 ldh 유전자의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 부위로서, ldhA_5'_HindIII(서열번호 18) 및 ldhA_up_3'_XhoI(서열번호 19)의 프라이머 세트와, ldhA_dn_5'_XhoI(서열번호 20) 및 ldhA_3'_EcoRI(서열번호 21)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δldh 벡터를 제작하였다.
1.2. CGL (Δ ldh ) 균주 제조
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법(electroporation)을 통해 상기 pK19_Δldh 벡터를 도입하였다. 도입된 균주를 18.5 g/L 뇌-심장 침출배지(brain-heart infusion broth), 0.5 M 솔비톨(sorbitol), 5 g/L 박토-트립톤(bacto-tryptone), 2.5 g/L 박토-효모 추출물(bacto-yeast extract), 5 g/L NaCl 및 18 g/L 박토-아가(bacto-agar)를 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였고, ldhA up(서열번호 22) 및 ldhA down(서열번호 23)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 ldh 유전자 결실 여부를 확인하였다. 그 결과, CGL (Δldh) 균주를 얻었다.
실시예 2. 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제 유전자 제거
2.1. ssdh 치환 벡터의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제(ssdh) 유전자를 pK19 mobsacB 벡터(ATCC 87097)를 사용하여 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.
ssdh 유전자인 NCgl0049(서열번호 7), NCgl0463(서열번호 8) 또는 NCgl2619(서열번호 9)를 제거하기 위한 상동 부위는 주형으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 통한 증폭에 의하여 얻었다.
NCgl0049 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 0049-1 for(서열번호 24) 및 0049-1 rev(서열번호 25)의 프라이머 세트와, 0049-2 for(서열번호 26) 및 0049-2 rev(서열번호 27)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 PstI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δn0049 벡터를 제작하였다.
NCgl0463 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 0463-1 for(서열번호 28) 및 0463-1 rev(서열번호 29)의 프라이머 세트와, 0463-2 for(서열번호 30) 및 0463-2 rev(서열번호 31)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 PstI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δn0463 벡터를 제작하였다.
NCgl2619 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, 2619-1 for(서열번호 32) 및 2619-1 rev(서열번호 33)의 프라이머 세트와, 2619-2 for(서열번호 34) 및 2619-2 rev(서열번호 35)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의하여 각각 증폭하였다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 PstI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δn2619 벡터를 제작하였다
2.2. CGL (Δ ldh Δ n0049 ), CGL (Δ ldh Δ n0463 ), CGL (Δ ldh Δn2619) 및 CGL (Δ ldh Δ gD 3 ) 균주 제조
실시예 1에서 제조한 CGL (Δldh) 균주에 전기천공법을 통해 벡터 pK19_Δn0049, pK19_Δn0463, 또는 pK19_Δn2619를 각각 도입하거나, 상기 3종의 벡터를 순차적으로 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃ 조건에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였고, 0049for(서열번호 36) 및 0049rev(서열번호 37)의 프라이머 세트, 0463for(서열번호 38) 및 0463rev(서열번호 39)의 프라이머 세트, 또는 2619for(서열번호 40) 및 2619rev(서열번호 41)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 NCgl0049, NCgl0463 및 NCgl2619의 결실 여부를 확인하였다.
그 결과, CGL (Δldh Δn0049), CGL (Δldh Δn0463), CGL (Δldh Δn2619) 및 CGL (Δldh ΔgD3) 균주를 얻었다. 하기 표 1은 (2)에서 제조된 균주의 균주명 및 유전자형을 나타낸다.
균주명 유전자형
CGL (Δldh Δn0049) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049
CGL (Δldh Δn0463) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0463
CGL (Δldh Δn2619) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl2619
CGL (Δldh ΔgD3) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049 ΔNCgl0463 ΔNCgl2619
실시예 3. cat1 , sucD 및 4 hbD 유전자 도입
3.1. pK19 gapA ::3G 및 pG3G 벡터의 제작
(1) pG3G 벡터의 제작
cat1, sucD 및 4hbD 유전자를 벡터 상에서 발현시키기 위하여, pGT1 벡터(서열번호 42)를 기반으로 cat1, sucD 및 4hbD 유전자 발현 벡터 pG3G(도 3)를 제작하였다. pGT1 벡터의 개열지도는 도 2에 개시하였으며, 하기 방법에 따라 제작하였다.
대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀벡터인 pET2 벡터 (GenBank accession number: AJ885178.1) 중 대장균의 복제 기점과 코리네박테리움 글루타미쿰의 복제 기점 사이의 영역인, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 및 rrnB 전사종결자를 포함하는 영역을 제거하였다. 또한, 카나마이신 내성 유전자인 aph 유전자를 Tn5 유래 카나마이신 내성 유전자인 neo 유전자(nptII)로 치환하여 제한효소 인식부위를 제거하고, 코리네박테리움 글루타미쿰의 복제 기점 내에 위치한 replicase(rep) 유전자 내의 XbaI 제한효소 인식부위를 제거하였다. 그 후, 14개의 제한효소 인식부위를 갖는 pBluescriptII SK(+) phagemid 벡터 유래 다중클로닝부위(MCS)를 삽입하여, pGSK+ 벡터(서열번호 58)를 제작하였다. 상기 pGSK+ 벡터를 기반으로, gltA 유전자의 3'UTR(untranslated region) 및 rrnB 전사종결자를 pGSK+의 SalI 위치에 삽입하여 pGT1를 제작하였다.
상기 3종의 유전자를 PCR 증폭하기 위한 주형으로, gapA 프로모터, 및 cat1, sucD, 4hbD 및 cat2 유전자를 순서대로 포함한 유전자 카세트(서열번호 43)를 합성하였다. 상기 카세트 중 gapA 프로모터부터 4hbD 유전자까지의 서열을 3G up(서열번호 44) 및 3G down(서열번호 45)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pGT1 벡터의 PstI 및 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 3에 나타낸 바와 같은 발현 벡터 pG3G를 제작하였다. gapA 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 gapA 유전자(NCgl1526)의 프로모터이다.
(2) pK19 gapA ::3G 벡터의 제작
또한, 상기 3종의 유전자를 염색체 내에 삽입하기 위하여, pK19 mobsacB에 기반하여 cat1, sucD 및 4hbD 유전자 삽입용 벡터 pK19 gapA::3G를 제작하였다.
상동 재조합을 위한 두 상동 부위는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로, 각각 ncgl0049_up F(서열번호 46) 및 ncgl0049_up R(서열번호 47)의 프라이머 세트와, ncgl0049_down F(서열번호 48) 및 ncgl0049_down R(서열번호 49)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다.
gapA 프로모터 및, cat1, sucD 및 4hbD 유전자를 포함하는 단편은 실시예 3의 (1)에서 제작한 pG3G 벡터를 주형으로, pG3G F(서열번호 50) 및 pG3G R(서열번호 51)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다.
pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에, 상기 두 상동 부위 사이에 gapA 프로모터 및, cat1, sucD 및 4hbD 유전자를 포함하는 단편이 위치하도록 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 pK19 gapA::3G 벡터를 제작하였다.
3.2. D001 및 D003 균주 제조
벡터 pK19 gapA::3G를 실시예 1에서 제조된 CGL (Δldh) 균주 또는 실시예 2에서 제조된 CGL (Δldh, ΔgD3) 균주에 전기천공법을 통하여 도입하였다. 도입된 균주를 실시예 1의 (2)에 기재된 바와 같은 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였고, cat1-seq1F(서열번호 52) 및 cat1-seq2R(서열번호 53)의 프라이머 세트, sucD-seq1F(서열번호 54) 및 sucD-seq2R(서열번호 55)의 프라이머 세트, 또는 4hbD-seq1F(서열번호 56) 및 4hbD-seq2R(서열번호 57)의 프라이머 세트 각각을 사용하여 PCR을 통해 cat1, sucD 및 4hbD의 도입 여부를 확인하였다.
그 결과, D001 및 D003 균주를 얻었다. 하기 표 2는 실시예 3.2.에서 제조된 균주의 균주명 및 유전자형을 나타낸다.
균주명 유전자형
D001 C. glutamicum ATCC 13032 Δldh, gapA::cat1, sucD, 4hbD
D003 C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049 ΔNCgl0463 ΔNCgl2619, gapA::cat1, sucD, 4hbD
3.3. CGL (Δ ldh pG3G ), CGL (Δ ldh Δ n0049 pG3G ), CGL (Δ ldh Δ n0463 pG3G), CGL (Δ ldh Δ n2619 pG3G ) 및 CGL (Δ ldh Δ gD 3 pG3G ) 균주 제조
벡터 pG3G를 실시예 1에서 제조된 CGL (Δldh) 균주 또는 실시예 2에서 제조된 CGL (Δldh Δn0049), CGL (Δldh Δn0463), CGL (Δldh Δn2619) 및 CGL (Δldh ΔgD3) 균주에 전기천공법을 통하여 도입하였다. 도입된 균주를 50 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된, 18.5 g/L 뇌-심장 침출배지, 0.5 M 솔비톨, 5 g/L 박토-트립톤, 2.5 g/L 박토-효모 추출물, 5 g/L NaCl 및 18 g/L 박토-아가를 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 카나마이신 내성을 갖는 균주를 선별함으로써, CGL (Δldh pG3G), CGL (Δldh Δn0049 pG3G), CGL (Δldh Δn0463 pG3G), CGL (Δldh Δn2619 pG3G) 및 CGL (Δldh ΔgD3 pG3G) 균주를 얻었다. 하기 표 3은 3.3.에서 제조된 균주의 균주명 및 유전자형을 나타낸다.
균주명 유전자형
CGL (Δldh pG3G) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh pGT1_cat1, sucD, 4hbD
CGL (Δldh Δ0049 pG3G) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049 pGT1_cat1, sucD, 4hbD
CGL (Δldh Δ0463 pG3G) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0463 pGT1_cat1, sucD, 4hbD
CGL (Δldh Δ2619 pG3G) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl2619 pGT1_cat1, sucD, 4hbD
CGL (Δldh ΔgD3 pG3G) C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049 ΔNCgl0463 ΔNCgl2619 pGT1_cat1, sucD, 4hbD
실시예 4. 플라스미드 벡터에서 유전자 발현하는 미생물 제작
cat1, sucD, 4hbD 유전자를 발현하기 위한 플라스미드 벡터로서 gapA 프로모터를 포함하는 pGSX1(서열번호 59)를 하기와 같이 제작하였다. gapA 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 gapA 유전자(NCgl1526)의 프로모터이다. gapA 프로모터는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로 MD-625 (서열번호 60) 및 MD-626 (서열번호 61)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭하여 얻었으며, pGT1 벡터의 KpnI 및 XhoI 제한효소 위치에, 상기 두 얻어진 270 bp의 DNA 절편이 위치하도록 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 pGSX1 벡터(도 5)를 제작하였다
4.1. cat1 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터 도입
Cat1 유전자를 벡터 상에서 발현시키기 위하여, pGSX1벡터(서열번호 59)를 기반으로 cat1 유전자 발현 벡터 pcat1(도 6)을 제작하였다. pGSX1벡터의 개열지도는 도 5에 개시하였으며, 실시예 4에 개시된 방법에 따라 제작하였다.
Cat1 유전자를 PCR 증폭하기 위한 주형으로, gapA 프로모터, 및 cat1, sucD, 4hbD 및 cat2 유전자를 순서대로 포함한 유전자 카세트 (서열번호 43)를 사용하였으며, cat1 서열을 cat1-up(서열번호 62) 및 cat1-down(서열번호 63)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pGSX1 벡터의 PstI 및 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 6에 나타낸 바와 같은 발현 벡터 pcat1를 제작하였다.
이후, 전기천공법을 통하여 상기 cat1이 포함된 벡터를 상기에서 제작한 미생물내로 도입하였다. 이후, LB 배지에서 배양 후 동결하여 보관하였다.
4.2. sucD 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터 도입
sucD 유전자를 벡터 상에서 발현시키기 위하여, pGSX1 벡터(서열번호 59)를 기반으로 sucD 유전자 발현 벡터 psucD (도 7)을 제작하였다. pGSX1 벡터의 개열지도는 도 5에 개시하였으며, 실시예 4에 개시된 방법에 따라 제작하였다.
sucD 유전자를 PCR 증폭하기 위한 주형으로, gapA 프로모터, 및 cat1, sucD, 4hbD 및 cat2 유전자를 순서대로 포함한 유전자 카세트 (서열번호 43)를 사용하였으며, sucD 서열을 sucD-up(서열번호 64) 및 sucD-down(서열번호 65)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pGSX1 벡터의 PstI 및 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 7에 나타낸 바와 같은 발현 벡터 psucD 를 제작하였다.
이후, 전기천공법을 통하여 상기 sucD가 포함된 벡터를 상기에서 제작한 미생물내로 도입하였다. 이후, LB 배지에서 배양 후 동결하여 보관하였다.
4.3. 4 Hbd 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터 도입
4hbD 유전자를 벡터 상에서 발현시키기 위하여, pGSX1 벡터(서열번호 59)를 기반으로 4hbD 유전자 발현 벡터 p4hbD (도 8)을 제작하였다. pGSX1 벡터의 개열지도는 도 5에 개시하였으며, 실시예 4에 개시된 방법에 따라 제작하였다.
4hbD 유전자를 PCR 증폭하기 위한 주형으로, gapA 프로모터, 및 cat1, sucD, 4hbD 및 cat2 유전자를 순서대로 포함한 유전자 카세트 (서열번호 43)를 사용하였으며, 4hbD 서열을 4hbD-up(서열번호 66) 및 4hbD-down(서열번호 67)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pGSX1 벡터의 PstI 및 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 8에 나타낸 바와 같은 발현 벡터 p4hbD 를 제작하였다.
이후, 전기천공법을 통하여 상기 4hbD가 포함된 벡터를 상기에서 제작한 미생물내로 도입하였다. 이후, LB 배지에서 배양 후 동결하여 보관하였다.
4.4. sucD 및 4 hbd 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터 도입
sucD 및 4hbD 유전자를 벡터 상에서 동시 발현시키기 위하여, pGSX1 벡터(서열번호 59)를 기반으로 sucD-4hbD 유전자 발현 벡터 pG2G(도 9)을 제작하였다. pGSX1 벡터의 개열지도는 도 5에 개시하였으며, 실시예 4에 개시된 방법에 따라 제작하였다.
sucD-4hbD 유전자를 PCR 증폭하기 위한 주형으로, gapA 프로모터, 및 cat1, sucD, 4hbD 및 cat2 유전자를 순서대로 포함한 유전자 카세트 (서열번호 43)를 사용하였으며, sucD-4hbD 서열을 sucD-up(서열번호 64) 및 4hbD-down(서열번호 67)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pGSX1 벡터의 PstI 및 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 9에 나타낸 바와 같은 발현 벡터 pG2G 를 제작하였다.
이후, 전기천공법을 통하여 상기 sucD-4hbD가 포함된 벡터를 상기에서 제작한 미생물내로 도입하였다. 이후, LB 배지에서 배양 후 동결하여 보관하였다.
상기에서 제작한 형질전환 균주를 정리하면 하기 표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같다.
유전자 조작된 코리네박테리아 균주의 유전형
균주/vector
D003 ATCC13032 Δldh ΔgabD1,2,3/gapA::cat1:sucD:4hbD
B039 ATCC13032 Δldh ΔgabD1,2,3
pcat1 pGSX1-cat1
psucD pGSX1-sucD
p4hbD pGSX1-4hbD
pG3G pGT1-cat1, sucD, 4hbD
pG2G pGSX1-sucD, 4hbD
유전자 조작된 코리네박테리아 균주의 유전형
균주명 유전형
D003 ATCC13032 Δldh ΔgabD1,2,3/gapA::cat1:sucD:4hbD
D003 psucD ATCC13032 Δldh ΔgabD1,2,3/gapA::cat1:sucD:4hbD psucD
D003 p4hbD ATCC13032 Δldh ΔgabD1,2,3/gapA::cat1:sucD:4hbD p4hbD
D003 pG2G ATCC13032 Δldh ΔgabD1,2,3/gapA::cat1:sucD:4hbD, pG2G
실시예 5. 4- HB 생산성 확인
기 보고된 바와 같이 (Yim, et al., 2011) 4-HB, 숙신산, GBL 또는 1,4-butandiol을 생산하기 위하여 대장균에 도입되었던 pathway를 코리네박테리아에 도입하여, 4HB 생산 여부를 확인하였다(도 10). 실시예 3에서 제작된 D003(기본균주)의 플라스크 테스트를 통하여 글루코오스로부터 4HB가 524 mg/L 생산됨을 확인 하였다 (도 11). 상기 균주를 Brain Heart Infusion(BHI) 배지(Becton, Dickinson and Company)에서 30℃, 230 rpm으로 8시간 동안 배양하였다. 배양액을 CgXII 배지(Keilhauer et al. J. Bacteriol. 1993, 175:5595)에 1/50의 농도로 접종한 후, 30℃, 230rpm에서 16시간 동안 배양하였다. 플라스크의 cap과 neck 부분을 밀봉하여 혐기 조건을 조성하고 30℃, 230 rpm으로 24시간 동안 배양하였다.
또한, D003 배양시 숙신산의 축적이 관찰되므로, 숙신산으로부터 4-HB 전환을 강화하기 위하여 sucD 및 4hbD의 과발현을 유도하는 플라즈미드를 도입한 균주(D003 pG2G)를 제작하였으며, 플라스크 테스트에서 sucD-4hbD 도입을 통해 생산성이 D003 대비 2.5배 증가함을 확인하였다 (도 11).
실시예 6. 발효 조건 변화에 따른 4- HB 생산량 확인
D003과 D003 pG2G의 발효는 호기에서 세포 성장시킨 후 혐기 전환하여 실시하며, 혐기운전 후 통기조건을 조절하여 실시하였으며, sucD와 4hbD의 발현을 높인 D003 pG2G는 D003 대비 4HB 생산성이 1.5배 증가하였다 (도 12).
D003 pG2G의 발효 공정에서 호기 성장 후 통기 조건 변화에 따른 4HB 생산성을 비교하였는데, 성장 완료 후 0.1 vvm으로 미세포기(microaerobic) 상태를 유지하는 경우 포기하지 않은 조건 및 혐기 24시간, 48 시간 유지 후 미세포기를 시작한 발효에 비해 생산성이 최대 1.2배 증가하였다 (도 13).
발효 종균 배양을 위해 포도당 4%, 폴리펩톤 1%, Yeast extract 5 g/L, (NH4)2SO4 2 g/L, potassium phosphate monobasic 4 g/L, potassium phosphate dibasic 8g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, 티아민-HCl 1 mg/L, D-비오틴 0.1 mg/L, 미량원소 (철, 망간, 아연 구리 0.1~10 ppm)을 포함하는 배지에서 30℃, 230 rpm으로 8~12시간 전배양을 실시하였다. 또한, 본 발효시 배양온도 30~35 ℃, 교반속도 500~800 rpm, 통기량 0.5~2 vvm, 배양중 pH는 6.5~8.0으로 17~35 시간 동안 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 호기 배양을 한 후, 동일한 배양온도 및 배양 중 pH 하에서 교반속도 100~500 rpm, 통기량 0~0.4 vvm으로 혐기 전환하여 24~150 시간 배양하며 4HB 생산성을 관찰하였다. 본 발효의 배지는 CSL 1%, (NH4)2SO4 2 g/L, potassium phosphate monobasic 1g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, 티아민-HCl 3 mg/L, D-비오틴 0.3 mg/L, 미량원소 (철, 망간, 아연 구리 0.1~10 ppm)를 포함하며, 발효 중 포도당은 소모량에 따라 추가 투입하였다.
실시예 7. cat2 및 adhE2 유전자 도입 및 1,4- BDO 생산량 확인
7.1. pC2E2 벡터의 제작
실시예 3의 (1)에 기재한 방법으로 제작된 pGSK+ 벡터(서열번호 58)(도 4)를 기반으로, P29 프로모터, cat2 및 adhE2 유전자, 및 전사종결자를 도입하여 cat2 및 adhE2 유전자 발현 벡터 pC2E2(서열번호 68)(도 14)를 제작하였다 P29 프로모터(P29)는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로, P1(서열번호 69) 및 P2(서열번호 70)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻는다. cat2 유전자는 벡터 MD0294(서열번호 71)를 주형으로, P3(서열번호 72) 및 P4(서열번호 73)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. adhE2 유전자는 벡터 MD0295(서열번호 74)를 주형으로, P5(서열번호 75) 및 P6(서열번호 76)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 전사종결자 부위(Term)는 벡터 pGSX1(서열번호 59)을 주형으로, P7(서열번호 77) 및 P8(서열번호 78)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물들을 pGSK+ 벡터의 KpnI 및 SacI 제한효소 위치에 In-fusion PCR cloning kit(Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 14에 나타낸 바와 같은 pC2E2 벡터를 제작하였다.
7.2. D001 pC2E2 및 D003 pC2E2 균주의 제조
벡터 pC2E2를 실시예 3에서 제조된 균주 D001 및 D003에 전기천공법을 통하여 실시예 3의 (3)에 기재된 바와 같은, 카나마이신 함유 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 카나마이신 내성을 갖는 균주를 선별함으로써, D001 pC2E2 및 D003 pC2E2 균주를 얻었다. 하기 표 6는 실시예 7.2에서 제조된 균주의 균주명 및 유전자형을 나타낸다.
균주명 유전자형
D001 pC2E2 C. glutamicum ATCC 13032 Δldh, gapA::cat1, sucD, 4hbD, pGSK+_cat2, adhE2
D003 pC2E2 C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049 ΔNCgl0463 ΔNCgl2619, gapA::cat1, sucD, 4hbD, pGSK+_cat2, adhE2
7.3. D001 p2G - C2E2 및 D003 p2G - C2E2 균주의 제조
cat2 및 adhE2의 도입과 함께 sucD-4hbD를 강화하기 위한 p2G-C2E2 벡터를 하기와 같이 제작한다. P29 프로모터, cat2 및 adhE2 유전자, 및 전사종결자로 구성된 DNA 절편은 pC2E2 벡터 (서열번호 68)을 주형으로 P1 (서열번호 69) 및 P9(서열번호 79) 의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻는다. gapA 프로모터, sucD 및 4hbD 유전자, 및 전사종결자로 구성된 DNA 절편은 pG2G 벡터 (서열번호 80)을 주형으로 P10 (서열번호 81) 및 P8 (서열번호 78) 의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻는다. 얻어진 증폭 산물들을 pGSK+ 벡터의 KpnI 및 SacI 제한효소 위치에 In-fusion PCR cloning kit(Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 도 15에 나타낸 바와 같은 p2G-C2E2 벡터를 제작한다.
벡터 p2G-C2E2를 실시예 3에서 제조된 균주 D001 및 D003에 전기천공법을 통하여 실시예 3의 (3)에 기재된 바와 같은, 카나마이신 함유 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양한다. 카나마이신 내성을 갖는 균주를 선별함으로써, D001 p2G-C2E2 및 D003 p2G-C2E2 균주를 얻는다. 하기 표 7는 실시예 7.3에서 제조된 균주의 균주명 및 유전자형을 나타낸다.
균주명 유전자형
D001 p2G-C2E2 C. glutamicum ATCC 13032 Δldh, gapA::cat1, sucD, 4hbD, pGSK+_cat2, adhE2, sucD, 4hbD
D003 p2G-C2E2 C. glutamicum ATCC 13032 Δldh ΔNCgl0049 ΔNCgl0463 ΔNCgl2619, gapA::cat1, sucD, 4hbD, pGSK+_cat2, adhE2, sucD, 4hbD
4-HB 또는 1,4-BDO와 같은 C4 화합물은 산업적으로 활용 가능성이 높다. 따라서, 이러한 유용한 물질의 생산 효율을 높일 경우 산업적으로 활용 가능성이 높다. 일 측면에 따른 형질전환 미생물은 종래의 미생물에 비하여 C4 화합물의 생산성이 우수하므로, 산업적으로 유용하게 활용될 수 있다.
<110> SAMSUNG ELECTORNICS CO., LTD. <120> Corynebacterium for producing C4-chemicals and method for producing C4 chemicals using them <130> PN100829 <160> 81 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 451 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Glu Ile Lys Glu Met Val Ser Leu Ala Arg Lys Ala Gln Lys Glu 1 5 10 15 Tyr Gln Ala Thr His Asn Gln Glu Ala Val Asp Asn Ile Cys Arg Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Val Ile Tyr Glu Asn Ala Ala Ile Leu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Val Asp Glu Thr Gly Met Gly Val Tyr Glu His Lys Val Ala Lys Asn 50 55 60 Gln Gly Lys Ser Lys Gly Val Trp Tyr Asn Leu His Asn Lys Lys Ser 65 70 75 80 Ile Gly Ile Leu Asn Ile Asp Glu Arg Thr Gly Met Ile Glu Ile Ala 85 90 95 Lys Pro Ile Gly Val Val Gly Ala Val Thr Pro Thr Thr Asn Pro Ile 100 105 110 Val Thr Pro Met Ser Asn Ile Ile Phe Ala Leu Lys Thr Cys Asn Ala 115 120 125 Ile Ile Ile Ala Pro His Pro Arg Ser Lys Lys Cys Ser Ala His Ala 130 135 140 Val Arg Leu Ile Lys Glu Ala Ile Ala Pro Phe Asn Val Pro Glu Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Ile Ile Glu Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Gln Glu Leu 165 170 175 Met Gly Ala Val Asp Val Val Val Ala Thr Gly Gly Met Gly Met Val 180 185 190 Lys Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ser Phe Gly Val Gly Ala Gly 195 200 205 Asn Val Gln Val Ile Val Asp Ser Asn Ile Asp Phe Glu Ala Ala Ala 210 215 220 Glu Lys Ile Ile Thr Gly Arg Ala Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Ser 225 230 235 240 Gly Glu Gln Ser Ile Ile Tyr Asn Glu Ala Asp Lys Glu Ala Val Phe 245 250 255 Thr Ala Phe Arg Asn His Gly Ala Tyr Phe Cys Asp Glu Ala Glu Gly 260 265 270 Asp Arg Ala Arg Ala Ala Ile Phe Glu Asn Gly Ala Ile Ala Lys Asp 275 280 285 Val Val Gly Gln Ser Val Ala Phe Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ile Asn 290 295 300 Ile Pro Glu Gly Thr Arg Ile Leu Val Val Glu Ala Arg Gly Val Gly 305 310 315 320 Ala Glu Asp Val Ile Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro Val Met Cys Ala 325 330 335 Leu Ser Tyr Lys His Phe Glu Glu Gly Val Glu Ile Ala Arg Thr Asn 340 345 350 Leu Ala Asn Glu Gly Asn Gly His Thr Cys Ala Ile His Ser Asn Asn 355 360 365 Gln Ala His Ile Ile Leu Ala Gly Ser Glu Leu Thr Val Ser Arg Ile 370 375 380 Val Val Asn Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Gly Gly His Ile Gln Asn 385 390 395 400 Gly Leu Ala Val Thr Asn Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Asn Asn 405 410 415 Ser Ile Ser Glu Asn Phe Thr Tyr Lys His Leu Leu Asn Ile Ser Arg 420 425 430 Ile Ala Pro Leu Asn Ser Ser Ile His Ile Pro Asp Asp Lys Glu Ile 435 440 445 Trp Glu Leu 450 <210> 2 <211> 1356 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 2 atggagatta aagagatggt cagtcttgcg cgcaaagctc agaaggagta tcaggccacc 60 cataaccaag aagctgtgga caacatctgc cgagcagcag cgaaggttat ttacgaaaat 120 gcagcaattc tggcacgcga ggcagtggac gaaaccggca tgggtgttta cgagcacaag 180 gtggccaaga atcaaggcaa gtccaaaggt gtttggtaca acctgcataa caagaagtcg 240 attggcatcc tcaatatcga cgagcgtacc ggcatgatcg agatcgcaaa acctatcggg 300 gttgtaggcg ccgttacgcc aaccaccaac cctatcgtta ctccgatgag caacatcatc 360 tttgctctta agacctgcaa cgccatcatt atcgccccac acccgcgctc caaaaagtgc 420 tctgcccacg cagttcggct gatcaaagag gctatcgctc cgttcaacgt gcccgaaggt 480 atggttcaga tcatcgagga gcctagcatc gagaagacgc aggaattgat gggcgccgta 540 gacgtggtcg ttgctaccgg gggcatgggc atggtcaagt ctgcctactc ctcagggaag 600 ccttctttcg gtgtcggagc cggcaatgtt caggtgatag tggacagcaa catcgacttc 660 gaagcggcag cagaaaagat catcaccgga cgtgccttcg acaacggtat catctgctca 720 ggcgaacagt ccatcatcta caacgaggct gacaaggaag cagttttcac agcattccgc 780 aaccacggtg cgtacttttg cgacgaggcc gagggagatc gggctcgtgc agcgatcttc 840 gaaaatggag ccatcgcgaa agatgttgtg ggccagtccg ttgcctttat tgcaaagaag 900 gcgaacatta atatccccga gggtactcgt attctcgtgg tcgaagctcg cggagtaggc 960 gccgaagatg tcatctgtaa agaaaagatg tgtccagtca tgtgcgccct ctcctacaag 1020 cacttcgaag agggggtaga gatcgcaagg acgaacctcg caaacgaagg caatggccat 1080 acctgtgcta tccactccaa caaccaagca cacatcatct tggcaggctc ggagctgacc 1140 gtgtctcgca tcgtggtcaa cgcgccaagt gctaccacag caggcggtca catccagaac 1200 ggtcttgccg tcaccaatac tctaggctgc ggctcttggg gtaacaactc gatctccgaa 1260 aacttcactt ataaacacct gctcaacatt tcacgcatcg ccccgttgaa ctccagcatt 1320 catatcccag atgataagga aatctgggaa ctctaa 1356 <210> 3 <211> 314 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile Gly Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln Gly Met Ala Asp 20 25 30 His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Val 35 40 45 Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser Arg Thr Arg Val 50 55 60 Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala Met Val Val Ile 65 70 75 80 Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Gln Leu Val 85 90 95 Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly Asp Val Met Asp 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu Trp Asn Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Met Leu 145 150 155 160 Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His Ala Tyr Ile Ile 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser Ser Ala Thr Ile 180 185 190 Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp Pro Glu Leu Glu 195 200 205 Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His 210 215 220 Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Met Gly Leu 225 230 235 240 Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp Val Ala Val Pro 245 250 255 Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg Arg Val Val Glu 275 280 285 Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys His Ser Ala Asn 290 295 300 Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe 305 310 <210> 4 <211> 490 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Thr Ile Asn Val Ser Glu Leu Leu Ala Lys Val Pro Thr Gly Leu 1 5 10 15 Leu Ile Gly Asp Ser Trp Val Glu Ala Ser Asp Gly Gly Thr Phe Asp 20 25 30 Val Glu Asn Pro Ala Thr Gly Glu Thr Ile Ala Thr Leu Ala Ser Ala 35 40 45 Thr Ser Glu Asp Ala Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Cys Ala Val Gln 50 55 60 Ala Glu Trp Ala Arg Met Pro Ala Arg Glu Arg Ser Asn Ile Leu Arg 65 70 75 80 Arg Gly Phe Glu Leu Val Ala Glu Arg Ala Glu Glu Phe Ala Thr Leu 85 90 95 Met Thr Leu Glu Met Gly Lys Pro Leu Ala Glu Ala Arg Gly Glu Val 100 105 110 Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Leu Arg Trp Phe Ser Glu Glu Ala Val Arg 115 120 125 Leu Tyr Gly Arg Tyr Gly Thr Thr Pro Glu Gly Asn Leu Arg Met Leu 130 135 140 Thr Ala Leu Lys Pro Val Gly Pro Cys Leu Leu Ile Thr Pro Trp Asn 145 150 155 160 Phe Pro Leu Ala Met Ala Thr Arg Lys Val Ala Pro Ala Ile Ala Ala 165 170 175 Gly Cys Val Met Val Leu Lys Pro Ala Arg Leu Thr Pro Leu Thr Ser 180 185 190 Gln Tyr Phe Ala Gln Thr Met Leu Asp Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val 195 200 205 Leu Asn Val Val Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ile Ser Asn Pro Ile 210 215 220 Met Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Thr Pro 225 230 235 240 Val Gly Gln Gln Leu Leu Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Leu Arg Thr 245 250 255 Ser Met Glu Leu Gly Gly Asn Ala Pro Phe Ile Val Phe Glu Asp Ala 260 265 270 Asp Leu Asp Leu Ala Ile Glu Gly Ala Met Gly Ala Lys Met Arg Asn 275 280 285 Ile Gly Glu Ala Cys Thr Ala Ala Asn Arg Phe Leu Val His Glu Ser 290 295 300 Val Ala Asp Glu Phe Gly Arg Arg Phe Ala Ala Arg Leu Glu Glu Gln 305 310 315 320 Val Leu Gly Asn Gly Leu Asp Glu Gly Val Thr Val Gly Pro Leu Val 325 330 335 Glu Glu Lys Ala Arg Asp Ser Val Ala Ser Leu Val Asp Ala Ala Val 340 345 350 Ala Glu Gly Ala Thr Val Leu Thr Gly Gly Lys Ala Gly Thr Gly Ala 355 360 365 Gly Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Asp Ala 370 375 380 Ala Ile Leu Asn Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Pro Ile Val Thr 385 390 395 400 Phe Gln Thr Glu Glu Glu Ala Leu Arg Leu Ala Asn Ser Thr Glu Tyr 405 410 415 Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Gln Asp Thr Ser Arg Ile Phe Arg 420 425 430 Val Ser Asp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Val Gly Val Asn Ser Gly Val 435 440 445 Ile Ser Asn Ala Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Met 450 455 460 Gly Arg Glu Gly Gly Leu Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Thr Ser Val Gln 465 470 475 480 Tyr Ile Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Gly 485 490 <210> 5 <211> 453 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Met Ser Leu Thr Phe Pro Val Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ile 1 5 10 15 Thr Glu Leu Glu Asn His Asp Ser Thr Gln Trp Met Ser Ala Leu Ser 20 25 30 Asp Ala Val Ala Ala Gly Pro Ser Trp Ala Ala Lys Thr Pro Arg Glu 35 40 45 Arg Ser Val Val Leu Thr Ala Ile Phe Glu Ala Leu Thr Glu Arg Ala 50 55 60 Gln Glu Leu Ala Glu Ile Ile His Leu Glu Ala Gly Lys Ser Val Ala 65 70 75 80 Glu Ala Leu Gly Glu Val Ala Tyr Gly Ala Glu Tyr Phe Arg Trp Phe 85 90 95 Ala Glu Glu Ala Val Arg Leu Pro Gly Arg Tyr Gly Gln Ser Pro Ser 100 105 110 Gly Ile Gly His Ile Ala Val Thr Arg Ala Pro Val Gly Pro Val Leu 115 120 125 Ala Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Ile Ala Met Ala Thr Arg Lys Ile 130 135 140 Ala Pro Ala Leu Ala Ala Gly Cys Pro Val Leu Val Lys Pro Ala Ser 145 150 155 160 Glu Thr Pro Leu Thr Met Val Lys Val Gly Glu Ile Ile Ala Ser Val 165 170 175 Phe Asp Thr Phe Asn Ile Pro Gln Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Thr 180 185 190 Thr Arg Asp Ala Glu Leu Ser Ala Glu Leu Met Ala Asp Pro Arg Leu 195 200 205 Ala Lys Val Thr Phe Thr Gly Ser Thr Asn Val Gly Arg Ile Leu Val 210 215 220 Arg Gln Ser Ala Asp Arg Leu Leu Arg Thr Ser Met Glu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Asn Ala Ala Phe Val Ile Asp Glu Ala Ala Asp Leu Asp Glu Ala Val 245 250 255 Ser Gly Ala Ile Ala Ala Lys Leu Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Ile 260 265 270 Ala Ala Asn Arg Phe Leu Val His Glu Ser Arg Ala Ala Glu Phe Thr 275 280 285 Ser Lys Leu Ala Thr Ala Met Gln Asn Thr Pro Ile Gly Pro Val Ile 290 295 300 Ser Ala Arg Gln Arg Asp Arg Ile Ala Ala Leu Val Asp Glu Ala Ile 305 310 315 320 Thr Asp Gly Ala Arg Leu Ile Ile Gly Gly Glu Val Pro Asp Gly Ser 325 330 335 Gly Phe Phe Tyr Pro Ala Thr Ile Leu Ala Asp Val Pro Ala Gln Ser 340 345 350 Arg Ile Val His Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Thr Ile Ala Thr 355 360 365 Phe Thr Asp Leu Ala Glu Gly Val Ala Gln Ala Asn Ser Thr Glu Phe 370 375 380 Gly Leu Ala Ala Tyr Gly Phe Ser Asn Asn Val Lys Ala Thr Gln Tyr 385 390 395 400 Met Ala Glu His Leu Glu Ala Gly Met Val Gly Ile Asn Arg Gly Ala 405 410 415 Ile Ser Asp Pro Ala Ala Pro Phe Gly Gly Ile Gly Gln Ser Gly Phe 420 425 430 Gly Arg Glu Gly Gly Thr Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Leu Ser Val Arg 435 440 445 Tyr Leu Ala Leu Pro 450 <210> 6 <211> 521 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ile Lys Arg Leu Pro Leu Gly Pro Leu Pro Lys Glu Leu His Gln 1 5 10 15 Thr Leu Leu Asp Leu Thr Ala Asn Ala Gln Asp Ala Ala Lys Val Glu 20 25 30 Val Ile Ala Pro Phe Thr Gly Glu Thr Leu Gly Phe Val Phe Asp Gly 35 40 45 Asp Glu Gln Asp Val Glu His Ala Phe Ala Leu Ser Arg Ala Ala Gln 50 55 60 Lys Lys Trp Val His Thr Thr Ala Val Glu Arg Lys Lys Ile Phe Leu 65 70 75 80 Lys Phe His Asp Leu Val Leu Lys Asn Arg Glu Leu Leu Met Asp Ile 85 90 95 Val Gln Leu Glu Thr Gly Lys Asn Arg Ala Ser Ala Ala Asp Glu Val 100 105 110 Leu Asp Val Ala Ile Thr Thr Arg Phe Tyr Ala Asn Asn Ala Gly Lys 115 120 125 Phe Leu Asn Asp Lys Lys Arg Pro Gly Ala Leu Pro Ile Ile Thr Lys 130 135 140 Asn Thr Gln Gln Tyr Val Pro Lys Gly Val Val Gly Gln Ile Thr Pro 145 150 155 160 Trp Asn Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Val Ser Asp Ala Val Pro Ala Leu 165 170 175 Leu Ala Gly Asn Ala Val Val Ala Lys Pro Asp Leu Ala Thr Pro Phe 180 185 190 Ser Cys Leu Ile Met Val His Leu Leu Ile Glu Ala Gly Leu Pro Arg 195 200 205 Asp Leu Met Gln Val Val Thr Gly Pro Gly Asp Ile Val Gly Gly Ala 210 215 220 Ile Ala Ala Gln Cys Asp Phe Leu Met Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr 225 230 235 240 Gly Arg Ile Leu Gly Arg Thr Met Gly Glu Arg Leu Val Gly Phe Ser 245 250 255 Ala Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Leu Ile Val Ala Lys Asp Ala Asp 260 265 270 Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Leu Pro Gln Ala Cys Phe Ser Asn Ser 275 280 285 Gly Gln Leu Cys Val Ser Thr Glu Arg Ile Tyr Val Glu Glu Asp Val 290 295 300 Tyr Glu Glu Val Ile Ala Arg Phe Ser Lys Ala Ala Lys Ala Met Ser 305 310 315 320 Ile Gly Ala Gly Phe Glu Trp Lys Tyr Glu Met Gly Ser Leu Ile Asn 325 330 335 Gln Ala Gln Leu Asp Arg Val Ser Thr Phe Val Asp Gln Ala Lys Ala 340 345 350 Ala Gly Ala Thr Val Leu Cys Gly Gly Lys Ser Arg Pro Asp Ile Gly 355 360 365 Pro Phe Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Ala Asp Val Pro Glu Gly Thr 370 375 380 Pro Leu Leu Thr Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Val Phe Ile Glu Lys 385 390 395 400 Val Ala Thr Leu Glu Glu Ala Val Asp Lys Ala Asn Gly Thr Pro Tyr 405 410 415 Gly Leu Asn Ala Ser Val Phe Gly Ser Ser Glu Thr Gly Asn Leu Val 420 425 430 Ala Gly Gln Leu Glu Ala Gly Gly Ile Gly Ile Asn Asp Gly Tyr Ala 435 440 445 Ala Thr Trp Ala Ser Val Ser Thr Pro Leu Gly Gly Met Lys Gln Ser 450 455 460 Gly Leu Gly His Arg His Gly Ala Glu Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Glu 465 470 475 480 Ile Arg Asn Ile Ala Glu Gln Arg Trp Met Ser Met Arg Gly Pro Ala 485 490 495 Lys Met Pro Arg Lys Val Tyr Ser Asp Thr Val Ala Thr Ala Leu Lys 500 505 510 Leu Gly Lys Ile Phe Lys Val Leu Pro 515 520 <210> 7 <211> 1473 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60 tcctgggtgg aagcatccga cggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 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ctaaacctga cctcgcgaca cctttctcct gcttgatcat ggtgcacctg 600 ctcattgaag ccggtctgcc gcgtgatttg atgcaggttg tcaccggccc tggcgatatt 660 gttggcggtg cgattgcagc tcagtgtgat ttcctcatgt tcactggatc cacggccacg 720 ggccggatct tgggtcggac aatgggtgag cgtttggtgg gtttctctgc ggaattaggc 780 ggaaagaacc ctcttattgt ggccaaggat gcagatctgg acaaggtgga agctgagctt 840 ccgcaggcgt gtttttccaa ctcggggcaa ttgtgtgtct ccactgaacg tatttatgtc 900 gaggaagacg tgtacgagga ggtgattgca cggtttagca aggcggcgaa agccatgtcc 960 attggtgccg gatttgagtg gaaatatgag atgggttcgt tgatcaatca ggcgcagctg 1020 gatcgggtga gcacctttgt tgatcaggct aaagctgcgg gcgccacggt gctgtgcggt 1080 ggcaagtcac gccctgatat tggtcccttc ttctatgagc ccacggtatt ggcggatgtc 1140 ccagagggca ccccactgct cacggaggaa gtcttcgggc cggtggtgtt catcgaaaag 1200 gtagccacac tggaagaagc cgtcgataag gcaaatggca cgccctacgg cctgaatgcg 1260 tccgtctttg ggtcgtcgga aaccggcaat cttgttgcag gccagctgga agctggcggt 1320 atcggtatta atgatggcta cgccgcgacg tgggcgagcg tgtccacgcc tctgggtggc 1380 atgaagcagt cggggctggg 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Claims (18)

  1. C4 화합물을 생산하는 미생물에 있어서, 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제가 벡터상에서 발현되는 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속인 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 L-락테이트 데히드로게나아제(LDH)를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄되어 있는 미생물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제(SSDH)를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄되어 있는 미생물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제는 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 미생물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(CAT1)를 추가로 포함하는 것인 미생물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 미생물의 크로모좀 상에 위치하는 것인 미생물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 및 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 크로모좀 상에 위치하는 것인 미생물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4HBD)가 플라스미드 벡터상에서 발현되는 것인 미생물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 C4 화합물은 4-히드록시부티레이트(4-HB)인 것인 미생물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인 벡터인 것인 미생물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물이 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 미생물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12의 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계;
    배양물로부터 C4 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 C4 화합물을 수득하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 C4 화합물은 숙시네이트, 푸마르산, 말릭산, 4-히드록시부티레이트, 3-히드록시프로피온산, 1,4-부탄디올, 또는 γ-부티로락톤 또는 이로부터 유래한 C4 화합물인 것인 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 조건은 호기 조건에서 배양 후 혐기 조건으로 전환시키는 것인 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 조건은 호기 조건에서 배양 후 미세포기 조건으로 전환시키는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 미세포기 조건은 0.1~0.4 vvm 인 것인 방법
  18. 청구항 15에 있어서, 혐기전환 후 0~24 시간 후 미세포기 실시하는 것인 방법.
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