JP2010536338A - クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼの突然変異体及びこれを利用したラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法 - Google Patents
クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼの突然変異体及びこれを利用したラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明で使用されたPseudomonas sp.6−19(KCTC11027BP)由来PHA合成酵素(phaC1Ps6−19)遺伝子を分離するために、Pseudomonas sp.6−19の全体DNAを抽出し、phaC1Ps6−19遺伝子配列(HaeJin Song, Master’s Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004)に基づく配列番号5及び6の塩基配列を有するプライマーを作製し、PCRを行い、phaC1Ps6−19遺伝子を得た。
配列番号6:5’−CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC−3’
配列番号8:5’−CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC−3’
配列番号9:5’−GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG−3’
配列番号10:5’−CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC−3’
配列番号11:5’−GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG−3’
配列番号12:5’−AAC GGG AGG GAA CCT GCA GG−3’
多様な種類のPHA合成酵素のうち、タイプII PHA合成酵素は、比較的炭素数が多い基質を重合させるMCL−PHA(medium-chain-length PHA)合成酵素として知られていて、このMCL−PHA合成酵素は、ラクテート共重合体の生産に非常に有用なものと期待されている。本発明で獲得したphaC1Ps6−19合成酵素と非常に相同性が高いPseudomonas sp.61−3由来phaC1合成酵素は、タイプ II合成酵素であるが、比較的広範囲の基質特異性を有すると報告されていて(Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459, 1998)、SCL−PHA(short-chain-length PHA)の生産に適した突然変異体に関する研究結果が報告されている(Takase et al., Biomacromolecules, 5: 480, 2004)。これに基づいて、本発明では、SCL活性に影響を及ぼすアミノ酸部位3ヶ所を、アミノ酸配列分析を通じて探索し、配列番号15乃至20のプライマーを使用したSDM方法を利用して下記表1のようなphaC1Ps6−19合成酵素変異体を製造した。
配列番号16:5’−GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG−3’
配列番号17:5’−CGA GCA GCG GGC ATA TCA TGA GCA TCC TGA ACC CGC−3’
配列番号18:5’−GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG−3’
配列番号19:5’−ATC AAC CTC ATG ACC GAT GCG ATG GCG CCG ACC−3’
配列番号20:5’−GGT CGG CGC CAT CGC ATC GGT CAT GAG GTT GAT−3’
本実施例では、ラクテート重合体及び共重合体合成の時に必要な単量体であるラクチル−CoAを提供するために、クルロストリディユムプロピオニクム由来のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ(CP−PCT)を使用し、その遺伝子配列を配列番号3に示した。cp−pctは、クロストリジウムプロピオニウムの染色体DNAを配列番号21及び22のプライマーを利用してPCRして得られた断片を使用し、この時、元々野生型CP−PCTに存在するNdeIサイトをクローニングの促進のためにSDM方法を利用して除去した。
配列番号22:5’−GC TCT AGA TTA GGA CTT CAT TTC CTT CAG ACC CAT TAA GCC TTC TG−3’
配列番号24:5’−gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c−3’
CP−PCTが大膓菌で高発現される場合、深刻な代謝障害を起こし、毒性を現わすことが知られているが、全般的に、組み換えタンパク質の発現に広く使用されるtacプロモーターやT7プロモーターを使用したIPTGによる発現誘導タンパク質製造システムにおいては、誘導剤の添加と同時に、組み換え大膓菌がすべて死滅した。このため、弱く発現されるが、微生物の成長によって持続的に発現される常時的発現システムを使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体の合成に成功した。cp−pctに無作為的突然変異を導入するために、pPs619C1300−CPPCT(大韓民国特許出願第10-2006-0116234号)を鋳型にし、配列番号1及び配列番号2のプライマーを利用してMn2+が添加され、dNTPsの濃度差異が存在する条件下でエラープローンPCR(Error−prone PCR)を実施した(図2)。
配列番号2:5’−ggc agg tca gcc cat atg tc−3’
実施例2で最終選別された突然変異体の活性を定量的に分析するために、これらの突然変異体が含有された組み換え発現ベクター(図2)で形質転換されたE.coli JM109をブドウ糖(20g/L)と3HB(2g/L)が含まれたLB培地で37℃で4日間フラスコ培養した。培養菌体を遠心分離を通じて回収し、100℃の乾燥機で24時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィ分析を行い、細胞内の合成された高分子含量を測定した(表2)。
実施例2で最終選別された突然変異体(512、522)についてさらに実施例2に記載の態様でランダム変異導入法(random mutagenesis)を行い、下記のようなCP−PCT変異体531〜537及び540を得た。
Claims (24)
- 配列番号3の遺伝子配列においてT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異された遺伝子配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてA1200Gが変異された遺伝子配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてA1200Gが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてGly335Aspが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてAsp65Glyが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてAsp65Asnが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてThr199Ileが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてA1200Gが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてAla243Thrが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてA1200Gが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてAsp257Asnが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 配列番号3の遺伝子配列においてT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号3に対応するアミノ酸配列においてVal193Alaが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−CoA供給酵素である、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体。
- 請求項1乃至9のいずれか一項に記載のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子。
- 請求項10に記載の遺伝子を含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組み換えベクター。
- 上記組み換えベクターが、ラクチル−CoAを基質として利用してラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成することができる配列番号4のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子(phaC1Ps6−19300)をさらに含有することを特徴とする、請求項11に記載の組み換えベクター。
- 請求項11に記載の組み換えベクターで形質転換された細胞または植物。
- 請求項12に記載の組み換えベクターで形質転換された細胞または植物。
- 請求項13に記載の細胞または植物を培養または栽培する工程を含むことを特徴とする、ラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
- 請求項14に記載の細胞または植物を培養または栽培する工程を含むことを特徴とする、ラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
- 上記培養または栽培が、ヒドロキシアルカノエートを含有する環境で行われることを特徴とする、請求項15に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシブチレート、炭素数が6〜14個である中間鎖長の(D)−3−ヒドロキシカルボン酸、2−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシヘプタン酸、3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシウンデカン酸、3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシヘキサデカン酸、4−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシヘキサン酸、4−ヒドロキシヘプタン酸、4−ヒドロキシオクタン酸、4−ヒドロキシデカン酸、5−ヒドロキシ吉草酸、5−ヒドロキシヘキサン酸、6−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−4−ペンテン酸、3−ヒドロキシ−4−trans−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−4−cis−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−5−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−6−trans−オクテン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−オクテン酸、3−ヒドロキシ−7−オクテン酸、3−ヒドロキシ−8−ノネン酸、3−ヒドロキシ−9−デセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−7−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−5,8−cis−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4−メチル吉草酸、3−ヒドロキシ−4−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、3−ヒドロキシ−4−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−8−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−9−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−7−メチル−6−オクテン酸、リンゴ酸、3−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、3−ヒドロキシ−8−アセトキシオクタン酸、3−ヒドロキシ−9−アセトキシノナン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−3−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシオクタン酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、para−ニトロフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸、3−ヒドロキシ−5−シクロヘキシルブチレート、3,12−ジヒドロキシドデカン酸、3,8−ジヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4,5−エポキシデカン酸、3−ヒドロキシ−6,7−エポキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−8,9−エポキシ−5,6−cis−テトラデカン酸、7−シアノ−3−ヒドロキシヘプタン酸、9−シアノ−3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシ−7−フルオロヘプタン酸、3−ヒドロキシ−9−フルオロノナン酸、3−ヒドロキシ−6−クロロヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−クロロオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−ブロモヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−ブロモオクタン酸、3−ヒドロキシ−11−ブロモウンデカン酸、3−ヒドロキシ−2−ブテン酸、6−ヒドロキシ−3−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−2−メチルブチレート、3−ヒドロキシ−2−メチル吉草酸及び3−ヒドロキシ−2、6−ジ−メチル−5−ヘプテン酸よりなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項17に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシブチレート、2−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、炭素数が6〜14個である中間鎖長の(D)−3−ヒドロキシカルボン酸、3−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシ吉草酸及び5−ヒドロキシ吉草酸よりなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項18に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする、請求項19に記載の製造方法。
- 上記培養または栽培が、ヒドロキシアルカノエートを含有する環境で行われることを特徴とする、請求項16に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシブチレート、炭素数が6〜14個である中間鎖長の(D)−3−ヒドロキシカルボン酸、2−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシヘプタン酸、3−ヒドロキシオクタン酸、3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシデカン酸、3−ヒドロキシウンデカン酸、3−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシテトラデカン酸、3−ヒドロキシヘキサデカン酸、4−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシヘキサン酸、4−ヒドロキシヘプタン酸、4−ヒドロキシオクタン酸、4−ヒドロキシデカン酸、5−ヒドロキシ吉草酸、5−ヒドロキシヘキサン酸、6−ヒドロキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−4−ペンテン酸、3−ヒドロキシ−4−trans−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−4−cis−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−5−ヘキセン酸、3−ヒドロキシ−6−trans−オクテン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−オクテン酸、3−ヒドロキシ−7−オクテン酸、3−ヒドロキシ−8−ノネン酸、3−ヒドロキシ−9−デセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−6−cis−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−7−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−5,8−cis−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4−メチル吉草酸、3−ヒドロキシ−4−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルヘキサン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、3−ヒドロキシ−4−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−5−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−8−メチルノナン酸、3−ヒドロキシ−7−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−9−メチルデカン酸、3−ヒドロキシ−7−メチル−6−オクテン酸、リンゴ酸、3−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、3−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、3−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、3−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、3−ヒドロキシ−8−アセトキシオクタン酸、3−ヒドロキシ−9−アセトキシノナン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−3−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−3−ヒドロキシオクタン酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシブチレート、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、para−ニトロフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸、3−ヒドロキシ−5−シクロヘキシルブチレート、3、12−ジヒドロキシドデカン酸、3、8−ジヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸、3−ヒドロキシ−4、5−エポキシデカン酸、3−ヒドロキシ−6、7−エポキシドデカン酸、3−ヒドロキシ−8、9−エポキシ−5、6−cis−テトラデカン酸、7−シアノ−3−ヒドロキシヘプタン酸、9−シアノ−3−ヒドロキシノナン酸、3−ヒドロキシ−7−フルオロヘプタン酸、3−ヒドロキシ−9−フルオロノナン酸、3−ヒドロキシ−6−クロロヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−クロロオクタン酸、3−ヒドロキシ−6−ブロモヘキサン酸、3−ヒドロキシ−8−ブロモオクタン酸、3−ヒドロキシ−11−ブロモウンデカン酸、3−ヒドロキシ−2−ブテン酸、6−ヒドロキシ−3−ドデセン酸、3−ヒドロキシ−2−メチルブチレート、3−ヒドロキシ−2−メチル吉草酸及び3−ヒドロキシ−2、6−ジ−メチル−5−ヘプテン酸よりなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項21に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシブチレート、2−ヒドロキシプロピオン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、炭素数が6〜14個である中間鎖長の(D)−3−ヒドロキシカルボン酸、3−ヒドロキシ吉草酸、4−ヒドロキシ吉草酸及び5−ヒドロキシ吉草酸よりなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする、請求項22に記載の製造方法。
- 上記ヒドロキシアルカノエートが、3−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする、請求項23に記載の製造方法。
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