TWI425090B - 可產生聚乳酸或其共聚物之重組貪銅菌及使用其製備聚乳酸或其共聚物之方法 - Google Patents

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Description

可產生聚乳酸或其共聚物之重組貪銅菌及使用其製備聚乳酸或其共聚物之方法
本發明係關於一種重組貪銅菌(Ralstonia eutropha )，其係可生產聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物，以及使用該貪銅菌製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法。
聚乳酸(PLA)是一種由乳酸衍生出之生物可降解聚合物，其係經常被用於一般用途或醫療聚合物合成方面的應用。今日，經由微生物發酵形成乳酸聚合物則是一種合成聚乳酸(PLA)的方法。然而，此種直接聚合乳酸的方法僅可生產低分子量(1000至5000道耳吞)的聚乳酸(PLA)。具有100,000道耳吞或以上的分子量的聚乳酸可由小分子聚乳酸藉由乳酸直接聚合方法，使用鏈偶聯試劑(chain coupling agent)聚合而成。然而，由於需添加溶劑或鏈偶聯試劑，而此二者皆不易移除，因此此方法較為複雜。最被廣為使用於製備高分子PLA的方法包括將乳酸轉化為乳酸交酯(lactide)之方法以及使用乳酸交酯環開環加成聚合法合成PLA之方法。
當使用乳酸合成PLA時，PLA同元聚合物是比較容易合成的。然而，含有各種單體組成之PLA共聚物的合成則較不容易，且其商業效益較低。
聚羥基烷酸酯(PHA，Polyhydroxyalkanoate)係一種聚酯類，於微生物中，當碳過多但其他養分(如磷、氮、鎂、以及氧)缺乏時，PHA可做為能量或碳的儲存分子。PHA另外亦作為一種習知的合成塑膠之替代物，係由於其特性近似於由石油衍生出之一般合成聚合物，且具有非常優秀的生物降解特性。
為了可由微生物生產出PHA，須具有可將微生物的代謝產物轉化成為PHA單體的酵素或是PHA合成酶，而可將PHA單體合成出PHA聚合物。為了使用微生物合成出PLA以及PLA共聚物，需要如上述之系統，或是可產生出乳酸基輔酶A以及羥醯基輔酶A(PHA合成酶之主要基質)的酵素。
再者，為了在具有經濟效益下生產生物可降解聚合物，必須能在細胞中有效地累積PLA以及PLA共聚物。尤其，必須經由高濃度培養來生產高濃度的PLA以及PLA共聚物。因此，亟須一種可符合上述需求，而有效地生產出重組微生物之技術。
本發明之一目的係在於提供一種重組貪銅菌(R. eutropha)，其係可生產出高濃度聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物，並提供一種使用該菌製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法。
本發明係提供一種重組菌株之貪銅菌，其係可生產出高濃度聚乳酸聚合物或共聚物，本發明亦提供一種使用該菌株製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法。
本發明之發明人成功地合成出聚乳酸聚合物以及共聚物，其係使用由可生產出乳酸基輔酶A之Clostridium propionicum (C. propionicum ，丙酸梭菌)所衍生出之丙醯基-輔酶A轉移酶(propionyl-CoA transferase)、或是使用由Pseudomonas sp. 6-19-所衍生且係使用新合成之乳酸基輔酶A作為基質之聚羥基烷酸酯合成酶突變型(韓國專利公開第10-2006-0116234號)。
此外，本發明之發明人欲製備一重組貪銅菌菌株，使其可有效地生產聚乳酸聚合物，並可用於生物可降解之聚合物的商業性生產中。藉此，發明人製備出一種失去PHA生產能力之重組貪銅菌、以及一種轉殖之重組貪銅菌，其轉殖之重組貪銅菌係經由於重組貪銅菌中轉殖一質體(該質體係可表現C. propionicum 所衍生之丙醯基-輔酶A轉移酶以及P. sp. 6-19之聚羥基烷酸酯合成酶)而得到、或是將一段可表現丙醯基-輔酶A轉移酶的基因(其係衍生自C. propionicum )以及一段可表現P. sp. 6-19之聚羥基烷酸酯合成酶的基因殖入一失去PHA生產能力之重組貪銅菌中而得到。發明人發現，使用上述方法製得之重組貪銅菌可有效地從葡萄糖製備聚乳酸聚合物以及共聚物。此即為本發明之主要技術。
本發明提供了一種重組之貪銅菌菌株，其係可生產聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物，本發明亦提供一種藉由培養上述重組之貪銅菌菌株來製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法。
本發明係提供一種重組貪銅菌菌株，其係可生產聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物，其中一野生型貪銅菌之聚羥基烷酸酯(PHA，polyhydroxyalkanoate)之生物合成基因縱子係被移除，並插入一段將外來乳酸轉換為乳酸基輔酶A之酵素之基因，以及一段使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶之基因。
本發明中，該將乳酸轉換為乳酸基輔酶A之酵素之基因可為一丙醯基-輔酶A轉移酶(pct)基因。
於一特別的實施例中，該pct基因係衍生自Clostridium propionicum(丙酸梭菌)。
本發明中，該pct基因可為一突變型，且該突變型係編碼為丙醯基-輔酶A轉移酶，且係具有相等或高於乳酸基輔酶A的產出活性。
於一特別的實施例中，該pct基因具有下述之核酸序列：SEQ ID NO: 1之核酸序列(cp-pct)；含有A1200G突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct512)；含有T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct522)；含有A1200G突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct531)，其中該A1200G突變所對應之胺基酸序列係包含有Gly335Asp突變；含有A1200G突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct532)，其中該A1200G突變所對應之胺基酸序列係包含有Ala243Thr突變；含有T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct533)，其中該T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Asp65Gly突變；含有A1200G突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct534)，其中該A1200G突變所對應之胺基酸序列係包含有Asp257Asn突變；含有T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct535)，其中該T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Asp65Asn突變；含有T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct537)，其中該T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Thr199Ile突變；以及含有T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct540)，其中該T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Val193Ala突變所組成之群組。
該pct突變基因可使用揭示於韓國專利申請案第10-2007-0081855號中所述之方法製備。於一特殊的實施例中，該pct基因較佳具有一含有T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO: 1之核酸序列(cppct540)，其中該T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Val193Ala突變。
此外，本發明中，該使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶之基因可為Pseudomonas sp. 6-19(假單胞菌)之PHA合成酶基因。
本發明中，該使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶之基因可包含一突變於其中，而該突變係可編碼為具有相等或高於PHA的產出活性之PHA合成酶。
於一特殊的實施例中，該使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶的基因可包括，但不限於：對應至SEQ ID NO: 2胺基酸序列之核酸序列、或對應至具有至少一選自以下突變之SEQ ID NO: 2胺基酸序列之核酸序列：E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、以及Q481R。
可編碼為PHA合成酶(使用乳酸基輔酶A作為基質)之基因的突變可使用揭露於韓國專利申請第10-2008-0068607號中所述的方法完成。於一特殊的實施例中，該PHA合成酶基因具有對應至至少一胺基酸序列之核酸序列，其中該胺基酸序列係選自由：含有E130D、S325T、L412M、S477G、以及Q481M突變之SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(C1335)；含有E130D、S477F、以及Q481K突變之SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(C1310)；以及含有E130D、S477F、以及Q481R突變之SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(C1312)所組成之群組。
本發明中，該重組貪銅菌菌株可更包括一3HB-CoA合成酶編碼基因。即使當培養基中不具有羥基烷酸酯時，該3HB-CoA合成酶編碼基因仍可使羥基烷酸酯-乳酸共聚物的製備可具有較高的羥基烷酸酯莫爾分率。
於一特殊的實施例中，該3HB-CoA合成酶編碼基因可包括一酮硫解酶(ketothiolase)基因以及一乙醯乙醯輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase)基因，此二者皆可衍生自貪銅菌，但不限於此。本發明中，重組貪銅菌可更包括一PhaG基因。
於一特殊的實施例中，該PhaG基因可衍生自P. Putida KT2440。當重組貪銅菌中包含有PhaG基因時，重組貪銅菌則可生產MCL之羥基烷酸酯-乳酸共聚物。
將可轉換乳酸成為乳酸基輔酶A的酵素的編碼基因、使用乳酸基輔酶A作為基質之基因、以及3HB-CoA合成酶編碼基因及/或重組貪銅菌之PhaG基因進行轉殖，可藉由下述習知技術中已知之方法來達成。例如，該方法可包括製備一載體(vector)，該載體係包括可將乳酸轉換為乳酸基輔酶A之酵素的編碼基因、以及/或使用乳酸基輔酶A做為基質之PHA合成酶的基因；以及將貪銅菌轉殖(其中一野生型聚羥基烷酸酯(PHA)合成操縱子係由重組載體中被移除)之步驟。
該「載體(vector)」一詞係指一種DNA結構，係包含有DNA序列，且係於一合適的宿主中可操作性地與一可表現DNA之控制序列連結。本發明中，該載體可為一質粒載體(plasmid vector)、噬菌體載體(bacteriophage vector)、黏質體載體(cosmid vector)、或酵母菌人工染色體(Yeast Artificial Chromosome(YAC) vector)，而一般係使用質粒載體。例如，在此所用之一般質粒載體可具有(a)複製起點，以有效地於每一宿主細胞中複製出數百個質粒載體；(b)對抗生素具抗藥性之基因，以可對於質粒載體所轉殖之宿主細胞具選擇性；以及(c)限制酵素切位點，其可使一外來DNA片段插入。若沒有合適的限制酵素切位點，仍可使用習知技術方法，使用合成寡核酸結合接頭(adaptor)或連結器(linker)將載體與外來DNA輕易地結合。
如習知技術中所述，為了增加轉殖基因的表現，相對應的基因應為可操作性地連接至一控制表現的序列，此序列係與選擇性表現的宿主中之轉錄以及轉譯有關。較佳地，該表現控制序列以及相對應的基因係包含於一單一表現載體中，該載體同時包含有對細菌具選擇性之標記(marker)以及複製起始點。當該表現宿主為一真核細胞，該表現載體可更包括一可用之表現標記。
該「表現控制序列(expression control sequence)」一詞係指一特定的宿主中，用於將一經由可操作性連結之編碼序列進行表現所用之基本的DNA序列。該控制序列包含有：一啟動子(promoter)，其係用於啟動轉錄；一隨機操作子序列，用以控制轉錄；一序列，用以編碼一合適的mRNA核糖體結合位點(ribosome binding site，RBS)；以及一序列，用以控制轉錄以及轉譯的終點。例如，原核細胞之控制序列可包括：一啟動子；一隨機操作子序列；以及一mRNA RBS。真核細胞之控制序列可包括：一啟動子；一多聚腺苷酸化信號(polyadenylation signal)；以及一增強子(enhancer)。該啟動子係為質粒中對於基因表現影響之關鍵因素。因此，可使用具有高度表現之啟動子，如SRα啟動子或由衍伸自巨細胞病毒之啟動子。
為了使用本發明之技術來表現DNA序列，任何表現控制序列皆可使用作為載體。表現控制序列之例子包括早期以及晚期的SV40啟動子或是腺病毒以及lac系統、trp系統、TAC系統、TRC系統、T3以及T7啟動子、噬菌體λ之主要操作子以及啟動子、fD外殼蛋白之控制區域、3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase)基因之啟動子或是不同醣解作用酵素之啟動子、磷酯酶(phosphatase)基因之啟動子(如，Pho5)、酵母菌α-交配系統之啟動子、以及其他習知用以控制原核以及真核細胞或其他病毒之表現的特徵或衍生特性之序列、及其各種混合序列。
當處於一功能性關係時，核酸會「操作性地連結」至一核酸序列。適當的分子(如，轉錄-活化蛋白)可為基因產物以及控制序列，其連接型式可使基因進行表現。例如，當一多肽作為分泌該多肽相關之前蛋白時，一可對前序列(pre-sequence)或分泌導子(secretory leader)編碼之DNA係操作性地連接至一可對該多肽編碼之DNA；一可影響編碼序列(coding sequence)轉錄的啟動子或增強子(enhancer)係操作性地連接至該編碼序列；以及一影響編碼序列之轉錄或轉譯的RBS係操作性地連接至該編碼序列。一般而言，「操作性地連接」係指相連接的DNA序列係連續性地連接在一起。尤其，在不論分泌導子之前提下，「操作性地連接」係指相連接的DNA序列在轉譯區(reading frame)上係連續性地連接在一起。然而，與編碼序列相接觸的增強子是並非必要的。序列之間的連接可由一習用的限制酵素端的連接作用(ligation)來完成。此外，人工合成之寡核酸轉接分子(oligonucleotide adaptor)或連接體(linker)亦可應用傳統方法使用於本發明中，且係不受任何限制酵素端的限制。
應注意的是，本發明中，並非所有的載體以及表現控制序列對於DNA序列表現的影響(作用)都是相同的。且相似地，於相同的表現系統中，所有的宿主並不會等效地作用。然而，在不悖離本發明之技術特徵下或是經由實驗錯誤所得到之經驗中，具習知技術之人員可選擇習知技術中之各種載體、表現控制序列、以及宿主。例如，在選擇載體之同時需考量宿主。此外，載體複製的數量、複製的數目的控制能力、以及被相對載體(如，抗生標記(antibiotic marker))編碼的其他蛋白質的表現也都應進行評估。考量到此些變異數後，具習知技術之人員可決定出合適的載體、表現控制序列、以及宿主的組合。
本發明亦提供一種製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法，其包括：於一含有碳源以及乳酸、或一含有碳原、乳酸、以及羥基烷酸酯之培養基中培養重組貪銅菌(R .eutropha )；以及由該重組貪銅菌取得聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物。
例如，當於一含有葡萄糖之培養基或含有葡萄糖以及羥基烷酸酯之培養基進行培養中，重組貪銅菌會分別生產出聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物。然而，即使當培養基中缺乏羥基烷酸酯時，當重組貪銅菌對於編碼3HB-CoA合成酶之基因進行表現時，產出的羥基烷酸酯-乳酸共聚物仍可具有較高的羥基烷酸酯莫爾分率。且當重組貪銅菌對於PhaG進行表現時，可製得出MCL的羥基烷酸酯-乳酸共聚物。
本發明中，該羥基烷酸酯-乳酸共聚物可包括，但不限於：3HA-LA共聚物(poly(3HA-co-LA))、3HB-LA共聚物(poly(3HB-co-LA))、3HP-LA共聚物(poly(3HP-co-LA))、3HB-4HB-LA共聚物(poly(3HB-co-4HB-co-LA))、3HP-4HB-LA共聚物(poly(3HP-co-4HB-co-LA))、3HB-3HV-LA共聚物(poly(3HB-co-3HV-co-LA))、4HB-LA-3HP共聚物(poly(4HB-co-LA-co-3HP))、以及MCL 3-HA-LA共聚物(poly(MCL 3-HA-co-LA)。
尤其，該羥基烷酸酯-乳酸共聚物的產量會根據培養基中羥基烷酸酯的種類而有所不同。
本發明中，該用以合成出羥基烷酸酯-乳酸共聚物的羥基烷酸酯基質可為至少一選自由以下化合物：3-羥基丁酸酯(3-hydroxybutyrate)、3-羥基戊酸酯(3-hydroxyvalerate)、4-羥基丁酸酯(4-hydroxybutyrate)、中鏈長之具有6至14個碳原子之(D)-3-羥基碳酸((D)-3-hydroxycarboxylic acid)、2-羥基丙酸(2-hydroxypropionic acid)、3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoic acid)、3-羥基庚酸(3-hydroxyheptanoic acid)、3-羥基辛酸(3-hydroxyoctanoic acid)、3-羥基壬酸(3-hydroxynonanoic acid)、3-羥基癸酸(3-hydroxydecanoic acid)、3-羥基十一酸(3-hydroxyundecanoic acid)、3-羥基十二酸(3-hydroxydodecanoic acid)、3-羥基十四酸(3-hydroxytetradecanoic acid)、3-羥基十六酸(3-hydroxyhexadecanoic acid)、4-羥基戊酸(4-hydroxyvaleric acid)、4-羥基己酸(4-hydroxyhexanoic acid)、4-羥基庚酸(4-hydroxyheptanoic acid)、4-羥基辛酸(4-hydroxyoctanoic acid)、4-羥基癸酸(4-hydroxydecanoic acid)、5-羥基戊酸(5-hydroxyvaleric acid)、5-羥基己酸(5-hydroxyhexanoic acid)、6-羥基十二酸(6-hydroxydodecanoic acid)、3-羥基-戊烯酸(3-hydroxy-pentenoic acid)、3-羥基-4-反式-己烯酸(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid)、3-羥基-4-順式-己烯酸(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid)、3-羥基-5-己烯酸(3-hydroxy-5-hexenoic acid)、3-羥基-6-反式-辛烯酸(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid)、3-羥基-6-順式-辛烯酸(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid)、3-羥基-7-辛烯酸(3-hydroxy-7-octenoic acid)、3-羥基-8-壬烯酸(3-hydroxy-8-nonenoic acid)、3-羥基-9-癸烯酸(3-hydroxy-9-decenoic acid)、3-羥基-5-順式-十二烯酸(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid)、3-羥基-6-順式-十二烯酸(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid)、3-羥基-5-順式-十四碳烯酸(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid)、3-羥基-7-順式-十四碳烯酸(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid)、3-羥基-5,8-順式-順式-十四碳烯酸(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid)、3-羥基-4-甲基戊酸(3-hydroxy-4-methylvaleric acid)、3-羥基-4-甲基己酸(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid)、3-羥基-5-甲基己酸(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid)、3-羥基-6-甲基庚酸(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid)、3-羥基-4-甲基辛酸(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid)、3-羥基-5-甲基辛酸(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid)、3-羥基-6-甲基辛酸(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid)、3-羥基-7-甲基辛酸(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid)、3-羥基-6-甲基壬酸(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid)、3-羥基-7-甲基壬酸(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid)、3-羥基-8-甲基壬酸(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid)、3-羥基-7-甲基癸酸(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid)、3-羥基-9-甲基癸酸(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid)、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid)、蘋果酸(malic acid)、3-羥基丁二酸-甲基酯(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester)、3-羥基己二酸-甲基酯(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester)、3-羥基辛二酸-甲基酯(3-hydroxysuberic acid-methyl ester)、3-羥基壬二酸甲基酯(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester)、3-羥基癸二酸甲基酯(3-hydroxysebacic acid-methyl ester)、3-羥基辛二酸乙基酯(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester)、3-羥基癸二酸乙基酯(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester)、3-羥基庚二酸-丙基酯(3-hydroxypimelic acid-propyl ester)、3-羥基癸二酸苄酯(3-hydroxysebacic acid-benzyl ester)、3-羥基-8-丙醯辛酸(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid)、3-羥基-9-丙醯壬酸(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid)、苯氧基-3-羥基丁酸(phenoxy-3-hydroxybutyric acid)、苯氧基-3-羥基戊酸(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、苯氧基-3-羥基庚酸(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid)、苯氧基-3-羥基辛酸(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid)、對-氰基苯氧基-3-羥基丁酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid)、對-氰基苯氧基-3-羥基戊酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、對-氰基苯氧基-3-羥基己酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、對-硝基苯氧基-3-羥基己酸(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、3-羥基-5-苯基戊酸(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid)、3-羥基-5-氯環己基丁酸(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid)、3,12-二羥基十二酸(3,12-dihydroxydodecanoic acid)、3,8-二羥基-5-順式-十四碳烯酸(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid)、3-羥基-4,5-環氧基癸酸(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid)、3-羥基-6,7-環氧基癸酸(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid)、3-羥基-8,9-環氧基-5,6-順式-十四酸(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid)、7-氰基-3-羥基庚酸(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid)、9-氰基-3-羥基壬酸(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid)、3-羥基-7-氟庚酸(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid)、3-羥基-9-氟壬酸(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid)、3-羥基-6-氯己酸(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid)、3-羥基-8-氯辛酸(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid)、3-羥基-6-溴己酸(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid)、3-羥基-8-溴辛酸(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid)、3-羥基-11-溴十一酸(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid)、3-羥基-2-丁烯酸(3-hydroxy-2-butenoic acid)、6-羥基-3-十二烯酸(6-hydroxy-3-dodecenoic acid)、3-羥基-2-甲基丁酸(3-hydroxy-2-methylbutyric acid)、3-羥基-2-甲基戊酸(3-hydroxy-2-methylvaleric acid)、以及3-羥基-2,6-二甲基庚酸(3-hydroxy-2,6-dimethylheptenoic acid)。
本發明使用了重組貪銅菌菌株，而提供出一種新穎之製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
<實施例1>失去PHA生產能力之貪銅菌的製備
為了移除貪銅菌(R. eutropha)中與合成聚(3-羥基丁酸酯)(poly(3-hydroxybutyrate)，[P(3HB)])相關之PHA生物合成基因操縱子，需如下述方法製備一重組載體。
將含有PHB-生產操縱子(衍生自貪銅菌H16)之一DNA片段由pSYL105載體(Lee et al.,Biotech. Bioeng.,1994,44:1337-1347)上使用BamHI/EcoRI切下，並插入至pBluescript II(Stratagene)之BamHI/EcoRI的辨識位置，如此則製得pReCAB重組載體。
將PHA合成酶(phaCRE )與單體供應酵素(phaARE ＆ phaBRE )連續地於pReCAB載體中，以PHB操作子啟動子(PHB operon promoter)進行表現。此外，載體亦可有效地於E. coli(Lee et al.,Biotech. Bioeng.,1994,44:1337-1347)中操作。使用BstBI/NdeI，切除新的pReCAB載體中，以移除R.eutropha H16 PHA合成酶(phaCRE )、b-酮硫解酶(b-ketothiolase(phaARE ))、以及乙醯乙醯輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase(phaBRE ))編碼基因。接著將一使用PCR並由一pEGFP質體(BD Biosciences Clontech)放大製得之GFP基因插入至載體(p△CAB-GFP)中。
EGFP_F_BstBI aaaaattcgaaac aggaaacagaat atggtgagcaag(SEQ ID NO: 3)
EGFP_R_NdeI ggaattcCATATGttacttgtacagctcgtcca(SEQ ID NO: 4)
接著，將p△CAB-GFP載體使用BamHI/XhoI切下，得到一段基因片段(其中之R. eutropha PHA生物合成啟動子係連接至5’方向(端)，且一轉錄終止基因係連接至3’方向(端))。該基因片段係插入至以BamHI/SalI切下之pK18mobSacB載體(Schafer et al. Gene(1994) 145: 69-73)中，如此則可得到pK18-△CAB-GFP載體。由於pK18mobSacB載體可表現sacB，則可藉由將一外來基因使用蔗糖插入至染色體中而製造出重組微生物。
將pK18-△CAB-GFP載體轉殖至E. coli S17-1後，於一含有25mg/l康那黴素(kanamycin)之LB液態培養基中，以37℃培養S17-1(pK18-△CAB-GFP)24小時。並且，將貪銅菌NCIMB11599於一LB液態培養基中，以37℃培養24小時。
將此些培養溶液彼此混合以得到體積比為S17-1(pK18-△CAB-GFP)：貪銅菌NCIMB11599為3:1，並以100ul的量逐滴加入至一LB固態培養基中。所得到的培養基係置放於一恆溫培養箱中，以30℃的溫度培養18小時。於培養期間，會有混交的情形產生，並使S17-1的pK18-△CAB-GFP載體轉換至貪銅菌中，如圖3所示，而於Ralstonia的染色體DNA之同原端得到一第一配種(first crossover)。由於pK18-△CAB-GFP無法於貪銅菌中複製，當pK18-△CAB-GFP經由基因間之第一配種被插入至貪銅菌的染色體中，貪銅菌會於含有500mg/L康那黴素的培養基中表現出抗性。
從LB盤中挑選一菌落，並將細胞懸浮於一LB液態培養基中，其中該菌落中之pK18-△CAB-GFP係經由第一配種被插入至貪銅菌的染色體中，接著將懸浮液塗布至一含有500mg/L康那黴素以及35mg/l的氯黴素的培養盤中。關於第二配種，係將一第一配種已完成之重組貪銅菌於一LB液態培養基中，以30℃培養24小時，並接著取100ul的培養溶液塗布至一含有70g/L蔗糖的LB培養盤中。使用PCR(如圖3所示)，選取一使用sacB基因達成第二配種之貪銅菌作為重組貪銅菌。當完成第二配種後，該重組貪銅菌會失去其PHA生合成操縱子(phaCAB)，但GFP基因仍會留存於染色體中。經由菌落PCR，可發現到該GFP已插入至染色體中的重組貪銅菌，則稱之為貪銅菌GFP。
<實施例2>製備插入有Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之PHA合成酶以及丙酸梭菌(Clostridium propionicum )之丙醯基-輔酶A轉移酶(propionyl-CoA transferase)(CPPCT)之重組貪銅菌
將實施例1中所製得之pK18-△CAB-GFP使用BamHI/NdeI將GFP切除，並將一由使用BamHI/NdeI於pPs619C1335CPPCT540載體中所切下的基因片段插入至其中，如此得到一pK18-△CAB-335540載體。藉著使用此載體，製備一重組貪銅菌，其中該重組貪銅菌之phaCAB係以移除且一Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之phaClPs6-19 335以及一丙酸梭菌(Clostridium propionicum )之丙醯基-輔酶A轉移酶(propionyl-CoA transferase)係插入至其染色體中(請見表1)。其係使用E. coli S17-1，以如同實施例1中所述之相同方法進行製備(請見圖3)。
<實施例3>重組貪銅菌之製備，其中一Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之PHA合成酶、以及貪銅菌H16之酮基硫解酶(ketothiolase，phaARE )與乙醯乙醯輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase)(phaBRE)係插入至該重組貪銅菌之中
將實施例1中所製備之pK18-△CAB-GFP載體以BamHI/NdeI剪切移除GFP，並將一由pPs619C1335ReAB載體中使用BamHI/NdeI切下之基因片段插至其中，如此可得到一pK18-△CAB-335ReAB載體。藉由使用該載體，可製得一重組貪銅菌335ReAB，其中phaCAB係被移除，且一Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之phaClPs6-19 335以及貪銅菌H16之PHB單體供應酵素(phaARE ＆ phaBRE )係被插入至一染色體中，請見表1。其係使用E. coli S17-1，以如同實施例1中所述之相同方法進行製備(請見圖3)。
<實施例4>重組貪銅菌之製備，其中一Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之PHA合成酶、丙酸梭菌(Clostridium propionicum )之丙醯基-輔酶A轉移酶(propionyl-CoA transferase)(CPPCT)、以及貪銅菌H16之酮基硫解酶(ketothiolase，phaARE )與乙醯乙醯輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase)(phaBRE )係插入至該重組貪銅菌之中
將實施例1中所製備之pK18-△CAB-GFP載體以BamHI/NdeI剪切移除GFP，並將一由pPs619C1310CPPCT540ReAB與pPs619C1312CPPCT540ReAB載體中使用BamHI/NdeI切下之基因片段插至其中，如此可分別得到一pK18-△CAB-310540ReAB與一pK18-△CAB-312540ReAB載體。藉由使用這些載體，可製得一重組貪銅菌310540ReAB與貪銅菌312540ReABphaCAB，其中phaCAB係被移除，且一Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之phaClPs6-19 310或phaClPs6-19 312、丙酸梭菌(Clostridium propionicum )之丙醯基-輔酶A轉移酶(propionyl-CoA transferase)(CPPCT540)、以及貪銅菌H16之PHB單體供應酵素(phaARE ＆ phaBRE )係被插入至一染色體中，請見表1。其係使用E. coli S17-1，以如同實施例1中所述之相同方法進行製備(請見圖3)。
<實施例5>培養重組貪銅菌以生物合成P(3HB-co-LA)共聚物
將表1中所示之重組貪銅菌於一含有葡萄糖作為基質以及34ug/mL氯黴素之基本培養基中培養，以生物合成P(3HB-co-LA)共聚物。該基本培養基之組成係為每公升含有KH2 PO4 ,2.65g；Na2 HPO4 ,3.8g；NH4 Cl,0.72g；MgSO4 7H2 O,0.4g；追蹤劑(tracer),1mL。此外，追蹤劑(tracer)之組成係為每公升含有FeSO4 ‧7H2 O,10g;ZnSO4 ‧7H2 O,2.25g;CuSO4 ‧5H2 O,1g;MnSO4 ‧5H2 O,0.5g;CaCl2 ‧2H2 O,2g;Na2 B4 O7 ‧7H2 O,0.23g;(NH4 )6 MO7 O24 ,0.1g;35% HCl,10mL。於主要培養前，須先於含有抗生素之LB培養基中進行種子培養30分鐘。接著將種子培養溶液接種至含有基質以及抗生素之基本培養基中使具有1%的濃度以進行4天的主要培養。所有的培養皆在30℃、200rpm的速度條件下進行。培養完成結束後，裂解細胞係以離心方式收集。將收獲到的裂解細胞於一乾燥器中以80℃乾燥48小時，並以氣相層析法分析測量裂解細胞中P(3HB-co-LA)共聚物所累積的含量。結果係如表2所示。分析中所使用之參考物質係P(3HB-co-12mol% 3HV)共聚物以及PLA聚合物。
*3HB: 3-羥基丁酯,2g/L
+ NaL：乳酸鈉(pH 7),4g/L
++ NaL：乳酸鈉(pH 7),6g/L
+++ NaL：乳酸鈉(pH 7),24g/L
<實施例6>經由重組貪銅菌的培養生物合成P(3HB-co-LA-co-mcl3HA)共聚物
將貪銅菌GFP轉移至一用於表現Pseudomonas sp. 6-19(KCTC 11027BP)之PHA合成酶、丙酸梭菌(Clostridium propionicum )之丙醯基-輔酶A轉移酶(propionyl-CoA transferase)(CPPCT)、以及P. putida KT2440之PhaG的載體中，並接著如實施例5中所述之方法進行培養。在此，使用2%葡萄糖作為碳源。累積於裂解細胞中的共聚物的含量係如表3中所示。
載體的製備步驟係如下所示。
首先，將一由P. putida KT2440經由PCR所放大得到的phaG插入至pPs619C1300CPPCT532或pPs619C1334CPPCT532載體(pPs619C1300CPPCT532PhaG或pPs619C1334CPPCT532PhaG)的一NdeI端。接著，使用BamHI/XhoI將pPs619C1300CPPCT532PhaG或pPs619C1334CPPCT532PhaG切下，將所得到的基因片段插入至pBBR1MCS2載體之同樣端，如此則可得到重組質粒，其係可於貪銅菌(pMCS2Ps619C1300CPPCT532PhaG或pMCS2Ps619C1334CPPCT532PhaG)中進行複製。而藉由使用該載體，則可製備出重組貪銅菌。
KTPhaG500f-NdeI ggaattc catatg ggggttggcgccggg ggag(SEQ ID NO: 5)
KTPhaGb-2100-NdeI 5- ggaattc catatg gga tcg gtg ggt aat tgg cc(SEQ ID NO: 6)
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1及2係為包含聚羥基烷酸酯合成酶(由Pseudomonas sp. 6-19衍生之)之突變基因、丙醯基-輔酶A轉移酶(由C. propionicum衍生之)之突變基因、以及由貪銅菌衍生之phaAB基因的重組表現載體之製備流程圖。
圖3係大腸桿菌(Escherichia coli S17-1)與貪銅菌之間的交配，以及將一段目標基因嵌入至貪銅菌之染色體中以製備重組貪銅菌之步驟示意圖。
<110> LG化學公司
<120> 可產生聚乳酸或其共聚物之重組貪銅菌及使用其製備聚乳酸或其共聚物之方法/RECOMBINANT RALSTONIA EUTROPHA CAPABLING OF PRODUCING POLYLACTATE OR ITS COPOLYMERS AND METHOD FOR PREPARING POLYLACTATE OR ITS COPOLYMERS USING THE SAME
<130> PJ172/7539TW
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1572
<212> DNA
<213> Clostridium propionicum
<400> 1
<210> 2
<211> 559
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP)
<400> 2
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic primer
<400> 3
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 4
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic primer
<400> 5
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic primer
<400> 6

Claims (11)

  1. 一種重組貪銅菌(R.eutropha )，其係用於生產聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物，其中一野生型貪銅菌之聚羥基烷酸酯(PHA，polyhydroxyalkanoate)之生物合成基因操縱子係被移除，並插入一段將乳酸轉換為乳酸基輔酶A之酵素之基因，以及一段使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶之基因，其中該將乳酸轉換為乳酸基輔酶A之酵素之基因係一衍生自Clostridium propionicum (丙酸梭菌)之丙醯基-輔酶A轉移酶(pct )基因，且該pct 基因具有一核酸序列，其係選自由：含有A1200G突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct512)；含有T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct522)；含有A1200G突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct531)，其中該A1200G突變所對應之胺基酸序列係包含有Gly335Asp突變；含有A1200G突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct532)，其中該A1200G突變所對應之胺基酸序列係包含有Ala243Thr突變；含有T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct533)，其中該T669C、A1125G、以及 T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Asp65Gly突變；含有A1200G突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct534)，其中該A1200G突變所對應之胺基酸序列係包含有Asp257Asn突變；含有T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct535)，其中該T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Asp65Asn突變；含有T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct537)，其中該T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Thr199Ile突變；以及含有T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct540)，其中該T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Val193Ala突變所組成之群組；並且其中該使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶之基因係衍生自Pseudomonas sp. 6-19(假單胞菌)並且具有一對應至具有至少一選自以下突變之SEQ ID NO：2胺基酸序列之核酸序列：E130D、S325T、L412M、S477R、S477H、S477F、S477Y、S477G、Q481M、Q481K、以及Q481R。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之重組貪銅菌，其中該pct 基因具有一含有T78C、T669C、A1125G、以及T1158C 突變之SEQ ID NO：1之核酸序列(cppct540)，其中該T78C、T669C、A1125G、以及T1158C突變所對應之胺基酸序列係包含有Val193Ala突變。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之重組貪銅菌，其中該使用乳酸基輔酶A作為基質之PHA合成酶之基因係具有一對應至至少一胺基酸序列之核酸序列，該至少一胺基酸序列係選自由：含有E130D、S325T、L412M、S477G、以及Q481M突變之SEQ ID NO：2之胺基酸序列(C1335)；含有E130D、S477F、以及Q481K突變之SEQ ID NO：2之胺基酸序列(C1310)；以及含有E130D、S477F、以及Q481R突變之SEQ ID NO：2之胺基酸序列(C1312)所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之重組貪銅菌，更包括一3HB-CoA合成酶編碼基因。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之重組貪銅菌，其中該3HB-CoA合成酶編碼基因係包括一酮硫解酶(ketothiolase)基因以及一乙醯乙醯輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase)基因。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之重組貪銅菌，其中該酮硫解酶基因以及該乙醯乙醯輔酶A還原酶基因係衍生自貪銅菌。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之重組貪銅菌，更包括一PhaG基因。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之重組貪銅菌，係可產生一MCL之羥基烷酸酯-乳酸共聚物。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之重組貪銅菌，其中該PhaG基因係衍生自P.Putida KT2440 。
  10. 一種製備聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物之方法，係包括：於一含有碳源以及乳酸、或一含有碳源、乳酸、以及羥基烷酸酯之培養基中培養如申請專利範圍第1至8中之任何一項所述之重組貪銅菌；以及由該重組貪銅菌取得聚乳酸或羥基烷酸酯-乳酸共聚物。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該羥基烷酸酯-乳酸共聚物之羥基烷酸酯係包括至少一選自由：3-羥基丁酸酯(3-hydroxybutyrate)、3-羥基戊酸酯(3-hydroxyvalerate)、4-羥基丁酸酯(4-hydroxybutyrate)、中鏈長之具有6至14個碳原子之(D)-3-羥基碳酸((D)-3-hydroxycarboxylic acid)、2-羥基丙酸(2-hydroxypropionic acid)、3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoic acid)、3-羥基庚酸(3-hydroxyheptanoic acid)、3-羥基辛酸(3-hydroxyoctanoic acid)、3-羥基壬酸(3-hydroxynonanoic acid)、3-羥基癸酸(3-hydroxydecanoic acid)、3-羥基十一酸(3-hydroxyundecanoic acid)、3-羥基十二酸(3-hydroxydodecanoic acid)、3-羥基十四酸 (3-hydroxytetradecanoic acid)、3-羥基十六酸(3-hydroxyhexadecanoic acid)、4-羥基戊酸(4-hydroxyvaleric acid)、4-羥基己酸(4-hydroxyhexanoic acid)、4-羥基庚酸(4-hydroxyheptanoic acid)、4-羥基辛酸(4-hydroxyoctanoic acid)、4-羥基癸酸(4-hydroxydecanoic acid)、5-羥基戊酸(5-hydroxyvaleric acid)、5-羥基己酸(5-hydroxyhexanoic acid)、6-羥基十二酸(6-hydroxydodecanoic acid)、3-羥基-戊烯酸(3-hydroxy-pentenoic acid)、3-羥基-4-反式-己烯酸(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid)、3-羥基-4-順式-己烯酸(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid)、3-羥基-5-己烯酸(3-hydroxy-5-hexenoic acid)、3-羥基-6-反式-辛烯酸(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid)、3-羥基-6-項式-辛烯酸(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid)、3-羥基-7-辛烯酸(3-hydroxy-7-octenoic acid)、3-羥基-8-壬烯酸(3-hydroxy-8-nonenoic acid)、3-羥基-9-癸烯酸(3-hydroxy-9-decenoic acid)、3-羥基-5-項式-十二烯酸(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid)、3-羥基-6-順式-十二烯酸(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid)、3-羥基-5-項式-十四碳烯酸(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid)、3-羥基-7-順式-十四碳烯酸(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid)、3-羥基-5,8-順式-順式-十四碳烯酸(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid)、3-羥基-4-甲基戊酸(3-hydroxy-4-methylvaleric acid)、3-羥基-4-甲基己酸(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid)、3-羥基-5-甲基己酸(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid)、3-羥基-6-甲基庚酸(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid)、3-羥基-4-甲基辛酸(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid)、3-羥基-5-甲基辛酸(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid)、3-羥基-6-甲基辛酸(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid)、3-羥基-7-甲基辛酸(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid)、3-羥基-6-甲基壬酸(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid)、3-羥基-7-甲基壬酸(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid)、3-羥基-8-甲基壬酸(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid)、3-羥基-7-甲基癸酸(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid)、3-羥基-9-甲基癸酸(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid)、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid)、蘋果酸(malic acid)、3-羥基丁二酸-甲基酯(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester)、3-羥基己二酸-甲基酯(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester)、3-羥基辛二酸-甲基酯(3-hydroxysuberic acid-methyl ester)、3-羥基壬二酸甲基酯(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester)、3-羥基癸二酸甲基酯(3-hydroxysebacic acid-methyl ester)、3-羥基辛二酸乙基酯(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester)、3-羥基癸二酸乙基酯(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester)、3-羥基庚二酸-丙基酯(3-hydroxypimelic acid-propyl ester)、3-羥基癸二酸苄酯(3-hydroxysebacic acid-benzyl ester)、3-羥基-8-丙醯辛酸(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid)、3-羥基-9-丙醯壬酸(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid)、苯氧基-3-羥基丁酸(phenoxy-3-hydroxybutyric acid)、苯氧基-3-羥基戊酸(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、苯氧基-3-羥基庚酸(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid)、苯氧基-3-羥基辛酸(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid)、對-氰基苯氧基-3-羥基丁酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid)、對-氰基苯氧基-3-羥基戊酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid)、對-氰基苯氧基-3-羥基己酸(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、對-硝基苯氧基-3-羥基己酸(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid)、3-羥基-5-苯基戊酸(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid)、3-羥基-5-氯環己基丁酸(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid)、3,12-二羥基十二酸(3,12-dihydroxydodecanoic acid)、3,8-二羥基-5-順式-十四碳烯酸(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid)、3-羥基-4,5-環氧基癸酸(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid)、3-羥基-6,7-環氧基癸酸(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid)、3-羥基-8,9-環氧基-5,6-順式-十四酸(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid)、7-氰基-3-羥基庚酸(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid)、9-氰基-3-羥基壬酸(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid)、3-羥基-7-氟庚酸(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid)、3-羥基-9-氟壬酸(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid)、3-羥基-6-氯己酸(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid)、3-羥基-8-氯辛酸(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid)、3-羥基-6-溴己酸 (3-hydroxy-6-bromohexanoic acid)、3-羥基-8-溴辛酸(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid)、3-羥基-11-溴十一酸(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid)、3-羥基-2-丁烯酸(3-hydroxy-2-butenoic acid)、6-羥基-3-十二烯酸(6-hydroxy-3-dodecenoic acid)、3-羥基-2-甲基丁酸(3-hydroxy-2-methylbutyric acid)、3-羥基-2-甲基戊酸(3-hydroxy-2-methylvaleric acid)、以及3-羥基-2,6-二甲基庚酸(3-hydroxy-2,6-dimethylheptenoic acid)所組成之群組。
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