JP2012516695A - ポリ乳酸またはポリ乳酸共重合体生成能を有する組換えラルストニアユートロファ及びこれを利用してポリ乳酸またはポリ乳酸共重合体を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一具体例において、上記pct遺伝子は、クロストリジウム プロピオニカム(Clostridium propionicum)由来のpct遺伝子であることができる。
配列番号1の核酸配列(cp−pct);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異された核酸配列(cppct512);
配列番号1の核酸配列でT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異された核酸配列(cppct522);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でGly335Aspが変異された核酸配列(cppct531);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAla243Thrが変異された核酸配列(cppct532);
配列番号1の核酸配列でT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAsp65Glyが変異された核酸配列(cppct533);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAsp257Asnが変異された核酸配列(cppct534);
配列番号1の核酸配列でT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAsp65Asnが変異された核酸配列(cppct535);
配列番号1の核酸配列でT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でThr199Ileが変異された核酸配列(cppct537);及び
配列番号1の核酸配列でT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でVal193Alaが変異された核酸配列(cppct540)よりなる群から選択された塩基配列を有するものであることができる。上記pct遺伝子変異体は、大韓民国特許出願10−2007−0081855号に開示された方法によって製造されることができる。本発明の好ましい具体例において、上記pct遺伝子は、配列番号1の核酸配列でT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でVal193Alaが変異された核酸配列(cppct540)を有するものであることができる。
配列番号2のアミノ酸配列;または
配列番号2のアミノ酸配列でE130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K及びQ481Rよりなる群から選択される1つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するものであることができる。
上記組換えラルストニア ユートロファからポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含む、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法を提供する。
〔実施例1〕PHA生成能が消失されたラルストニア ユートロファの製作
R.eutrophaでポリ(3−hydroxybutyrate)[P(3HB)]合成に関与するPHA生合成遺伝子オペロンを除去するために、組換えベクターを次のように製作した。
EGFP_R_NdeI ggaattcCATATGttacttgtacagctcgtcca (配列番号4)
実施例1で製作したpK18−△CAB−GFPベクターをBamHI/NdeIで切断し、GFPを除去した後、pPs619C1335CPPCT540ベクターをBamHI/NdeIで切断して収得した遺伝子断片を挿入することによって、pK18−△CAB−335540ベクターを製作した。このベクターを利用してphaCABが除去され、クロモソームにPseudomonas sp.6−19(KCTC11027BP)由来phaC1Ps6−19335とClostridium propionicum由来のプロピオニル−CoAトランスフェラーゼ(CPPCT540)が挿入された組換えR.eutropha335540を製作した(表1)。製作方法は、大腸菌S17−1を利用して実施例1と同様の方法で行った(図3)。
実施例1で製作したpK18−△CAB−GFPベクターをBamHI/NdeIで切断してGFPを除去した後、pPs619C1335ReABベクターをBamHI/NdeIで切断して収得した遺伝子断片を挿入することによって、pK18−△CAB−335ReABベクターを製作した。このベクターを利用してphaCABが除去され、クロモソームにPseudomonas sp.6−19(KCTC11027BP)由来phaC1Ps6−19335とRalstonia eutrophaH16由来のPHB単量体供給酵素である(phaARE&phaBRE)が挿入された組換えR.eutropha 335ReABを製作した(表1)。製作方法は、大腸菌S17−1を利用して実施例1と同様の方法で行った(図3)。
実施例1で製作したpK18−△CAB−GFPベクターをBamHI/NdeIで切断してGFPを除去した後、pPs619C1310CPPCT540ReABとpPs619C1312CPPCT540ReABベクターをBamHI/NdeIで切断して収得した遺伝子断片を挿入することによって、pK18−△CAB−310540ReABとpK18−△CAB−312540ReABベクターを製作した。このベクターを利用してphaCABが除去され、クロモソームにPseudomonas sp.6−19(KCTC11027BP)由来phaC1Ps6−19310またはphaC1Ps6−19312、Clostridium propionicum由来のpropionyl−CoAtransferase(CPPCT540)とRalstonia eutropha H16由来のPHB単量体供給酵素である(phaARE&phaBRE)が挿入された組換えR.eutropha310540ReABとR.eutropha312540ReABを製作した(表1)。製作方法は、大腸菌S17−1を利用して実施例1と同様の方法で行った(図3)。
表1に示された組換えR.eutrophaを葡萄糖を基本基質とする34μg/mLのクロラムフェニコールを含む最小培地で培養し、P(3HB−co−LA)共重合体を生合成した。最小培地の成分は、次の通りである(/L)。KH2PO4、2.65g;Na2HPO4、3.8g;NH4Cl、0.72g;MgSO4・7H2O、0.4g;Tracer、1mL。また、tracerの成分は、次の通りである(/L)。FeSO4・7H2O、10g;ZnSO4・7H2O、2.25g;CuSO4・5H2O、1g;MnSO4・5H2O、0.5g;CaCl2・2H2O、2g;Na2B4O7・7H2O、0.23g;(NH4)6Mo7O24、0.1g;35%HCl、10mL。本培養の前に、種菌培養は、抗生剤を含むLB培地で30時間行われた。種菌培養液を基質と抗生剤が含有された最小培地に1%となるように接種し、本培養を4日間行った。すべての培養は、30℃、200rpmの速度で行った。培養後、遠心分離を通じて菌体を回収した。回収された菌体を80℃の乾燥器で48時間乾燥後、ガスクロマトグラフィ分析を行い、菌体内に蓄積されたP(3HB−co−LA)共重合体含量を測定し、その結果を表2に示した。分析に使用された標準物質は、P(3HB−co−12mol%3HV)共重合体及びPLA高分子であった。
R.eutropha GFPをPseudomonas sp.6−19(KCTC11027BP)由来PHAsynthase、Clostridium propionicum由来propionyl−CoA transferase(CPPCT)、P.Putida KT2440由来PhaGを発現するベクターに形質転換した後、実施例5のように、培養した。炭素源としては、2%葡萄糖を使用した。菌体内の蓄積された共重合体含量の結果を表3に示した。
まず、pPs619C1300CPPCT532あるいはpPs619C1334CPPCT532ベクターにP.putida KT2440からPCRで増幅したphaG遺伝子をNdeI siteに挿入した(pPs619C1300CPPCT532PhaGまたはpPs619C1334CPPCT532PhaG)。次に、pPs619C1300CPPCT532PhaGまたはpPs619C1334CPPCT532PhaGをBamHI/XhoIで切断した後、遺伝子断片をpBBR1MCS2ベクターに同じsiteに挿入することによって、R.eutrophaで複製可能な組換えプラスミドを製作した(pMCS2Ps619C1300CPPCT532PhaGまたはpMCS2Ps619C1334CPPCT532PhaG)。上記ベクターを利用して組換えR.eutrophaを製作した。
KTPhaGb-2100-NdeI 5- ggaattc catatg gga tcg gtg ggt aat tgg cc (配列番号6)
Claims (16)
- 野生型ラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)のポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoate:PHA)生合成遺伝子オペロンが除去され、ラクテートをラクチル−CoAに転換する酵素の遺伝子及びラクチル−CoAを基質として使用するPHA合成酵素の遺伝子が導入されたポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換えラルストニア ユートロファ(Ralstonia eutropha)。
- 上記ラクテートをラクチル−CoAに転換する酵素の遺伝子は、プロピオニル−CoAトランスフェラーゼ(pct)遺伝子であることを特徴とする請求項1に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記pct遺伝子は、クロストリジウム プロピオニカム(Clostridium propionicum)由来のpct遺伝子であることを特徴とする請求項2に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記pct遺伝子は、
配列番号1の核酸配列(cp−pct);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異された核酸配列(cppct512);
配列番号1の核酸配列でT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異された核酸配列(cppct522);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でGly335Aspが変異された核酸配列(cppct531);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAla243Thrが変異された核酸配列(cppct532);
配列番号1の核酸配列でT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAsp65Glyが変異された核酸配列(cppct533);
配列番号1の核酸配列でA1200Gが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAsp257Asnが変異された核酸配列(cppct534);
配列番号1の核酸配列でT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でAsp65Asnが変異された核酸配列(cppct535);
配列番号1の核酸配列でT669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でThr199Ileが変異された核酸配列(cppct537);及び
配列番号1の核酸配列でT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でVal193Alaが変異された核酸配列(cppct540)
よりなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項2に記載の組換えラルストニア ユートロファ。 - 上記pct遺伝子は、配列番号1の核酸配列でT78C、T669C、A1125G及びT1158Cが変異され、配列番号1の核酸配列に対応するアミノ酸配列でVal193Alaが変異された核酸配列(cppct540)を有するものであることを特徴とする請求項4に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記ラクチル−CoAを基質として使用するPHA合成酵素の遺伝子は、シュードモナス属6−19(Pseudomonas sp.6−19)のPHA合成酵素遺伝子であることを特徴とする請求項1に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記ラクチル−CoAを基質として使用するPHA合成酵素の遺伝子は、
配列番号2のアミノ酸配列でE130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K及びQ481Rよりなる群から選択される1つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するものであることを特徴とする請求項1に記載の組換えラルストニア ユートロファ。 - 上記ラクチル−CoAを基質として使用するPHA合成酵素の遺伝子は、配列番号2のアミノ酸配列でE130D、S325T、L412M、S477G及びQ481Mが変異されたアミノ酸配列(C1335);
配列番号2のアミノ酸配列でE130D、S477F及びQ481Kが変異されたアミノ酸配列(C1310);及び
配列番号2のアミノ酸配列でE130D、S477F及びQ481Rが変異されたアミノ酸配列(C1312)
よりなる群から選択されたいずれか1つのアミノ酸配列に対応する核酸配列を有するものであることを特徴とする請求項7に記載の組換えラルストニア ユートロファ。 - 上記組換えラルストニア ユートロファが3HB−CoA生成酵素をコーディングする遺伝子をさらに含むものであることを特徴とする請求項1に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記3HB−CoA生成酵素をコーディングする遺伝子は、ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−CoAリダクターゼ遺伝子であることを特徴とする請求項9に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−CoAリダクターゼ遺伝子は、ラルストニア ユートロファから由来したものであることを特徴とする請求項10に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記組換えラルストニア ユートロファがMCLのヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有するものであることを特徴とする請求項1に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記組換えラルストニア ユートロファがPhaG遺伝子をさらに含むものであることを特徴とする請求項1に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 上記PhaG遺伝子は、P.Putida KT2440由来のPhaG遺伝子であることを特徴とする請求項13に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
- 請求項1〜14のいずれかの記載の組換えラルストニア ユートロファを炭素源及びラクテート;または炭素源、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートを含む培地で培養し;
上記組換えラルストニア ユートロファからポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含む
ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法。 - 上記ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体中のヒドロキシアルカノエートは、3−ヒドロキシ酪酸(3-hydroxybutyrate)、3−ヒドロキシ吉草酸(3-hydroxyvalerate)、4−ヒドロキシ酪酸(4-hydroxybutyrate)、炭素数が6〜14個の中間鎖長さの(D)−3−ヒドロキシカルボン酸((D)-3-hydroxycarboxylic acid)、2−ヒドロキシプロピオン酸(2-hydroxypropionic acid)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3-hydroxypropionic acid)、3−ヒドロキシヘキサン酸(3-hydroxyhexanoic acid)、3−ヒドロキシヘプタン酸(3-hydroxyheptanoic acid)、3−ヒドロキシオクタン酸(3-hydroxyoctanoic acid)、3−ヒドロキシノナン酸(3-hydroxynonanoic acid)、3−ヒドロキシデカン酸(3-hydroxydecanoic acid)、3−ヒドロキシウンデカン酸(3-hydroxyundecanoic acid)、3−ヒドロキシドデカン酸(3-hydroxydodecanoic acid)、3−ヒドロキシテトラデカン酸(3-hydroxytetradecanoic acid)、3−ヒドロキシヘキサデカン酸(3-hydroxyhexadecanoic acid)、4−ヒドロキシ吉草酸(4-hydroxyvaleric acid)、4−ヒドロキシヘキサン酸(4-hydroxyhexanoic acid)、4−ヒドロキシヘプタン酸(4-hydroxyheptanoic acid)、4−ヒドロキシオクタン酸(4-hydroxyoctanoic acid)、4−ヒドロキシデカン酸(4-hydroxydecanoic acid)、5−ヒドロキシ吉草酸(5-hydroxyvaleric acid)、5−ヒドロキシヘキサン酸(5-hydroxyhexanoic acid)、6−ヒドロキシドデカン酸(6-hydroxydodecanoic acid)、3−ヒドロキシ−4−ペンテン酸(3-hydroxy-pentenoic acid)、3−ヒドロキシ−4−trans−ヘキセン酸(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid)、3−ヒドロキシ−4−cis−ヘキセン酸(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid)、3−ヒドロキシ−5−ヘキセン酸(3-hydroxy-5-hexenoic acid)、3−ヒドロキシ−6−trans−オクテン酸(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid)、3−ヒドロキシ−6−cis−オクテン酸(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid)、3−ヒドロキシ−7−オクテン酸(3-hydroxy-7-octenoic acid)、3−ヒドロキシ−8−ノネン酸(3-hydroxy-8-nonenoic acid)、3−ヒドロキシ−9−デセン酸(3-hydroxy-9-decenoic acid)、3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid)、3−ヒドロキシ−6−cis−ドデセン酸(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid)、3−ヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−7−cis−テトラデセン酸(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−5、8−cis−cis−テトラデセン酸(3-hydroxy-5、8-cis-cis tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−4−メチル吉草酸(3-hydroxy-4-methylvaleric acid)、3−ヒドロキシ−4−メチルヘキサン酸(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid)、3−ヒドロキシ−5−メチルヘキサン酸(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid)、3−ヒドロキシ−4−メチルオクタン酸(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−5−メチルオクタン酸(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−メチルオクタン酸(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチルオクタン酸(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−メチルノナン酸(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチルノナン酸(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid)、3−ヒドロキシ−8−メチルノナン酸(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチルデカン酸(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid)、3−ヒドロキシ−9−メチルデカン酸(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−メチル−6−オクテン酸(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid)、リンゴ酸(malic acid)、3−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester)、3−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester)、3−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル(3-hydroxysuberic acid-methyl ester)、3−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester)、3−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル(3-hydroxysebacic acid-methyl ester)、3−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester)、3−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester)、3−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル(3-hydroxypimelic acid-propyl ester)、3−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル(3-hydroxysebacic acid-benzil ester)、3−ヒドロキシ−8−アセトキシオクタン酸(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid)、3−ヒドロキシ−9−アセトキシノナン酸(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシ酪酸(phenoxy-3-hydroxybutyric acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシヘプタン酸(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid)、フェノキシ−3−ヒドロキシオクタン酸(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid)、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ酪酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid)、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシ吉草酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、para−シアノフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、para−ニトロフェノキシ−3−ヒドロキシヘキサン酸(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid)、3−ヒドロキシ−5−シクロヘキシル酪酸(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid)、3、12−ジヒドロキシドデカン酸(3、12-dihydroxydodecanoic acid)、3、8−ジヒドロキシ−5−cis−テトラデセン酸(3、8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid)、3−ヒドロキシ−4、5−エポキシデカン酸(3-hydroxy-4、5-epoxydecanoic acid)、3−ヒドロキシ−6、7−エポキシドデカン酸(3-hydroxy-6、7-epoxydodecanoic acid)、3−ヒドロキシ−8、9−エポキシ−5、6−cis−テトラデカン酸(3-hydroxy-8、9-epoxy-5、6-cis-tetradecanoic acid)、7−シアノ−3−ヒドロキシヘプタン酸(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid)、9−シアノ−3−ヒドロキシノナン酸(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid)、3−ヒドロキシ−7−フルオロヘプタン酸(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid)、3−ヒドロキシ−9−フルオロノナン酸(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−クロロヘキサン酸(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid)、3−ヒドロキシ−8−クロロオクタン酸(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid)、3−ヒドロキシ−6−ブロモヘキサン酸(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid)、3−ヒドロキシ−8−ブロモオクタン酸(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid)、3−ヒドロキシ−11−ブロモウンデカン酸(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid)、3−ヒドロキシ−2−ブテン酸(3-hydroxy-2-butenoic acid)、6−ヒドロキシ−3−ドデセン酸(6-hydroxy-3-dodecenoic acid)、3−ヒドロキシ−2−メチル酪酸(3-hydroxy-2-methylbutyric acid)、3−ヒドロキシ−2−メチル吉草酸(3-hydroxy-2-methylvaleric acid)、及び3−ヒドロキシ−2、6−ジメチル−5−ヘプテン酸(3-hydroxy-2、6-heptenoic acid)よりなる群から選択される1つ以上であることを特徴とする請求項15に記載の製造方法。
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